Uproszczona metoda długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości
March 5th, 2016
Kultury o niskiej gęstości pierwotnych neuronów hipokampa zazwyczaj wymagają warstwy zasilającej glej, aby dostarczyć czynników neurotroficznych i utrzymać długowieczność. Opisujemy tutaj uproszczoną metodę hodowli neuronów o ultra niskiej gęstości na szklanych szkiełkach nakrywkowych w obecności warstwy zasilającej neurony o dużej gęstości, co ułatwia badanie specyficznych mechanizmów neuronalno-autonomicznych.
Ogólnym celem tej procedury jest ustanowienie zdrowych, długoterminowych kultur pierwotnych mysich neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości, aby ułatwić znakowanie immunocytochemiczne i badanie autonomicznych mechanizmów komórek neuronalnych. Badanie to może pomóc w zrozumieniu niektórych kluczowych pytań w dziedzinie badań neurobiologicznych, takich jak badania nad specyficznością białka w neuromorfologii funkcji rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala neuronom rosnąć w bardzo niskiej gęstości na szkiełku nakrywkowym bez wsparcia warstwy zasilającej glej.
Procedurę zademonstruje Mariel Piechowicz, studentka z mojego laboratorium. Przygotuj dwie płytki 24-dołkowe o dużej gęstości i dwie płytki 24-dołkowe o małej gęstości. Za pomocą igły o rozmiarze 28 wytraw spód płytek 24-dołkowych, tak aby przemieszczone tworzywa sztuczne działały jako podpora dla szkiełek nakrywkowych, na których rosną neurony o niskiej gęstości.
Przenieś sterylne szkiełka szklane do dwóch 24-dołkowych płytek przeznaczonych do hodowli o małej gęstości. Pokryj wszystkie cztery płytki 300 mikrolitrami 0,1 miligrama na mililitr poli-D-lizyny rozcieńczonej w buforze boranowym i włóż je z powrotem do inkubatora w celu powlekania przez noc. Przed pobraniem tkanek przygotuj dwie 10-centymetrowe szalki Petriego wypełnione lodowatym sterylnym HBSS.
Pod mikroskopem przytrzymaj zarodek za szyję kleszczami i wykonaj pierwsze cięcie tuż przy linii środkowej, poniżej poziomu móżdżku. Następnie wykonaj nacięcie po lewej stronie podstawy czaszki. Następnie wykonaj kolejne cięcie po prawej stronie podstawy czaszki.
Pozostaw niewielką część kości czaszki i tkanki skórnej na końcu rostralnym nieprzeciętą, aby cały mózg można było łatwo odwrócić na bok w celu ekstrakcji. Teraz przenieś mózg do roztworu HBSS. Sprawdź mózg, aby upewnić się, że jest nienaruszony, bez rażąco odciętych obszarów.
Następnie powtórz procedury, aby zebrać resztę mózgu zarodka na nowej szalce Petriego zawierającej 20 mililitrów zimnego buforu HBSS. Ustaw każdy mózg brzuszną stroną do góry. Przytrzymując mózg kleszczami na końcu ogonowym, wykonaj cięcie po przekątnej między środkowym punktem rostralnym a ogonowym obszarem skroniowym za pomocą ostrej pęsety.
Powtórz to dla drugiej półkuli. Następnie oddziel dwie półkule z nienaruszonym hipokampem od reszty tkanek macierzystych mózgu. Powtórz procedury dla wszystkich mózgów i połącz wszystkie wypreparowane półkule razem.
Następnie usuń opony mózgowe za pomocą dwóch par pęset. Zidentyfikuj rozwijający się hipokamp jako zakrzywioną strukturę, która jest złożona wewnątrz płata skroniowego i oddziel go od sąsiednich tkanek korowych. Zbierz i połącz wszystkie tkanki hipokampa razem.
W tej procedurze przenieś wszystkie wypreparowane hipokampy do enzymatycznego roztworu trawiącego w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Następnie umieść probówkę w łaźni wodnej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 25 minut. Po 25 minutach ostrożnie usuń roztwór enzymu.
Następnie dodaj pięć mililitrów ciepłego medium myjącego, aby uzyskać całkowitą objętość do 10 mililitrów. Delikatnie umyj chusteczkę, powoli obracając rurkę pięć razy. Usuń medium myjące i ponownie dodaj 10 mililitrów środka myjącego w celu dodatkowego prania.
Następnie usuń medium myjące i ponownie dodaj trzy mililitry świeżego ciepłego środka myjącego. Potrząśnij rurką ręcznie rygorystycznie 15 razy, aby usunąć strawione neurony z tkanki. Pożywka powinna stać się mętna po oddzieleniu komórek od tkanki do pożywki myjącej.
Następnie zbierz zawiesinę komórek w nowej 15-mililitrowej stożkowej probówce, pozostawiając pozostałą tkankę w probówce. Następnie dodaj kolejne dwa mililitry pożywki myjącej do tkanki i delikatnie oddziel pozostałą tkankę, rozcierając 15 razy plastikową pipetą. Pozostaw zawiesinę komórek na pięć minut przed zebraniem jej w nowej 15-mililitrowej stożkowej probówce, która zawiera zebrane komórki do strząsania.
Następnie policz gęstość neuronów za pomocą hemocytometru. Oblicz objętość zawiesiny komórkowej potrzebną do uzyskania gęstości 250 000 neuronów na mililitr i dodaj ją do jednej z dwóch stożkowych probówek zawierających 30 mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej, aby uzyskać pożywkę do powlekania neuronów o dużej gęstości. Przenieś 1,2 mililitra tego roztworu neuronów o dużej gęstości do kolejnych 30 mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej, aby uzyskać stężenie 10 000 neuronów na mililitr i użyj tego roztworu do zasiewu szkiełek nakrywkowych o niskiej gęstości.
W tej procedurze umieść 24-dołkowe płytki z wytrawionym dnem dla neuronów o dużej gęstości w kapturze hodowlanym. Usuń 300 mikrolitrów wstępnie kondycjonowanej pożywki za pomocą próżni, a następnie umieść 0,6 mililitra zawiesiny komórek o dużej gęstości w ilości 250 000 neuronów na mililitr. Umieść pozostałe dwie 24-dołkowe płytki ze szkiełkami nakrywkowymi w pokrywie hodowlanej.
Usuń 300 mikrolitrów wstępnie przygotowanego podłoża za pomocą próżni, a następnie posiew 0,6 mililitra zawiesiny komórek o niskiej gęstości w ilości 10 000 neuronów na mililitr na szkiełkach nakrywkowych. Następnie należy umieścić wszystkie cztery płytki 24-dołkowe z powrotem w inkubatorze i inkubować przez dwie godziny. Następnie odwróć szkiełka nakrywkowe o niskiej gęstości z przylegającymi neuronami do kultury o dużej gęstości i upewnij się, że neurony są zwrócone do siebie.
Następnie zwróć dwie płytki z kokulturą do inkubatora. Nakarm kokultury, dodając 300 mikrolitrów świeżej pożywki paszowej w DIV 5. Po tym wstępnym karmieniu co tydzień dodawaj 300 mikrolitrów świeżej pożywki paszowej bez arabinozydu cytozyny do każdej studzienki.
Jeśli kultura jest przechowywana dłużej niż jeden miesiąc, należy co tydzień zastępować połowę pożywki świeżą pożywką po upływie jednego miesiąca. Pod względem morfologicznym zarówno neurony o dużej, jak i niskiej gęstości powinny wyglądać zdrowo do trzech miesięcy. W tym przypadku znakowanie immunocytochemiczne służy do ujawnienia funkcjonalnych synaps glutaminergiczne, w których podjednostka receptora NMDA NR1 i podjednostka receptora ApoE GluR1 są znakowane podwójnym barwieniem.
Funkcjonalne synapsy można łatwo zidentyfikować i określić ilościowo za pomocą obrazu J. Neurony o niskiej gęstości są również znakowane przeciwciałem przeciwko dendrytycznemu markerowi białkowemu MAP2 w połączeniu z aksonalnym markerem białkowym p-Tau. To podwójne znakowanie pozwala na wyraźne rozróżnienie dendrytów i aksonów. Kultury o niskiej gęstości mogą być również z powodzeniem transfekowane plazmidami DNA przy użyciu metod fosforanu wapnia, chociaż szybkość transfekcji jest zwykle bardzo niska na późniejszych etapach.
Rysunek ten ilustruje, że transfekcja EGFP może ujawnić morfologię neuronów i uwidocznić drobne struktury dendrytyczne kręgosłupa. Wreszcie, jako dowód słuszności koncepcji, neurony o bardzo niskiej gęstości mogą być hodowane w warunkach, które sprzyjają tworzeniu autapse. Te neurony autaptyczne o ultra niskiej gęstości hodowane na mikrowyspach pokrytych poli-D-lizyną mogą być podtrzymywane przez neurony zasilające o dużej gęstości przez ponad dwa miesiące dzięki temu protokołowi kohodowli.
Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin w dniu hodowli komórek, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest, aby pokryć szkiełka pokrywy szkła i dno płytki 24-dołkowej poli-D-lizyną. Proste wytrawienie dna płytki jest wystarczające, aby zapewnić mechaniczne i odżywcze wsparcie neuronom hipokampa o niskiej gęstości, które rosną na szkiełkach nakrywkowych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować pierwotne embrionalne neurony hipokampa myszy o ultraniskiej gęstości, przy braku warstwy zasilającej glej. Mam nadzieję, że możesz wykorzystać tę metodę do własnych celów eksperymentalnych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę hodowania pierwotnych neuronów hipokampu myszy w ultraniska gęstość na szklanych pokrywach. Technika eliminuje potrzebę warstwy podtrzymującej z komórek glejowych, umożliwiając badanie mechanizmów neuronalnych autonomicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Techniki hodowania neuronów
Tło
- Pierwotne neurony hipokampu zazwyczaj wymagają wsparcia glejowego dla wzrostu.
- Kultury ultraniskiej gęstości mogą poprawić badania określonych funkcji neuronowych.
- Rozumienie mechanizmów neuronowych jest kluczowe dla badań neuronaukowych.
- Ta metoda ma na celu uproszczenie procesu hodowania przy zachowaniu zdrowia neuronów.
Cel badania
- Ustanowić długoterminowe kultury pierwotnych neuronów hipokampu.
- Ułatwić immunocytochemiczne znaczenie.
- Badać mechanizmy autonomiczne komórek neuronowych.
Stosowane metody
- Przygotowanie płytek 24-dołkowych o wysokiej i niskie gugęstości.
- Trawienie dna płytek igłą 28-miarową.
- Używanie pokryw do wzrostu neuronów o niskie gugęstości.
- Demonstracja procedury przez studenta laboratorium.
Główne wyniki
- Sukcesywne ustanowienie kultur neuronów ultraniskiej gęstości.
- Neurony utrzymały zdrowie i długowieczność bez wsparcia glejowego.
- Ułatniło skuteczne badanie mechanizmów neuronowych.
- Dostarczyło uproszczonej metody dla przyszłych zastosowań badawczych.
Wnioski
- Metoda umożliwia badanie mechanizmów neuronalnych autonomicznych.
- Upraszcza proces hodowania pierwotnych neuronów.
- To podejście może poprawić badania w dziedzinie neuronauki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Establishing ultra-low density primary hippocampal neuron cultures without glial support enables mechanistic interrogation of cell-autonomous neuronal functions, reducing confounding variables in target validation. This approach supports predictive confidence in early discovery by isolating intrinsic neuronal phenotypes relevant to neuropsychiatric and neurodegenerative disease models. Long-term culture stability (>3 months) facilitates sustained assay windows for lead compound screening and phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuronal cell-autonomous mechanisms by eliminating glial feeder layer variability.
- Operational Value: Simplifies culture workflow by removing time-consuming glial preparation and maintenance steps.
- Predictive Value: Supports target de-risking through isolated study of protein function in neurite morphology and synaptic formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a stable, serum-free, glial-free platform for quantifying synapse formation and dendritic spine morphology over extended periods.
- Operational Value: Etched well-bottom microspaces allow reproducible, low-density neuron seeding without physical spacers, enhancing assay standardization.
- Scalability: Compatible with standard 24-well plates and coverslips, enabling integration into existing imaging and transfection workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Ultra-low density autaptic neuron cultures model isolated neuronal circuit function, relevant to studying hyperexcitability in epilepsy and autism spectrum disorders.
- Mechanistic De-risking: Enables longitudinal observation of neuronal health and synaptic marker expression (e.g., NR1, GluR1, MAP2, p-Tau) to assess compound effects on neuronal integrity.
- Assay Continuity: Supports immunocytochemistry and transfection-based readouts for target engagement and pathway modulation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early neuronal phenotype screening to mechanistic follow-up in lead optimization, particularly for CNS-targeted programs requiring neuronal health readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neuronal-autonomous pathways by isolating intrinsic growth and synaptogenesis without glial interference.
- Screening: Enables reproducible, low-density plating for high-content imaging of dendritic complexity and spine density as phenotypic endpoints.
- Analytics: Facilitates quantitative immunocytochemistry and image-based analysis of synaptic puncta and axonal-dendritic compartmentalization.
- Translational Research: Autaptic neuron islands allow study of isolated synaptic function, modeling monosynaptic circuit disruptions in disease.
- Enterprise Reuse: Poly-D-lysine coated coverslips and etched plates represent a low-cost, reusable platform for long-term neuronal culture across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuronal studies by eliminating glial-derived trophic and signaling confounders.
- Operational Value: Eliminates need for glial feeder layer preparation, reducing culture setup time and technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in CNS target validation by providing cleaner phenotypic readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on neuron-specific functional data rather than mixed glia-neuron responses.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique for hippocampal dissection and enzymatic dissociation of embryonic mouse tissue.
- Depends on precise Poly-D-lysine coating of glass coverslips and 24-well plate surfaces for neuron adhesion.
- Necessitates micro-etching of well plate bottoms with a 28-gauge needle to create supportive microspaces for coverslips.
- Relies on weekly feeding with fresh medium (without cytosine arabinoside after DIV5) to maintain culture health beyond one month.
- Limited transfection efficiency at later stages may require alternative methods (e.g., viral vectors) for genetic manipulation in mature neurons.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
24-well Plate Preparation for High and Low Density Neuron Culture
1:48
Brain Removal and Hippocampi Dissection of E16.5 - E17.5 Mouse Embryos
4:02
Enzymatic Digestion and Separation into Single Neurons
6:53
Plating of Neurons and Long Term Co-Culture
8:51
Results: Experimental Manipulations of Low Density Neurons Grown in Co-Culture
10:23
Conclusion
