Name: Uproszczona metoda długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa myszy przy bardzo niskiej gęstości bez warstwy glejowej. Technika umożliwia badanie mechanizmów autonomicznych neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant NIH/NIMH dla S.Q. (R00MH087628).

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Arizony i były zgodne z wytycznymi NIH.
1. Źródło tkanki do hodowli neuronów hipokampa
<ol>
	<li>Aby wygenerować prenatalne młode myszy do hodowli neuronów hipokampa, użyj myszy w ciąży (C57Bl6 / J), które są hodowane w domu17. Dzień, w którym wykryto czop dopochwowy, jest oznaczony jako E0,5. Planowany czas zbiorów dla upraw to E16.5-E17.5. 
	Uwaga: Protokół ten opisuje hodowle dwóch 24-dołkowych płytek dwóch neuronów o wysokiej gęstości współhodowanych z neuronami o niskiej gęstości (łącznie 48 szkiełek nakrywkowych). Aby uzyskać więcej płytek, materiały i odczynniki można odpowiednio skalować.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytek 24-dołkowych do hodowli neuronów o dużej gęstości
Uwaga: Wykonaj następujące kroki (2-3) dzień przed planowanym pobraniem zarodków.
<ol>
	<li>Włożyć dwie 24-dołkowe płytki do kaptura do hodowli komórkowych, otworzyć opakowanie indywidualne.</li>
	<li>Połączyć igłę ze strzykawką 18 G z plastikową strzykawką jednorazowego użytku o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Trzymać strzykawkę i skierować końcówkę igły na ~1 mm w lewo do środka dna studzienki. Zastosuj umiarkowaną siłę (~250 g), aby wytrawić dno studzienki (o długości ~1 mm). Zostanie utworzony rowek, a przemieszczone tworzywa sztuczne utworzą podwyższoną podporę nad powierzchnią studni z płaskim dnem. W podobny sposób wytrawić kolejny równoległy rowek o długości ~1 mm na prawo od środka dna.</li>
	<li>Powtórz ten krok dla wszystkich dołków dwóch 24-dołkowych płytek. Dwie 24-dołkowe płytki używane do hodowli o wysokiej gęstości są teraz gotowe do pokrycia poli-D-lizyną (patrz krok 3.8 poniżej).</li>
</ol>
3. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych do hodowli neuronów o niskiej gęstości
<ol>
	<li>Użyj okrągłego szkła o średnicy 12 mm #1.</li>
	<li>Umieść 50 szkiełek nakrywkowych w sterylnej plastikowej szalce Petriego o średnicy 100 mm i zanurz szkiełka nakrywkowe w 20 ml 70% roztworu etanolu. Umieść tę szalkę Petriego na obrotowej platformie z umiarkowaną (70 obr./min) prędkością obrotową na godzinę. Usuń 70% etanolu, a następnie zastąp świeżą partią 70% etanolu. Obróć i pierz przez kolejną godzinę.</li>
	<li>Wyrzuć 70% etanolowy roztwór czyszczący. Dodaj sterylną wodę (przefiltrowaną przez jednostkę filtrującą 0,2 μm). Dokładnie opłucz szkiełka nakrywkowe, obracając ręcznie szalkę Petriego. Spłucz trzy razy, za każdym razem zastępując świeżą sterylną wodą.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego ze szkiełkami nakrywkowymi w sterylnym kapturze do hodowli komórkowych z przepływem laminarnym. Zassać wodę płuczącą przez przewód próżniowy i dodać 10 ml przefiltrowanej sterylnej wody, aby zanurzyć szkiełka nakrywkowe. Szkiełka nakrywkowe powinny być sterylne, a powierzchnia powinna być wystarczająco czysta, aby można było ją pokryć poli-D-lizyną.</li>
	<li>Otwórz dwie 24-dołkowe płytki z ich indywidualnego opakowania i umieść je w kapturze.</li>
	<li>Włącz przewód podciśnieniowy w okapie. Podłącz końcówkę do pipety o pojemności 200 μl do przewodu podciśnieniowego i użyj nożyczek, aby przeciąć końcówkę, aby utworzyć większy otwór.</li>
	<li>Użyj pęsety #5 z cienką końcówką, aby zebrać szkiełka nakrywkowe z szalki Petriego, pojedynczo, i użyj linii próżniowej, aby całkowicie wysuszyć szkiełko nakrywkowe. Następnie umieść po jednym szkiełku nakrywkowym w każdym z dołków 24-dołkowej płytki. 50 oczyszczonych szkiełek nakrywkowych powinno wystarczyć do wypełnienia każdej z dołków dwóch płytek 24-dołkowych.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy poli-D-lizyny (1 mg/ml) w roztworze roboczym (0,1 mg/ml) buforem boranowym (pH 8,5). Dla czterech płytek 24-dołkowych (w tym dwóch płytek o dużej gęstości z wytrawionym dnem) należy przygotować 30 ml całkowitego roztworu roboczego.</li>
	<li>Dodać 300 μl 0,1 mg/ml roztworu roboczego poli-D-lizyny do każdej studzienki ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są całkowicie zanurzone w roztworze. Jeśli nie, użyj końcówki pęsety #5, aby docisnąć szkiełka nakrywkowe do dna studzienki i użyj końcówki do prowadzenia roztworu poli-D-lizyny, aby pokryć całą powierzchnię szkiełek nakrywkowych. Sprawdź wzrokowo wszystkie szkiełka nakrywkowe, aby upewnić się, że między płytką a szkiełkami nakrywkowymi nie zostało uwięzione powietrze.</li>
	<li>Dodać 300 μl 0,1 mg/ml roztworu roboczego poli-D-lizyny do każdego dołka płytki hodowlanej o wysokiej gęstości z wytrawionym dnem. Obróć ręcznie, aby rozprowadzić roztwór, aby pokryć całe dno studzienki.</li>
	<li>Umieścić wszystkie cztery płytki z poli-D-lizyną z powrotem w inkubatorze hodowli i inkubować O/N.</li>
</ol>
4. Mycie i wstępne kondycjonowanie płyt dla kultury
Uwaga: Następujące kroki (4-9) są wykonywane w dniu pobrania tkanki.
<ol>
	<li>Po inkubacji/pokryciu szkiełkami nakrywkowymi i 24-dołkowymi płytkami O/N, wprowadzić wszystkie cztery płytki (dwie z szkiełkami nakrywkowymi dawcy, dwie akceptorowe płytki o wysokiej gęstości z wytrawionym plastikowym dnem) do kaptura hodowlanego. Użyj przewodu próżniowego, aby usunąć roztwór poli-D-lizyny.</li>
	<li>Natychmiast po usunięciu roztworu poli-D-lizyny dodać ~1 ml sterylnej wody do każdej studzienki za pomocą plastikowej pipety transferowej. Po napełnieniu wszystkich studni wodą odstaw na 10 minut. Usunąć wodę za pomocą próżni, a następnie dodać 300 μl pożywki myjącej do każdej studzienki, aby przykryć dno studzienki (ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi lub bez). Nie dopuścić do wyschnięcia powłoki poli-D-lizyny.</li>
	<li>Umieścić wszystkie cztery płytki z powrotem w inkubatorze komórkowym. Płytki są gotowe do użycia po przygotowaniu rozproszonych neuronów hipokampa.</li>
</ol>
5. Przygotowanie kompletnej pożywki hodowlanej i roztworu trypsyny do trawienia enzymatycznego
<ol>
	<li>Przygotować 60 ml kompletnej pożywki hodowlanej, mieszając składniki (patrz Materiały). Za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml połączonej z filtrem strzykawkowym o porach 0,2 μm przefiltrować pożywkę Complete Culture do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Każda probówka zawiera 30 ml kompletnej pożywki do hodowli.</li>
	<li>Do oddzielnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać ~30 ml pożywki myjącej (patrz Materiały) i podgrzać ją do temperatury 37 °C. Zostanie to wykorzystane do przemycia tkanki po trawieniu enzymatycznym.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do trawienia enzymatycznego. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml dodaj 4,5 ml pożywki myjącej i 0,5 ml 2,5% roztworu trypsyny oraz 50 μl 100X DNazy I.</li>
	<li>Umieścić kompletną pożywkę hodowlaną, pożywkę płuczącą i pożywkę do mineralizacji enzymatycznej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
6. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych
<ol>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w woreczku do sterylizacji: dwie małe nożyczki, parę kleszczy i dwie pęsety #5.</li>
</ol>
7. Usunięcie mózgów z embrionów myszy E16.5-E17.5 i sekcja hipokampów
<ol>
	<li>Przygotuj dwie 10-centymetrowe szalki Petriego wypełnione lodowatym, sterylnym zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS).</li>
	<li>Poddać matkę myszy eutanazji za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia fenobarbitalu sodu (100 mg/kg w objętości ~ 0,5 ml). Po wstrzyknięciu, gdy tama straci odpowiedź na uszczypnięcie palca, ofiara ze zwichnięciem szyjki macicy.</li>
	<li>Spryskaj okolice brzucha koniczy 70% etanolem i wykonaj 2-centymetrowe nacięcie wzdłuż linii środkowej brzucha, aby odsłonić macicę.</li>
	<li>Usuń zarodki i umieść pojedyncze na szalce Petriego o średnicy 10 cm z zimnym buforem HBSS do preparowania.</li>
	<li>Przytrzymaj zarodek za szyję za pomocą kleszczy i użyj małych nożyczek, aby wykonać pierwsze cięcie w linii środkowej poniżej poziomu móżdżku i przeciąć tkankę mózgową. Nie odcinaj głowy zarodkowi.
	<ol>
		<li>Włóż prawą boczną końcówkę małego nożyczki z okolicy ogona, która jest rozcięta, aż do rostralnej części mózgu embrionalnego (nie przekraczaj linii środkowej) i wykonaj nacięcie po lewej stronie na poziomie podstawy czaszki.</li>
		<li>Włóż ponownie końcówkę nożyczek po lewej stronie, aby wykonać cięcie po prawej stronie. Pozostaw wąski pas nieprzeciętej kości czaszki i tkanki skórnej na końcu rostralnym, tak aby cały mózg można było odwrócić na bok w celu łatwej ekstrakcji.</li>
