Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych
9 marca 2016
Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.
Ogólnym celem tej metody jest monitorowanie całego procesu rozmnażania płciowego u drożdży rozszczepialnych za pomocą mikroskopii świetlnej. Metoda ta opisuje przygotowanie komórek drożdży rozszczepienia do obrazowania poklatkowego różnych etapów cyklu życia płciowego, takich jak wybór partnera godowego, wzrost spolaryzowany, fuzja komórka-komórka, mioza i sporulacja. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia wizualizację pojedynczych komórek, a tym samym przezwycięża problem polegający na tym, że komórki nie wchodzą w różnicowanie płciowe synchronicznie.
Ta metoda jest bardzo prosta, ale demonstracja wizualna jest przydatna, aby pokazać, jak zamontować kilka szczepów równolegle do mikroskopii. Procedurę zademonstruje moja doktorantka Omaya Dudin, Laura Merlini, doktor habilitowany w moim laboratorium. Istnieje kilka wariantów tego protokołu, które można dostosować do badania różnych etapów cyklu życia płciowego, przy użyciu szczepów homotallicznych lub heterotallicznych.
W tej demonstracji zostaną użyte homotalliczne szczepy H90. W tych szczepach zmiana typu kojarzenia ma miejsce podczas ostatniego podziału mitotycznego po deprywacji azotu, co skutkuje mieszanką dwóch typów kojarzenia. Wieczorem, dwa dni przed eksperymentem krytowym, zaszczepić świeżo prążkowane szczepy z pożywki stałej do probówek hodowlanych zawierających 3 mililitry minimalnej pożywki zarodnikowej azotem lub MSL plus N. Inkubować przez noc z wytrząsaniem w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
Następnego ranka, jeśli to konieczne, rozcieńczyć zawiesiny komórek w MSL plus N, aby zapewnić wykładniczy wzrost w ciągu dnia. Wieczorem zmierz gęstość optyczną i rozcieńcz komórki w 20 mililitrach pożywki MSL plus N w kolbach o pojemności 100 mililitrów do gęstości optycznej 025 Hodowle komórkowe typu dzikiego powinny osiągnąć gęstość optyczną 600 około 8 następnego ranka. Dlatego rozcieńczenie powinno być odpowiednio dostosowane, jeśli pracujesz ze szczepami o dłuższym czasie generacji.
Inkubuj kultury przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, potrząsając. Następnego ranka zmierz gęstość optyczną, aby sprawdzić, czy każda kultura ma gęstość optyczną 600 około 8. Granuluj komórki o masie 1000 x g przez jedną minutę i przenieś do probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Umyj komórki trzykrotnie w 1 mililitrze minimalnej pożywki zarodnikowej bez azotu lub MSL minus N. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w 3 mililitrach pożywki MSL minus N. Zmierz gęstość optyczną i rozcieńcz komórki do gęstości optycznej 600 wynoszącej 1,5. Aby rozpocząć przygotowanie płatków agarozowych, najpierw rozpuść Aliquat MSL minus N agaroza 2 procent w bloku grzewczym o temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut.
W międzyczasie osadzać 100 mikrolitrów przygotowanej wcześniej zawiesiny komórek w temperaturze 1000 x g przez jedną minutę. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pozostałych 2 do 4 mikrolitrach pożywki. Gdy komórki czekają na stole, dodaj 200 mikrolitrów stopionego podłoża na szkiełku podstawowym między dwoma przekładkami.
Delikatnie umieść kolejne szkiełko na stopionym agarze . Gdy agaroza zastygnie, ostrożnie usuń przekładki. Aby zdjąć górny szkiełko, delikatnie obróć i pociągnij go na boki.
Jeśli kilka szczepów ma być obrazowanych jednocześnie, pad można podzielić na cztery mini pady. W tym celu użyj żyletki i podziel podkładkę na środku, odciągając części na bok o około 1 milimetr i powtórz w kierunku prostopadłym. Dodaj 1 mikrolitr komórek do podkładki agarozowej i odczekaj około minuty.
Przykryć komórki szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnić całe obrzeże szkiełka nakrywkowego za pomocą podgrzanego VELAP. Ważne jest, aby uszczelnić całe szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec wysuszeniu podkładki. Pozostaw podkładkę na co najmniej 30 minut przed obrazowaniem.
Aby zapewnić powodzenie protokołu i wysoką wydajność krycia, komórki muszą być utrzymywane w wykładniczym wzroście aż do głodu azotu i montowane bez nadmiaru płynu, tak aby były nieruchome na podkładce agarozowej. Obrazowanie żywych komórek współpracujących komórek drożdży przeprowadza się następnie w temperaturze 25 stopni Celsjusza lub temperaturze pokojowej, zgodnie z procedurą opisaną w tekście protokołu. Obrazowanie poklatkowe umożliwia wizualizację komórek przechodzących shmooing, fuzję i zarodnikowanie w ciągu 24 godzin następujących po głodzie azotu.
