Name: Bezkarmowe pozyskiwanie melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Poznaj protokół różnicowania ludzkich komórek pluripotencjalnych w dojrzałe melanocyty zawierające melaninę. Ta metoda umożliwia produkcję dużych ilości komórek do badań nad pigmentacją i chorobami skóry.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez stypendium dla badaczy czerniaka z Fundacji Joanny M. Nicolay oraz przez National Institutes of Health pod patronatem Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F31. Prace te były dodatkowo wspierane przez granty z NYSTEM i Tri-institutional stem cell initiative (Starr Foundation).

UWAGA: Opisany tutaj protokół melanocytów został po raz pierwszy zademonstrowany przez Mica et al.
1. Przygotowanie pożywki hodowlanej, panierowane naczynia i utrzymanie hPSC
<ol>
	<li>Średnie przygotowanie 
	Uwaga: Przechowywać całe podłoże w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 2 tygodni. Przefiltruj wszystkie media do sterylizacji.
	<ol>
		<li>Przygotuj DMEM/10% FBS. Wymieszaj 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen/Strep i 5 ml L-glutaminy. Filtr do sterylizacji.</li>
		<li>Przygotować pożywkę z hESC. Wymieszaj 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml L-glutaminy, 10 ml roztworu minimum aminokwasów egzogennych MEM, 1 ml β-merkaptoetanolu i 5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca. Po przefiltrowaniu dodać 10 ng/ml FGF-2.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę różnicującą KSR: Wymieszaj 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutaminy, 10 ml Pen/Strep, 10 ml roztworu minimum aminokwasów egzogennych MEM i 1 ml β-merkaptoetanolu. Filtr do sterylizacji.</li>
		<li>Przygotować pożywkę różnicującą N2. Rozpuścić 12 g proszku DMEM/F12 w 980 ml dH2O. Dodać 1,55 g glukozy, 2 g wodorowęglanu sodu i 100 mg apo ludzkiej transferyny. Zmieszać 2 ml dH2O z 25 mg insuliny ludzkiej i 40 μl 1 N NaOH; Po rozpuszczeniu dodaj mieszaninę do podłoża. Dodać 100 μl dichlorowodorku putrescyny, 60 μl seleninu, 100 μl progesteronu. Przed przefiltrowaniem doprowadzić końcową objętość do 1 l za pomocądH 2O.</li>
		<li>Przygotuj pełne podłoże melanocytowe. Połącz 50% pożywki neuropodstawowej, 30% DMEM o niskiej stężeniu glukozy i 20% MCDB201. Do tego dodaj: 0,8% ITS+, 250 nM L-glutamina, 100 μM kwas askorbinowy (L-AA), 50 ng/ml toksyny, 50 ng/ml SCF, 0,05 μM deksametazon, 100 nM EDN3, 4 ng/ml FGF2. Sterylny filtr, a następnie dodać pozostałe odczynniki: 2% suplement B27, 25 ng / ml BMP4, 3 μM CHIR99021, 500 μM cAMP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powlekanie naczyń kulturowych
	<ol>
		<li>Przeprowadzić powlekanie za pomocą galaretowatego białka, takiego jak Matrigel. Po otwarciu podwielokrotność i zamrożenie Matrigel na części o pojemności 1 ml, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Rozmrozić i ponownie zawiesić 1 ml zamrożonej podwielokrotności w 19 ml DMEM/F12. Talerz 5 ml na 10 cm naczyniu. Inkubować szalki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed posianiem komórek odessać galaretowate białko i przemyć DMEM/F12.</li>
		<li>Przeprowadzić powlekanie za pomocą bromowodorku ornityny Poly-L / mysiej Laminin-I / fibronektyny (PO / Lam / FN). Pokryć naczynie PBS zawierającym 15 μg/ml bromowodorku poli-l-ornityny. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze. Odessać roztwór i przemyć płytki trzykrotnie PBS przed pokryciem PBS zawierającym 1 μg/ml mysiej Laminin-I i 2 μg/ml fibronektyny. Inkubować szalki O/N w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze.
		<ol>