		<li>Użyj końcówki nożyczek, aby zgarnąć embrionalny mózg do roztworu HBSS. Zbadaj mózg pod mikroskopem preparacyjnym. Mózg powinien być nienaruszony, bez grubych obszarów odcięcia.</li>
		<li>Powtórz te kroki, aby zebrać wszystkie zarodki mózgu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać wszystkie nienaruszone mózgi na nowej szalce Petriego zawierającej 20 ml zimnego buforu HBSS. Umieść szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym</li>.
	<li>Zobacz mózg od strony brzusznej. Przytrzymując mózg kleszczami na końcu ogonowym, włóż ostrą pęsetę #5 po przekątnej, aby wykonać cięcie między środkowym punktem rostralnym a obszarem ogonowo-skroniowym. Powtórz to dla drugiej półkuli. Po przecięciu oddziel dwie półkule z nienaruszonym hipokampem od reszty tkanek pnia mózgu.
	<ol>
		<li>Powtórz to dla każdego z mózgów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz wszystkie wypreparowane półkule i usuń opony mózgowe za pomocą dwóch par pęsety #5.</li>
	<li>Zidentyfikuj rozwijający się hipokamp jako zakrzywioną strukturę, która jest złożona wewnątrz płata skroniowego. Naprzemiennie dwie pary pęsety, aby oddzielić hipokamp od sąsiednich tkanek korowych. Zbierz i zgromadź całą tkankę hipokampa (patrz ryc. 1).</li>
</ol>
8. Trawienie enzymatyczne, rozdzielone na pojedyncze neurony
<ol>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś wszystkie wypreparowane hipokampy do roztworu do trawienia enzymatycznego zawierającego 5 ml pożywki do przemywania z 0,25% trypsyną + 1X DNazy I w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Umieścić probówkę w łaźni wodnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 25 minut, z przerywanym delikatnym odwracaniem probówki raz na 5 minut.</li>
	<li>Po 25 minutach ostrożnie usunąć roztwór enzymu za pomocą ręcznej pipety z tworzywa sztucznego przez aspirację. Dodaj ciepły Wash medium do 10 ml i delikatnie umyj chusteczkę, powoli odwracając probówkę 5 razy. Usuń medium do mycia i ponownie dodaj 10 ml medium do mycia w celu dodatkowego umycia.</li>
	<li>Usuń medium myjące i ponownie dodaj 3 ml świeżego, ciepłego medium do mycia. Potrząśnij rurką ręcznie rygorystycznie 15 razy, aby usunąć strawione neurony z tkanki. Pożywka powinna stać się mętna po oddzieleniu komórek od tkanki do pożywki myjącej. Zebrać zawiesinę komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, pozostawiając pozostałą tkankę w probówce.</li>
	<li>Dodaj kolejne 2 ml pożywki do płukania do chusteczki i delikatnie oddziel pozostałą tkankę, przecierając ją plastikową pipetą ~15 razy. Odstaw na 5 minut. Umieścić zawiesinę komórek w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml, która zawiera zebrane komórki "strząśnięte".</li>
	<li>Policz gęstość neuronów za pomocą hemocytometru. Zazwyczaj można uzyskać 3 000-5 000 komórek na mikrolitr w zależności od liczby wypreparowanych zarodków. Średnią liczbę neuronów 2,5 x 107 szacuje się, jeśli założymy, że wypreparowanych zostanie sześć zarodków.</li>
	<li>Oblicz objętość potrzebną do uzyskania gęstości 250 000 neuronów/ml po dodaniu do 30 ml pożywki Complete Culture. Dodać tę objętość do jednej z dwóch stożkowych probówek zawierających 30 ml pożywki Complete Culture, aby uzyskać pożywkę do posiewu neuronów o dużej gęstości.</li>
	<li>Przenieś 1,2 ml tego roztworu neuronów o wysokiej gęstości do innego 30 ml pożywki Complete Culture, aby uzyskać stężenie ~10 000 neuronów/ml. Użyj tego rozcieńczenia do wysiewu szkiełek nakrywkowych o niskiej gęstości.</li>
</ol>
9. Poszycie neuronów i długotrwała współkultura
<ol>
	<li>Umieść dwie 24-dołkowe płytki z wytrawionym dnem dla neuronów o dużej gęstości do kaptura hodowli komórkowej. Usunąć 300 μl pożywki kondycjonującej za pomocą próżni. Płytka 0,6 ml zawiesiny komórek o dużej gęstości przy 250 000 neuronów/ml.</li>
	<li>Wprowadzić pozostałe dwie 24-dołkowe płytki ze szkiełkami nakrywkowymi do okapu hodowlanego i usunąć 300 μl pożywki kondycjonującej za pomocą próżni. Płytka 0,6 ml zawiesiny komórek o niskiej gęstości w stężeniu 10 000 neuronów/ml na szkiełkach nakrywkowych wewnątrz dwóch 24-dołkowych płytek.</li>
	<li>Umieścić wszystkie cztery płytki 24-dołkowe z powrotem w inkubatorze. Odstawić na 2 godziny.</li>
	<li>Odwróć szkiełka nakrywkowe o niskiej gęstości z przylegającymi neuronami do kultury o wysokiej gęstości. Upewnij się, że neurony są zwrócone do siebie (tj. nie są oddzielone szklanym szkiełkiem nakrywkowym). Następnie zwróć dwie płytki z kokulturą do inkubatora.</li>
</ol>
10. Podtrzymywanie współkultury
<ol>
	<li>Podawać kokultury paszowe, dodając 300 μl świeżej pożywki paszowej (patrz Materiały) w ciągu dnia in vitro (DIV) 5. Nie ma potrzeby usuwania 50% oryginalnej pożywki Complete Culture, jak wynika z wielu innych badań. Pożywka zawiera również 15 μM arabinozydu cytozyny (Ara-C, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μM), aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia i namnażania się gleju.</li>
	<li>Po tym wstępnym karmieniu co tydzień dodawaj do studzienki 300 μl świeżej pożywki bez Ara-C. Jeśli kultura jest przechowywana dłużej niż jeden miesiąc, należy zastąpić połowę pożywki świeżą pożywką co tydzień po upływie jednego miesiąca (z pierwszą połową wymianą pożywki przy DIV33). Morfologicznie zarówno neurony o wysokiej, jak i niskiej gęstości wyglądają zdrowo do trzech miesięcy (najdłuższy czas zaobserwowany przez eksperymentatorów).</li>
</ol>
11. Ilustracja eksperymentalnej manipulacji - transfekcja neuronów o niskiej gęstości
Uwaga: Gdy pożądana jest transfekcja w neuronach o niskiej gęstości, można zastosować prosty protokół fosforanu wapnia. Odkryliśmy, że kultury o niskiej gęstości mają lepszą wydajność transfekcji z protokołem fosforanu wapnia przed DIV12, ale mogą być transfekowane ze znacznie niższą wydajnością przy DIV21 lub starszych, w którym to czasie widoczne są kolce dendrytyczne. Wykonalność transfekcji hodowanego neuronu o niskiej gęstości ilustruje transfekcja neuronów plazmidem pEGFP-C3 (patrz poniżej).
<ol>
	<li>W DIV21 usunąć 600 μl kondycjonowanej pożywki z każdej studzienki kokultury i przenieść ją na nową 24-dołkową płytkę. Następnie dodaj 600 μl świeżej pożywki paszowej do kokultury, aby przywrócić jej pierwotną objętość.
	<ol>
		<li>Przenieść szkiełka nakrywkowe do nowej 24-dołkowej płytki z kondycjonowanym 600 μl pożywki. Upewnij się, że neurony o niskiej gęstości są skierowane do góry. Umieść płytki o dużej gęstości i nowe płytki z szkiełkami nakrywkowymi z powrotem w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj dwie sterylne probówki o pojemności 1,5 ml. W jednej probówce dodaj 600 μl 2X buforowanego roztworu soli fizjologicznej (HBS) HEPES. Obliczyć objętość 12 μg DNA pEGFP-C3 na podstawie stężenia plazmidu. Do drugiej probówki dodać 74 μl CaCl2 (2 M zapasu) i objętość wody, która po dodaniu plazmidu wyniesie 600 μl. Dobrze wymieszaj przez pipetowanie, a następnie dodaj plazmidowe DNA. Powoli dobrze wymieszaj. Pozostaw obie rurki na 5 minut w temperaturze RT.</li>
	<li>Trzymając w ręku probówkę 2X HBS i umiarkowanie mieszając roztwór na mieszalniku, dodaj całość 600 μl roztworu DNA-CaCl2 kropla po kropli do probówki 2X HBS o pojemności 600 μl. Bardzo ważne jest, aby powstały osad miał postać "drobnych granulek piasku". Zbyt mocne i zbyt szybkie mieszanie nie jest pożądane, ponieważ z większym prawdopodobieństwem spowoduje powstanie dużych osadów przypominających płatki śniegu, co ma znacznie niższą wydajność transfekcji w oparciu o nasze obserwacje.</li>
	<li>Pozwól osadowi nadal tworzyć się w ciemności przy temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Dodaj 100 μl osadu do każdej studzienki, która zawiera neuron o niskiej gęstości na szkiełkach nakrywkowych, kropla po kropli i równomiernie. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze i inkubować przez 2 godziny. Zakładając, że większość CaCl2 jest w postaci wolnej, daje to stężenie ~17,6 mM Ca2+, które może być toksyczne dla neuronów po długotrwałej inkubacji.</li>
	<li>Przygotować stożkową probówkę o pojemności 50 ml z ~50 ml pożywki do mycia, podgrzać do 37 °C.</li>
	<li>Pod koniec 2 godzin przynieś neuron o niskiej gęstości z osadami DNA-fosforan wapnia do kaptura. Podnieś każde szkiełko nakrywkowe za pomocą ostrej pęsety #5 i zanurz je trzy razy w 50 ml medium do mycia, aby krótko je umyć. Następnie zwróć go do neuronów o wysokiej gęstości na oryginalnych płytkach kokulturowych, z neuronami o niskiej gęstości skierowanymi w dół.</li>
	<li>Kontynuuj hodowlę, aż neurony hodowlane o niskiej gęstości na szkiełkach nakrywkowych zostaną pobrane do badań.</li>
</ol>

