Name: Hoduj pierwotne komórki nabłonka nosa od dzieci i przeprogramuj je w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Naucz się metody nieinwazyjnej izolacji komórek nabłonka nosa od dzieci i ich przeprogramowania w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste. Technika ta umożliwia badanie astmy i chorób dróg oddechowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Pluripotentnemu Ośrodkowi Komórek Macierzystych oraz Rdzeniowi Obrazowania Konfokalnego w Szpitalu Dziecięcym w Cincinnati. Prace te były wspierane przez R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH/NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) i 2U19AI70235 (GKKH).

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach.
1. Pobieranie próbek błony śluzowej nosa
UWAGA: Uzyskaj próbki od osób, które są wolne od objawów infekcji wirusowej dróg oddechowych.
<ol>
	<li>Przygotuj 15 ml stożkowej świeżości przed wizytą uczestnika i dodaj 2 ml BEGM (Bronchial Epithelial Cell Growth Medium) plus 20 μl sterylnego Penn/Strep/Fungizone (P/S/F) (0,01%).</li>
	<li>Otwórz szczoteczkę cytologiczną tuż przed pobraniem próbki i upewnij się, że szczoteczka jest sterylna i nie dotykaj jej żadnymi powierzchniami poza powierzchniami nosa.</li>
	<li>Poproś uczestnika, aby siedział nieruchomo i przechylił głowę w kierunku sufitu. Niech mniejsze lub bardziej niespokojne dzieci usiądą na rękach i/lub położą się, aby uniknąć odgarniania zarośli.</li>
	<li>Wyceluj pędzelkiem w tył nosa, gdzie przejście zwęża się (wygląda jak mała). Przesuń szczoteczkę w dół i przekręć nadgarstki, gdy szczoteczka jest wyjmowana z nozdrza.</li>
	<li>Umieść pędzel w stożku i zanurz w BEGM. Odetnij nadmiar szczotki i załóż nakrętkę na rurkę. NIE WIROWAĆ. 
	UWAGA: Jeśli uczestnik jest chętny, zaopatrz się w drugą szczotkę w ten sam sposób, ale w drugie nozdrze. Uzyskanie szczotkowania obu nozdrzy spowoduje większe prawdopodobieństwo, że pobieranie próbek zakończy się sukcesem. Pobranie próbki z tego samego nozdrza może spowodować krwawienie i prawdopodobnie nie poprawi jakości próbki.</li>
	<li>Podczas transportu próbki należy przechowywać w temperaturze jak najbliżej 37 °C, używając zlewki z ciepłą wodą.</li>
</ol>
2. Liczba komórek i cytospina
<ol>
	<li>Delikatnie wymieszać szczoteczkę w BEGM i pobrać 10 μl próbki do zliczania komórek za pomocą hemacytometru. Dodać 10 μl żywej/martwej plamy i policzyć pod mikroskopem tylko żywe komórki.</li>
	<li>Pobrać 50 μl próbki i rozcieńczyć do 200 μl za pomocą 1x PBS. Dodać do lejka cytospinowego przymocowanego do szkiełka i wirować z prędkością 300 obr./min przez 2 min. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia O/N i bejca zgodnie z instrukcjami producenta. Pozostawić do wyschnięcia, najlepiej w ciemności.</li>
	<li>Szkiełko do plam z bejcą Hema 3
	<ol>
		<li>Przenieś każdy roztwór (utrwalacz Hema, jasnoniebieski; Hema 3 Roztwór I, różowy; i Hema 3 Roztwór II, ciemnoniebieski) do naczynia barwiącego; Przechowywać pod przykryciem, gdy nie jest używane. Włóż szkiełka do łodzi do barwienia szkiełek</li>
		<li>Zanurz szkiełka w sposób ciągły w utrwalaczu przez 30 sekund, a następnie pozwól nadmiarowi spłynąć. Zanurz szkiełka w sposób ciągły w roztworze I przez 30 sekund, a następnie pozwól nadmiarowi spłynąć. Zanurz szkiełka w sposób ciągły w roztworze II przez 30 sekund, a następnie pozwól nadmiarowi spłynąć</li>
		<li>Spłucz wodą dejonizowaną, aż woda będzie czysta. Pozostawić do wyschnięcia, najlepiej w ciemności</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spójrz na szkiełko pod mikroskopem i policz komórki, określ procent komórek nabłonka. Powinna wynosić 90% lub więcej, jeśli próbkowanie jest dobre.</li>
</ol>
3. Komórki wysiewające
UWAGA: Przeprowadź wszystkie procedury hodowli komórkowej w odpowiednim i certyfikowanym kapturze do hodowli tkankowej przy użyciu sterylnej techniki.
<ol>
	<li>Pokryć płytki z bydlęcym kolagenem skórnym (BDC), typ 1. Dodać 0,5 ml 3 mg/ml BDC rozcieńczonego w 49,5 ml 1x PBS. Przygotuj mniej, jeśli będzie używanych tylko kilka talerzy. Pokryć kolbę T25 2 ml BDC i inkubować w sterylnym kapturze O/N lub w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, jeśli to konieczne.</li>
	<li>Po inkubacji odessać pozostały płyn. Wystaw kolby na działanie światła UV przez 30 minut w sterylnym kapturze. Kolby przechowywać przez okres do jednego miesiąca w temperaturze 4 °C, ale przed wysiewem komórek doprowadzić je do temperatury RT lub 37 °C.</li>
	<li>Przechowywać pędzel i komórki w BEGM w temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do wysiewu. Delikatnie przetrzyj szczotkę w stożku, ale nie wiruj.
	<ol>
		<li>Płytka 7 x 105 komórek w kolbie T25. Jeśli jest mniej, użyj mniejszego pojemnika, takiego jak jeden dołek na płytce 6-dołkowej. Ten rozmiar płytki wymaga około 3 x 105 komórek. 
		UWAGA: Jeśli nie ma tak wielu komórek, nie zaleca się kontynuowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pod sterylnym kapturem wyjąć szczoteczkę z tubki i delikatnie obrócić szczoteczkę na powierzchni powlekanej kolby, uważając, aby nie zarysować powłoki. Wyrzuć szczotkę do odpowiedniego pojemnika na zagrożenie biologiczne.</li>
	<li>Powoli odpipetować pozostałe komórki z BEGM ze stożka do kolby T25. Obserwuj komórki pod mikroskopem. Obserwowana będzie pewna liczba pływających komórek, a z nosa mogą znajdować się pewne zanieczyszczenia, co jest dopuszczalne na tym etapie (ryc. 3A).</li>
</ol>
4. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Po wysianiu komórek pozwól im osiąść przez 48 godzin bez zakłóceń (ryc. 3). Po 48 godzinach powoli i delikatnie dodać 2 ml ciepłego BEGM i 20 μl sterylnego Penicilin/Streptomycyny/Fungizonu (P/S/F). 
	UWAGA: NIE zasysaj oryginalnych 2 ml podłoża.</li>
	<li>W 4 dniu po wysiewie ostrożnie odessać cały płyn i zastąpić 4 ml świeżego, podgrzanego BEGM plus 1x Pen/Strep (fungizon nie jest już potrzebny). Zmieniaj pożywkę co dwa dni i oceniaj komórki pod kątem przyczepienia, wzrostu i zbiegu. Kiedy komórki osiągną ~80% konfluencji, zwykle w ciągu 2-3 tygodni, są gotowe do przejścia.</li>
	<li>Jedna kolba T25 (około 2,5 x 106 komórek w przypadku zlewania się) może być przepuszczona do trzech kolb T25 lub jednej kolby T75. Po pierwszym pasażu komórki powinny być mocne i zdrowe, osiągając zbieg mniej więcej co trzy dni.</li>
</ol>
5. Komórki pasujące
<ol>
	<li>Delikatnie zassać podłoże z płytki. Dodać 1 ml 0,05% roztworu trypsyny na kolbę T25 do płytki i umieścić w inkubatorze na około 4 minuty lub do momentu, gdy komórki oderwą się od płytki. Sprawdzaj poziom odklejania się komórek co 2 minuty i nie pozostawiaj Trypsyny włączonej dłużej niż 10 minut.</li>
	<li>Dodaj 5 ml roztworu neutralizującego trypsynę (TNS) lub pożywki zawierającej surowicę, aby zneutralizować enzym. Usunąć cały płyn i komórki z kolby i umieścić w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g (przyspieszenie 0 opóźnienie 0) przez 5 minut w celu uzyskania osadu komórkowego. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w BEGM + P/S w objętości wymaganej dla nowych kolb (4 ml dla kolby T25, 10 ml dla kolby T75)</li>
	<li>Przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą żywej/martwej plamy, jak opisano powyżej (2.1). Dodać odpowiednią ilość BEGM i komórek do kolb powlekanych i powrócić do inkubatora. Przechowywać zgodnie z powyższymi opisami lub kriokonserwować w pożywce zamrażającej (70% BEGM, 20% FBS i 10% DMSO) w stężeniu 0,5-2 x 106 komórek na ml.</li>
</ol>
6. Przeprogramowanie na iPSC
UWAGA: Zanim zaczniesz tworzyć iPSC, upewnij się, że przestrzegasz wszystkich przepisów instytucjonalnych regulujących generowanie i używanie ludzkich iPSC. Sterylna technika jest szczególnie ważna w przypadku hodowli iPSC, ponieważ pożywka hodowlana nie zawiera rutynowo antybiotyków. Bardzo ważne jest, aby NEC wydawały się zdrowe i silnie proliferacyjne dla pomyślnego przeprogramowania.
<ol>
	<li>Płytka: 5 x 105 NEC na basenik z 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Po 24 godzinach dodać polibren do BEGM do końcowego stężenia 8 μg/ml i przeprowadzić NEC poprzez dodanie do pożywki cząstek lentiwirusowych eksprymujących Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc. Dąż do osiągnięcia wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej ~527.
