Hoduj pierwotne komórki nabłonka nosa od dzieci i przeprogramuj je w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Ogólnym celem tej procedury jest wyhodowanie komórek nabłonka nosa uzyskanych od dzieci i przeprogramowanie ich w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób napowietrzonych, takie jak przebieg astmy. Główną zaletą tej techniki jest to, że pobiera komórki nabłonka dróg oddechowych od dzieci bez stresujących zabiegów.

W hodowli znajdują się one w jednorodnej populacji i służą jako doskonałe źródło do wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub iPSC. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tego badania, kiedy rozmawialiśmy z doktorami Ji i Hershey o ich badaniu polegającym na zbieraniu komórek mezonabłonkowych od dzieci w celu zbadania zmienności epigenetycznej w astmie i zanieczyszczeniu powietrza.

Wizualna demonstracja tych technik ma kluczowe znaczenie, ponieważ pobieranie próbek z nosa i przeprogramowywanie komórek nabłonka nosa do iPSC jest techniką trudną do nauczenia, ponieważ opiera się na osobistym doświadczeniu, a nie na ustalonych protokołach. Przed wizytą uczestnika przenieś dwa mililitry świeżej pożywki do wzrostu nabłonka oskrzeli, w skrócie BEGM, do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Następnie do tego podłoża dodaj 20 mikrolitrów mieszaniny penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny b do końcowego stężenia 0,01%Gdy uczestnik dotrze na miejsce, skieruj go na krzesło, aby usiadł.

Następnie otwórz szczoteczkę cytologiczną bezpośrednio przed pobraniem próbki i nie dotykaj jej żadnymi powierzchniami, aby upewnić się, że pozostaje sterylna. Następnie poinstruuj uczestnika, aby siedział nieruchomo i przechylił głowę w górę w kierunku sufitu. Jeśli są niespokojne, każ im usiąść na rękach, aby nie próbowały odepchnąć szczotki.

Następnie wyceluj i włóż szczoteczkę do tylnej części nosa, gdzie przejście się zwęża. Następnie wyjmij szczoteczkę z nozdrza, przesuwając ją w dół ruchem skręcającym nadgarstka. Kontynuuj, umieszczając szczotkę we wcześniej przygotowanej stożkowej rurce i upewnij się, że jest zanurzona w BEGM.

Następnie odetnij nadmiar szczotki i zamocuj nakrętkę na tubce. Po pobraniu próbki należy ją natychmiast umieścić w zlewce wypełnionej ciepłą wodą, tak aby była utrzymywana w temperaturze jak najbardziej zbliżonej do 37 stopni Celsjusza. Następnie przetransportuj go do laboratorium.

Po znalezieniu się w laboratorium delikatnie porusz szczoteczką w BEGM. Następnie usuń 10 mikrolitrów próbki, a do tego dodaj 10 mikrolitrów barwienia żywych/martwych komórek. Kontynuuj wprowadzanie tej mieszaniny do hemocytometru.

I policz tylko żywe komórki pod mikroskopem. Po zliczeniu komórek weź 50 mikrolitrów próbki i przystąp do rozcieńczania do 200 mikrolitrów za pomocą 1X PBS. Przenieś pozostałą część nierozcieńczonej mieszaniny komórek wraz ze szczotką do regulowanej łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do wysiewu komórek.

Kontynuuj dodawanie próbki rozcieńczonej PBS do lejka cytospinowego przymocowanego do szkiełka podstawowego. I obracaj cały aparat z prędkością 400 obr./min przez dwie minuty. Następnie wyjmij lejek i pozostaw szkiełko do wyschnięcia przez noc w ciemności.

Po zabarwieniu szkiełka preparatem Hema 3, jak omówiono w protokole tekstowym, należy go obserwować pod mikroskopem i policzyć komórki. Identyfikuj komórki nabłonkowe na podstawie ich unikalnych cech. Kształt kolumnowy, rzęski i jedno okrągłe jądro i określić procentową zawartość tych komórek w preparacie.

Aby rozpocząć wysiew, delikatnie zakręć szczotką wewnątrz stożka w certyfikowanym kapturze do hodowli tkankowych, a następnie wyjmij ją z tuby. Następnie delikatnie obróć szczoteczkę na wewnętrznej powierzchni kolby T25, uprzednio pokrytej bydlęcym kolagenem skórnym, uważając, aby nie zarysować powłoki. Następnie wyrzuć szczotkę do odpowiedniego pojemnika na zagrożenie biologiczne.

Powoli odpipetować pozostałe komórki BEGM ze stożka do kolby T25, co najmniej 7 razy 10 do piątej komórki. Przystąp do obserwacji komórek pod odwróconym mikroskopem. Po hodowli i pasażowaniu komórek, jak opisano w tekście, przejdź do płytki 5 razy 10 do piątej komórki nabłonka nosa w dwóch mililitrach BEGM na dołek sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej.

Następnie inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po inkubacji upewnij się, że komórki silnie się namnażają. Następnie dodać Polybrene do każdej studzienki zawierającej BEGM do końcowego stężenia ośmiu mikrogramów na mililitr pod wyciągiem.