<ol><li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Cultureing+Nerve+Cells%22">Cultureing Nerve Cells</a>. , 2nd edition, 339-370 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+microtubule-based+transport+of+dendritic+membrane+proteins+arises+in+concert+with+axon+specification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification.</a> J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Shi, Y., Ethell, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+control+dendritic+spine+plasticity+in+hippocampal+neurons+through+NMDA+receptor+and+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II-mediated+actin+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization.</a> J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures%3A+a+methodological+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8, e83899(2013).</li>
<li>Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP-dependent+protein+kinase+mediates+activity-regulated+synaptic+targeting+of+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors.</a> J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).</li>
<li>Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+induces+synaptic+delivery+of+hnRNP+A2%2FB1+by+a+BDNF-dependent+mechanism+in+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons.</a> PLoS One. 9, e108175(2014).</li>
<li>Clarke, L. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+astrocytes+in+neural+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of astrocytes in neural circuit development.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).</li>
<li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+rat+hippocampal+neurons+at+low+density+in+serum-free+medium%3A+combination+of+the+sandwich+culture+technique+with+the+three-dimensional+nanofibrous+hydrogel+PuraMatrix%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS One. 9, e102703(2014).</li>
<li>Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cellular+peptidomics+of+supraoptic+magnocellular+and+hippocampal+neurons+in+low-density+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures.</a> ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).</li>
<li>Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+dendrite+development+in+hippocampal+neurons+by+binding+to+p75NTR+and+modulating+the+cellular+targets+of+Notch%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch.</a> Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).</li>
<li>Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+culturing+primary+fetal+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 803930(2012).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Qiu, S., Weeber, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+signaling+facilitates+maturation+of+CA1+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses.</a> J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).</li>
<li>Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET+receptor+tyrosine+kinase+controls+dendritic+complexity%2C+spine+morphogenesis%2C+and+glutamatergic+synapse+maturation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus.</a> J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiamy szczegółowy protokół długotrwałej hodowli neuronów glutaminergalnych w hipokampie o ultraniskiej gęstości w warunkach wolnych od surowicy. Przy ~ 2000 neuronów / cm2 gęstość jest co najmniej dwukrotnie niższa niż w przypadku większości preparatów hodowlanych o "niskiej gęstości" z lub bez wsparcia gleju zgłoszonego w istniejącej literaturze2,3,11,13,14. Oprócz tego, że ma bardzo niską gęstość, protokół ten jest nowatorski i istotny pod dwoma innymi względami. Po pierwsze, nie jest potr...

