Technika celowania w mikrowstrzyknięcie do rozwijającej się nerki Xenopus
3 maja 2016
Tutaj prezentujemy protokół do wykorzystania map losu i znaczników linii do celowania w zastrzyki do poszczególnych blastomerów, które dają początek nerkom zarodków Xenopus laevis.
Ogólnym celem tej procedury jest ukierunkowanie mikroiniekcji do rozwijającej się nerki ksenopusowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwojowej, takie jak sposób tworzenia się nerki i jakie geny są ważne dla tego procesu. Główną zaletą tej techniki jest to, że maksymalizuje ona dostarczanie mikroiniekcyjnych odczynników do docelowej tkanki.
Wizualizacja tej metody jest ważna, ponieważ identyfikacja właściwego blastomeru do celowanej mikroiniekcji ma kluczowe znaczenie. Aby rozpocząć tę procedurę, oba jądra wyizolowano z jednego samca żaby i umieszczono na 60-milimetrowej szalce Petriego wypełnionej 10 mililetami roztworu do przechowywania jąder. Następnie przechowuj jądra w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie pobrano jaja od samicy żaby na 100-milimetrowej szalce Petriego. Odlej nadmiar wody z szalki Petriego. Następnie odetnij ćwiartkę jądra w roztworze do przechowywania jąder.
Przenieś kawałek jądra na szalkę Petriego zawierającą jaja. Następnie pokrój część jądra na małe kawałki. Dodaj MMR plus Gentamycynę do szalki Petriego, aby przykryć jaja.
Wymieszaj je, mieszając naczynie, a następnie odczekaj około 30 minut, aż nawożenie nastąpi w temperaturze pokojowej. Po zapłodnieniu pigmentowana strona zarodków powinna być skierowana do góry. Usunąć MMR z płytki Petriego za pomocą pipety transferowej i dodać tyle roztworu galaretki, aby pokryć zarodki.
Następnie obracaj naczyniem przez następne kilka minut, aby rozpuścić galaretowatą powłokę na zarodkach. Gdy zarodki ściśle stykają się ze sobą w środku naczynia, galaretowa powłoka została usunięta. Usunąć roztwór galaretki za pomocą pipety transferowej.
Następnie umyj pozbawione galaretki zarodki 3 do 5 razy w MMR plus Gentamycyna, ostrożnie odlewając MMR i napełniając naczynie nowym MMR. Nie należy usuwać całej szczepionki MMR z naczynia, ponieważ może to spowodować uszkodzenie zarodków. Następnie usuń wszelkie niezapłodnione jaja lub kawałki jąder z szalki Petriego.
Aby rozłożyć ich rozwój w czasie, umieść połowę zarodków z pojedynczego zapłodnienia na szalce Petriego utrzymywanej w temperaturze 14 stopni Celsjusza, a drugą połowę zarodków na szalce Petriego utrzymywanej w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Zarodki rozwijają się wolniej w temperaturze 14 stopni Celsjusza niż w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Pozwala to na wielokrotne wstrzykiwanie z jednego nawożonego sprzęgła.
Przygotować roztwór do wstrzykiwań zawierający punkt zerowy, jeden nanogram na nanolitr mRNA białka czerwonej fluorescencji związanej z błoną. Podczas gdy zarodki rozwijają się do stadium 4-komórkowego lub 8-komórkowego. Roztwór do wstrzykiwań należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
Następnie załaduj siedmiocalową wymienną szklaną rurkę kapilarną do ściągacza igieł tak, aby górna część wymiennej rurki była wyrównana z górną częścią obudowy ściągacza do igieł. Ustaw wartość ciepła numer dwa na 800, a wartość naciągu na 650 i naciśnij przycisk ciągnięcia, aby wyciągnąć igłę. Następnie odetnij końcówkę wyciągniętej igły za pomocą kleszczy Dumonta.