	<ol>
		<li>Aby określić MOI, należy przygotować seryjne rozcieńczenia skoncentrowanego lentiwirusa i przeprowadzić transdukcję komórek HT1080 tymi rozcieńczeniami. Po pierwszym jednoznacznym wykryciu ekspresji dTomato w komórkach HT1080, oblicz liczbę "jednostek transdukcyjnych/ml", oceniając liczbę komórek dTomato-dodatnich/małych skupisk komórek w każdym rozcieńczeniu. 
		UWAGA: Zazwyczaj będą rozcieńczenia, które są zbyt wysokie (wszystko jest dodatnie dTomato) i zbyt niskie (brak lub tylko kilka dodatnich komórek).</li>
		<li>Przeprowadzić punktację z rozcieńczeń, w których zidentyfikowano dyskretnie dodatnie komórki/małe skupiska komórek. Oznaczyć miano, korygując liczbę jednostek kroczących/ml za pomocą odpowiedniego współczynnika rozcieńczenia. MOI jest wtedy stosunkiem liczby transdukowanych komórek do liczby cząstek wirusa 27, 
		UWAGA: Zakłada się, że każda komórka/mała grudka dTomato dodatnia powstaje z pojedynczej cząsteczki wirusa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Około 3 godziny po transdukcji usuń pożywkę i zastąp ją świeżym BEGM. Należy odrzucić pożywki zawierające lentiwirusa przy użyciu procedur zatwierdzonych przez instytucję. Zwróć transdukowane NEC do inkubatora na 3 dni.</li>
	<li>W 3 dniu zastąp pożywkę świeżym BEGM, a następnie inkubuj przez kolejne 3 dni. Odessać zużytą pożywkę, przemyć komórki 1x PBS i dodać 1 ml 0,05% roztworu trypsyny do studzienki. Pasaż komórek z trypsyną, jak opisano powyżej (sekcja 5). Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 4 ml BEGM + P/S. Komórki można przenieść do nowego dołka na 6-dołkowej płytce pokrytej BDC lub dodać do kultur MEF, jeśli są gotowe (patrz następny krok).</li>
	<li>Przygotuj płyty pokryte MEF. W dniu 4 dodać 0,1% roztwór żelatyny (1 ml / basenik) do 2 dołków z 6 dołkami (aby wykonać +/- tiazowiwinę (SPT), patrz krok 6.6). Następnego dnia rozmrozić fiolkę z inaktywowanymi MEFami 28.</li>
	<li>Umieścić MEF w 10 ml pożywki MEF (DMEM + 1x NEAA + 10% dFCS). Wirować w 200 x g przez 5 minut, aby opluć. Ponowne zawieszanie na nośniku MEF. Odessać żelatynę z płytki 6-dołkowej i dodać 1,87 x 105 MEF na dołek z pokrytej żelatyną płytki 6-dołkowej. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C lub przez minimum 24 godziny.</li>
	<li>Przenieść 2 ml BEGM zawierającego transdukowane komórki na studzienkę do 2 dołków uprzednio pokrytej płytki 6-dołkowej i inkubować O/N. Następnego dnia zastąpić BEGM 2,5 ml na studzienkę standardowej pożywki hESC zawierającej 4 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów. Karmić komórki świeżą pożywką hESC +/- SPT codziennie przez 10 dni 
	UWAGA: Możliwe jest dodanie koktajlu małych cząsteczek (SB431542, PD0325901 i koktajlu tiazowiwinów (SPT)) w celu zwiększenia wydajności i kinetyki przeprogramowania dla NEC 23.</li>
	<li>Po dziesięciu dniach kontynuuj codzienne karmienie przy użyciu pożywek hESC bez SPT. Codziennie podawaj kultury, aż pojawią się kolonie podobne do hESC (Figura 5A, kolonia P0). Zidentyfikuj kolonie zawierające przypuszczalne iPSC na podstawie ich wysokiego stosunku jądra do cytoplazmy i wydatnych jąderek.</li>
	<li>Ręczne wycinanie i przenoszenie kolonii o morfologii podobnej do hESC w celu oddzielenia studzienek do hodowli i ekspansji jako oddzielnych linii w systemie bez karmienia. Wycięte rodziny powinny szybko przystosować się do tych warunków.
	<ol>
		<li>Po posianiu wyciętych kolonii te dyskretne przypuszczalne linie iPSC są teraz uważane za przejście 1 (p1). Codziennie podawaj kultury bakterii za pomocą mTeSR1. Przechodzenie i rozszerzanie linii iPSC przy użyciu standardowych procedur. Może minąć od kilku dni do tygodnia, zanim kolonie p1 osiągną rozmiar, przy którym powinny być przepasywane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Utrzymanie iPSC w kulturze
<ol>
	<li>Codziennie karm i oceniaj kultury. Ręczne wycinanie obszarów wykazujących wyraźne zróżnicowanie poprzez skrobanie sterylną szklaną pipetą lub końcówką mikropipety. Zmień nośnik po codziennym zbieraniu.</li>
	<li>Komórki pasażujące mniej więcej co cztery dni: Delikatnie odessać pożywkę, dodać 1 ml ciepłej pożywki (1 mg/ml) do dołka na płytce 6-dołkowej (połowa objętości karmienia), a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez około 4 minuty. Krawędzie kolonii zaczną się podnosić, co wygląda jak biały kontur wokół kolonii. Delikatnie zassać Dispase i przemyć 3x podgrzanym DMEM/F12.</li>
	<li>Dodać 2 ml mTeSR1 i użyć podnośnika komórkowego, aby podnieść kolonie z płytki. Użyj pipety serologicznej o pojemności 5 ml lub mikropipety P1000, aby delikatnie rozdzielić komórki, aż kolonie zostaną rozbite na mniejsze skupiska.
	<ol>
		<li>Unikaj wytwarzania bardzo małych klastrów lub pojedynczych komórek, ponieważ przeżycie i późniejsza proliferacja będą nieoptymalne. Podczas ponownego posiewania kolonii, podział 1:4 do 1:6 pozwoli utrzymać optymalną gęstość kolonii. Delikatnie usuń kolonie i pożywkę z płytki i dodaj do nowych, pokrytych matriżelem studzienek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).</li>
<li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Guenther, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure+and+gene+expression+programs+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure and gene expression programs of human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell stem cell. 7 (2), 249-257 (2010).</li>
<li>Polo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+of+origin+influences+the+molecular+and+functional+properties+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 28 (8), 848-855 (2010).</li>
<li>Ono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+nasal+epithelial+cells+using+a+Sendai+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector.</a> PloS one. 7 (8), e42855(2012).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).</li>
<li>Brennand, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+schizophrenia+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multipotent+lung+and+airway+progenitors+from+mouse+ESCs+and+patient-specific+cystic+fibrosis+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs.</a> Cell stem cell. 10 (4), 385-397 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+without+viral+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated without viral integration.</a> Science. 322 (5903), 945-949 (2008).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nat Biotechnol. 26 (7), 795-797 (2008).</li>
<li>Kuperman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+effects+of+interleukin-13+on+epithelial+cells+cause+airway+hyperreactivity+and+mucus+overproduction+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma.</a> Nat Med. 8 (8), 885-889 (2002).</li>
<li>Braunstahl, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+bronchoprovocation+in+allergic+rhinitis+patients+affects+mast+cell+and+basophil+numbers+in+nasal+and+bronchial+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 164 (5), 858-865 (2001).</li>
<li>Compalati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+link+between+allergic+rhinitis+and+asthma%3A+the+united+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+review+of+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">The link between allergic rhinitis and asthma: the united airways disease.</a> Expert review of clinical immunology. 6 (3), 413-423 (2010).</li>
<li>Crimi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+mechanical+factors+of+allergen-induced+bronchoconstriction+in+mild+asthma+and+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and mechanical factors of allergen-induced bronchoconstriction in mild asthma and rhinitis.</a> Journal of applied physiology. 91 (3), 1029-1034 (2001).</li>
<li>Djukanovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchial+mucosal+manifestations+of+atopy%3A+a+comparison+of+markers+of+inflammation+between+atopic+asthmatics%2C+atopic+nonasthmatics+and+healthy+controls%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+respiratory+journal+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Clinical+Respiratory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bronchial mucosal manifestations of atopy: a comparison of markers of inflammation between atopic asthmatics, atopic nonasthmatics and healthy controls.</a> The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 5 (5), 538-544 (1992).</li>