			<li>Przed posiewem komórek należy odessać roztwór i pozostawić płytki do całkowitego wyschnięcia bez pokrywki w kapturze do hodowli tkankowych. Pozostaw płytki do wyschnięcia na około 10-15 minut. 
			Uwaga: Naczynia są suche i gotowe do powlekania komórek, gdy na powierzchni pojawią się struktury krystaliczne gołym okiem. Płytki można przechowywać w inkubatorze z PBS zawierającym LAM/FN przez dwa tygodnie, dopóki płyn nie odparuje. Talerze można przechowywać w suszeniu w temperaturze pokojowej przez kilka godzin. </li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymanie komórek komórek macierzystych hPSC 
	Uwaga: hPSC są utrzymywane na 0,1% żelatynie i mitotycznie inaktywowanych mysich fibroblastach zarodkowych (MEF) w pożywce hESC. Komórki należy dzielić co 6-8 dni.
	<ol>
		<li>Posmaruj 10 cm naczynie 0,1% żelatyną w PBS w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Zamrożone MEF-y należy szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odessać żelatynę i ułożyć komórki na płytce. Płytka MEF o gęstości ~50 000 komórek/cm2 w DMEM/10% FBS. Inkubować MEF-y w temperaturze 37 °C O/N przed dodaniem hPSC.</li>
		<li>Odessać DMEM/10% FBS z przygotowanej płytki MEF, przemyć płytkę PBS i dodać 10 ml pożywki hESC z hPSC. Przejście hPSC w stosunku 1:5/10 w zależności od gęstości przed pasażowaniem. 
		Uwaga: Jeśli hPSC są rozmrażane lub pasażowane jako pojedyncze komórki, należy je uzupełnić 10 μM dichlorowodorkiem Y-27632 (ROCKi) do pierwszego pasażu.</li>
		<li>Codziennie podawać komórki świeżą 10 ml pożywki hESC.</li>
		<li>Przed rozpoczęciem różnicowania usuń wszelkie kolonie pluripotencjalne, które wydają się zawierać zróżnicowane komórki, nieregularne granice lub przezroczyste centra 28. Mechanicznie usunąć i odessać nieregularne kolonie za pomocą pipety pod okapem z przepływem laminarnym za pomocą mikroskopu preparacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Posiewanie hPSC w celu różnicowania
Uwaga: Warunki różnicowania są opisane dla szalek 10 cm.
<ol>
	<li>Przygotować 10-centymetrowe szalki Matrigel przed rozpoczęciem różnicowania, jak opisano w kroku 1.3.1.</li>
	<li>Podczas posiewu hPSC w celu różnicowania zacznij od płytki hPSC o gęstości gotowej do przejścia (~80% konfluentu), odessaj pożywkę hESC, przemyj PBS i dodaj 3 ml 0,05% trypsyny-EDTA do komórek.</li>
	<li>Energicznie potrząsaj naczyniem poziomo przez 2 minuty, wizualizując pod mikroskopem, aż MEF-y oderwą się jako pojedyncze komórki. Kolonie hPSC powinny pozostać połączone jako kolonie.</li>
	<li>Odessać trypsynę po podniesieniu MEF, ale przed oderwaniem się kolonii hPSC.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki hESC zawierającej 10 μM dichlorowodorku Y-27632 do płytki i odłączyć komórki, pipetując w górę i w dół nad koloniami.</li>
	<li>Odessać roztwór Matrigelu z 10 cm naczynia przygotowanego w kroku 2.1 i przemyć DMEM/F12 w celu usunięcia grudek. Ułóż hPSC w stosunku 1:2 na płytce Matrigel. Dodać pożywkę hESC zawierającą 10 μM dichlorowodorku Y-27632 w objętości do 10 ml. Inkubować w temperaturze 37 °C O/N. 
	Uwaga: To posiewanie powinno dać około 100 000 komórek/cm2.</li>
</ol>
3. Indukcja różnicowania neuronalnego
Uwaga: Różnicowanie powinno zostać zainicjowane (dzień 0), gdy hPSC są w 80% zlewne. Komórki mogą być codziennie karmione pożywką hESC zawierającą 10 μM dichlorowodorek Y-27632 aż do rozpoczęcia różnicowania.
<ol>
	<li>W dniu 0 i dniu 1 nakarmić komórki 10 ml pożywki różnicującej KSR zawierającej 100 nM LDN193189 i 10 μM SB431542.</li>
	<li>W dniu 2 nakarm komórki 10 ml pożywki różnicującej KSR zawierającej 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542 i 3 μM CHIR99021.</li>