Wsuń tuleję zaciskową mikropipety na tylną część igły. Następnie wsuń O-ring z dużym otworem na tył igły za tuleją zaciskową. Teraz napełnij igłę olejem mineralnym za pomocą igły hiperdermalnej o rozmiarze 27, uważając, aby pęcherzyki powietrza nie dostały się do igły.
Wsunąć igłę na tłok mikrowstrzykiwacza, osadzając igłę w dużym otworze w białym plastikowym przekładce zainstalowanym na tłoku. Zabezpiecz igłę, dokręcając tuleję zaciskową. Następnie naciśnij i przytrzymaj przycisk "Opróżnij" na skrzynce sterowniczej mikrowtryskiwacza, aż usłyszysz dwa sygnały dźwiękowe.
Następnie odpipetować trzy mikrolitry roztworu do wstrzykiwań na kawałek parafilmu. Następnie należy włożyć końcówkę igły do kulki roztworu do wstrzykiwań na parafilm. Naciśnij i przytrzymaj przycisk "Napełnij" na skrzynce sterowniczej mikrowstrzykiwacza, aby pobrać roztwór do wstrzykiwań do igły.
Przed mikroiniekcją ważne jest, aby zrozumieć wczesne podziały komórkowe zarodka xenopus. Zarodek jednokomórkowy ma ciemno zabarwiony, zwierzęcy biegun i biegun roślinny, który jest biały i jarzowyty. W zarodku dwukomórkowym pierwsze rozszczepienie zwykle występuje między lewą i prawą stroną zarodka.
Komórki te w równym stopniu przyczyniają się do linii pronefryjskiej. Drugi łupliwość dzieli grzbietową i brzuszną połowę zarodka, prowadząc do zarodka 4-komórkowego. Komórki grzbietowe są mniejsze i mają mniej pigmentu niż komórki brzuszne.
W przypadku wstrzykiwania do 4-komórkowego zarodka, wstrzyknij lewy blastomer brzuszny, aby celować w lewą nerkę. Trzecie rozszczepienie dzieli się na dwie sekcje po stronie zwierzęcej i roślinnej. W wyniku czego powstaje 8-komórkowy zarodek.
W tym momencie znajdują się cztery blastomery zwierzęce i cztery blastomery roślinne. Aby celować w lewą nerkę 8-komórkowego zarodka, wstrzyknij do lewego brzusznego blastomeru roślinnego. Następnie napełnij 60-milimetrową szalkę Petriego wyłożoną siatką poliestrową o grubości 500 mikronów pięcioprocentowym fykolem w MMR plus Gentamycyna.
Ostrożnie odpipetuj od 20 do 30 8-komórkowych zarodków do naczynia. Za pomocą pętli do włosów manipuluj zarodkami tak, aby blastomer do wstrzyknięcia był skierowany w stronę igły. Aby celować w lewą nerkę, ustaw zarodki tak, aby lewe brzuszne blastomery roślinne 8-komórkowych zarodków były skierowane w stronę igły.
Wstrzyknij 10 nanolitrów roztworu do wstrzykiwań do wybranego blastomeru każdego zarodka w naczyniu. Następnie przenieś wstrzyknięte zarodki do studzienek płytki hodowlanej z pięcioprocentowym fykolem w MMR plus gentamycyna. Inkubuj wstrzyknięte zarodki w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez około jedną do dwóch godzin, aby umożliwić zagojenie się wstrzykniętych blastomerów.
Następnie przenieś zarodki z mikrowstrzykniętymi zarodkami do nowych dołków na płytce hodowlanej wypełnionej MMR i gentamycyną. Inkubuj zarodki w temperaturze od 14 do 22 stopni Celsjusza, aż osiągną stadium od 38 do 40. W tej procedurze przenieść od 10 do 20 zarodków w stadium 38 do 40 do szklanej fiolki.
Dodaj 10 mikrolitrów pięcioprocentowej benzokainy w 100-procentowym etanolu do fiolki. Wymieszać, odwracając fiolkę i odczekać 10 minut, aby znieczulić zarodki. Następnie należy usunąć MMR z fiolki i napełnić ją MEMFA.