<li>Gaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophils+are+a+feature+of+upper+and+lower+airway+pathology+in+non-atopic+asthma%2C+irrespective+of+the+presence+of+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+experimental+allergy+%3A+journal+of+the+British+Society+for+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eosinophils are a feature of upper and lower airway pathology in non-atopic asthma, irrespective of the presence of rhinitis.</a> Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 30 (5), 663-669 (2000).</li>
<li>Hurst, J. R., Wilkinson, T. M., Perera, W. R., Donaldson, G. C., Wedzicha, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+bacteria%2C+upper+airway%2C+lower+airway%2C+and+systemic+inflammation+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Relationships among bacteria, upper airway, lower airway, and systemic inflammation in COPD.</a> Chest. 127 (4), 1219-1226 (2005).</li>
<li>Gaga, M., V, A. M., Chanez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upper+and+lower+airways%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22European+respiratory+monograph%22%5BJournal%5D)">Upper and lower airways: similarities and differences.</a> European respiratory monograph. 18, 1-15 (2001).</li>
<li>Lopez-Guisa, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+cells+from+asthmatic+children+differentially+express+proremodeling+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial cells from asthmatic children differentially express proremodeling factors.</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (4), 990-997 (2012).</li>
<li>Doi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+methylation+of+tissue-+and+cancer-specific+CpG+island+shores+distinguishes+human+induced+pluripotent+stem+cells%2C+embryonic+stem+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts.</a> Nature genetics. 41 (12), 1350-1353 (2009).</li>
<li>Poole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+childhood+asthma+with+nasal+transcriptomics+distinguishes+subphenotypes+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dissecting childhood asthma with nasal transcriptomics distinguishes subphenotypes of disease.</a> J Allergy Clin Immunol. , (2014).</li>
<li>Ji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptional+and+epigenomic+reprogramming+from+pediatric+nasal+epithelial+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptional and epigenomic reprogramming from pediatric nasal epithelial cells to induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 135 (1), 236-244 (2015).</li>
<li>Guajardo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+gene+expression+profiles+in+nasal+respiratory+epithelium+reflect+stable+versus+acute+childhood+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Altered gene expression profiles in nasal respiratory epithelium reflect stable versus acute childhood asthma.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 115 (2), 243-251 (2005).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+pluripotent+stem+cells+become+even+more+accessible%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-specific pluripotent stem cells become even more accessible.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 1-2 (2010).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+cell+type+can+influence+the+epigenome+and+differentiation+potential+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Donor cell type can influence the epigenome and differentiation potential of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 29 (12), 1117-1119 (2011).</li>
<li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19 (4), 782-789 (2011).</li>
<li>Wicell. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Wicell+Feeder+Based+%28MEF%29+Pluripotent+Stem+Cell+Protocols%22">Wicell Feeder Based (MEF) Pluripotent Stem Cell Protocols</a>. , (2003).</li>
<li>Harkema, J. R., Carey, S. A., Wagner, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nose+revisited%3A+a+brief+review+of+the+comparative+structure%2C+function%2C+and+toxicologic+pathology+of+the+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">The nose revisited: a brief review of the comparative structure, function, and toxicologic pathology of the nasal epithelium.</a> Toxicol Pathol. 34 (3), 252-269 (2006).</li>
<li>Allegrucci, C., Young, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Differences between human embryonic stem cell lines.</a> Hum Reprod Update. 13 (2), 103-120 (2007).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+stem+cell+advances%3A+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+stem+cell-based+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration.</a> Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).</li>
<li>Pasca, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+iPSC-derived+neurons+to+uncover+cellular+phenotypes+associated+with+Timothy+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome.</a> Nature medicine. 17 (12), 1657-1662 (2011).</li>
<li>Lai, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternate+methods+of+nasal+epithelial+cell+sampling+for+airway+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternate methods of nasal epithelial cell sampling for airway genomic studies.</a> J Allergy Clin Immunol. , (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+chemical+and+genetic+approach+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 525-528 (2008).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mature+airway+epithelia+expressing+functional+CFTR+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein.</a> Nature biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+signature+and+memory+retention+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e7076(2009).</li>
<li>Nukaya, D., Minami, K., Hoshikawa, R., Yokoi, N., Seino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+gene+expression+and+epigenetic+memory+of+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Preferential gene expression and epigenetic memory of induced pluripotent stem cells derived from mouse pancreas.</a> Genes Cells. 20 (5), 367-381 (2015).</li>
<li>Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Epigenetic+memory%27+phenomenon+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">'Epigenetic memory' phenomenon in induced pluripotent stem cells.</a> Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).</li>
<li>Bar-Nur, O., Russ, H. A., Efrat, S., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+and+preferential+lineage-specific+differentiation+in+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+human+pancreatic+islet+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (1), 17-23 (2011).</li>
<li>Jandial, R., Levy, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+alchemy%3A+induced+pluripotent+stem+cells+retain+epigenetic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Cellular alchemy: induced pluripotent stem cells retain epigenetic memory.</a> World Neurosurg. 75 (1), 5-6 (2011).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Ohi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+DNA+methylation+underlies+a+transcriptional+memory+of+somatic+cells+in+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Incomplete DNA methylation underlies a transcriptional memory of somatic cells in human iPS cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (5), 541-549 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Komórki nabłonka nosa (NEC) są dostępną platformą do badania chorób dróg oddechowych, a NEC-iPSC oferują ekscytującą drogę do badania rozwoju, leczenia i terapii chorób 1,31,32. NEC można łatwo uzyskać bez stresujących lub potencjalnie szkodliwych procedur 6,23. Z naszego doświadczenia wynika, że pobieranie próbek błony śluzowej nosa opisane w tym protokole wydaje się być mniej stresujące i lepiej postrzegane niż pobieranie krwi u dzieci. Dlatego metoda ta może być szczególnie przydatna w populacjac...