Proces ten jest zilustrowany na tym reprezentatywnym filmie przez dwie komórki powiększone w lewej dolnej wstawce. Protokół ten może być również stosowany do monitorowania dynamiki fluorescencyjnie znakowanych białek w łączących się komórkach. W tym przypadku heterotalliczny szczep H eksprymujący myo52 oznaczony 3GFP został połączony z heterotallicznym szczepem H + eksprymującym myo52 połączonym z czerwonym fluorescencyjnym białkiem tdTomato, a także cytozolowym GFP.
Cytozolowy GFP umożliwia monitorowanie czasu fuzji, uwidocznionej przez jej wejście do komórki H. Te zdjęcia poklatkowe pokazują, że myo52 początkowo uformował się w dynamiczne strefy w całej korze komórkowej. Sygnał Myo52 został następnie ustabilizowany w pojedynczym ognisku tuż przed zdarzeniem fuzji.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować komórki do efektywnego krycia i badania żywych komórek procesu kojarzenia drożdży rozszczepialnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę badawczą umożliwiającą długotrwałą mikroskopię cyklu życiowego drożdży rozmnażających się przez podział. Protokół ten pozwala badaczom skupić się na różnych etapach procesu rozmnażania poprzez zdjęcia time-lapse.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Mikrobiologia
- Biologia rozmnażania
Tło
- Drożdże podziałowe służą jako organizm modelowy do badań nad rozmnażaniem płciowym.
- Zrozumienie cyklu życiowego jest kluczowe dla wnikliwego poznania różnicowania komórkowego.
- Poprzednie metody nie pozwalały na wizualizację pojedynczych komórek podczas rozmnażania.
- Ta metoda radzi sobie z problemami synchronizacji w różnicowaniu płciowym.
Cel badania
- Monitorowanie całego procesu rozmnażania płciowego u drożdży podziałowych.
- Dostarczenie prostego, ale skutecznego protokołu dla badaczy.
- Przedstawienie procedury montażu kilku szczepów do mikroskopi.
Zastosowane metody
- Przygotowanie komórek drożdży podziałowych do zdjęć time-lapse.
- Wizualizacja wyboru partnera rozmnażania, wzrostu spolaryzowanego i fuzji komórka-komórka.
- Obserwacja etapów mejozy i sporulacji.
- Wykorzystanie zarówno szczepów homotalicznych, jak i heterotalicznych do zróżnicowanego badania.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja pojedynczych komórek podczas cyklu życiowego.
- Demonstracja różnych etapów rozmnażania poprzez mikroskopię.
- Modyfikacje protokołu umożliwiają dostosowanie badań do określonych etapów cyklu życiowego.
- Współpraca ze studentami zwiększa aspekt edukacyjny metody.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia cennego narzędzia do badania rozmnażania drożdży podziałowych.
- Przełamuje wcześniejsze ograniczenia w obserwowaniu różnicowania płciowego.
- Przyszłe badania mogą budować na tym protokole, aby zbadać dalsze aspekty biologii drożdży.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This microscopy method enables detailed observation of dynamic cellular processes in a genetically tractable model system, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By visualizing mating, fusion, and sporulation at single-cell resolution, it provides quantitative phenotypic data that can inform target validation and assay development for conserved eukaryotic pathways. The approach enhances predictive confidence in probing fundamental biological mechanisms relevant to drug target identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of conserved cellular mechanisms such as polarized growth and cell-cell fusion relevant to target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible system for phenotypic screening of genetic or chemical perturbations affecting mating efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, time-resolved readouts of morphological transitions suitable for high-content imaging assays.
- Operational Value: Supports standardization through agarose pad chambers that ensure consistent environmental conditions across replicates.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of conserved regulators of meiosis and sporulation with potential relevance to gametogenesis and cellular differentiation pathways.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of fluorescently tagged proteins to assess target engagement and dynamics in live cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where phenotypic characterization of cellular behaviors informs target selection and lead optimization strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven investigation of signaling pathways governing cell polarity and fusion through direct visualization.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs on cellular morphology and progression that enable comparison across experimental conditions.
- Analytics: Provides morphometric and fluorescence-based measurements that support statistical analysis of cellular responses.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance through conservation of cell cycle and fusion machinery in higher eukaryotes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform adaptable to multiple stages of the sexual lifecycle and various genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cellular processes by enabling direct observation of asynchronous events in individual cells.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized sample preparation and environmental control during time-lapse imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing phenotypic clarity on target modulation in a genetically accessible system.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in a disease-relevant cellular context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial culture techniques and fluorescence microscopy.
- Dependent on access to temperature-controlled imaging systems and agarose pad preparation tools.
- Necessitates standardization across teams for consistent nitrogen deprivation timing and cell mounting procedures.
- Adaptation to non-yeast systems may require optimization of substrate compatibility and environmental conditions.
- Practical limitations include the need for careful sealing to prevent desiccation during extended imaging sessions.
