Kapsułkowanie cytochromu c w nanoarchitekturach aerożelu krzemionkowego bez nanocząstek metalu przy jednoczesnym zachowaniu bioaktywności w fazie gazowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest enkapsulacja cytochromu c w sol-żelach krzemionkowych. Następnie żele te są poddawane procesowi nadkrytycznemu w celu utworzenia bioaerogeli, które służą do szybkiego wykrywania tlenku azotu poprzez reakcję w fazie gazowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biosensorów i analizy biologicznej, takie jak: jakie warunki są niezbędne, aby cytochrom c pozostał aktywny po enkapsulacji w wysoce porowatym aerogelu?

Znaczenie tej techniki polega na tym, że jest ona prostą procedurą kapsułkowania białka w matrycy, w której białka nie były często kapsułkowane z sukcesem. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat cytochromu c, może ona również doprowadzić do opracowania procedur kapsułkowania innych białek w aerogelach, co może mieć istotne znaczenie dla przyszłych urządzeń bioanalitycznych. Przygotować roztwór z koncentracją Cytochromu c w zakresie od 0,7 do millimolar.

Jak również rozcieńczony 0,105 mM roztwór cytochromu c, opisany w protokole tekstowym. Następnie należy oznakować jednorazowy polipropylenowy zlewka o pojemności 50 ml jako Zlewka A. Należy umieścić zlewkę na szalce wagi analitycznej i za pomocą szklanej pipety Pasteura dodać do niej 1,88 g tetrametoksysilanu. Następnie należy wytarować wagę.

Następnie pipetą odmieř 2,88 g metanolu do zlewki A. Przykryj zlewkę A parafilmem. Do jednorazowej polipropylenowej zlewki o pojemności 50 ml oznaczonej jako zlewka B włóż mieszadło magnetyczne i umieść ją na szali wagi analitycznej. Za pomocą pipety szklanej dodaj 0,75 g wody oraz 3,00 g metanolu, a następnie przykryj zlewkę B parafilmem.

Rozpocząć mieszanie zawartości zlewki B na mieszadle magnetycznym wewnątrz dygestorium. Następnie, za pomocą strzykawki, wprowadzić 5 µL 28,0-30,0% roztworu wodorotlenku amonu przez pokrycie z parafilmu do mieszaniny podczas mieszania. Natychmiast po zakończeniu tego kroku, dodać zawartość zlewki A do zlewki B. Mieszać mieszaninę przez 20 minut, utrzymując pokrycie z parafilmu.

Podczas mieszania mieszaniny z sol-żelem krzemionkowym, przygotuj od ośmiu do dziewięciu polipropylenowych fiolek scyntylacyjnych wraz z odpowiadającymi im nakrętkami. Przykryj koniec fiolki przeznaczony na nakrętkę folią spożywczą, aby stworzyć płaską powierzchnię, na której uformuje się żel, a następnie nałóż na nią nakrętkę.

Należy upewnić się, że folia plastikowa pozostaje nienaruszona wewnątrz zakrętki. Ustawić probówki na blacie tak, aby zakrętki były skierowane w dół, a otwarte dna do góry. Następnie wyciąć kawałki parafilmu, które posłużą do zakrycia każdej probówki.

Po zakończeniu mieszania zolu, przenieś 3 mililitry mieszaniny zolu do czystego jednorazowego zlewka polipropylenowego o pojemności 50 mililitrów. Używając szklanej pipety Pasteura, bardzo powoli nanieś 500 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu cytochromu c o stężeniu 0,105 milimol na ściankę zlewka do 3 mililitrów mieszaniny zolu w czasie około jednej minuty. Pamiętaj o delikatnym mieszaniu zawiesiny podczas dodawania cytochromu c, aby uniknąć powstawania dużych czerwonych grudek.

Do każdej przygotowanej formy pipetuj 0,5 milliliters otrzymanego zoletu krzemionkowego z cytochromem c. Do jednej lub dwóch form pipetuj również 0,5 milliliters pozostałego czystego zoletu krzemionkowego, aby posłużyły jako próbki kontrolne podczas procesu suszenia nadkrytycznego. Przykryj otwory form od góry parafilmem i pozostaw w lodówce na noc lub na co najmniej 12 hours w celu wytworzenia żeli.

Wyjmij formy z lodówki. Usuń parafilm z góry jednej formy zawierającej sol-żel cytochromu c, a także zdejmij zakrętkę i folię plastikową z dołu. Po dodaniu do formy niewielkiej ilości etanolu z butelki zmywacza, użyj okrągłego końca tłoka strzykawki, aby ostrożnie wypchnąć żel z formy do czystej szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml zawierającej około 5 ml etanolu.

Powtarzaj tę procedurę usuwania żelu, aż wszystkie żele z cytochromem c zostaną przeniesione do jednej fiolki, a wszystkie żele krzemionkowe do oddzielnej fiolki. Następnie napełnij fiolki etanolem po brzegi. Zakręć i przechowuj w temperaturze od 2 do 8 °C.