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z ludzkich próbek (hiPSC) to szybko rozwijająca się technologia badań nad komórkami macierzystymi. Stanowią one alternatywę dla badań nad embrionalnymi komórkami macierzystymi (hESC) ze znacznie mniejszą liczbą wad etycznych i moralnych 1,2. Chociaż nie są one epigenetycznie identyczne z hESC 3-5, hiPSC oferują unikalny sposób modelowania rozwoju i fenotypów choroby, a także mogą pochodzić z tkanek istotnych dla stanu chorobowego 5-8. Nieustannie poszukuje się nowych metod generowania hiPSC w celu zidentyfikowania optymalnych typów komórek, które należy rozpocząć, jako sposobu na przygotowanie iPSC o jakości GMP odpowiednich do przeszczepienia, a także w celu zwiększenia terminowości i efektywności procesu przeprogramowania 6,9-11.
Komórki nabłonka dróg oddechowych są kluczowe w rozwoju alergicznego zapalenia 12, a nabłonek jest głównym czynnikiem wywołującym reakcje alergiczne i przebudowę dróg oddechowych poprzez interakcję z komórkami odpornościowymi i zrębowymi. Nabłonek dróg oddechowych odgrywa zasadniczą rolę w powstawaniu i utrzymywaniu się chorób płuc, takich jak astma. Jednak komórki nabłonka dolnych dróg oddechowych są trudne do uzyskania w warunkach klinicznych, zwłaszcza od zdrowych pacjentów z grupy kontrolnej i dzieci. Dane z kilku badań potwierdzają założenie, że komórki nabłonkowe błony śluzowej nosa są ważnym i praktycznym wskaźnikiem zastępczym dla komórek nabłonka dolnych dróg oddechowych 13-20, zwłaszcza podczas badania reakcji na zanieczyszczenia powietrza i alergeny. Błona śluzowa nosa składa się w ponad 90% z komórek nabłonka rzęsek dróg oddechowych, a pobieranie próbek z tych komórek nabłonka nosa (NEC) można łatwo przeprowadzić u dzieci w wieku czterech lub pięciu lat, ponieważ jest mniej inwazyjne niż inne techniki pobierania próbek komórek/tkanek i wiąże się z minimalnym ryzykiem zdarzeń niepożądanych, takich jak infekcja 20-23. Oferuje szybki i prosty sposób pobierania próbek zarówno od zdrowych, jak i chorych dzieci bez długich, niepotrzebnych i często bolesnych zabiegów bronchoskopii, które wymagają sedacji. Wcześniejsze badania wykazały, że podtypy choroby związane z ciężkością astmy można rozróżnić zarówno w błonie śluzowej nosa, jak i w próbkach komórek oskrzeli pobranych od dzieci z astmą, a ekspresja genów między tymi dwoma typami tkanek była podobna w około 90% genów niewszechobecnych 22,24. Jako źródło iPSC, NEC oferują przewagę nad innymi często stosowanymi typami komórek. Fibroblasty są często używane do generowania iPSC, ale chociaż komórki te można łatwo wyhodować z biopsji skóry, proces ten zwykle wymaga znieczulenia miejscowego, nacięcia i szwów i wiąże się z pewnym ryzykiem infekcji. W związku z tym uzyskanie świadomej zgody pacjentów na ten rodzaj biopsji może być trudne 25. Jedną z alternatyw dla fibroblastów są komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC). Jednak uzyskanie wystarczającej ilości krwi do wytworzenia iPSC od pacjentów pediatrycznych może być trudne. Ponadto istnieją ograniczenia dalszych zastosowań fibroblastów i iPSC pochodzących z komórek krwi, zwłaszcza ich zdolność do różnicowania do niektórych typów komórek 5,26. W związku z tym, biorąc pod uwagę względną dostępność i niskie ryzyko wystąpienia działań niepożądanych po ich pobraniu, NEC stanowią idealne źródło komórek do wytwarzania iPSC w populacjach pediatrycznych.
iPSC cieszą się ostatnio dużym zainteresowaniem jako platforma do badania rozwoju człowieka, generowania nowych modeli chorób oraz jako potencjalne źródło komórek do spersonalizowanych terapii. Zanim będzie można w pełni wykorzystać potencjał tej technologii, należy wyjaśnić molekularne podstawy procesu przeprogramowywania, ale na razie ten protokół i przedstawione w nim procedury wyjaśnią badania naukowe skoncentrowane na narażeniu dróg oddechowych, a także zapewnią platformę do badania skutków medycyny spersonalizowanej z udziałem iPSC.
Wspólna praca kilku laboratoriów doprowadziła do stworzenia udanej techniki nie tylko pobierania próbek błony śluzowej nosa, ale także hodowli NEC i przeprogramowania tych komórek do iPSC 23. Ten artykuł zawiera zarys protokołu zapewniającego optymalne warunki pobierania próbek, hodowli i przeprogramowywania.