	<li>W dniu 3 nakarm komórki 10 ml pożywki różnicującej KSR zawierającej 10 μM SB431542 i 3 μM CHIR99021.</li>
	<li>W dniach 4 i 5 nakarm komórki 15 ml pożywki różnicującej 75% KSR i 25% pożywki różnicującej N2 zawierających 3 μM CHIR99021, 
	Uwaga: Nie przejmuj się, widząc dużą ilość śmierci komórek w postaci komórek pływających. Jest to normalne i należy się tego spodziewać.</li>
	<li>W dniach 6 i 7 nakarm komórki 15 ml 50% pożywki różnicującej KSR i 50% pożywki różnicującej N2, które zawierają 3 μM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 i 100 nM EDN3.</li>
	<li>W dniach 8 i 9 nakarm komórki 20 ml 25% pożywki różnicującej KSR i 75% pożywki różnicującej N2, które zawierają 3 μM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 i 100 nM EDN3.</li>
	<li>W dniach 9 i 10 przygotować szalki PO/Lam/FN, jak wskazano w ppkt 1.2.2, w celu ponownego posiewu komórek w dniu 11.</li>
	<li>W dniu 10 komórek karmiących się 20 ml pożywki różnicującej N2 zawierającej 3 μM CHIR99021, 25 ng/ml BMP4 i 100 nM EDN3.</li>
</ol>
4. Powtarzanie w kropelkach dla specyfikacji NC
<ol>
	<li>W dniu 11 odessać Lam/FN z przygotowanych płytek PO/LAM/FN i całkowicie wysuszyć.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z komórek dnia 11, przemyć PBS i dodać 4 ml roztworu do oddzielania komórek, takiego jak Accutase, na 10 cm naczynie. Inkubować przez 25 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 5 ml pożywki Full Melanocyte do naczynia i ponownie zawiesić komórki, ręcznie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aż wszystkie komórki oderwą się od płytki. Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Obracaj komórki przez 5 minut w temperaturze 200 x g i ponownie zawieś komórki w ilości 2 x 106 komórek na ml w pożywce Full Melanocyte. Policzyć komórki, stosując wykluczenie błękitu trypanowego na hemocytometrze lub równoważnej technice.</li>
	<li>Umieść 10 μl kropel blisko siebie (tak, aby się nie stykały) na wysuszonych szalkach PO/Lam/FN o średnicy 10 cm. Jeśli płytka została wystarczająco wysuszona, kropelki powinny mieć dobrze zaznaczone krawędzie i nie spływać. 
	Uwaga: Tworzy to lokalne środowisko o dużej gęstości dla komórek, co jest ważne podczas ponownego powlekania komórek, przy jednoczesnym zachowaniu miejsca w naczyniu na ekspansję.</li>
	<li>Pozostaw kropelki w temperaturze pokojowej przez 10-20 minut, aby komórki mogły przylegać, a następnie powoli (aby nie przeszkadzać przyczepionym komórkom) dodaj 10 ml pożywki z pełnego melanocytu. Przenieś naczynie do inkubatora.</li>
</ol>
5. Rozszerzające się progenitory melanocytów
<ol>
	<li>Kontynuuj karmienie pożywką Full Melanocyte co 2 do 3 dni. 
	Uwaga: Pigmentacja powinna zacząć być widoczna w skupiskach komórek pod koniec pierwszego tygodnia i stać się bardzo wyraźna w drugim tygodniu. Spójrz na płytę na białym tle, takim jak kartka papieru, aby dostrzec te wczesne, małe, ciemne gromady. Komórki będą z czasem stawać się coraz bardziej pigmentowane, aż cała płytka zostanie równomiernie zabarwiona (patrz ryc. 2B).</li>
	<li>Komórki pasażowe raz w tygodniu w stosunku ~1:6 (na tym etapie posiewanie w postaci kropelek nie jest już konieczne). Użyj Accutase do dysocjacji komórek i przemyj dwukrotnie zwykłą pożywką Neurobasel przed ponownym posiewem w pożywce Full Melanocyte. Utrzymuj komórki na płytkach PO/LAM/FN. 
	Uwaga: Odkryliśmy, że pożywka Full Melanocyte najlepiej nadaje się do utrzymywania i rozszerzania melanocytów pochodzących z hESC i iPSC. Jednak komórki mogą być krótko hodowane w dostępnym na rynku pożywce M254, ale uproszczone podłoże zwiększa ryzyko obumarcia komórek i oderwania się od płytki.</li>
</ol>