Co cztery godziny w ciągu dnia wyjmuj żele z lodówki. Odlej etanol z żeli i zastąp go świeżym etanolem. Przez kolejne trzy dni zanurzaj wilgotne żele sol-gel w acetonie, odlewając go i dodając świeży aceton trzy razy dziennie.

Schłodź aparat do suszenia w punkcie krytycznym do 10 degrees celsius, ustawiając temperaturę podłączonego cyrkulatora na osiem degrees celsius. Gdy aparat osiągnie 10 degrees celsius, przeprowadź test szczelności urządzenia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po upewnieniu się, że aparat jest szczelny, ostrożnie przelej mokre żele z fiolek scyntylacyjnych wraz z większością acetonu do trzech długich sekcji łodzi transferowej.

W razie potrzeby dodać więcej acetonu, aby upewnić się, że wszystkie żele są całkowicie zanurzone w acetonie przed zamknięciem korytka wewnątrz aparatury. Otworzyć zawór napełniający aparatury, aby wprowadzić dwutlenek węgla. Po zaobserwowaniu opadania dwutlenku węgla na dno aparatury przez okno urządzenia, otworzyć zawór spustowy, aby odprowadzać aceton przez pięć minut.

Przesiąkanie acetonu na dno nastąpi przed całkowitym napełnieniem aparatury dwutlenkiem węgla. Dlatego podczas spuszczania należy pozostawić otwarty zawór napełniający, aby aparatura mogła być nadal napełniana. Następnie należy zamknąć zawór spustowy.

Pozostaw zawór napełniający lekko uchylony. Na początku odpływająca mieszanina zawiera wodę, ponieważ aceton nie jest bezwodny. Możliwe jest zamarznięcie, zapchanie oraz wzrost ciśnienia w rurce odpływowej.

W przypadku wykrycia zatoru należy zamknąć zawór spustowy do momentu rozpuszczenia zatoru. Po pięciu minutach należy otworzyć zawór spustowy na kolejne pięć minut i wyregulować zawór napełniający tak, aby był wystarczająco otwarty, by aparat pozostawał pełny przez cały czas spuszczania cieczy. Po pięciu minutach należy zamknąć zawór spustowy i pozostawić zawór napełniający lekko uchylony.

Następnie powtórz ten etap osuszania jeszcze raz po pięciu minutach. Po zakończeniu etapów osuszania zamknij zawór napełniający i spuść ciekły dwutlenek węgla tak, aby jego poziom pozostał widoczny tuż nad wypustkami na łódce przez okno aparatury. Następnie ustaw temperaturę podłączonego do aparatury cyrkulatora na 40 °C, aby upewnić się, że ciekły dwutlenek węgla przekroczy swoją temperaturę i ciśnienie krytyczne.

Po około 15 minutach obserwuj przez okno aparatury przejście z fazy ciekłej w nadkrytyczny fluid, kiedy menisk cieczy nad zębami łódki zniknie. Po co najmniej 15-minutowym czasie równoważenia, lekko otwórz zawór odpowietrzający, aby rozpocząć uwalnianie nadkrytycznego fluidu. Przez około 45 minut stopniowo i sukcesywnie zwiększaj otwarcie zaworu odpowietrzającego tak, aby słyszalny był stały, lecz bardzo cichy syk uwalnianego fluidu, a manometr wskazywał powolny spadek ciśnienia do zera.

Po spadku ciśnienia w urządzeniu do zera należy otworzyć jego drzwiczki. Wyjąć łódzkę, a następnie za pomocą pęsety umieścić nowo wysuszone aerogele w czystych szklanych fiolkach scyntylacyjnych.

Aerogele krzemionkowe z cytochromem c są teraz gotowe do wykrywania obecności tlenku azotu w formie gazowej, po przeprowadzeniu charakterystyki opisanej w protokole tekstowym. Przedstawiono aerogele zawierające 15 µM cytochromu c w buforze fosforanowym potasu o stężeniach 4,4 mM, 40 mM i 70 mM w porównaniu do monety. Poniżej ukazano reprezentatywne widma cytochromu c w buforze w porównaniu z cytochromem c zamkniętym w aerogelach w różnych warunkach.

Pasmo Soret cytochromu c przy 409 nanometrach pozostaje w aerogelach praktycznie bez przesunięcia, wykazując charakterystyczne przesunięcie w stronę czerwieni, gdy bioaerogele są poddane działaniu tlenku azotu w fazie gazowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat syntezy sol-żeli krzemionkowych, enkapsulacji cytochromu c w tych sol-żelach oraz suszenia tych kompozytowych sol-żeli do postaci aerogeli. Dalsze informacje można znaleźć w protokole tekstowym dotyczącym charakterystyki bioaerogeli oraz wykorzystania bioaerogeli do detekcji tlenku azotu w fazie gazowej.