Name: Technika celowania w mikrowstrzyknięcie do rozwijającej się nerki Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Naucz się techniki mikrowstrzyknięć do rozwijających się nerek Xenopus laevis. Ta metoda pozwala precyzyjnie dostarczać substancje do docelowych blastomerów, badając geny kluczowe dla organogenezy nerek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health NIDDK (K01DK092320) oraz fundusze na rozpoczęcie działalności przez Wydział Pediatrii Uniwersytetu Teksańskiego McGovern Medical School.

Poniższy protokół został zatwierdzony przez Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w Houston's Center for Laboratory Animal Medicine Animal Welfare Committee, który służy jako Komitet ds. Opieki Instytucjonalnej i Użytkowania (protokół #: HSC-AWC-13-135).
1. Identyfikacja i wybór blastomerów do iniekcji ukierunkowanych na nerki 
<ol>
	<li>Przed wygenerowaniem zarodków należy skorzystać z Tabeli Normalnej Rozwoju Xenopus 21, aby zrozumieć orientację wczesnych podziałów komórkowych w zarodku. Alternatywnie, uzyskaj dostęp do diagramów wczesnych etapów rozwoju Xenopus na Xenbase 11.</li>
	<li>Uzyskaj dostęp do interaktywnych map losu komórek Xenopus w Xenbase11, aby wybrać, który blastomer będzie przeznaczony do mikroiniekcji.</li>
	<li>Zauważ, że zarodek jednokomórkowy ma ciemno zabarwiony biegun zwierzęcy i biegun roślinny, który jest biały i żółtkowy. Należy pamiętać, że błona ochronna, znana jako otoczka witelinowa, pokrywa zarodek.</li>
	<li>Zauważ, że pierwsze rozszczepienie zwykle występuje między lewą i prawą stroną zarodka. Komórki te w równym stopniu przyczyniają się do linii pronefryjskiej.</li>
	<li>Zauważ, że drugie rozszczepienie dzieli grzbietową i brzuszną połowę zarodka, prowadząc do 4-komórkowego zarodka. Komórki grzbietowe są mniejsze i mają mniej pigmentu niż komórki brzuszne (ryc. 2A i ryc. 3A).
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj blastomery brzuszne (V; duże, ciemne komórki) po lewej i prawej stronie, które bardziej przyczyniają się do rozwoju nerki niż blastomery grzbietowe (D; małe, jasne komórki) (ryc. 2A).</li>
		<li>W przypadku wstrzykiwania do 4-komórkowego zarodka, wstrzyknij lewy blastomer brzuszny, aby celować w lewą nerkę (ryc. 3A i sekcja 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzecie rozszczepienie przecina na pół stronę zwierzęcą i roślinną, w wyniku czego powstaje ośmiokomórkowy zarodek. W tym momencie znajdują się cztery blastomery zwierzęce [lewy i prawy brzuszny (V1) i grzbietowy (D1)] oraz cztery blastomery roślinne [lewy i prawy brzuszny (V2) i grzbietowy (D2)] (ryc. 2B i ryc. 3B).
	<ol>
		<li>Zlokalizuj brzuszne, roślinne blastomery (V2). Te blastomery bardziej przyczyniają się do rozwoju nerki niż inne komórki na tym etapie (ryc. 2B). Aby celować w lewą nerkę 8-komórkowego zarodka, wstrzyknąć do lewego blastomeru V2 (Figura 3B i sekcja 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zauważ, że czwarte i piąte rozszczepienie przecinają blastomery zwierzęce i roślinne. Z każdego blastomeru generowane jest dwoje potomstwa, w wyniku czego powstaje 16-komórkowy zarodek. Komórki noszą nazwy swoich poprzedników. Na przykład blastomer V2 z etapu 8-komórkowego daje początek potomstwu V2.1 i V2.2 na etapie 16-komórkowym (Figura 2C). Komórka V2.2 w stadium 16-komórkowym zapewnia większość komórek przyczyniających się do rozwoju nerki.</li>
	<li>Zauważ, że szóste i siódme rozszczepienie dają 32-komórkowy zarodek. Ponownie, z każdego blastomeru generowane jest dwa potomstwo, które nosi nazwę pochodzącą od swojego poprzednika. Na przykład blastomer V2.2 z etapu 16-komórkowego powoduje powstanie V2.2.1 i V2.2.2 w stadium 32-komórkowym. Istnieje alternatywny system nazewnictwa na etapie 32 komórek, w którym komórki są identyfikowane w czterech rzędach jako A, B, C i D (od zwierzęcych do roślinnych) oraz w czterech kolumnach jako 1, 2, 3 i 4 (od grzbietowej do brzusznej). Tak więc blastomer V2.2.2, który w największym stopniu przyczynia się do rozwoju przednercza, nazywany jest C3 w tym alternatywnym systemie nazewnictwa (ryc. 2D).</li>
</ol>
2. Przygotowanie zarodków
<ol>
	<li>Przygotuj 50 ml roztworu dejelly (2% cysteiny, NaOH do pH 8,0).</li>
	<li>Wyizoluj oba jądra od jednego samca żaby zgodnie ze standardowymi protokołami14. Umieścić jądra na szalce Petriego o średnicy 60 mm wypełnionej 10 ml roztworu do przechowywania jąder (1x zmodyfikowany Dzwonek Marca [MMR; 0,1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 8, 0,1 mM EDTA]12, 1% albumina surowicy bydlęcej, 50 μg/ml gentamycyny). Przechowywać jądra w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Jądra mogą być przechowywane przez około 7 - 10 dni w temperaturze 4 °C, ale skuteczność nawożenia będzie się zmniejszać, im dłużej jądra będą przechowywane.</li>
	<li>Ściśnij samicę żaby, aby uzyskać jaja zgodnie ze standardowymi protokołami14. Zbierz jajka na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Odlej nadmiar wody.</li>