Następnie umieść go na trójwymiarowej, bujanej platformie na godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie usuń MEMFA z fiolki i napełnij ją 100% metanolem. Następnie umieść fiolkę na trójwymiarowej, kołyszącej się platformie na dziesięć minut w temperaturze pokojowej.
Powtórz ten krok mycia jeszcze raz i przechowuj zarodki w 100% metanolu przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Zarodki są teraz utrwalone i gotowe do barwienia immunologicznego. Ten schemat pokazuje, który blastomer należy wstrzyknąć w celu celowania w lewe przednercze zarodków xenopus w stadium 8-komórkowym przy użyciu mRNA białka czerwonej fluorescencji związanej z błoną jako znacznika.
Lokalizacja znacznika po wstrzyknięciu do lewego brzusznego blastomeru roślinnego jest pokazana na czerwono, podczas gdy nerka jest oznaczona na zielono. Ten obraz pokazuje, że nerka była zabarwiona na zielono przeciwciałami 3G8 i 4A6. Oto zbliżenie obszaru nerki pokazującego loakalizację znacznika, a tutaj jest scalony obraz pokazujący kolokalizację znacznika z nerką.
Pokazany jest tutaj obraz konfokalny nerki drugiego zarodka barwionego 3G8 i 4A6. To jest lokalizacja czerwonego znacznika w nerce i otaczającej tkance, a to jest połączony obraz pokazujący kolokalizację znacznika 3G8 i 4A6 w nerce. Przed wykonaniem tej procedury ważne jest, aby zapoznać się z wczesnym zarodkiem xenopus.
Pozwoli to na prawidłowe ukierunkowanie mikroiniekcji za pomocą ustalonej mapy zanikania xenopus. Po opanowaniu technika ta może być dostosowana do celowania w inne tkanki, takie jak cewa nerwowa lub serce.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę ukierunkowanych mikroiniekcji do poszczególnych blastomerów, z których rozwija się nerka embrionów Xenopus laevis. Celem procedury jest pogłębienie wiedzy na temat nefrogenezy oraz genów zaangażowanych w ten proces.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwoju
- Embriologia
- Analiza funkcji genów
Wstęp
- Zrozumienie rozwoju nerek jest kluczowe w biologii rozwoju.
- Techniki mikroiniekcji umożliwiają precyzyjne dostarczanie odczynników.
- Identyfikacja odpowiedniego blastomeru jest niezbędna dla powodzenia iniekcji.
- Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu roli genów w organogenezie.
Cel badania
- Zbadanie procesu formowania się nerek u Xenopus laevis.
- Zidentyfikowanie kluczowych genów zaangażowanych w rozwój nerek.
- Udoskonalenie technik celowanej mikroiniekcji w embrionach.
Zastosowane metody
- Izolacja jąder z organizmu samca żaby.
- Przygotowanie roztworu do przechowywania jąder.
- Przechowywanie jąder w niskich temperaturach.
- Techniki wizualizacji służące do identyfikacji blastomerów.
Główne wyniki
- Skuteczne celowanie mikroiniekcji w konkretne blastomery.
- Pogłębione zrozumienie procesów rozwoju nerek.
- Identyfikacja kluczowych genów wpływających na formowanie nerek.
- Udoskonalona metodologia dla przyszłych badań nad biologią rozwoju.
Wnioski
- Niniejszy protokół zapewnia niezawodną metodę badania rozwoju nerek.
- Ukierunkowane mikroiniekcje mogą dostarczyć istotnych informacji na temat funkcji genów.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu zgłębienia procesu organogenezy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Celowana mikrowstrzyknięcie do zarodków Xenopus umożliwia precyzyjną przestrzenną kontrolę ekspresji genów, ograniczając efekty pozatarcowe i zwiększając przejrzystość mechanistyczną w badaniach rozwojowych. Podejście to wspiera walidację celu poprzez powiązanie konkretnych genów ze ścieżkami organogenezy, takimi jak tworzenie pronefrosu, przy minimalnych zaburzeniach systemowych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w fazie wczesnego odkrywania poprzez izolację funkcji genów w określonych kontekstach tkankowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez nadekspresję lub wyciszanie genów w konkretnych blastomerach przyczyniających się do powstaniapronefrosu.