<ol><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+using+familial+dysautonomia+induced+pluripotent+stem+cells+identifies+compounds+that+rescue+IKBKAP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression.</a> Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).</li>
<li>Lee, G., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease.</a> Nat methods. 7, 25-27 (2010).</li>
<li>Zimmer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+developmental+toxicants+and+signaling+pathways+in+a+functional+test+based+on+the+migration+of+human+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+health+persp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells.</a> Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).</li>
<li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neural+crest+induction%2C+melanocyte+specification%2C+and+disease-related+pigmentation+defects+in+hESCs+and+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+rep%22%5BJournal%5D)">Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs.</a> Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).</li>
<li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA%2FGlutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162, 375-390 (2015).</li>
<li>Doulatov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Diamond+Blackfan+Anemia+in+Vivo+Using+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Blood. 124, (2014).</li>
<li>Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogrammed+Cells+for+Disease+Modeling+and+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine.</a> Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).</li>
<li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells%3A+a+game+changer+for+future+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> Embo J. 33, 409-417 (2014).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494, 105-110 (2013).</li>
<li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).</li>
<li>Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+neural+crest+and+the+opportunities+of+life+on+the+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+biol%22%5BJournal%5D)">Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge.</a> Dev biol. 275, 1-11 (2004).</li>
<li>White, R. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocytes+in+development%2C+regeneration%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Melanocytes in development, regeneration, and cancer.</a> Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).</li>
<li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification%2C+isolation+by+flow+cytometry%2C+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li>
<li>Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phox2b+function+in+the+enteric+nervous+system+is+conserved+in+zebrafish+and+is+sox10-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+develop%22%5BJournal%5D)">Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent.</a> Mech develop. 122, 659-669 (2005).</li>
<li>Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox+proteins+in+melanocyte+development+and+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pigm+cell+melanoma+r%22%5BJournal%5D)">Sox proteins in melanocyte development and melanoma.</a> Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).</li>
<li>Herbarth, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+Sry-related+Sox10+gene+in+Dominant+megacolon%2C+a+mouse+model+for+human+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease.</a> PNAS. 95, 5161-5165 (1998).</li>
<li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+genetics%22%5BJournal%5D)">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nat genetics. 18, 60-64 (1998).</li>
<li>Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+3+induces+the+reversion+of+melanocytes+to+glia+through+a+neural+crest-derived+glial-melanocytic+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor.</a> PNAS. 97, 7882-7887 (2000).</li>
<li>Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nacre+encodes+a+zebrafish+microphthalmia-related+protein+that+regulates+neural-crest-derived+pigment+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate.</a> Development. 126, 3757-3767 (1999).</li>
<li>Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+and+transcriptional+regulation+in+the+neural+crest-derived+melanocyte+lineage%3A+interactions+between+KIT+and+MITF%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF.</a> Development. 127, 5379-5389 (2000).</li>
<li>Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MITF%3A+master+regulator+of+melanocyte+development+and+melanoma+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+mol+med%22%5BJournal%5D)">MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene.</a> Trends mol med. 12, 406-414 (2006).</li>
<li>Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-KIT+signaling+depends+on+microphthalmia-associated+transcription+factor+for+effects+on+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation.</a> PloS one. 6, e24064(2011).</li>
<li>Grichnik, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIT+expression+reveals+a+population+of+precursor+melanocytes+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+invest+dermatol%22%5BJournal%5D)">KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin.</a> J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dermal+stem+cells+differentiate+into+functional+epidermal+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+cell+sci%22%5BJournal%5D)">Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes.</a> J cell sci. 123, 853-860 (2010).</li>
<li>Nishimura, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+role+of+the+niche+in+melanocyte+stem-cell+fate+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination.</a> Nature. 416, 854-860 (2002).</li>
<li>Zur Nieden, N. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZur+Nieden%2C+NI+%22Embryonic+stem+cell+therapy+for+osteo-degenerative+diseases+%3A+methods+and+protocols%22">Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-content+screening+for+novel+pigmentation+regulators+using+a+keratinocyte%2Fmelanocyte+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+dermatol%22%5BJournal%5D)">high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system.</a> Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

