Testy jakościowe i ilościowe do wykrywania i charakterystyki białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Ogólnym celem tych eksperymentów jest szybkie badanie przesiewowe i scharakteryzowanie enzymów pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Test dyfuzji mikroszkiełka i uwalniania barwnika jest przydatny do funkcjonalnego odkrywania nowych środków przeciwdrobnoustrojowych o działaniu litycznym przeciwko określonym celom, takim jak bacząca bakteria chorobozna. Główną zaletą tych technik jest to, że są proste w wykonaniu, zapewniają elastyczność w zakresie zmiany parametrów eksperymentalnych i mogą być wykonywane za pomocą sprzętu laboratoryjnego powszechnie spotykanego w większości laboratoriów mikrobiologicznych.

Przed rozpoczęciem testu dyfuzji mikroszkiełkowej należy określić stężenie enzymu przeciwdrobnoustrojowego, który ma być oceniany, za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA, zgodnie z protokołem producenta. Przeprowadzić seryjne rozcieńczanie enzymu przeciwdrobnoustrojowego, używając PBS jako buforu reakcyjnego. Dozuj białko do pojedynczych probówek do mikrofuge i dostosuj objętość do 20 mililitrów za pomocą PBS.

Następnie przygotuj 0,5% roztwór agarozy, rozpuszczając 0,25 grama agarozy w 50 mililitrach PBS. Podgrzej ten roztwór do wrzenia, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Oznaczyć wagowo wodę utraconą podczas procesu topienia i dodać z powrotem do roztworu.

Aby zahamować rozwój bakterii zanieczyszczających podczas inkubacji testu, dodaj 15 mikrolitrów 10% azydku sodu w wodzie do roztworu agarozy i dostosuj temperaturę roztworu do 50 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Jeśli jako substrat używane są żywe komórki, należy pominąć azydek sodu w roztworze agarozy. Rozmrozić zabity termicznie substrat bakteryjny na lodzie.

Ponownie zawiesić substrat bakteryjny w 12 mililitrach roztworu agarozy, aby w przybliżeniu dopasować zmętnienie do wzorca mętności równoważnej 2,0 McFarlanda. Porównaj zmętnienia roztworów, wizualizując czarną linię na białym tle przez roztwory, dodając substrat bakteryjny do agarozy, aż do osiągnięcia przybliżonego zmętnienia. Natychmiast, ale ostrożnie, odpipetuj trzy mililitry roztworu substratu agarozy do każdego mikroszkiełka, upewniając się, że roztwór nie przelewa się przez mikroszkiełko.

Po zestaleniu się szkiełek użyj świdra korkowego o średnicy 4,8 milimetra, aby przebić trzy dołki w warstwie substratu agarozowego każdego mikroszkiełka. Dodać 20 mikrolitrów każdego skorygowanego seryjnego rozcieńczenia białka do odpowiednich studzienek. Użyj albuminy surowicy bydlęcej w studzience kontroli negatywnej.

Jako kontrolę pozytywną należy użyć znanych enzymów bakteriolitycznych odpowiednich dla substratu, takich jak lizozym. Inkubuj szkiełka w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, czyli optymalnej temperaturze aktywności enzymu. Czas trwania inkubacji zależy od stężenia i aktywności specyficznej enzymu przeciwdrobnoustrojowego.

Typowy czas reakcji wynosi około 16 godzin. Po zakończeniu inkubacji obserwuj szkiełka w świetle pośrednim i uchwyć obrazy rozwijającego się testu. Używaj cyfrowej lustrzanki jednoobiektywowej z obiektywem 60 milimetrów w odległości ogniskowej około 30 centymetrów.

W teście uwalniania barwnika, który zostanie pokazany w następnym segmencie, substrat jest kowalencyjnie połączony z barwnikiem Remazol Brilliant Blue R lub RBB. Rozpocznij ten protokół od wykonania 200-milimolowego roztworu RBB. Rozpuść 1,25 grama RBB w świeżo przygotowanym roztworze wodorotlenku sodu.

Następnie ponownie zawieś zabite termicznie komórki bakteryjne w stężeniu 0,5 grama mokrej masy w 30 mililitrach roztworu RBB. W przypadku oczyszczonego peptydoglikanu należy ponownie zawiesić peptydoglikan w stężeniu 0,3 grama mokrej masy w 30 mililitrach roztworu RBB. Ponieważ kolejne etapy są takie same, niezależnie od użytego substratu, oznakowanie zostanie pokazane tylko dla komórek bakteryjnych.

Mieszaninę reakcyjną inkubować na obrotowej platformie przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając. Po sześciu godzinach przenieść mieszaninę reakcyjną do inkubatora o temperaturze czterech stopni Celsjusza i inkubować przez dodatkowe 12 godzin z delikatnym mieszaniem. Po zakończeniu inkubacji zebrać barwione podłoże przez odwirowanie przy 3000 x g przez 30 minut.

Zdekantować roztwór barwnika z osadu substratu. Dokładnie zawiesić osad w wodzie typu I, a następnie odwirować. Podlej komórki znakowane barwnikiem trzy do pięciu razy w ten sposób, aby usunąć niekowalencyjnie związany rozpuszczalny barwnik z substratów.