Hodowla neuronów hipokampa w warunkach in vitro umożliwia obserwację i eksperymentalne manipulowanie tymi neuronami, które w inny sposób nie są możliwe in vivo. To eksperymentalne podejście jest szeroko stosowane w celu ujawnienia neuronalnych mechanizmów wzrostu, polaryzacji, specyfikacji neurytów, transportu i subkomórkowej lokalizacji białek, tworzenia synaps i dojrzewania funkcjonalnego1. Te neurony hipokampa hodowane in vitro, po pobraniu z późnych stadiów embrionalnych, są stosunkowo czystymi (>90%) komórkami glutaminergicznymi o morfologii piramidalnej2. Ponieważ neurony hodowano na powierzchni 2D w warunkach in vitro, metoda ta umożliwia łatwą obserwację, taką jak obrazowanie na żywo lub barwienie immunocytochemiczne (ICC) przez pojedynczą płaszczyznę ogniskową3; lub manipulacje, takie jak leczenie farmakologiczne i transfekcje3-6. Neurony hodowane w dużej gęstości mają zwykle wysokie wskaźniki przeżycia ze względu na wyższe stężenia wydzielanych czynników wzrostu oprócz wsparcia pokarmowego ze strony pożywki wzrostowej, a także ze względu na mechanizmy zależne od kontaktu neurytów7. Jednak neurony hipokampa o niskiej gęstości są pożądane w badaniach morfologicznych, w których pojedynczy neuron może być zobrazowany w całości lub wybarwiony do analizy ICC. Neurony o niskiej gęstości są trudne do utrzymania w hodowli ze względu na brak podparcia parakrynnego, a zatem często wymagają wsparcia troficznego z warstwy zasilającej glejowe (zwykle astrocyty korowe), która musi być przygotowana przed hodowlą neuronów2. Podczas jednoczesnej hodowli z warstwą zasilającą komórki glejowe, neurony o niskiej gęstości są hodowane na szkiełkach nakrywkowych, a następnie odwracane na warstwę gleju tak, że neurony o niskiej gęstości i glej są zwrócone do siebie. Niewielka ograniczona przestrzeń między glejem a neuronami jest tworzona przez umieszczenie kropek wosku parafinowego na rogach szkiełek nakrywkowych, tworząc w ten sposób układ "kanapkowy"2,8,9. Neurony o niskiej gęstości będą rosły w ograniczonej przestrzeni między glejem a szkiełkiem nakrywkowym, co tworzy permisywne mikrośrodowisko ze skoncentrowanymi czynnikami wydzielanymi przez neurony i glej. Takie podejście pozwala uzyskać w pełni rozwinięte neurony o niskiej gęstości, które są rozsądnie oddalone od siebie, co ułatwia znakowanie ICC lub badania obrazowania na żywo.
Oczywistą wadą koterapii neuronów i glejów, oprócz tego, że jest czasochłonna i pracochłonna, jest to, że uniemożliwia ona badanie mechanizmów specyficznych dla neuronów lub autonomicznych komórek. Chociaż system ten jest znacznie mniej złożony niż tkanka nerwowa in vivo, wpływ gleju na rozwój neuronów poprzez wydzielane, jeszcze nie w pełni zdefiniowane czynniki może zakłócić eksperymenty10. Dlatego w eksperymentach, które wymagają zbadania mechanizmów specyficznych dla neuronów, konieczne są określone warunki hodowli, które usuwają surowicę i warstwę nośną gleju. Poprzednie badanie zakończyło się sukcesem w hodowli niskich stężeń neuronów (~9 000 komórek/cm2) przy użyciu trójwymiarowej matrycy hydrożelowej11. Ponieważ stosunkowo czysta populacja neuronów może być hodowana w dużej gęstości w warunkach wolnych od surowicy bez wsparcia glejowego, stawiamy hipotezę, że ultra-niska gęstość neuronów hipokampa może być hodowana w pożywce hodowlanej wolnej od surowicy poprzez kokulturę z neuronami o dużej gęstości, w sposób analogiczny do konwencjonalnie przyjętej kokultury neuron-glej. Rzeczywiście, hodowle neuronów hipokampa o dużej gęstości w konfiguracji "kanapkowej" zostały ostatnio wykorzystane do wspierania niewielkiej liczby wyspecjalizowanych magnokomórkowych neuronów endokrynnych12.
Dlatego też współkultura z neuronami o dużej gęstości może pozwolić neuronom o niskiej gęstości na otrzymywanie wsparcia czynników troficznych, które jest wystarczające do umożliwienia długoterminowego przetrwania. W ten sposób sformułowano i zatwierdzono ten protokół hodowli neuronów o bardzo niskiej gęstości. Protokół można wdrożyć w ramach jednego eksperymentu, najpierw przygotowując zdysocjowane neurony hipokampa o dużej gęstości (~250 000 komórek/ml), a następnie rozcieńczając w celu uzyskania gęstości ~10 000 neuronów/ml (~3000 neuronów/szkiełko nakrywkowe lub ~2000 neuronów/cm2), która jest znacznie niższa niż w większości zgłoszonych kultur o niskiej gęstości2,3,9,11,13. Ten warunek hodowli jest luźno określany jako kultura "o bardzo niskiej gęstości" i używany zamiennie z "niską gęstością". Neurony o dużej gęstości są posiane na 24-dołkowych płytkach pokrytych poli-D-lizyną; podczas gdy neurony o niskiej gęstości są wysiewane na 12-milimetrowych szklanych szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną, które umieszcza się w innej 24-dołkowej płytce. Szkiełka nakrywkowe z przylegającymi neuronami o niskiej gęstości są odwracane na neurony o dużej gęstości 2 godziny później po zejściu neuronów i przymocowaniu do szkiełek nakrywkowych. Ponadto, zamiast używać kropek wosku parafinowego do podniesienia szkiełek nakrywkowych ponad warstwę neuronów o dużej gęstości, użyto igły strzykawkowej o strzykawce 18 G do wytrawienia dna 24-dołkowych płytek za pomocą dwóch równoległych pasków. Powstałe w ten sposób przemieszczone, przylegające do siebie tworzywa sztuczne stanowią podwyższone podparcie dla szklanych szkiełek nakrywkowych. Przestrzeń ta jest konsekwentnie mierzona na poziomie 150-200 μm, co pozwala na wystarczającą wymianę tlenu i pożywki hodowlanej, zapewniając jednocześnie mikrośrodowisko ze skoncentrowanymi czynnikami troficznymi. W tych warunkach neurony o niskiej gęstości rosną intensywnie i mogą przetrwać w hodowli dłużej niż trzy miesiące. Kiedy te neurony są transfekowane plazmidem GFP po trzech tygodniach hodowli, dendryty są obficie nabijane kolcami dendrytycznymi. Jako dowód zasadniczy przedstawiono dane pokazujące, że ten system kokultur obsługuje kultury neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości osadzonych na "mikrowyspach" poli-D-lizyny, gdzie neurony tworzą połączenia autaptyczne, które mogą ułatwić badanie autonomicznych komórkowych, niezależnych od sieci mechanizmów.