	<li>Odetnij 1/4 jądra, gdy jest w roztworze do przechowywania jąder za pomocą kleszczy i żyletki. Przenieś kawałek jądra na szalkę Petriego zawierającą jaja. Dostosuj wielkość użytej części jądra, aby uwzględnić wielkość jądra, czas przechowywania jądra i liczbę jaj, które mają zostać zapłodnione. Zwykle używa się od 1/4 do 1/3 świeżo wypreparowanego jądra do zapłodnienia jednego lęgu jaj.</li>
	<li>Pokrój część jądra na małe kawałki za pomocą kleszczy i żyletki. Dodać tyle 0,3 x MMR + 30 mg/ml gentamycyny do szalki Petriego, aby przykryć jaja. Zakręć MMR w naczyniu, aby wymieszać.</li>
	<li>Odczekaj około 30 minut, aż nawożenie nastąpi w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że półkula zwierzęca (pigmentowana strona zarodka) usiądzie na zarodku po skutecznym zapłodnieniu. Następnie usunąć MMR z szalki Petriego za pomocą pipety transferowej. Dodaj tyle roztworu Dejelly do naczynia, aby przykryć zarodki.</li>
	<li>Przez następne kilka minut delikatnie obracaj naczynie z przerwami. Energiczne potrząsanie naczyniami w tym czasie może spowodować wady osi.  Galaretowa powłoka na zarodkach rozpuści się, a zarodki zgromadzą się w środku naczynia podczas wirowania. Gdy zarodki ściśle stykają się ze sobą na środku naczynia, usuń roztwór Dejelly za pomocą pipety transferowej. Nie pozostawiaj zarodków w roztworze Dejelly na dłużej niż 5 minut, ponieważ może to spowodować uszkodzenie zarodków.</li>
	<li>Umyj zarodki 3 - 5 razy w 0,3x MMR + 30 mg/ml gentamycyny, ostrożnie wylewając lub pipetując MMR i napełniając naczynie nowym MMR. Nie należy usuwać całej szczepionki MMR z naczynia, ponieważ może to spowodować uszkodzenie zarodków.</li>
	<li>Usunąć wszelkie niezapłodnione jaja lub kawałki jąder z szalki Petriego za pomocą pipety do przenoszenia.</li>
	<li>Inkubować zarodki w temperaturze od 14 do 22 °C. 
	Uwaga: Zarodki hodowane w niższych temperaturach rozwijają się wolniej niż zarodki hodowane w wyższych temperaturach. Czas etapów rozwoju można znaleźć na Xenbase22.
	<ol>
		<li>Aby rozłożyć ich rozwój w czasie, należy umieścić połowę zarodków z pojedynczego zapłodnienia na szalce Petriego przechowywanej w temperaturze 14 °C, a drugą połowę zarodków na szalce Petriego utrzymywanej w temperaturze 18 °C. Pozwala to na wykonanie dwóch zestawów iniekcji do zarodków 4- lub 8-komórkowych z jednego zapłodnienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworów iniekcyjnych i mikroiniekcja zarodków
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do wstrzykiwań zawierający mRNA9 białka czerwonej fluorescencji (MEM-RFP) o stężeniu 0,01 ng/nl, podczas gdy zarodki rozwijają się do stadium 4- lub 8-komórkowego. Roztwór do wstrzykiwań należy przechowywać na lodzie do czasu przygotowania go do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Załaduj 7-calową wymienną szklaną rurkę kapilarną do ściągacza igieł, tak aby górna część wymiennej rurki była wyrównana z górną częścią obudowy ściągacza do igieł. Ustaw wartość ciepła #2 na 800, a wartość ściągania na 650. Naciśnij przycisk "pull", aby wyciągnąć igłę. Spowoduje to utworzenie 2 igieł z pojedynczej 7-calowej szklanej rurki kapilarnej.</li>
	<li>Odetnij końcówkę wyciągniętej igły za pomocą kleszczy Dumont. 
	Uwaga: Po wyciągnięciu igły końcówka jest szczelnie zamknięta i należy ją rozciąć. Im bliżej punktu igły, w którym jest ona cięta, tym mniejsza średnica będzie miała końcówka igły. Chociaż średnica końcówki nie będzie miała wpływu na objętość wstrzyknięcia w przypadku zastosowanego tutaj systemu mikroiniekcji, końcówka o większej średnicy jest bardziej podatna na uszkodzenie zarodka.</li>
	<li>Wsuń tuleję zaciskową mikropipety na tylną część igły. Następnie wsuń O-ring z dużym otworem na tył igły za tuleją zaciskową.</li>
	<li>Napełnij igłę olejem mineralnym za pomocą igły podskórnej o rozmiarze 27, uważając, aby nie dostały się pęcherzyki powietrza do igły.</li>
	<li>Wsunąć igłę na tłok mikrowstrzykiwacza, osadzając igłę w dużym otworze w białym plastikowym przekładce zainstalowanym na tłoku. Tłok powinien mieć mały O-ring znajdujący się najbliżej korpusu mikrowtryskiwacza, a następnie białą przekładkę, O-ring z dużym otworem i tuleję zaciskową. Zabezpiecz igłę, dokręcając tuleję zaciskową. Delikatnie pociągnąć za igłę, aby upewnić się, że jest prawidłowo zabezpieczona.</li>
	<li>Naciśnij i przytrzymaj przycisk "opróżnij" na skrzynce sterowniczej mikrowtryskiwacza, aż usłyszysz dwa sygnały dźwiękowe.</li>
	<li>Odpipetować 3 μl roztworu do wstrzykiwań na kawałek Parafilmu. Włożyć końcówkę igły do kulki roztworu do wstrzykiwań na Parafilm. Naciśnij i przytrzymaj przycisk "napełniania" na skrzynce sterowniczej mikrowstrzykiwacza, aby pobrać roztwór do wstrzykiwań do igły.</li>
	<li>Napełnij szalkę Petriego o średnicy 60 mm wyłożoną siatką poliestrową o grubości 500 mikronów z 5% Ficollu w 0,3x MMR + 30 mg/ml gentamycyny. Ostrożnie pipetować 20 - 30 4- lub 8-komórkowych zarodków do naczynia.</li>