W celu końcowego prania przenieś porcję granulek, która zostanie użyta w teście uwalniania barwnika, do 1,5-mililitrowych probówek do mikrofuge. Supernatant z ostatniego prania powinien być klarowny, podczas gdy podłoże pozostaje niebieskie. Barwione podłoże należy przechowywać zawieszone w minimalnej ilości wody o temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż będzie gotowe do użycia.

Aby przygotować się do testu uwalniania barwnika, pozwól, aby zamrożony barwiony substrat powrócił do temperatury pokojowej i przemyj dwukrotnie buforem testowym, który został empirycznie określony dla enzymu. W tym przypadku używany jest PBS. Obliczyć objętość zawiesiny substratu, która jest potrzebna, mnożąc objętość reakcji wynoszącą 200 mikrolitrów przez liczbę testów uwalniania barwnika, które należy przeprowadzić.

W celu przygotowania zawiesiny substratu należy najpierw dodać barwione podłoże do odpowiedniej objętości PBS. Wykonaj rozcieńczenie jeden do jednego i wykonaj wstępny pomiar gęstości optycznej przy 595 nanometrach, używając PBS jako ślepej próby. Dodawać przyrostowe ilości barwionego podłoża do zawiesiny, aż do uzyskania gęstości optycznej 2,0 przy 595 nanometrach.

W tej demonstracji test uwalniania barwnika zostanie wykorzystany do określenia optymalnych warunków inkubacji białkowego środka przeciwdrobnoustrojowego. Najpierw należy przygotować podstawową zawiesinę przeciwdrobnoustrojową białka, dostosowując stężenie do jednego miligrama na mililitr za pomocą PBS, jak opisano w tekście protokołu. Następnie rozcieńczyć podstawową zawiesinę przeciwdrobnoustrojową białka do stężenia 100 nanogramów na mikrolitr.

Stężenie to daje końcową masę reakcyjną wynoszącą jeden mikrogram białka na objętość dodanego do reakcji testu. Wykonaj testy reakcji w 0,5-mililitrowych probówkach do mikrofuge dla ocenianego zakresu termicznego. Dla każdego warunku termicznego dodać 10 mikrolitrów białka podstawowego do 200 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny substratu.

Inkubować w termocyklerze przez osiem godzin z mieszaniem przez inwersję raz na godzinę. Po inkubacji zatrzymaj reakcje, dodając 25 mikrolitrów etanolu do każdej probówki do mikrofuge. Aby usunąć niestrawiony nierozpuszczalny substrat, odwirować przy 3000 x g przez dwie minuty.

Następnie, uważając, aby nie zakłócić osadu niestrawionego substratu, przenieś 150 mikrolitrów supernatantu reakcyjnego dla każdej mieszaniny reakcyjnej na 96-dołkową mikropłytkę płaskodenną. Aby określić ilościowo aktywność enzymatyczną, użyj spektrofotometru z mikropłytkami, aby zmierzyć absorbancję supernatantu przy 595 nanometrach. Zwiększona absorbancja przez rozpuszczalny barwnik uwalniany do supernatantu ze znakowanego substratu jest ilościowym pomiarem aktywności enzymatycznej.

Test dyfuzji mikroszkiełkowej wykorzystano do jakościowej oceny aktywności nieznanego białka przeciwdrobnoustrojowego w stosunku do zabitego termicznie substratu całych komórek Salmonella enterica. Środek przeciwdrobnoustrojowy dodawano w coraz większych ilościach od studzienek A do F, a PBS stosowano do kontroli ujemnych. Po sześciu godzinach zaobserwowano wielkość czystej strefy hydrolizy, która utworzyła się wokół każdego odwiertu.

Wysoka aktywność enzymatyczna odnosi się jakościowo do większej strefy, podczas gdy niska aktywność enzymatyczna jakościowo odnosi się do mniejszej strefy. Ilościowy test uwalniania barwnika wykorzystano do określenia optymalnej temperatury reakcji dla białkowego środka przeciwdrobnoustrojowego. Jak widać na podstawie ilości niebieskiego koloru w supernatantach reakcyjnych i jednostek aktywności wynikających z pomiarów absorbancji przy 595 nanometrach, optymalna temperatura wynosi 35 stopni Celsjusza.

Test uwalniania barwnika wykorzystano również do określenia zakresu aktywności nieznanego białkowego środka przeciwdrobnoustrojowego w stosunku do substratu zabitego termicznie przez Bacillus subtilis. Porównanie z zakresem aktywności alfa-chymotrypsyny wykazało, że nieznany enzym przeciwdrobnoustrojowy ma prawie dwukrotnie większe powinowactwo do substratu. Ponadto, podczas gdy aktywność alfa-chymotrypsyny zaczyna utrzymywać się na poziomie około 0,3 mikrograma, aktywność nieznanego enzymu nadal rosła we wszystkich ilościach enzymu.

Po opanowaniu test dyfuzji mikroszkiełka można zakończyć w ciągu 30 minut. Test uwalniania barwnika można zakończyć w ciągu jednej godziny. Czas inkubacji dla każdego testu będzie zależał od aktywności enzymów i ich stężeń.

Rozszerzając te procedury, metodę uwalniania barwnika można zmodyfikować w celu określenia wpływów chemicznych wpływających na aktywność enzymatyczną enzymu przeciwdrobnoustrojowego poprzez manipulowanie aspektami reakcji, takimi jak pH buforu i zasolenie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak szybko badać i charakteryzować enzymy pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej za pomocą testów dyfuzji mikroszkiełka i uwalniania barwnika.