W celu skutecznego różnicowania melanocytów od hPSC należy wziąć pod uwagę następujące sugestie. Przede wszystkim niezbędna jest praca w sterylnych warunkach hodowli przez cały czas. Ponadto ważne jest, aby zacząć od pluripotencjalnych, w pełni niezróżnicowanych hPSC; Jeśli wyjściowa populacja zawiera zróżnicowane komórki, wydajność niezmiennie spadnie, ponieważ zanieczyszczenia nie mogą być kierowane do melanocytów, a nawet mogą jeszcze bardziej zakłócić prawidłowo różnicujące się komórki.
Ab...

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) stanowią platformę do naśladowania normalnego różnicowania w skalowalny sposób do modelowania chorób, badań przesiewowych leków i terapii zastępczych 1-6. Szczególnie interesujące jest to, że hPSC otwierają możliwości badania trudnych do wyizolowania lub rzadkich/przejściowych typów komórek, w których próbki od pacjentów są rzadkie. Co więcej, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) umożliwiają naukowcom badanie rozwoju i modelowania choroby w sposób specyficzny dla pacjenta w celu rozwikłania unikalnych mechanizmów 1,2,7-11. Opublikowany wcześniej protokół różnicowania melanocytów z hPSC wymaga do 6 tygodni różnicowania i polega na hodowli komórek z kondycjonowaną pożywką z komórek L-Wnt3a 12. Protokół, po raz pierwszy zaprezentowany przez Mica i wsp. i opisany tutaj, wytwarza komórki barwnikowe w ciągu trzech tygodni i usuwa niejasności i niespójności związane z kondycjonowaną pożywką.
Melanocyty pochodzą z grzebienia nerwowego, migrującej populacji komórek unikalnej dla kręgowców. Grzebień nerwowy jest definiowany podczas gastrulacji i reprezentuje populację komórek na krawędzi płytki nerwowej, graniczącej między ektodermą nerwową i nieneuronalną. Podczas neurulacji tkanka nerwowa ewoluuje z płytki nerwowej, tworząc fałdy nerwowe, które zbiegają się w grzbietowej linii środkowej, tworząc cewę nerwową 13,14.
Komórki grzebienia nerwowego wyłaniają się z płyty dachowej cewy nerwowej, naprzeciwko struny grzbietowej, i przechodzą przejście z nabłonka do mezenchymalnego, zanim odejdą, dając początek zróżnicowanej populacji zróżnicowanych komórek. Losy komórek grzebienia są częściowo określone przez anatomiczne położenie płytki dachowej wzdłuż osi ciała zarodka. Pochodne komórek grzebienia nerwowego obejmują linie charakterystyczne zarówno dla mezodermy (komórki mięśni gładkich, osteoblastów, adipocytów, chondrocytów), jak i komórek ektodermy (melanocyty, komórki Schwanna, neurony) 14. Komórki macierzyste grzebienia nerwowego regulują w górę czynnik transkrypcyjny SOX10 i mogą być izolowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją z przeciwciałami przeciwko p75 i HNK1.
Komórki grzebienia nerwowego, które stają się melanocytami, przechodzą przez etap melanoblastu i zwiększają poziom KIT i MITF (czynnik transkrypcyjny związany z mikroftalmią) 6,21 MITF jest głównym regulatorem rozwoju melanocytów i jest czynnikiem transkrypcyjnym odpowiedzialnym za kontrolowanie rozwoju melanocytów 22-24. Ludzkie melanoblasty migrują do warstwy podstawnej naskórka, gdzie znajdują się albo w wybrzuszeniu włosa, albo otoczone keratynocytami w naskórku (tworząc jednostki pigmentacyjne), aby służyć jako prekursory dojrzałych, pigmentowanych melanocytów. Różnicowanie i dojrzewanie melanoblastów do melanocytów barwnikowych następuje wraz z kolonizacją cebulki włosa i ekspresją szlaku produkcji melaniny (TYRP1, TYR, OCA2 i PMEL) 25,26.
Izolowanie ludzkich melanocytów i melanoblastów od pacjentów jest kosztowne, trudne i ograniczające pod względem ilości. Protokół ten umożliwia naukowcom różnicowanie hPSC (indukowanych lub embrionalnych) w melanocyty lub prekursory melanocytów w dobrze zdefiniowaną, szybką, powtarzalną, skalowalną i niedrogą metodę bez sortowania komórek. Protokół był wcześniej stosowany do identyfikacji wad specyficznych dla choroby podczas różnicowania iPSC od pacjentów z zaburzeniami pigmentacji.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>apo ludzka transferyna</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy (L-AA)</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>B27 (suplement B27)</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-bp</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>4423</td><td>6 mM</td></tr><tr><td>Toksyna</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>cAMP (cyklicznie)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D2915-100MG</td><td>50 &mu; M</td></tr><tr><td>DMEM - Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11985-092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 - Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco: mieszanka składników odżywczych F-12</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>1133--032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 w proszku</td><td>Invitrogen</td><td>12500-096</td><td></td></tr><tr><td>EDN3 (endotelina-3, człowiek)</td> <td>American Peptide Company</td><td>88-5-10B</td><td>100 &mu; M</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td>200 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>żelatyny (PBS bez Mg/Ca)</td> <td>w domu</td><td></td><td>0,1% w PBS</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Insulina ludzka</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>ITS+ Uniwersalny suplement do hodowli Premix&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>KSR (wymiana surowicy do nokautu)</td> <td>Gibco-Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Nokaut DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>DMEM o niskim poziomie glukozy</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Rozpuścić 1:20 w DMEM/F12</td></tr><tr><td>MCDB201 Medium</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>MEM Minimalny roztwór aminokwasów egzogennych</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11140-080</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasty embrionalne myszy (7 milionów komórek/fiolkę)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-8105M</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Laminin-I</td><td>R& D Systems</td><td>3400-010-01</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycyna</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10 000 U/ml</td></tr><tr><td>Poly-L Bromowodorek Omitiny</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>15 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>0,032 g w 100 ml 100% etanolu</td></tr><tr><td>Dichlorowodorek putrescyny</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 (Rekombinowany ludzki FGF zasadowy)</td><td>R& Systemy D</td><td>233-FB-001MG/CF</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris-R& D Systems</td><td>1814</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Selenit</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SCF (czynnik komórek macierzystych, rekombinowany człowiek)&nbsp;</td><td>Peprotech Sp. z o.o.</td><td>300-07</td><td>50 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało TYRP1 (G-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>10443</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało TYRP2</td><td>Abcam</td><td>74073</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek</td><td>Tocris-R& Systemy D</td><td>1254</td><td>10 mM</td></tr></tbody></table>