	<li>Za pomocą pętli do włosów14 manipuluj zarodkami tak, aby blastomer do wstrzyknięcia był skierowany w stronę igły. Aby celować w lewą nerkę, ustaw zarodki tak, aby lewe brzuszne blastomery zarodków 4-komórkowych lub lewe blastomery V2 zarodków 8-komórkowych były skierowane w stronę igły.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 nl roztworu do wstrzykiwań do wybranego blastomeru każdego zarodka w naczyniu. 
	Uwaga: Siatka na dnie szalki Petriego stabilizuje zarodki i zapobiega ich zwijaniu się, umożliwiając ich wstrzyknięcie bez użycia pętli włosowej do stabilizacji.</li>
	<li>Przenieść wstrzyknięte zarodki do studzienek płytki hodowlanej, które zostały wypełnione 5% Ficollem w 0,3x MMR + 30 mg/ml gentamycyny. Inkubować wstrzyknięte zarodki w temperaturze 16 °C przez co najmniej jedną godzinę, aby umożliwić zagojenie się wstrzykniętych blastomerów.</li>
	<li>Przenieś zagojone zarodki do studzienek nowej płytki hodowlanej, które zostały wypełnione 0,3x MMR + 30 mg/ml gentamycyny do etapu 9 (przed gastrulacją).</li>
	<li>Inkubować zarodki w temperaturze 14 - 22 °C aż do osiągnięcia przez zarodki stadium 38 - 4021.</li>
</ol>
4. Utrwalanie i barwienie immunologiczne zarodków
<ol>
	<li>Przygotować 50 ml MOPS/EGTA/siarczanu magnezu/buforu formaldehydowego [MEMFA: 100 mM MOPS (pH 7,4), 2 mM EGTA, 1 mMMgSO4, 3,7% (v/v) formaldehydu].</li>
	<li>Za pomocą pipety transferowej umieścić 10 - 20 zarodków w stadium 38 - 40 w szklanej fiolce. Dodać 10 μl 5% benzokainy w 100% etanolu do fiolki i wymieszać fiolkę do wymieszania. Odczekaj 10 minut, aby znieczulić zarodki.</li>
	<li>Wyjąć szczepionkę MMR z fiolki za pomocą szklanej pipety. W przypadku przetwarzania wielu fiolek w tym samym czasie, fiolki można trzymać pionowo na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej.</li>
	<li>Za pomocą szklanej pipety napełnić fiolkę olejem MEMFA. Umieścić fiolkę na trójwymiarowej platformie bujanej na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyjąć MEMFA z fiolki za pomocą szklanej pipety. Napełnij fiolkę 100% metanolem. Umieścić fiolkę na trójwymiarowej platformie bujanej na 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten etap mycia jeszcze raz i przechowuj zarodki w 100% metanolu przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj 1x Albumina Albuminy Trytonowej (PBT) z solą fizjologiczną buforowaną fosforanem w surowicy bydlęcej: 1x PBS, 2 mg / ml białka surowicy bydlęcej, 0,1% Triton X-100.</li>
	<li>Przygotuj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała: 1x PBT z 10% kozią surowicą z rozcieńczeniem 1:5 mysiego przeciwciała monoklonalnego 4A6 (do znakowania błon pośrednich, dystalnych i łączących kanalików20), rozcieńczenie 1:30 mysiego przeciwciała monoklonalnego 3G8 (do znakowania światła kanalików proksymalnych20) i rozcieńczenie 1:250 króliczego poliklonalnego przeciwciała RFP (do znakowania znacznika MEM-RFP). Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj roztwór przeciwciał drugorzędowych: 1x PBT z 10% surowicą kozą, 1:500 Alexa 488 kozia anty-mysia IgG (stężenie podstawowe 2 mg / ml; do oznaczania 4A6 i 3G8) i 1:500 Alexa 555 kozia anty-królicza IgG (stężenie podstawowe 2 mg / ml; do oznaczania znacznika MEM-RFP). Przechowywać w temperaturze 4 °C, przykrywając probówkę folią w celu ochrony przed światłem.</li>
	<li>Alternatywnie, należy zebrać przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe po barwieniu i zachować w temperaturze 4 °C do ponownego wykorzystania w przyszłych eksperymentach. Jeśli przeciwciało ma zostać zachowane do ponownego użycia, należy dodać 0,01% azydku sodu.</li>
	<li>Barwienie immunologiczne zarodków przy użyciu ustalonych protokołów18.</li>
</ol>
5. Wizualizacja zarodków i analiza docelowej tkanki pronefric 
<ol>
	<li>Przeprowadź badania przesiewowe zarodków wybarwionych immunologicznie, aby sprawdzić, czy wstrzyknięto prawidłowy blastomer, oglądając fluorescencję znacznika pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu 1X (aby zobaczyć cały zarodek) i 5X (aby zobaczyć nerkę). Umieść zarodki na szklanej płytce wielodołkowej z dołkami wypełnionymi 1x PBT za pomocą pipety transferowej z odciętą końcówką. Manipuluj zarodkami za pomocą pętli do włosów. Do analizy nadekspresji genów lub knockdownu należy używać wyłącznie zarodków, w których znacznik z wstrzyknięciem jest obecny w przednerczu po lewej stronie zarodka (ryc. 3C, F i ryc. 4C, F).</li>
	<li>Alternatywnie, wyczyść zarodki w Murray's Clear (2 części benzoesanu benzylu: 1 część alkoholu benzylowego), umieszczając zarodki w szklanej fiolce i wypełniając fiolkę Murray's Clear. Wizualizacja zarodków za pomocą szklanej płytki dołka. 
	Uwaga: Murray's Clear jest rozpuszczalnikiem organicznym i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Nosić rękawice i używać wyłącznie szklanych fiolek i pipet z Murray's Clear.</li>
	<li>Przechowuj zarodki w temperaturze 4 °C w 1x PBT przez 2 - 3 tygodnie. W przypadku długotrwałego przechowywania zarodków należy je odwodnić, myjąc je dwukrotnie w 100% metanolu w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przechowywać zarodki w temperaturze -20 °C w 100% metanolu.</li>
</ol>