<table><tbody><tr><td>15 ml stożkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>Protokół Krok 1.1.</td></tr><tr><td>Protokół BEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Krok 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep/Fungicide</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Protokół Krok 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Protokół Krok 4.a.</td></tr><tr><td>cytomiękka szczoteczka cytologiczna</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-263-357</td><td>Protokół Krok 1.2.</td></tr><tr><td>błękit trypanowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-900-CI</td><td>Protokół Krok 2.1.</td></tr><tr><td>hemytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Protokół Krok 2.1.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2438-4</td><td>Protokół Krok 2.2.</td></tr><tr><td>Klipsy do lejka cytologicznego</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td>Protokół Krok 2.2.</td></tr><tr><td>lejek cytospinowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-640-320</td><td>Protokół Krok 2.2.</td></tr><tr><td>Cytospin 4</td><td>Protokół A78300003 Fishera Scientific</td><td></td><td>Krok 2.2.</td></tr><tr><td>pusty slajd</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95933</td><td>Protokół Krok 2.2.</td></tr><tr><td>Zestaw plam hema 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td>Protokół Krok 2.2.</td></tr><tr><td>Bydlęcy kolagen skórny, typ 1</td><td>Life Technologies</td><td>A1064401</td><td>Protokół Krok 3.2.</td></tr><tr><td>Kolba T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-45</td><td>Protokół Krok 3.3.</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td>Protokół Krok 5.2.</td></tr><tr><td>Roztwór neutralizujący trypsynę</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td>Protokół Krok 5.2.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), sterylizowana termicznie w temperaturze 65 & stopni; C przez 30 min</td><td>Protokół Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Krok 5.5.</td></tr><tr><td>Dimetylosulftlenek Hybri-Max&trade;, sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni dla hybrydoma, &ge; 99.7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Protokół Krok 5.5.</td></tr><tr><td>lentiwirus policystonowy*</td><td>np. Protokół Millipore</td><td>SCR511</td><td>Krok 6.4.&nbsp; Wymienione jest komercyjne źródło wektora przeprogramowania. Rutynowo używamy plazmidu 4 w 1 opisanego przez Voelkela i innych (PMID: 20385817) do generowania we własnym zakresie policistronicznego lentiwirusa przeprogramowanego pseudotypem VSV-G. Ten plazmid można uzyskać, kontaktując się z&nbsp;</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134220</td><td>Protokół Krok 6.4.</td></tr><tr><td>Napromieniowane CF1 MEF</td><td>GlobalStem&nbsp;</td><td>Protokół GSC-6301G</td>, <td>krok 6.4.</td></tr><tr><td>Pożywki z hESC</td><td>Patrz przepis zawarty w protokole</td><td></td><td>Krok 6.11.</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Protokół Stemgent</td><td>04-0010</td><td>Krok 6.11.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Protokół Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Krok 6.11.</td></tr><tr><td>Tiazowiwina&nbsp;</td><td>Protokół Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Krok 6.11.</td></tr><tr>Protokół <td>354277</td> Matrigel <td>BD Biosciences</td> z <td>kwalifikacją hESC</td><td>, krok 6.13.</td></tr><tr><td>Płytka Corning, 6-dołkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Protokół Krok 6.13.</td></tr><tr><td>Protokół mTeSR1</td><td>StemCell</td><td>5850</td><td>Krok 6.13.</td></tr><tr><td>Jednorazowa kolba filtrująca o pojemności 250 ml (0,22 &mikro; m)</td><td>Fisher</td><td>SCGP-U02-RE&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dispase</td><td>StemCell</td><td>7923</td><td>Protokół Krok 7.3.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Protokół Krok 7.3.</td></tr><tr><td>podnośnik komórkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td>Protokół Krok 7.4.</td></tr><tr><td>hESC Media**</td><td></td><td></td><td>Protokół Krok 6.11. składniki należy wymieszać, a następnie wysterylizować filtrem. Nośnik można przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C przez okres do dwóch tygodni. Podczas podgrzewania mediów nie pozostawiaj w temperaturze 37 & stopni; C dłużej niż 15 min</td></tr><tr><td>DMEM-F12 50/50 media</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 11330-032</td><td>Stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Serum zastępcze KO (KO-SR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>0,2</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>55 mM &szlig;-merkaptoetanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>100x aminokwasy endogenne</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1x</td></tr><tr><td>2 &mikro; g/ml Zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (b-FGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