bezkarmowe pozyskiwanie melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) stanowią platformę do badania rozwoju człowieka in vitro, zarówno w warunkach normalnych, jak i chorobowych. Naukowcy mogą kierować różnicowaniem hPSC w zależności od typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania, manipulując warunkami hodowli w celu podsumowania sygnałów zaobserwowanych podczas rozwoju. Jednym z takich typów komórek jest melanocyt, komórka wytwarzająca pigment pochodząca z grzebienia nerwowego (NC), odpowiedzialna za ochronę skóry przed promieniowaniem UV. Protokół ten stanowi rozszerzenie obecnie dostępnego in vitro protokołu różnicowania grzebieni nerwowych z hPSC w celu dalszego różnicowania NC w pełni pigmentowane melanocyty. Prekursory melanocytów mogą być wzbogacone z protokołu Neural Crest poprzez czasową ekspozycję na aktywatory sygnalizacji WNT, BMP i EDN3 w warunkach podwójnego hamowania SMAD. Powstałe w ten sposób prekursory melanocytów są następnie oczyszczane i dojrzewają do w pełni pigmentowanych melanocytów poprzez hodowlę w selektywnej pożywce. Powstałe melanocyty są w pełni pigmentowane i barwią się odpowiednio dla białek charakterystycznych dla dojrzałych melanocytów.

Niniejszy protokół przedstawia metodę otrzymywania w pełni pigmentowanych, dojrzałych melanocytów z hPSC w sposób in vitro, bez użycia komórek karmiących, w sposób ekonomiczny i powtarzalny. W przeciwieństwie do wcześniej opracowanego protokołu Fang et al. dla melanocytów pochodzących z hPSC, opisany protokół nie wymaga użycia medium warunkowanego i skraca czas trwania procesu. Protokół Fang et al. wykorzystywał medium warunkowane z mysiej linii komórkowej prod...