<ol><li>Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+the+study+of+kidney+development%3A+Use+of+the+pronephros+in+the+analysis+of+organ+induction+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning.</a> Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).</li>
<li>Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+molecular+anatomy+of+the+Xenopus+pronephric+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).</li>
<li>Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+pronephros+as+a+model+system+for+the+study+of+kidney+development+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol.+Dial.+Transplant%22%5BJournal%5D)">The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).</li>
<li>Carroll, T., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li>
<li>Zhou, X., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximo-distal+specialization+of+epithelial+transport+processes+within+the+Xenopus+pronephric+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules.</a> Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).</li>
<li>Raciti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+pronephric+kidney+revealed+by+large-scale+gene+expression+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping.</a> Genome Biol. 9 (5), 84(2008).</li>
<li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+%28Xenopus+laevis%29+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+Berl%22%5BJournal%5D)">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+of+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li>
<li>Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cleavage+stage+origin+of+Spemann%27s+Organizer%3A+Analysis+of+the+movements+of+blastomere+clones+before+and+during+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus.</a> Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).</li>
<li>Karpinka, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).</li>
<li>Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha5beta1+and+fibronectin+regulate+polarized+cell+protrusions+required+for+Xenopus+convergence+and+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension.</a> Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).</li>
<li>Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precocious+expression+of+the+Wilms%27+tumor+gene+xWT1+inhibits+embryonic+kidney+development+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis.</a> Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis.+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+RK+%22Xenopus+Development%22">Xenopus Development</a>. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).</li>
<li>Lienkamp, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+kidney+tubules+elongate+using+a+planar+cell+polarity-dependent+rosette-based+mechanism+of+convergent+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension.</a> Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).</li>
<li>Lyons, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+in+pronephric+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development.</a> Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).</li>
<li>Miller, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronephric+tubulogenesis+requires+Daam1-mediated+planar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).</li>
<li>Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Xenopus+pronephric+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Xenopus pronephric system.</a> Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).</li>
<li>Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+RK+%22Xenopus+Development%22">Xenopus Development</a>. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).</li>
<li>Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+LIM+class+homeobox+gene+Xlim-1+in+pronephros+and+CNS+cell+lineages+of+Xenopus+embryos+is+affected+by+retinoic+acid+and+exogastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation.</a> Development. 120, 1525-1536 (1994).</li>
<li>Weber, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+the+tissue-specific+transcription+factor+HNF1+alpha+%28LFB1%29+during+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development.</a> Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).</li>
<li>Carroll, T. J., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+between+Pax-8+and+lim-1+in+embryonic+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development.</a> Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).</li>
<li>Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+injected+DNA+templates+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos.</a> Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).</li>
<li>Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.+Patterns%22%5BJournal%5D)">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li>
<li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Na%2B%2C+K%2B-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+systematical+%26+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
<li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li>
<li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morph%22%5BJournal%5D)">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Celowanie w przednercze rozwijających się zarodków Xenopus polega na identyfikacji i wstrzyknięciu prawidłowego blastomeru. Wstrzyknięcie blastomeru V2 8-komórkowych zarodków jest ukierunkowane na lewe przednercze18. To pozostawia kontralateralne prawe przednercze jako kontrolę wewnętrzną. Jeśli knockdown morpholino lub nadekspresja RNA jest używana do zmiany rozwoju nerek, przeciwległe prawe przednercze można wykorzystać do porównania skutków knockdownu lub nadekspresji genu na lewym przedpleczu. W t...