hoduj pierwotne komórki nabłonka nosa od dzieci i przeprogramuj je w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Komórki nabłonka nosa (NEC) są częścią dróg oddechowych, które reagują na zanieczyszczenia powietrza i są pierwszymi komórkami zakażonymi wirusami układu oddechowego. Są również zaangażowane w wiele chorób dróg oddechowych poprzez ich wrodzoną odpowiedź immunologiczną i interakcję z komórkami odpornościowymi i zrębu dróg oddechowych. NEC są szczególnie interesujące w badaniach z udziałem dzieci ze względu na ich dostępność podczas wizyt klinicznych. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) zostały wygenerowane z wielu typów komórek i są potężnym narzędziem do modelowania rozwoju i chorób człowieka, a także do ich potencjalnych zastosowań w medycynie regeneracyjnej. Jest to pierwszy protokół, który określa metody pomyślnego generowania iPSC z NEC pochodzących od uczestników pediatrycznych do celów badawczych. Opisano, jak uzyskać komórki nabłonka nosa od dzieci, jak wygenerować pierwotne kultury NEC z tych próbek oraz jak przeprogramować pierwotne NEC w dobrze scharakteryzowane iPSC. Próbki błony śluzowej nosa są przydatne w badaniach epidemiologicznych związanych ze skutkami zanieczyszczenia powietrza u dzieci i stanowią ważne narzędzie do badania chorób dróg oddechowych. Pierwotne komórki nosa i pochodzące z nich iPSC mogą być narzędziem dostarczającym nieograniczonego materiału do badań specyficznych dla pacjenta w różnych obszarach biologii nabłonka dróg oddechowych, w tym badań nad astmą i POChP.