<table><tbody><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>porcja, przechowywać w rozmiarze 0,6 ml</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>rozcieńczony 100X&nbsp;</td></tr><tr><td>antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (AA)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-096</td><td>rozcieńczony 100X&nbsp;</td></tr><tr><td>Kompletna pożywka</td><td></td><td></td> hodowlana <td>Pożywka neurobazalna z 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td> myjąca <td>taka sama jak "Pożywka neuropodstawowa"</td></tr> <tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td><td>Neurobazalna z 1X suplementem B27</td></tr><tr><td>DNAza I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>przygotuj 100X zapas w 0,6 mg / ml</td></tr><tr><td>poli-D-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>MW. 70000-150000</td></tr><tr><td>bufor boranowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768 (kwas borowy); 71997 (boraks)</td> <td>1,24 g kwasu borowego i 1,9 g boraksu w 400 ml H2O, pH do 8,5 użyj</td></tr><tr><td>szkiełek nakrywkowych HCl 12 mm okrągłych</td><td>Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH</td><td>1001/12</td><td>Szkło nr 1, zakup od Carolina Biological Supply</td></tr><tr><td>zestaw do transfekcji Promega</td><td></td><td>E1200</td><td>szczegóły w protokole</td></tr><tr><td>2X Sól fizjologiczna buforowana HEPES (HBS)</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td>zobacz&nbsp; protokół w celu uzyskania szczegółowych informacji</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td>Wielkość porów 0,2um</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania endofree plasmidu</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>do przygotowania plazmidu DNA anty-MAP2 klasy transfekcyjnej</td></tr><tr><td></td><td>Przeciwciało myszy Millipore</td><td>MAB3418</td>, klon przeciwciała <td></td></tr><tr><td>anty-p-Tau</td> AP20Przeciwciało <td>poliklonalne</td> <td>Millipore</td><td>AB10417</td> królika</tr><tr><td>Przeciwciało anty-NR1 Przeciwciało</td> myszy <td>Millipore</td><td>MAB1586</td><td>, klon Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-GluR1</td> R1JHL <td>Przeciwciało poliklonalne królika</td><td>Millipore</td><td>AB1504</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td>rozmiar 500ml</td></tr></tbody></table>