Nerka embrionalna Xenopus, przednercze, jest dobrym modelem do badania rozwoju i chorób nerek. Zarodki rozwijają się zewnętrznie, są duże, mogą być produkowane w dużych ilościach i można nimi łatwo manipulować za pomocą mikroiniekcji lub zabiegów chirurgicznych. Ponadto zachowane są geny rządzące rozwojem nerek u ssaków i. Nerki ssaków przechodzą przez trzy etapy: przednercze, śródnercze i śródnercze1, podczas gdy embrionalne mają przednercze, a dorosłe mają śródnercze. Podstawową jednostką filtrującą tych form nerkowych jest nefron, a zarówno ssaki, jak i wymagają tych samych kaskad sygnałowych i zdarzeń indukcyjnych, aby przejść nefrogenezę2, 3. Xenopus pronephros zawiera pojedynczy nefron złożony z kanalików proksymalnych, pośrednich, dystalnych i łączących oraz kłębuszka nerkowego (analogicznego do kłębuszka nerkowego ssaków)1, 4-6 (ryc. 1). Pojedynczy, duży nefron obecny w przednerczu Xenopus sprawia, że nadaje się on jako prosty model do badania genów zaangażowanych w rozwój nerek i procesy chorobowe.
Mapy losu komórek zostały stworzone dla wczesnych zarodków Xenopus i są dostępne za darmo online na Xenbase7-11. W tym miejscu opisujemy technikę mikroiniekcji znaczników linii w celu ukierunkowania na rozwijające się przednercze Xenopus, chociaż tę samą technikę można dostosować do celowania w inne tkanki, takie jak serce lub oczy. Znaczniki linii to znaczniki (w tym barwniki witalne, znakowany fluorescencyjnie dektrans, histochemicznie wykrywalne enzymy i mRNA kodujące białka fluorescencyjne), które można wstrzyknąć do wczesnego blastomeru, umożliwiając wizualizację potomstwa tej komórki podczas rozwoju. Protokół ten wykorzystuje mRNA MEM-RFP, kodujące białko czerwonej fluorescencji12 ukierunkowane na błonę, jako znacznik linii. Opisane tutaj techniki celowanej mikroiniekcji dla pojedynczych blastomerów w zarodkach 4- i 8-komórkowych mogą być wykorzystane do wstrzykiwania morfolinosów w celu obniżenia ekspresji genów lub egzogennego RNA w celu nadekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Poprzez wstrzyknięcie do brzusznego, roślinnego blastomeru, głównym celem będzie przednercze zarodka, pozostawiając przeciwległe przedejcze jako kontrolę rozwojową. Jednoczesne wstrzyknięcie znacznika sprawdza, czy wstrzyknięto właściwy blastomer i pokazuje, które tkanki w zarodku powstały z wstrzykniętego blastomeru, weryfikując celowanie w przednercze. Barwienie immunologiczne przednerczy umożliwia wizualizację, jak dobrze kanaliki pronefriczne zostały namierzone. Efekty nadekspresji i knockdown można następnie ocenić na przeciwległej stronie zarodka, która służy jako kontrola rozwojowa i może być wykorzystana do obliczenia wskaźnika pronerkowego13. Dostępność map losu komórek pozwala na zastosowanie tej ukierunkowanej techniki mikroiniekcji do celowania w tkanki inne niż przednercze, a jednoczesne wstrzyknięcie znacznika fluorescencyjnego pozwala na weryfikację celowanej mikroiniekcji do każdej tkanki przed analizą.
Podczas mikroiniekcji zarodka, temperatura rozwoju powinna być ściśle regulowana, biorąc pod uwagę, że tempo rozwoju Xenopus jest od niego wysoce zależne14. Zarodki powinny być inkubowane w niższych temperaturach (14 - 16 °C) w przypadku wstrzyknięć 4- i 8-komórkowych, ponieważ czas rozwoju jest spowolniony. W temperaturze 22 °C czas rozwoju od etapu 1 (1 komórka) do etapu 3 (4 komórki) wynosi około 2 godzin, podczas gdy w temperaturze 16 °C czas rozwoju do etapu 3 wynosi około 4 godzin. Przejście od zarodka 4-komórkowego do zarodka 8-komórkowego (stadium 4) w temperaturze 22 °C zajmuje około 15 minut, ale w temperaturze 16 °C zajmuje około 30 minut. Podobnie, w temperaturze 22 °C, wystarczy 30 minut, aby 8-komórkowy zarodek rozwinął się w 16-komórkowy zarodek (etap 5). Czas ten wydłuża się do 45 minut w temperaturze 16 °C. Dlatego przydatne jest spowolnienie tempa rozwoju zarodków, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na wstrzyknięcia w stadium 8-komórkowym, zanim zarodki przejdą do stadium 16-komórkowego. Dodatkowo temperatury wzrostu mogą być modulowane w celu przyspieszenia lub spowolnienia rozwoju embrionalnego, aż nerka w pełni się rozwinie.
Naskórek zarodków Xenopus w stadium kijanki jest względnie przezroczysty, co pozwala na łatwe obrazowanie rozwijającego się przednercza bez preparowania lub oczyszczania tkanki15. Ze względu na względną przezroczystość zarodków Xenopus, możliwe jest również obrazowanie żywych komórek16,17. Barwienie immunologiczne w całości w celu uwidocznienia przednerczy jest możliwe dzięki ustalonym przeciwciałom, które znakują kanaliki proksymalne, pośrednie, dystalne i łączące zarodków w stadium 38 - 40, co pozwala na ocenę rozwoju pronercza po ukierunkowanej manipulacji ekspresją genów w zarodkach Xenopus 18-20.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór gentamycyny, 50 mg/ml</td><td>Amresco</td><td>E737-20ML</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina, 99%+</td><td>Acros Organics</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher</td><td>BP525-100 100</td><td></td></tr><tr><td>mm x 15 mm szalka Petriego</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Mini Lodówka II</td><td>Boekel</td><td>260009</td><td>Inkubator stołowy do zarodków.</td></tr><tr>Plazmid <td></td><td></td><td>Gap43-RFP</td><td>Do wytwarzania śladowego RNA. Patrz: Davidson et al., 2006.</td></tr><tr><td>Dekstran rodaminy, 10 000 M.W.</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Tracer.</td></tr><tr><td>Klasa biologii molekularnej, sterylna oczyszczona woda USP</td><td>Corning</td><td>46-000-CI 7-calowe</td><td></td></tr><tr><td>rurki zamienne</td><td>Drummond Drummond</td><td>3-000-203-G/XL</td><td>Igły do mikroiniekcji.</td></tr><tr><td>Ściągacz igieł</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze drobnoziarniste</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>Do łamania końcówki igły do mikroiniekcji.</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>Mikrowtryskiwacz.</td></tr><tr><td>Olej mineralny, ciężki</td><td>Fisher</td><td>CAS 8042-47-5</td><td>Olej do igieł.</td></tr><tr><td>27 G Igła podskórna Monoject</td><td>Covidien</td><td>8881200508</td><td>Do ładowania oleju mineralnego do igły do mikroiniekcji.</td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309646</td><td>Do ładowania oleju mineralnego do igły do mikroiniekcji.</td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm szalka Petriego</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>800 mikronów Siatka poliestrowa</td><td>Małe części</td><td>CMY-0800-C</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>Do transferu zarodków. Odetnij końcówkę, aby zarodki zostały łatwo pobrane przez pipetę.</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 45 mm Fiolka z gwintem śrubowym</td><td>Fisher</td><td>03-339-25B</td><td>Do utrwalania, barwienia i przechowywania zarodków.</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórek</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Widmo benzokainy</td><td></td><td>BE130</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1x proszek</td><td>Fisher</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>Białko surowicy bydlęcej</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>3D Mini rocker, model 135</td><td>Denville Scientific</td><td>57281</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia, pochodzenie z Nowej Zelandii</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Fisher</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne 3G8</td><td>Europejskie Centrum</td><td></td> Zasobów Xenopus <td>Przeciwciało pierwszorzędowe do znakowania proksymalnego Kanalików.</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne 4A6</td><td>Europejskie Centrum</td><td></td> Zasobów Xenopus <td>Przeciwciało pierwszorzędowe do znakowania kanalików pośrednich, dystalnych i łączących.</td></tr><tr><td>anty-RFP pAb, oczyszczone IgG / królik</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe do znakowania znacznika Gap43-RFP.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozia anty-mysia IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Przeciwciało wtórne do znakowania kanalików nerkowych.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 kozia anty-królicza IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21428</td><td>Przeciwciało wtórne do znakowania znacznika Gap43-RFP.</td></tr><tr><td>9 Płytka punktowa wnęki</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Benzoesan benzylu</td><td>Fisher</td><td>105862500</td><td>Opcjonalnie - do usuwania zarodków</td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy</td><td>Fisher</td><td>A396-500</td><td>Opcjonalnie - do usuwania zarodków</td></tr></tbody></table>