Początkowa część nosa, nazywana przedsionkiem nosa, jest obszarem otoczonym chrząstką 29. Pędzel musi gładko przejść przez ten obszar nosa, poza zastawką nosową (ostium internum, czyli „czarną dziurą” widoczną z tyłu nozdrza), a próbkę pobiera się z małżowiny dolnej (Rycina 1). Małżowiny nosowe to struktury kostne, które zwiększają powierzchnię nosa 29, co czyni je idealnym miejscem do pobierania próbek. Obszar ten jest również wyścielony unaczynioną...

Ta publikacja demonstruje metody skutecznego pobierania próbek i hodowli błony śluzowej nabłonka nosa od dzieci oraz przeprogramowania tych komórek na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC).

Hoduj pierwotne komórki nabłonka nosa od dzieci i przeprogramuj je w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla komórek nabłonka nosowego pobranych od dzieci i ich przeprogramowanie do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu chorób dróg oddechowych, takie jak mechanizm rozwoju astmy. Główną zaletą tej techniki jest możliwość pobrania komórek nabłonka dróg oddechowych od dzieci bez konieczności stosowania stresujących procedur.W hodowli stanowią one populację homogeniczną i służą jako doskonałe źródło do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs). Pomysł na to badanie pojawił się u nas po rozmowie z dr. Ji i dr. Hershey na temat ich projektu mającego na celu pozyskanie komórek nabłonka mezoestela u dzieci w celu zbadania zmienności epigenetycznej w astmie i zanieczyszczeniu powietrza.Wizualna demonstracja tych technik jest kluczowa, ponieważ pobieranie wymazów z nosa oraz reprogramowanie komórek nabłonka nosa do iPSC są trudnymi technikami do opanowania, gdyż opierają się one na osobistym doświadczeniu, a nie na ustalonych protokołach. Przed wizytą uczestnika przenieś 2 mL świeżej pożywki do wzrostu nabłonka oskrzelowego, w skrócie BEGM, do stożkowej probówki o pojemności 15 mL. Następnie do pożywki dodaj 20 µL mieszaniny penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B do stężenia końcowego 0,01%. Po przybyciu uczestnika poproś go o zajęcie miejsca na krześle.Następnie, bezpośrednio przed pobraniem próbki, otwórz szczoteczkę cytologiczną i nie dotykaj jej żadnych powierzchni, aby zapewnić zachowanie sterylności. Poinstruuj uczestnika, aby siedział nieruchomo i odchylił głowę do góry w stronę sufitu. Jeśli uczestnik jest niespokojny, poproś go, aby usiadł na własnych dłoniach, aby nie próbował odsunąć szczoteczki.Następnie nakieruj i wprowadź szczoteczkę do tylnej części nosa, w miejscu, gdzie przejście się zwęża. Po tym usuń szczoteczkę z nozdrza, wysuwając ją ruchem obrotowym nadgarstka. Kontynuuj, umieszczając szczoteczkę w wcześniej przygotowanej probówce stożkowej i upewniając się, że jest ona zanurzona w BEGM.Następnie odetnij nadmiar szczoteczki i zakręć nakrętkę na probówce. Po pobraniu próbki natychmiast umieść ją w zlewce wypełnionej ciepłą wodą, aby utrzymać temperaturę jak najbliższą 37°C. Następnie przetransportuj ją do laboratorium.Po dostarczeniu do laboratorium, delikatnie wymieszaj szczoteczkę w BEGM. Następnie pobierz 10 µL próbki i dodaj do niej 10 µL barwnika do żywych i martwych komórek. Następnie nanieś tę mieszaninę na hemocytometr.Następnie należy policzyć pod mikroskopem tylko żywe komórki. Po zliczeniu komórek należy pobrać 50 µL próbki i rozcieńczyć ją do 200 µL przy użyciu 1X PBS. Pozostałą część nierozcieńczonej zawiesiny komórkowej, wraz z pędzelkiem, należy przenieść do kąpieli wodnej o regulowanej temperaturze 37 °C do momentu wysiewania komórek.Następnie należy przenieść próbkę rozcieńczoną w PBS do lejka do cytocentryfugi przymocowanego do szkiełka przedmiotowego. Cały aparat należy wirować z prędkością 400 rpm przez dwie minuty. Po tym czasie należy zdjąć lejek i pozostawić szkiełko do wyschnięcia przez noc w ciemności.Po zabarwieniu preparatu barwnikiem Hema 3, zgodnie z opisanym w protokole tekstem, należy poddać go obserwacji pod mikroskopem i policzyć komórki. Zidentyfikować komórki nabłonkowe po ich charakterystycznych cechach: kolumnowym kształcie, obecności rzęsek oraz jednym okrągłym jądrze, a następnie wyznaczyć procentowy udział tych komórek w preparacie.Aby rozpocząć wysiewanie, delikatnie zamieszaj pędzelkiem wewnątrz probówki stożkowej w certyfikowanym dygestorze do hodowli tkanek, a następnie wyjmij go z probówki. Następnie delikatnie obracaj pędzelkiem na wewnętrznej powierzchni kolby T25, wcześniej pokrytej kolagenem skórnym bydlęcym, uważając, aby nie uszkodzić powłoki. Pędzelek należy następnie wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady biologiczne.Powoli przenieś za pomocą pipety pozostałe komórki w BEGM z probówki stożkowej do kolby T25, w ilości co najmniej 7 × 10⁵ komórek. Następnie obserwuj komórki pod mikroskopem odwróconym. Po hodowli i pasażowaniu komórek, zgodnie z opisem w tekście, wysiej 5 × 10⁵ komórek nabłonka nosowego w 2 mL BEGM na każdą studzienkę sześciostudzienkowej płytki hodowlanej.Następnie inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Po inkubacji upewnij się, że komórki intensywnie proliferują. Następnie, pracując pod wyciągiem, dodaj Polybrene do każdej studni zawierającej BEGM do końcowego stężenia 8 µg/mL.Przystąp do transdukcji komórek nabłonka nosa poprzez dodanie do medium w każdej studzience cząsteczek lentiwirusowych wykazujących ekspresję Oct4, Sox2, Klf4 oraz c-Myc, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po inkubacji transdukowanych komórek przez około trzy godziny, usuń medium zawierające wirusa i zutylizuj je zgodnie z zatwierdzonymi procedurami instytucjonalnymi. Następnie zastąp to medium pożywką BEGM i przenieś transdukowane komórki nabłonka nosa z powrotem do inkubatora.Po trzech dniach wymienić pożywkę na świeże BEGM. Następnie inkubować transdukowane komórki w tych samych warunkach. Następnego dnia dodać 0,1% roztwór żelatyny do dwóch studzienek płytki 6-studzienkowej, aby rozpocząć przygotowywanie płytek pokrytych zarodkowymi fibroblastami mysimi.Następnie przykryj płytkę odpowiednią pokrywką i inkubuj ją przez noc w temperaturze 37 °C. W piątym dniu rozmroź fiolkę zawierającą około 5 × 10⁵ inaktywowanych embrionalnych fibroblastów mysich, w skrócie MEFs. Następnie przenieś komórki do 10 ml pożywki MEF.Następnie wirować je z prędkością 200 x g przez pięć minut. Po tym czasie odprowadzić nadsącz i resuspender MEFs w tym samym medium. Po przeliczeniu tych komórek, odessać roztwór żelatyny z wcześniej przygotowanej płytki sześciodołkowej.Następnie do każdej powlekanej żelatyną studni płytki należy dodać 1,87 × 10⁵ MEFs i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 24 godziny. Następnie, w szóstym dniu hodowli, należy odessać zużyte medium z przetransportowanych komórek i przemyć je w 1X PBS. Następnie do każdej studni płytki dodaje się 1 ml 0,05% roztworu trypsyny.Po odłączeniu komórek należy je zneutralizować za pomocą roztworu neutralizującego trypsynę (TNS), a następnie zebrać i odwirować komórki zgodnie z wcześniej omówioną procedurą. Po wirowaniu należy odessać nadsącz i resuspenderć komórki w czterech mililitrach BEGM uzupełnionego o penicylinę i streptomycynę. Następnie należy wprowadzić dwa mililitry tej zawiesiny komórkowej do każdej z dołków uprzednio przygotowanej płytki pokrytej żelatyną i MEF.Po inkubacji komórek przez noc, zastąpić BEGM 2,5 mililitrami standardowej pożywki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (w skrócie hESC), zawierającej cztery nanogramy na mililitr podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów. Kontynuować hodowlę komórek, dostarczając im codziennie świeżą pożywkę hESC, aż do momentu zaobserwowania w kulturach kolonii przypominających hESC, zawierających domniemane indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Kolonie te należy ręcznie wyciąć i przenieść do osobnych studzienek płytki 24-dołkowej w celu ich hodowli i ekspansji jako oddzielne linie w systemie bezkomórkowym (feeder-free).Początkowo próbki z nosa stanowią mieszaninę różnych typów komórek i szczątków komórkowych. Jednak po hodowli i zmianach pożywki w preparatach zaczynają przeważać komórki nabłonkowe, co pokazano na tym zdjęciu wykonanym jeden dzień po pasażowaniu komórek. Tutaj komórki nabłonkowe, rosnąc do stanu konfluencji, wykazują duże jądra i rozciągniętą cytoplazmę.Ze względu na właściwości cząsteczek lentiwirusowych użytych w tej badaniu, po transdukcji komórki nabłonka nosowego wykazują ekspresję fluorescencyjnego markera tdTomato, co pokazano na górnym prawym zdjęciu komórek, wykonanym cztery dni po transdukcji. Porównanie z odpowiadającym mu zdjęciem w jasnym polu wykazuje, że nie każda komórka wykazuje sygnał tdTomato, co potwierdza nałożony obraz na dole. Zatem nie każda komórka została poddana transdukcji.Jednakże wydajność transdukcji wynosi około 90%. Kiedy transdukowane komórki nabłonka nosa są hodowane zgodnie z opisem w protokole, powstają z nich kolonie iPSC. Po zbiorze kolonii iPSC i hodowli w standardowych warunkach bez komórek dokarmiających, poszczególne komórki w takich koloniach wykazały typową morfologię przypominającą hESC, taką jak okrągły kształt, duże jądro i wysoki stosunek jądra do cytoplazmy, co pokazano na tym powiększonym obrazie. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w półtorej godziny.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o prawidłowym pobraniu próbki, utrzymaniu komórek w temperaturze 37°C oraz jak najszybszym ich wysianiu z zachowaniem odpowiedniej gęstości. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak stworzenie interfejsu powietrze-ciecz z wykorzystaniem pierwotnych komórek nabłonka nosowego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, jak reagujemy na alergeny i patogeny drogą powietrzną. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom do modelowania takich chorób jak astma, POChP i mukowiscydoza.Technika ta pomaga również badać wpływ czynników środowiskowych na rozwój płuc w ludzkim systemie in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak hodować komórki nabłonka nosowego dzieci oraz jak generować iPSC z tej populacji. Ponieważ pracujemy z ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi oraz indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi, należy pamiętać o stałym przestrzeganiu wytycznych instytucjonalnych i krajowych.

cultivate-primary-nasal-epithelial-cells-from-children-reprogram-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy tutaj metodę pobierania biopsji błony śluzowej węchowej z jam nosowych szczura i człowieka. Biopsje te mogą być wykorzystane do identyfikacji anomalii molekularnych w chorobach mózgu lub do izolacji wielopotencjalnych dorosłych komórek macierzystych, które mogą zostać użyte do transplantacji komórkowej w zwierzęcych modelach urazów i chorób mózgu.

Izolowanie komórek macierzystych węchowych z nosa gryzoni lub ludzi

Komórki nabłonka nosa, uzyskane poprzez powierzchowną biopsję zeskrobaną ludzkich ochotników, są rozszerzane i przenoszone do wkładek do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, dając kultury komórek rzęskowych i nierzęskowych. Zróżnicowane hodowle komórek nabłonka nosa dostarczają realnych modeli eksperymentalnych do badania błony śluzowej układu oddechowego.

Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Ekspansja ludzkich pediatrycznych komórek nabłonka przełyku za pomocą warunkowego przeprogramowania dostarcza badaczom specyficznej dla pacjenta populacji komórek, które mogą być wykorzystane do inżynierii konstrukcji przełyku do autologicznej implantacji w celu leczenia wad lub urazów i służyć jako rezerwuar dla terapeutycznych testów przesiewowych.

Warunkowe przeprogramowanie pediatrycznych ludzkich komórek nabłonka przełyku do wykorzystania w inżynierii tkankowej i badaniach chorób

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Bezpośrednie przeprogramowanie neuronów generuje neurony, które utrzymują wiek początkowej komórki somatycznej. W tym miejscu opisujemy pojedynczą metodę opartą na wektorach do generowania indukowanych neuronów z fibroblastów skóry uzyskanych od dorosłych dawców ludzkich.

Proste generowanie wysokowydajnej kultury indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Tutaj opisujemy izolację, amplifikację i różnicowanie pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka nosa (HNE) na granicy powietrze-ciecz oraz protokół biobankowania pozwalający na skuteczne zamrażanie, a następnie rozmrażanie amplifikowanego HNE. W protokole analizowane są właściwości elektrofizjologiczne zróżnicowanych komórek HNE i korekcja wydzielania chlorków związanych z CFTR po różnych zabiegach modulatorowych.

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka nosa: biobankowanie w kontekście medycyny precyzyjnej

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Naucz się metody nieinwazyjnej izolacji komórek nabłonka nosa od dzieci i ich przeprogramowania w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste. Technika ta umożliwia badanie astmy i chorób dróg oddechowych.

Hoduj pierwotne komórki nabłonka nosa od dzieci i przeprogramuj je w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Przeglądaj więcej filmów