Przystąp do transdukcji komórek nabłonka nosa, dodając cząsteczki lentiwirusa, wyrażające Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc do pożywki w każdym dołku, jak omówiono w protokole tekstowym. Po inkubacji transdukowanych komórek przez około trzy godziny, należy usunąć pożywkę zawierającą wirusa i wyrzucić ją, stosując procedury zatwierdzone przez instytucję. Następnie zastąp tę pożywkę BEGM i zwróć transdukowane komórki nabłonka nosa do inkubatora.

Po trzech dniach wymień podłoże na świeże BEGM. A następnie inkubować transdukowane komórki w tych samych warunkach. Następnego dnia dodaj 0,1% roztwór żelatyny do dwóch dołków sześciodołkowej płytki, aby rozpocząć przygotowywanie mysich embrionalnych płytek pokrytych fibroblastami.

Następnie przykryj płytkę odpowiednią pokrywką i inkubuj ją przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kontynuuj w piątym dniu, aby rozmrozić fiolkę zawierającą około 5 razy 10 do piątych inaktywowanych fibroblastów embrionalnych myszy, w skrócie MEF. Następnie umieść te komórki w 10 mililitrach pożywki MEF.

I kontynuuj obracanie ich z prędkością 200 x g przez pięć minut. Następnie należy odessać supernatant i ponownie zawiesić MEF w tym samym podłożu. Po zliczeniu tych komórek należy odessać roztwór żelatyny z wcześniej przygotowanej płytki sześciodołkowej.

Następnie dodaj 1,87 razy 10 do 5 MEF do każdego dołka pokrytego żelatyną płytki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny. Następnie, w szóstym dniu hodowli, odessać zużytą pożywkę z transdukowanych komórek i umyć je w 1X PBS. Następnie dodaj jeden mililitr 0,05% roztworu trypsyny do każdej studzienki płytki.

Po odłączeniu komórek przystąp do neutralizacji roztworem neutralizującym trypsynę lub TNS, a następnie zbierz i odwiruj komórki, jak omówiono wcześniej. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w czterech mililitrach BEGM, uzupełnionych penicyliną i streptomycyną. Przystąp do wprowadzania dwóch mililitrów tej zawiesiny komórkowej do każdej z dołków pokrytych żelatyną i MEF wcześniej przygotowanej płytki.

Po inkubacji komórek przez noc zastąp BEGM 2,5 mililitra standardowej ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej, w skrócie hESC, pożywki, zawierającej cztery nanogramy na mililitr podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów. Przystąp do hodowli komórek i podawaj je codziennie świeżą pożywką hESC, aż do momentu, gdy w kulturach zostaną zaobserwowane kolonie podobne do hESC, zawierające przypuszczalnie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub iPSC. Ręcznie wyciąć i przenieść te kolonie do oddzielnych studzienek na 24-dołkowej płytce w celu hodowli i rozprężania ich jako oddzielnych linii w systemie bez karmienia.

Początkowo próbki z nosa są mieszanką typów komórek i szczątków. Jednak po zmianie hodowli i pożywki komórki nabłonkowe stają się dominujące w tych preparatach, jak pokazano na tym zdjęciu, wykonane jeden dzień po pasażowaniu komórek. Tutaj komórki nabłonkowe, rosnące do zbiegu, wykazują duże jądra i rozciągniętą cytoplazmę.

Ze względu na właściwości cząstek lentiwirusowych użytych w tym badaniu, gdy takie komórki nabłonka nosa są transdukowane, wyrażają one marker fluorescencyjny tdTomato, jak pokazano na prawym górnym obrazie komórek, cztery dni po transdukcji. Porównanie z odpowiadającym mu obrazem w jasnym polu pokazuje, że nie każda komórka demonstruje sygnał tdTomato, o czym świadczy scalony obraz na dole. Tak więc nie każda komórka jest transdukowana.

Jednak skuteczność transdukcji wynosi około 90%Gdy transdukowane komórki nabłonka nosa są hodowane zgodnie z opisem w protokole, dają one początek koloniom iPSC. Po zbiorze kolonii iPSC i hodowli w standardowych warunkach bez karmników, poszczególne komórki w takich koloniach wykazywały typową morfologię podobną do hESC, taką jak okrągły kształt, duże jądro i wysoki stosunek jądra do cytoplazmy, jak pokazano na tym powiększonym obrazie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w półtorej godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o prawidłowym pobraniu próbki, utrzymaniu komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i jak najszybszym pokryciu ich płytką o odpowiedniej gęstości. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak tworzenie interfejsu powietrze-ciecz przy użyciu pierwotnych komórek nabłonka nosa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jak powietrze reaguje na alergeny i patogeny. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do modelowania chorób takich jak astma, POChP i mukowiscydoza.

Technika ta pomaga również badać wpływ środowiska na rozwój płuc w organizmie człowieka in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak hodować komórki nabłonka nosa od dzieci i generować iPSC z tej populacji. Ponieważ pracujemy z ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi i indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi, pamiętaj, aby zawsze przestrzegać wytycznych instytucjonalnych i krajowych.