technika celowania w mikrowstrzyknięcie do rozwijającej się nerki xenopus

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Embrionalna nerka Xenopus laevis (żaby), przednercze, składa się z pojedynczego nefronu i może być używana jako model choroby nerek. Zarodki Xenopus są duże, rozwijają się zewnętrznie i można nimi łatwo manipulować za pomocą mikroiniekcji lub zabiegów chirurgicznych. Ponadto ustalono mapy losów wczesnych zarodków Xenopus. Ukierunkowana mikroiniekcja do pojedynczego blastomeru, która ostatecznie doprowadzi do powstania narządu lub tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, może być wykorzystana do selektywnej nadekspresji lub obniżenia ekspresji genów w tym ograniczonym regionie, zmniejszając skutki wtórne w pozostałej części rozwijającego się zarodka. W tym protokole opisujemy, w jaki sposób wykorzystać ustalone mapy losu Xenopus do celowania w rozwijającą się nerkę Xenopus (przednercze), poprzez mikroiniekcję do specyficznego blastomeru zarodków 4- i 8-komórkowych. Wstrzyknięcie znaczników linii pozwala na weryfikację konkretnego ukierunkowania wstrzyknięcia. Po tym, jak zarodki rozwiną się do stadium 38 - 40, stosuje się barwienie immunologiczne w całości w celu wizualizacji rozwoju pronefricznego i można ocenić udział komórek docelowych w przednerczu. Tę samą technikę można dostosować do celowania w inne typy tkanek oprócz przednerczy.

Mikroiniekcje mRNA MEM-RFP do zarodków Xenopus w stadium 4 i 8 komórek wykazują różne poziomy celowania do pronefry. Rysunek 4 przedstawia zarodki w stadium 40 z prawidłowym wzorcem ekspresji mRNA MEM-RFP. Zarodki zostały zainiektowane w lewym brzuszny blastomerze (Rysunek 4A) i wyselekcjonowane pod kątem właściwego wzorca ekspresji mRNA MEM-RFP. Oprócz ekspresji MEM-RFP w cewkach proksymalnych, pośrednich, dystalnych i łączących nerki, w prawidł...

Tutaj prezentujemy protokół do wykorzystania map losu i znaczników linii do celowania w zastrzyki do poszczególnych blastomerów, które dają początek nerkom zarodków Xenopus laevis.