Ta praca opisuje protokół różnicowania in vitro do produkcji pigmentowanych, dojrzałych melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą grzebienia nerwowego i etapu pośredniego melanoblastu przy użyciu 25-dniowego protokołu bez karmienia.

Bezkarmowe pozyskiwanie melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zróżnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w w pełni pigmentowane, dojrzałe melanocyty. Metoda ta może pomóc w identyfikacji kluczowych czynników podczas rozwoju melanocytów. Dodatkowo protokół ten umożliwi identyfikację czynników, które uległy zaburzeniu podczas rozwoju choroby, a także przesiewanie istotnych leków w procesie odkrywania nowych substancji terapeutycznych.Główną zaletą niniejszego protokołu jest to, że umożliwia on otrzymanie dużej liczby w pełni pigmentowanych melanocytów, podczas gdy izolacja melanocytów od pacjentów zazwyczaj skutkuje uzyskaniem stosunkowo niewielkiej liczby komórek. Po rozdzieleniu na alykwoy i zamrożeniu białka żelatynowego, rozmrozić i resuspender jedną alykwoję o objętości 1 mL w 19 mL DMEM f12.Następnie nanieś pięć mililitrów tej mieszaniny na jedną szalkę hodowlaną o średnicy 10 centymetrów. Po przygotowaniu kilku takich szalek należy inkubować je przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie rozpocznij przygotowywanie szalek pokrytych PO, lamininą i fibronektyną, dodając najpierw do szalki hodowlanej PBS zawierający 15 mikrogramów na mililitr PO.Następnie inkubować pły

feeder-free-derivation-melanocytes-from-human-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Poniższy protokół zawiera instrukcje dotyczące adaptacji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) do hodowli bez warstwy komórek żerujących (feeder-free) z wykorzystaniem kompletnego medium KnockOut Serum Replacement Feeder-Free (KSR-FF). Po zakończeniu adaptacji przedstawiono również instrukcje dotyczące ich dalszego utrzymania.

Adaptacja bez użycia komórek karmicieli, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek iPS z wykorzystaniem bezkomórkowego medium Complete KnockOut Serum Replacement

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

W niniejszym protokole zidentyfikowaliśmy nową populację komórek melanocytopodobnych (znanych również jako melanocyty serca) w sercach myszy i ludzi, które przyczyniają się do wyzwalania arytmii przedsionkowej u...

Izolowanie pierwotnych komórek melanocytopodobnych z serca myszy

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Komórki grzebienia nerwowego (NC) pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) mają ogromny potencjał w modelowaniu rozwoju i chorób człowieka oraz w terapiach zastępczych komórek. W tym artykule przedstawiono bezżywieniową adaptację obecnie powszechnie stosowanego protokołu różnicowania in vitro do wyprowadzania komórek NC z hPSC.

Bezkarmowe wyprowadzanie komórek progenitorowych grzebienia nerwowego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Tutaj prezentujemy protokół precyzyjnego tworzenia hemogennego śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w stanie wolnym od karmów i kseno. Metoda ta będzie miała szerokie zastosowanie w modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych pod kątem związków terapeutycznych.

Różnicowanie śródbłonka hemogennego od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w zdefiniowanym stanie wolnym od karmnika i ksenotypu

Ten artykuł informuje, że dodanie Y-27632 do podłoża TIVA może znacznie zwiększyć wydajność melanocytów z tkanek skóry dorosłych.

Y-27632 Wzbogaca wydajność ludzkich melanocytów z tkanek skóry dorosłych

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system bezpośredniego przeprogramowania melanocytów oraz wysoce wydajny, skoncentrowany system pakowania wirusów, który zapewnia płynne bezpośrednie przeprogramowanie.

Bezpośrednie przeprogramowanie mysich fibroblastów w melanocyty

Poznaj protokół różnicowania ludzkich komórek pluripotencjalnych w dojrzałe melanocyty zawierające melaninę. Ta metoda umożliwia produkcję dużych ilości komórek do badań nad pigmentacją i chorobami skóry.

Bezkarmowe pozyskiwanie melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów