Bezkarmowe pozyskiwanie melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zróżnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w w pełni pigmentowane, dojrzałe melanocyty. Metoda ta może pomóc w identyfikacji kluczowych czynników podczas rozwoju melanocytów. Dodatkowo protokół ten umożliwi identyfikację czynników, które uległy zaburzeniu podczas rozwoju choroby, a także przesiewanie istotnych leków w procesie odkrywania nowych substancji terapeutycznych.

Główną zaletą niniejszego protokołu jest to, że umożliwia on otrzymanie dużej liczby w pełni pigmentowanych melanocytów, podczas gdy izolacja melanocytów od pacjentów zazwyczaj skutkuje uzyskaniem stosunkowo niewielkiej liczby komórek. Po rozdzieleniu na alykwoy i zamrożeniu białka żelatynowego, rozmrozić i resuspender jedną alykwoję o objętości 1 mL w 19 mL DMEM f12.

Następnie nanieś pięć mililitrów tej mieszaniny na jedną szalkę hodowlaną o średnicy 10 centymetrów. Po przygotowaniu kilku takich szalek należy inkubować je przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie rozpocznij przygotowywanie szalek pokrytych PO, lamininą i fibronektyną, dodając najpierw do szalki hodowlanej PBS zawierający 15 mikrogramów na mililitr PO.

Następnie inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaczem. Po tym czasie odessać roztwór i przemyć naczynia trzykrotnie w 1X PBS. Kontynuować powlekanie, dodając 10 ml PBS zawierającego 1 µg/ml lamininy 1 z myszy oraz 2 µg/ml fibronektyny.

Następnie inkubować szalki zgodnie z wcześniejszym opisem. Na początek dodać 0,1% żelatyny w PBS do szalki o średnicy 10 cm. Pozostawić w temperaturze pokojowej na pięć minut.

Podczas powlekania płytki, umieść zamrożone embrionalne fibroblasty mysie (MEFs) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby je szybko rozmrozić. Następnie odessaj żelatynę z płytki i wysiej MEFs z gęstością około 50 000 komórek na cm² w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej. Po inkubowaniu płytki przez noc w temperaturze 37 °C, odessaj pożywkę i przemyj przygotowaną płytkę z MEF roztworem 1X PBS.

Należy dodać 10 ml wcześniej przygotowanego pożywki dla hESC zawierającej ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSCs) do szalki o średnicy 10 cm. Po wysianiu komórek w zagęszczeniu 5 milionów komórek na szalkę, płytki należy inkubować w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Następnie komórki należy codziennie dokarmiać 10 ml świeżej pożywki dla hESC.

Przed rozpoczęciem różnicowania należy sprawdzić płytkę pod kątem obecności kolonii, które wydają się zawierać zróżnicowane komórki, mają nieregularne brzegi lub przezroczyste centra. Pod mikroskopem stereoskopowym w laminarnym przepływie powietrza należy mechanicznie usunąć takie nieregularne kolonie za pomocą pipety. Aby przeprowadzić powlekanie białkiem żelatynowym, takim jak Matrigel, należy najpierw podzielić białko na aliquoty po 1 mL i zamrozić, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.

Następnie rozmrozić i resuspender mrożoną alikwot 1 ml w 19 ml DMEM f12. Przenieść 5 ml tej mieszaniny na szalkę 10 cm i inkubować szalki przez jedną godzinę w RT. Po tym czasie, bezpośrednio przed wysianiem komórek, odessać żelatynowe białko i przemyć DMEM F12. Podczas powlekania szalki wybrać płytkę, na której hPSCs osiągnęły około 80% konfluencji.

Następnie należy odessać pożywkę dla hESC. Potem komórki należy przemyć PBS. Po usunięciu PBS do płytki należy dodać 3 mL 0,05% trypsyny-EDTA.

Następnie należy energicznie potrząsać szalką w poziomie przez dwie minuty, aż pod mikroskopem zostanie zaobserwowane odrywanie się MEF w postaci pojedynczych komórek. W tym czasie kolonie hPSC powinny pozostać przytwierdzone do płytki. Należy odessać trypsynę po odrywaniu się MEF, lecz przed odłączeniem się kolonii hPSC.

Następnie do płytki dodać 10 ml pożywki dla hESC zawierającej 10 µM dihydrochlorku Y-27632, który jest inhibitorem ROCK. Po tym czasie odkleić komórki, pipetując roztwór w górę i w dół nad koloniami. Następnie przenieść je z powrotem do naczynia z białkiem żelatynowym i odessać roztwór.

Przemyj to naczynie pożywką DMEM f12, aby usunąć wszelkie grudki. Następnie wysiej do niego hPSCs w stosunku od 1 do 2. Do płytki dodaj pożywkę dla hESC zawierającą 10 µM dichlorowodorku Y-27632, dopełniając objętość do 10 mL.

Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez noc. Codziennie dokarmiać komórki pożywką uzupełnioną o inhibitor ROCK. Gdy hPSC osiągną 80% konfluencji, należy rozpocząć różnicowanie neuronalne i wyznaczyć ten punkt czasowy jako dzień 0.

Aby rozpocząć różnicowanie, w dniu 0. i dniu 1. należy zasilić komórki 10 mililitrami medium do różnicowania KSR zawierającego 100 nanomolar LDN-193189 (inhibitora MP) oraz 10 mikromolar SB 431542 (inhibitora aktywiny i Nodala). W dniu 2. należy zastąpić medium takim, które zawiera te same stężenia BNP oraz inhibitorów aktywiny i Nodala, a dodatkowo trzy mikromolar CHIR99021 (agonistę Wnt). Następnie, w dniu 3., komórki należy zasilić medium do różnicowania KSR uzupełnionym jedynie o 10 mikromolar SB 431542 i trzy mikromolar CHIR99021.