Technika celowania w mikrowstrzyknięcie do rozwijającej się nerki Xenopus

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ukierunkowanie mikroiniekcji na rozwijającą się nerkę żaby z rodzaju Xenopus. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak sposób formowania się nerki oraz to, które geny są istotne dla tego procesu. Główną zaletą tej techniki jest maksymalizacja dostarczenia mikroiniekcyjnych reagentów do docelowej tkanki.Wizualizacja tej metody jest istotna, ponieważ prawidłowa identyfikacja blastomeru do celowanej mikroiniekcji jest krytyczna. Aby rozpocząć tę procedurę, oba jądra wyizolowano od jednego samca żaby i umieszczono w 60 milimetrowej szalce Petri wypełnionej 10 mililitrami roztworu do przechowywania jąder. Następnie jądra należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsius.Następnie ze samicy żaby pobrano jaja do szalki Petriego o średnicy 100 mm. Odlać nadmiar wody ze szalki Petriego. Po tym etapie odciąć jedną czwartą jądra w roztworze do przechowywania jąder (Testes Storage Solution).Przenieś fragment jądra do szalki Petriego zawierającej jaja. Następnie potnij fragment jądra na małe kawałki. Dodaj do szalki Petriego pożywkę MMR z Gentamycyną, aby pokryć jaja.Wymieszaj je, delikatnie obracając szalką, a następnie odczekaj około 30 minut w temperaturze pokojowej, aż dojdzie do zapłodnienia. Po zapłodnieniu pigmentowana strona zarodków powinna być skierowana ku górowi. Usuń MMR z szalki Petriego za pomocą pipety transferowej i dodaj wystarczającą ilość roztworu do usuwania otoczki galaretowatej (de-jelly solution), aby pokryć zarodki.Następnie przez kolejne kilka minut delikatnie obracaj szalkę, aby rozpuścić otoczkę galaretowatą zarodków. Gdy zarodki zaczną ściśle dotykać się w centrum szalki, oznacza to, że otoczka galaretowata została usunięta. Usuń roztwór do usuwania otoczki za pomocą pipety transferowej.Następnie należy przepłukać pozbawione otoczki galaretowatej embriony od 3 do 5 razy w roztworze MMR z dodatkiem Gentamycyny, ostrożnie odlewając MMR i napełniając szalkę nową porcją MMR. Nie należy usuwać całego roztworu MMR ze szalki, aby nie uszkodzić embrionów. Po tym zabiegu z szalki Petriego należy usunąć wszelkie niezapłodnione jaja lub fragmenty jąder.Aby zróżnicować tempo ich rozwoju, połowę embrionów z jednego zapłodnienia należy umieścić w szalce Petri utrzymywanej w temperaturze 14 °C, a drugą połowę w szalce Petri utrzymywanej w temperaturze 18 °C. Embriony będą rozwijać się wolniej w temperaturze 14 °C niż w 18 °C, co umożliwi wykonanie wielu serii iniekcji z jednego zapłodnionego obzoru.Przygotować roztwór do iniekcji zawierający 0,01 ng/nl mRNA białka fluorescencyjnego czerwonego związanego z błoną. W tym czasie embriony powinny rozwijać się do stadium 4- lub 8-komórkowego. Roztwór do iniekcji należy przechowywać w lodzie do momentu użycia.Następnie należy umieścić siedmiocalową zapasową szklaną kapilarę w wyciągaczu do igieł, tak aby górna część kapilary znajdowała się na wysokości górnej krawędzi obudowy urządzenia. Ustawić wartość drugiego grznika na 800, a wartość wyciągania na 650, a następnie nacisnąć przycisk wyciągania (pull), aby uformować igłę. Po tym zabiegu należy odciąć końcówkę wyciągniętej igły za pomocą pęsety Dumont.Nasunąć tuleję mikropipety na tylną część igły. Następnie nasunąć oring z dużym otworem na tylną część igły, za tuleją. Teraz napełnić igłę olejem mineralnym za pomocą igły hipodermicznej o rozmiarze 27 G, uważając, aby do wnętrza igły nie dostały się pęcherzyki powietrza.Wsuń igłę na tłok mikroinjektora, osadzając ją w dużym otworze białego plastikowego dystansera zamontowanego na tłoku. Zabezpiecz igłę, dokręcając tulejkę zaciskową. Następnie naciśnij i przytrzymaj przycisk „Empty” na panelu sterowania mikroinjektora, aż usłyszysz dwa sygnały dźwiękowe.Następnie nanieś pipetą 3 µL roztworu do iniekcji na kawałek parafilmu. Potem wprowadź końcówkę igły w kroplę roztworu do iniekcji na parafilmie. Naciśnij i przytrzymaj przycisk „Fill” na panelu sterowania mikroinjektora, aby zassać roztwór do iniekcji do igły.Przed mikroiniekcją ważne jest zrozumienie wczesnych podziałów komórkowych zarodka xenopus. Zarodek jednokomórkowy posiada ciemno pigmentowany biegun zwierzęcy oraz biały i żółtkowy biegun roślinny. W zarodku dwukomórkowym pierwsze bruzdowanie zazwyczaj przebiega pomiędzy lewą a prawą stroną zarodka.Komórki te w równym stopniu przyczyniają się do powstania linii pronefrycznej. Drugi podział dzieli embrion na połowę grzbietową i brzuszną, prowadząc do powstania embrionu 4-komórkowego. Komórki grzbietowe są mniejsze i mają mniej pigmentu niż komórki brzuszne.W przypadku wstrzykiwania do embrionu w stadium 4 komórek, należy wstrzyknąć lewy brzuszny blastomer, aby celować w lewą nerkę. Trzeci podział dzieli na pół stronę zwierzęcą i roślinną, co skutkuje powstaniem embrionu w stadium 8 komórek.Na tym etapie obecne są cztery blastomery zwierzęce i cztery blastomery roślinne. Aby skierować działanie na lewą nerkę zarodka w stadium 8 komórek, należy wykonać wstrzyknięcie do lewego brzusznego blastomeru roślinnego. Następnie należy napełnić 60 milimetrową szalkę Petriego wyłożoną 500 mikronową siatką poliestrową 5% fycolem w MMR z dodatkiem gentamycyny.Ostrożnie przenieś pipetą od 20 do 30 embrionów w stadium 8 komórek do szalki. Za pomocą pętelki z włosia manipuluj embrionami tak, aby blastomer przeznaczony do iniekcji był skierowany w stronę igły. Aby celować w lewą nerkę, ustaw embriony tak, aby lewe brzuszne blastomery wegetatywne embrionów w stadium 8 komórek były skierowane w stronę igły.Wstrzyknij 10 nanolitrów roztworu do iniekcji do wybranego blastomeru każdego embrionu w szalce. Następnie przenieś wstrzyknięte embriony do dołków płytki hodowlanej zawierającej 5% fycol w MMR z dodatkiem gentamycyny. Inkubuj wstrzyknięte embriony w temperaturze 16 °C przez około jedną do dwóch godzin, aby umożliwić regenerację wstrzykniętych blastomerów.Następnie przenieść mikroiniekcyjne embriony do nowych dołków w płytce hodowlanej wypełnionych MMR z dodatkiem Gentamycyny. Inkubować embriony w temperaturze od 14 do 22 °C, aż osiągną stadium 38–40. W tej procedurze przenieść od 10 do 20 embrionów w stadium 38–40 do szklanej fiolki.Do fiolki dodać 10 µL 5% benzokainy w 100% etanolu. Wymieszać poprzez odwrócenie fiolki i odczekać 10 minut w celu znieczulenia embrionów. Następnie usunąć MMR z fiolki i napełnić ją MEMFA.Następnie umieść próbkę na trójwymiarowej platformie kołyszącej na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie usuń MEMFA z fiolki i wypełnij ją 100% metanolem. Następnie umieść fiolkę na trójwymiarowej platformie kołyszącej na dziesięć minut w temperaturze pokojowej.Powtórz ten etap płukania jeszcze raz, a następnie przechowuj zarodki w 100% metanolu przez noc w temperaturze -20 °C. Zarodki są teraz utrwalone i gotowe do immunobarwienia. Ten schemat pokazuje, który blastomer należy wstrzyknąć w celu celowania w lewy pronefros zarodków xenopus w stadium 8 komórek, używając mRNA dla białka fluorescencyjnego czerwonego związanego z błoną (Membrane-bound Red Fluorescent Protein) jako znacznika.Lokalizacja znacznika po wstrzyknięciu do lewego brzusznego blastomeru wegetacyjnego jest pokazana na czerwono, natomiast nerka jest oznakowana na zielono. Obraz ten pokazuje, że nerka została zabarwiona na zielono za pomocą przeciwciał 3G8 i 4A6. Tutaj znajduje się powiększony widok obszaru nerki pokazujący lokalizację znacznika, a tutaj obraz scalony ukazujący ko-lokalizację znacznika z nerką.Przedstawiono tutaj obraz konfokalny nerki drugiego embrionu zabarwionego przeciwciałami 3G8 i 4A6. Jest to lokalizacja czerwonego znacznika w nerce i otaczających tkankach, a tutaj znajduje się obraz złożony ukazujący ko-lokalizację znaczników 3G8 i 4A6 w nerce. Przed przystąpieniem do tej procedury ważne jest zapoznanie się z wczesnym embrionem xenopus.Pozwoli to na prawidłowe celowanie mikroiniekcji z wykorzystaniem opracowanej mapy zaniku u xenopus. Po opanowaniu tej techniki można ją zaadaptować do celowania w inne tkanki, takie jak cewka neuralna lub serce.

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym materiale demonstrujemy mikroiniekcję cytoplazmatyczną oocytów Xenopus laevis z substratem importu jądrowego, a także przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą elektronowej mikroskopii sekcji cienkich.<br...

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

Hodowla eksplantów neuronalnych z wypreparowanych embrionów Xenopus laevis wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek fuzyjnych umożliwia obrazowanie dynamiki cytoszkieletu stożka wzrostu.

Kultury eksplantów neuronalnych z Xenopus laevis

Ten film opisuje technikę mikroiniekcji zarodka w celu dostarczenia związków do woreczka z żółtkiem danio pręgowanego.

Mikroiniekcja zarodka: technika dostarczania związku do żółtka danio pręgowanego

Ten film demonstruje dożylne wstrzykiwanie nefrotoksyn do żyły ogonowej zarodka danio pręgowanego w celu zbadania ich chemicznego wpływu na czynność nerek.

Dożylne mikrowstrzyknięcie nefrotoksyn do zarodka danio pręgowanego: technika dostarczania środków nefrotoksycznych do krwiobiegu zarodka danio pręgowanego

Metody tworzenia morfujących zarodków są niezbędne do badania mechanizmów rozwojowych i sieci regulacji genów.  Gwiazda morska Patiria miniata jest wyłaniającym się systemem modelowym dla tych badań.  W tym miejscu przedstawiamy protokół pozyskiwania gamet, produkcji kultur zarodków oraz szybkiej mikroiniekcji zygot tego gatunku.

Metoda mikroiniekcji zygot Patiria minata

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

Uszkodzenia nerek spowodowane nefrotoksynami, które obejmują różne leki, od antybiotyków po chemioterapeutyki, mogą powodować złożone zaburzenia, których patogeneza pozostaje nie do końca poznana. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób danio pręgowany może być wykorzystany do modelowania chorób tych stanów, co można zastosować do identyfikacji środków renoprotekcyjnych.

Mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek

Opisano zoptymalizowane procedury izolacji pojedynczych pęcherzyków, mikroiniekcji cytoplazmatycznego RNA, usuwania otaczających warstw komórek i ekspresji białek w oocytach Xenopus. Ponadto przedstawiono prostą metodę szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych z kanałami jonowymi bramkowanymi ligandem.

Ksenopus (Ksenopus) Oocyty: zoptymalizowane metody mikroiniekcji, usuwania warstw komórek pęcherzykowych i szybkiej zmiany roztworu w eksperymentach elektrofizjologicznych

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Naucz się techniki mikrowstrzyknięć do rozwijających się nerek Xenopus laevis. Ta metoda pozwala precyzyjnie dostarczać substancje do docelowych blastomerów, badając geny kluczowe dla organogenezy nerek.

Technika celowania w mikrowstrzyknięcie do rozwijającej się nerki Xenopus

Przeglądaj więcej filmów