uproszczona metoda długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Hodowla pierwotnych neuronów hipokampa in vitro ułatwia mechanistyczne badanie wielu aspektów rozwoju neuronów. Zdysocjowane embrionalne neurony hipokampa mogą często z powodzeniem rosnąć na szklanych szkiełkach nakrywkowych o dużej gęstości w warunkach wolnych od surowicy, ale kultury o niskiej gęstości zazwyczaj wymagają dostarczania czynników troficznych poprzez kokulturę ich z warstwą zasilającą glej, której przygotowanie może być czasochłonne i pracochłonne. Ponadto obecność gleju może zakłócić interpretację wyników i wykluczyć badania nad mechanizmami specyficznymi dla neuronów. W tym miejscu przedstawiono uproszczoną metodę dla długoterminowej (~2000 neuronów/cm 2) pierwotnej hodowli neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości >(~2000 neuronów/cm2), która odbywa się w warunkach wolnych od surowicy i bez wsparcia komórek glejowych. Neurony o niskiej gęstości są hodowane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną i przenoszone na neurony o dużej gęstości hodowane na 24-dołkowej płytce. Zamiast używać kropek parafinowych do tworzenia przestrzeni między dwiema warstwami neuronów, eksperymentatorzy mogą po prostu wytrawić plastikowe dno studzienki, na którym znajdują się neurony o dużej gęstości, aby stworzyć mikroprzestrzeń sprzyjającą wzrostowi neuronów o niskiej gęstości. Kokultura może być łatwo utrzymana przez >3 miesiące bez znaczącej utraty neuronów o niskiej gęstości, ułatwiając w ten sposób morfologiczne i fizjologiczne badanie tych neuronów. Aby zilustrować ten udany warunek hodowli, przedstawiono dane wskazujące na obfite tworzenie synaps w komórkach o niskiej gęstości po długotrwałej hodowli. Ten system kokultur ułatwia również przetrwanie nielicznych pojedynczych neuronów hodowanych w wyspach substratów poli-D-lizyny, a tym samym tworzenie połączeń autaptycznych.

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu umożliwia skuteczną, długoterminową hodowlę czystych neuronów glutaminergicznych o ultraniskiej gęstości, bez konieczności stosowania komórek glejowych jako warstwy zasilającej. Protokół przedstawiono schematycznie na Rysunku 1; obejmuje on oddzielne przygotowanie neuronów o wysokiej gęstości (w 24-dołkowych płytkach pokrytych poli-D-lizyną) oraz neuronów o niskiej gęstości (na szklanych szkiełkach podstawowych pokrytych poli-D-li...

Kultury o niskiej gęstości pierwotnych neuronów hipokampa zazwyczaj wymagają warstwy zasilającej glej, aby dostarczyć czynników neurotroficznych i utrzymać długowieczność. Opisujemy tutaj uproszczoną metodę hodowli neuronów o ultra niskiej gęstości na szklanych szkiełkach nakrywkowych w obecności warstwy zasilającej neurony o dużej gęstości, co ułatwia badanie specyficznych mechanizmów neuronalno-autonomicznych.

Uproszczona metoda długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ustanowienie zdrowych, długoterminowych kultur pierwotnych neuronów hipokampa myszy o ultraniskiej gęstości, aby ułatwić znakowanie immunocytochemiczne oraz badanie autonomicznych mechanizmów komórkowych neuronów. Badanie to może pomóc w wyjaśnieniu kluczowych kwestii w dziedzinie neuronauki, takich jak badania nad specyficznością białek w neuromorfologii lub funkcjach rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona neuronom rosnąć przy ultraniskiej gęstości na szkiełku nakrywowym bez wsparcia warstwy pokarmowej gleju.Procedurę zaprezentuje Mariel Piechowicz, studentka z mojego laboratorium. Przygotuj dwie płytki 24-dołkowe o wysokiej gęstości oraz dwie płytki 24-dołkowe o niskiej gęstości. Używając igły o rozmiarze 28 G, wykonaj nacięcia na dnie płytek 24-dołkowych, tak aby odkształcony plastik służył jako podparcie dla szkiełek podstawowych, na których rosną neurony o niskiej gęstości.Przenieś sterylne szklane szkiełka nakładkowe do dwóch płytek 24-dołkowych przeznaczonych dla kultur o niskiej gęstości. Pokryj wszystkie cztery płytki 300 µL Poly-D-lysine w stężeniu 0,1 mg/mL rozpuszczonym w buforze boratowym i umieść je w inkubatorze w celu inkubacji przez noc. Przed pobraniem tkanek przygotuj dwie 10 cm szalki Petriego wypełnione lodowatym sterylnym HBSS.Pod mikroskopem przytrzymaj embrion za kark za pomocą pęsety i wykonaj pierwsze cięcie dokładnie w linii środkowej, poniżej poziomu móżdżku. Następnie wykonaj cięcie po lewej stronie podstawy czaszki. W kolejnym kroku wykonaj kolejne cięcie po prawej stronie podstawy czaszki.Pozostaw niewielką część kości czaszki i tkanki skórnej na końcu rostralnym nieprzeciętą, aby cały mózg można było łatwo odsunąć w bok w celu jego wyjęcia. Następnie przenieś mózg do roztworu HBSS. Sprawdź, czy mózg jest nieuszkodzony i czy nie posiada widocznych ubytków.Następnie powtórz procedury, aby zebrać pozostałe mózgi zarodków do nowej szalki Petriego zawierającej 20 mililitrów zimnego buforu HBSS. Ułóż każdy mózg stroną brzuszna do góry. Przytrzymując mózg pęsetą za koniec guzowy, wykonaj cięcie ukośne pomiędzy środkowym punktem rostralnym a guzowym obszarem skroniowym za pomocą ostrej pęsety.Powtórz tę czynność dla drugiej półkuli. Następnie oddziel obie półkule z nienaruszonym hipokampem od pozostałych tkanek pnia mózgu. Powtórz procedury dla wszystkich mózgów i połącz wszystkie wypreparowane półkule w jednej grupie.Następnie usuń opony mózgowe za pomocą dwóch par pęset. Zidentyfikuj rozwijający się hipokamp jako zakrzywioną strukturę złożoną wewnątrz płata skroniowego i oddziel go od przyległych tkanek korowych. Zbierz i połącz wszystkie tkanki hipokampów.W tej procedurze należy przenieść wszystkie wypreparowane hipokampy do roztworu trawienia enzymatycznego w 15 mililitrowej probówce stożkowej. Następnie umieść probówkę w kąpieli wodnej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 25 minut. Po 25 minutach ostrożnie usuń roztwór enzymu.Następnie dodaj pięć mililitrów ciepłego medium piorącego, aby uzyskać całkowitą objętość 10 mililitrów. Delikatnie przemyj tkankę, powoli odwracając probówkę pięć razy. Usuń medium piorące i ponownie dodaj 10 mililitrów medium piorącego, aby przeprowadzić dodatkowe płukanie.Następnie usunąć medium płuczące i ponownie dodać trzy mililitry świeżego, ciepłego medium płuczącego. Energicznie potrząsnąć probówką ręcznie 15 razy, aby odseparować strawione neurony od tkanki. Medium powinno stać się mętne po oddzieleniu komórek od tkanki do medium płuczącego.Następnie zebrać zawiesinę komórkową do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml, pozostawiając resztki tkanki w probówce. Po tym dodać kolejne dwa mililitry medium piorącego do tkanki i delikatnie rozdzielić pozostałą tkankę, triturując ją plastikową pipetą 15 razy. Pozostawić zawiesinę komórkową na pięć minut, a następnie połączyć ją w nowej probówce stożkowej o pojemności 15 ml, w której znajdują się wcześniej zebrane komórki z odwirowania.Następnie zmierz gęstość neuronów za pomocą hemocytometru. Oblicz objętość zawiesiny komórkowej niezbędną do uzyskania gęstości 250 000 neuronów na mililitr i dodaj ją do jednej z dwóch probówek stożkowych zawierających 30 mililitrów pełnej pożywki hodowlanej, aby przygotować pożywkę do wysiewu neuronów o wysokiej gęstości. Przenieś 1,2 mililitra tego roztworu neuronów o wysokiej gęstości do kolejnych 30 mililitrów pełnej pożywki hodowlanej, aby uzyskać stężenie 10 000 neuronów na mililitr, i użyj tego roztworu do wysiewu na szkiełka podstawowe o niskiej gęstości.W tej procedurze umieść w komorze kultur płytki 24-dołkowe z trawionym dnem do neuronów o wysokiej gęstości. Usuń 300 µL wcześniej przygotowanego pożywki za pomocą próżni, a następnie wysiej 0,6 mL zawiesiny komórek o wysokiej gęstości w stężeniu 250 000 neuronów na mL. Umieść dwie pozostałe płytki 24-dołkowe z szkiełkami nakrywkowymi w komorze kultur.Usuń 300 µL uprzednio przygotowanego medium za pomocą próżni, a następnie nanieś na szkiełka przedmiotowe 0,6 ml zawiesiny komórek o niskiej gęstości w stężeniu 10 000 neuronów na ml. Następnie wprowadź wszystkie cztery płytki 24-dołkowe z powrotem do inkubatora i inkubuj przez dwie godziny. Po tym czasie odwróć szkiełka przedmiotowe o niskiej gęstości z przytwierdzonymi neuronami w stronę hodowli o wysokiej gęstości, upewniając się, że neurony są skierowane ku sobie.Następnie zwróć dwie płytki z kokulturą do inkubatora. Dokarm kokultury, dodając 300 µL świeżego medium pożywczego w piątym dniu in vitro (DIV five). Po tym pierwszym dokarmieniu dodawaj 300 µL świeżego medium pożywczego bez cytosyny arabinozydu do każdej studni raz w tygodniu.Jeśli hodowla ma być utrzymywana przez ponad miesiąc, co tydzień po upływie pierwszego miesiąca należy wymienić połowę pożywki na świeżą pożywkę do zasilania. Pod względem morfologicznym zarówno neurony o wysokiej, jak i niskiej gęstości powinny wyglądać zdrowo przez okres do trzech miesięcy. W tym przypadku zastosowano barwienie immunocytochemiczne w celu ujawnienia funkcjonalnych synaps glutaminergicznych, w których podjednostka receptora NMDA NR1 oraz podjednostka receptora ApoE GluR1 zostały oznakowane za pomocą podwójnego barwienia.Funkcjonalne synapsy można łatwo zidentyfikować i skwantyfikować przy użyciu programu ImageJ. Neurony o niskiej gęstości są również znakowane przeciwciałem przeciwko markerowi białka dendrytycznego MAP2 w połączeniu z markerem białka aksonalnego p-Tau. Takie podwójne znakowanie pozwala na wyraźne rozróżnienie dendrytów i aksonów. Kultury o niskiej gęstości mogą być również z sukcesem transfekowane plazmidami DNA metodą fosforanu wapnia, choć stopień transfekcji jest zazwyczaj bardzo niski w późniejszych etapach.Rysunek ten obrazuje, że transfekcja EGFP pozwala na ujawnienie morfologii neuronalnej oraz uwidocznienie drobnych struktur kolców dendrytycznych. Na koniec, jako dowód koncepcji, neurony o ultra-niskiej gęstości mogą być hodowane w warunkach sprzyjających tworzeniu autapsów. Takie autaptyczne neurony o ultra-niskiej gęstości, hodowane na mikro-wysepkach pokrytych poli-D-lizyną, mogą być utrzymywane przy wsparciu neuronów dokarmiających o wysokiej gęstości przez ponad dwa miesiące dzięki zastosowaniu tego protokołu kokultury.Po opanowaniu techniki, w przypadku prawidłowego wykonania, procedura ta zajmuje od dwóch do trzech godzin w dniu hodowli komórkowej. Podczas przeprowadzania tej procedury kluczowe jest pokrycie szkiełek podstawkowych oraz dna płytek 24-dołkowych poli-D-lizyną. Proste trawienie dna płytek jest wystarczające, aby zapewnić wsparcie mechaniczne i odżywcze neuronom hipokampa o niskiej gęstości rosnącym na szkiełkach podstawkowych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat hodowli pierwotnych neuronów hipokampa embrionalnego myszy o ultra-niskiej gęstości, bez zastosowania warstwy wspierającej z gleju. Mamy nadzieję, że będą Państwo mogli wykorzystać tę metodę we własnych celach eksperymentalnych.

a-simplified-method-for-ultra-low-density-long-term-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wyizolowanie i hodowla komórek z konkretnego obszaru mózgu ułatwia badanie parametrów komórkowych i fizjologicznych. Opisujemy metodę pierwotnej hodowli komórek, która pozwala na uzyskanie kultur wzbogaconych w neurony w środowisku bezsurowiczym.

Hodowla pierwotna neuronów hipokampa z noworodków szczurów w dniu P0

Niniejszy protokół opisuje etapy niezbędne do wyizolowania, transfekcji metodą elektroporacji oraz hodowli neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Hodowle krótkoterminowe mogą być wykorzystywane do badań nad wzrostem i prowadzeniem aksonów, natomiast hodowle długoterminowe mogą służyć do badań nad synaptogenezą i analizy kolców dendrytycznych.

Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

Opisujemy protokół umożliwiający obrazowanie mitochondriów w żywych neuronach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez dłuższy czas. Obrazowanie w wydłużonych przedziałach czasowych osiągnięto dzięki ekspresji białka fluorescencyjnego skierowanego do mitochondriów za pomocą lentiwirusa oraz zastosowaniu niedrogiego inkubatora nakładanego na stolik mikroskopu, który został zaprojektowany i zbudowany w naszym laboratorium.

Neuromodulacja i transport mitochondriów: obrazowanie żywych neuronów hipokampa w długich odstępach czasu

Przedstawiamy protokół hodowli wysoko oczyszczonych neuronów hipokampa z prenatalnych mózgów myszy bez użycia warstwy komórek glejowych jako komórek zasilających.

Izolacja i hodowla neuronów hipokampa z myszy prenatalnych

Film demonstruje metodę hodowli neuronów z mysich hipokampów. Początkowo hipokampy przechodzą trawienie enzymatyczne w celu rozbicia zewnątrzkomórkowej macierzy tkankowej. Następnie strawiona tkanka jest mechanicznie rozrywana w celu wyizolowania pojedynczych neuronów. Wreszcie, neurony te są hodowane na komórkach glejowych.

Technika hodowli neuronów hipokampa myszy

Ten film demonstruje metodę hodowli kriokonserwowanych neuronów embrionalnych, obejmującą kontrolowane rozmrażanie, rozcieńczanie pożywką neurobazalną i wysiewanie na płytkę pokrytą poli-L-lizyną. Późniejsza inkubacja wspomaga wzrost i utrzymanie połączeń neuronalnych.

Generowanie hodowli neuronów pierwotnych o niskiej gęstości z zamrożonych neuronów embrionalnych

Ten film demonstruje metodę hodowli neuronów o ultra niskiej gęstości w obecności warstwy zasilającej neurony o dużej gęstości. Ustanawia wspólną kulturę neuronów o różnej gęstości, zapewniając bliską bliskość fizyczną. Czynniki wzrostu wydzielane przez neurony o dużej gęstości pomagają w przetrwaniu i wzroście neuronów, utrzymując neurony o ultraniskiej gęstości przez dłuższy czas.

Generowanie kultury neuronalnej o ultraniskiej gęstości przy użyciu warstwy zasilającej neurony o dużej gęstości

Ten film demonstruje dysocjację i kulturę neuronów hipokampa z próbek tkanek hipokampa za pomocą dysocjacji enzymatycznych i mechanicznych. Leczenie Ara-C hamuje wzrost komórek nieneuronalnych, ułatwiając selektywny wzrost neuronów hipokampa.

Dysocjacja i hodowla neuronów z próbek tkanki hipokampa

Ten artykuł opisuje protokół hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o niskiej gęstości rosnących na szklanych szkiełkach nakrywkowych odwróconych na monowarstwie glejowej. Warstwy neuronów i glejowe są oddzielone kulkami wosku parafinowego. Neurony wyhodowane tą metodą nadają się do obrazowania optycznego o wysokiej rozdzielczości i testów funkcjonalnych.

Pierwotna hodowla neuronów hipokampa o niskiej gęstości

Ten protokół pokazuje, jak wykorzystać mikroskopię superrozdzielczą do badania kolokalizacji białek w pierwotnych kulturach neuronalnych.

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Gotowy do użycia zamrożony zasób neuronów jest potężnym narzędziem do oceny funkcji synaptycznych. Tutaj wprowadzamy łatwą hodowlę pierwotną o niskiej gęstości z zamrożonego wywaru przy użyciu 96-dołkowej płytki.

Łatwa i powtarzalna hodowla pierwotna o niskiej gęstości przy użyciu zamrożonego materiału embrionalnych neuronów hipokampa

Poznaj uproszczoną metodę długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa myszy przy bardzo niskiej gęstości bez warstwy glejowej. Technika umożliwia badanie mechanizmów autonomicznych neuronów.

Uproszczona metoda długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości

Przeglądaj więcej filmów