Po przygotowaniu mieszaniny 75% pożywki różnicującej KSR i 25% pożywki różnicującej N2 zawierającej również 3 µM agonisty Wnt, należy podać komórkom 15 ml tego roztworu w dniu 4 i 5. Następnie, w dniach 6 i 7, komórki należy zasilić 15 ml pożywki składającej się z 50% pożywki różnicującej KSR i 50% pożywki różnicującej N2, uzupełnionej dodatkowo o 3 µM CHIR99021, 25 ng/ml BMP4 oraz 100 nM EDN3.

Następnie w 8. i 9. dniu zasil komórki 20 ml pożywki różnicującej składającej się z 25% KSR i 75% pożywki N2, uzupełnionej o te same stężenia czynników, które stosowano w 6. i 7. dniu. W 10. dniu kontynuuj różnicowanie neuronalne, podając komórkom 20 ml pożywki różnicującej N2 zawierającej 3 µM CHIR99021, 25 ng/ml BMP4 oraz 100 nM EDN3. W 11. dniu odessij roztwór z naczyń uprzednio pokrytych lamininą 1 i fibronektyną.

Następnie pozostaw płytki nieprzykryte w komorze do hodowli tkanek przez około 10 do 15 minut, aby całkowicie wyschły. Przejdź do usunięcia pożywki z komórek z 11. dnia i przemyj je PBS. Następnie dodaj cztery mililitry roztworu do odrywania komórek do naczynia i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 25 minut.

Po inkubacji do szalki należy dodać pięć mililitrów pełnej pożywki do melanocytów. Następnie komórki należy resuspendować, pipetując je ręcznie w górę i w dół, aż oddzielą się od powierzchni płytki. Zawiesinę należy przenieść do probówki o pojemności 15 mililitrów i odwirować komórki przez pięć minut przy 200 Gs. Po policzeniu komórek metodą wykluczania błękitu trypanu przy użyciu hemocytometru, należy je resuspendować w pełnej pożywce do melanocytów do gęstości 2X10⁶ komórek na mililitr.

Nanieś krople zawiesiny komórkowej o objętości 10 µL na wysuszone, powlekone szalki. Upewnij się, że krople znajdują się blisko siebie, ale nie stykają się, mają wyraźne krawędzie i nie rozlewają się. Aby umożliwić adhezję komórek, pozostaw krople w temperaturze pokojowej na 10 do 20 minut.

Następnie powoli dodaj do naczynia 10 ml pełnej pożywki dla melanocytów, uważając, aby nie naruszyć przytwierdzonych komórek. Następnie przenieś naczynie do inkubatora. Dokarmiaj komórki pełną pożywką dla melanocytów co dwa do trzech dni.

Pod koniec pierwszego tygodnia należy spodziewać się zaobserwowania pigmentacji w klastrach komórek. Raz w tygodniu należy pasażować komórki, najpierw traktując je roztworem do odrywania komórek, zgodnie z wcześniejszym opisem. Po zebraniu i odwirowaniu komórek należy je dwukrotnie przemyć czystym medium Neurobasal.

Następnie przesiać komórki w stosunku jeden do sześciu w pełnej pożywce dla melanocytów na szalki pokryte PO, lamininą 1 i fibronektyną. Około 30. dnia różnicowania komórki będą silnie pigmentowane, co jest łatwo widoczne przy wysiewaniu w wysokiej gęstości lub po odwirowaniu podczas pasażowania.

Przedstawiono obraz w polu jasnym komórek z transgenicznej ludzkiej linii komórek macierzystych zarodkowych psox10 GFP, hodowanych do 11. dnia opisanego protokołu różnicowania przed przesianiem komórek. W tych kulturach widoczne są ciemne, wyraźne grzbiety komórek. Po ocenie sygnału GFP w tych kulturach stwierdzono, że ciemne grzbiety były wzbogacone w komórki sox10 dodatnie.

Ponieważ sox10 jest czynnikiem transkrypcyjnym zwiększanym w komórkach macierzystych grzebienia nerwowego i utrzymywanym w melanoblastach, wyniki te sugerują, że do 11. dnia ta metoda różnicowania doprowadziła do wzbogacenia populacji w komórki, z których ostatecznie powstaną melanocyty. Dowodem na to jest fakt, że do 20. dnia protokołu w hodowlach znajdowały się niepigmentowane, dojrzewające oraz w pełni dojrzałe pigmentowane melanocyty. W 25. dniu w hodowlach obserwuje się te same typy komórek.

Obecność dojrzewających i pigmentowych melanocytów w tych preparatach potwierdzono poprzez barwienie z wykorzystaniem dwóch białek produkcji melaniny. TYRP2, który służy jako marker zarówno dla melanoblastów, jak i melanocytów, oraz TYRP1, który jest markerem późnego stadium melanocytów i wykazuje ekspresję wyłącznie w melanocytach pigmentowych. Po opanowaniu, niniejszy protokół może zostać wykorzystany do różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w w pełni pigmentowe dojrzałe melanocyty w ciągu 25 dni.

Protokół odzwierciedla prawidłowy rozwój melanocytów, przechodząc najpierw przez stan grzebienia neuronalnego, a następnie przez stadium melanoblastów.