- Wartość operacyjna: Ogranicza efekty wtórne w tkankach poza obszarem docelowym, zwiększając stosunek sygnału do szumu w odczytach fenotypowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnianie roli genów w rozwoju nerek za pomocą przestrzennie ograniczonej manipulacji.
Przesiew i opracowywanie testu
- Wartość naukowa: Umożliwia tworzenie zwalidowanych systemów biologicznych z komórkami o śledzonym pochodzeniu do późniejszych analiz wkładu w rozwój przymierki.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje immunobarwienie całych preparatów w stadium 38–40 do ilościowej oceny integracji docelowych komórek w przymierce.
- Reprodukowalność: Opiera się na ustalonych mapach losów komórek oraz spójności targetowania blastomerów w embrionach w stadium 4- i 8-komórkowym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie translacyjne: Pronefros Xenopus służy jako istotny w kontekście chorobowym system do modelowania konserwatywnych mechanizmów rozwoju nerek kręgowców.
- Ciągłość mechanistyczna: Umożliwia przejście od odkrywania funkcji genów w embrionach do analizy szlaków w modelach przedklinicznych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez walidację zaangażowania celu w rozwijającym się systemie narządowym przed badaniami na ssakach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Technika ta wpisuje się w wczesne etapy procesów badawczych (workflows), łącząc specyficzną dla blastomerów modulację genów z oceną fenotypową w rozwijających się tkankach, co pozwala na wybór celów do dalszej walidacji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ograniczenie manipulacji genami do blastomerów linii przymierki, co pozwala wyjaśnić udział konkretnych szlaków w organogenezie.
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie embrionów z potwierdzoną lokalizacją znacznika, co umożliwia standaryzację immunobarwienia i obrazowania w celu ilościowej analizy przymierki.
- Analityka: Ułatwia porównywanie struktury przymierki oraz ko-lokalizacji znacznika w celu oceny wpływu funkcji genów na rozwój nerek.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki dotyczące embrionalnej przymierki z konserwatywnymi mechanizmami, które można zastosować w modelach chorób nerek ssaków.
- Zastosowanie w innych badaniach: Możliwość adaptacji do innych tkanek (np. cewy nerwowej, serca) z wykorzystaniem tego samego schematu mikrowstrzykiwania opartego na mapie losów komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa precyzję walidacji celu poprzez minimalizację efektów zakłócających wynikających z rozległej modulacji genów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia powtarzalną, skalowalną mikroiniekcję do określonych blastomerów przy użyciu standaryzowanych etapów przygotowania i inkubacji.
- Wartość strategiczna: Poprawia selekcję projektów w portfolio poprzez zapewnienie wyraźniejszych powiązań genotyp-fenotyp w rozwijającym się systemie narządowym.
- Wpływ na portfolio: Redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach dzięki wczesnemu ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w odniesieniu do celów związanych z nerkami.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w obchodzeniu się z zarodkami Xenopus, identyfikacji blastomerów oraz technikach mikroiniekcji.
- Metoda zależy od funkcjonalnego sprzętu do iniekcji, w tym wyciągaczy igieł, mikroinjektorów oraz systemów inkubacyjnych z kontrolą temperatury.
- Niezbędne są ustandaryzowane protokoły wyznaczania stadium rozwoju zarodków, ich fiksacji oraz immunostainingu, aby zapewnić spójność pomiędzy eksperymentami.
- Adaptacja do innych tkanek opiera się na dokładnych mapach losów komórek oraz precyzji celowania w blastomery.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość żywotności zarodków na zmiany temperatury oraz urazy podczas iniekcji.
