Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Ogólnym celem tego eksperymentu jest naśladowanie transfuzji płytek krwi in vitro i przetestowanie jej przy użyciu hemostazy na kolagenie, z przepływem hydrodynamicznym i mikroskopią w czasie rzeczywistym. Pacjenci z małopłytkowością są leczeni przechowywanymi koncentratami płytek krwi. Nasza metoda ma pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu zakrzepicy i hemostazy, ze szczególnym uwzględnieniem jakości i funkcji przechowywanych w ten sposób koncentratów płytek krwi.

Wartością dodaną tej techniki jest to, że naśladuje ona przepływ krwi, a tym samym uwzględnia wpływy reologiczne na uczestniczące komórki i biomolekuły. Obecna metoda ocenia wiązanie się płytek krwi z kolagenem. Można go jednak również stosować do innych tkanek adhezyjnych, w tym blaszki miażdżycowej, komórek śródbłonka lub specyficznych białek macierzy, takich jak czynnik von Willebranda i fibrynogen.

Zacznij od przygotowania biochipa. Zwirować i rozcieńczyć zapas kolagenu od jednego do 20 w izotonicznym roztworze glukozy producenta do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr. Następnie pipetować 0,8 mikrolitra do pasów nowego jednorazowego biochipa.

Wypełnij wszystkie tory na jednym końcu chipa i oznacz go jako koniec wylotu. Następnie sprawdź chip, aby upewnić się, że każdy pas jest wypełniony roztworem w 5/6 długości i nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie inkubuj chip w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery godziny lub przez noc w nawilżonym i zamkniętym pojemniku.

Później zablokuj zakodowane kanały, pipetując bufor blokujący na drugi koniec linii. Następnie dla każdej linii wytnij 12-centymetrowe odcinki rurki i przymocuj szpilkę do każdej długości rurki, aby można je było przymocować do biochipa. Przepłukać rurki wodą destylowaną ze strzykawki i łącznika.

Następnie nasącz je buforem blokującym i zamknij w nawilżonym pojemniku na co najmniej godzinę. Następnie przygotuj pompę i kolektor. Najpierw przepłucz pompę i kolektor wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

Następnie przymocuj biochip do zautomatyzowanego stolika mikroskopu. Umieść jeden koniec długości w 1,5-mililitrowej tubie wypełnionej HBS, a następnie przymocuj je drugim końcem do wlotów biochipa. Umieść kołki kolektora w wylotach biochipa.

Następnie przepłukać system HBS za pomocą pompy. W ten sposób usunięty zostanie wszelki pozostały bufor blokujący lub słabo przylegający kolagen. Na tym kończą się przygotowania komory przepływowej.

Zacznij od zebrania ostatnich próbek krwi od zdrowych ochotników do stożkowej probówki wirówkowej. Wirować próbkę przez około 15 minut w temperaturze 250 Gs.Do nie używać hamulca, ponieważ zakłóci to luźno upakowaną dolną fazę. Usunąć i wyrzucić osocze bogatopłytkowe i okrywę koralową.

Należy zachować upakowane krwinki czerwone zawierające jak najmniejszą liczbę płytek krwi, aby wytworzyć zrekonstytuowaną krew. Teraz rozpocznij rozmrażanie czterech mililitrów plazmy typu AB w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut i 20 sekund. W międzyczasie określ hematokryt przygotowanych upakowanych krwinek czerwonych za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.

Następnie należy określić stężenie płytek krwi w skoncentrowanym roztworze płytek krwi przygotowanym przez bank krwi, który ma być użyty do rozpuszczenia krwi pełnej. Oblicz wymagane objętości na jeden mililitr odtworzonej krwi z 40% hematokrytem i 250 000 płytek krwi na mikrolitr. Teraz, za pomocą przyciętej końcówki pipety, przenieś wymaganą objętość czerwonych krwinek, osocza i koncentratu płytek krwi do pożądanego stężenia i końcowej objętości jednego mililitra.

Wymieszać rozpuszczoną krew z delikatnymi inwersjami i wykonać pełną morfologię krwi. Następnie weź przygotowaną probówkę do mikrowirówki zawierającą Calceinę AM i dodaj do niej jeden mililitr odtworzonej krwi. Wymieszaj krew z barwnikiem, stosując delikatne inwersje.

Następnie inkubować rozpuszczoną krew przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W oprogramowaniu wybierz obszar zainteresowania na torze perfuzji. Skoncentruj się na włóknach kolagenowych przylegających do dolnej części pasów przy 100-krotnym powiększeniu.

Najlepiej użyć kontrastu fazowego lub różnicowego kontrastu interferencyjnego. Wybierz opcję ustaw bieżącą literę Z dla wybranych regionów kafelków, aby cyfrowo ustalić wybrane pozycje Z. Ognisko optyczne przed perfuzją powinno być skierowane na kolagen ameloblast, ale może to być trudne.

Alternatywą jest ustawienie ostrości mikroskopu na początkowych przylegających płytkach krwi. Teraz delikatnie wymieszaj próbki i umieść je obok biochipa. Następnie należy umieścić rurkę podłączoną do obserwowanego pasa do odtworzonej krwi.

Następnie, korzystając z oprogramowania sterującego pompą, należy zastosować ciśnienie 50 dyny na centymetr kwadratowy, aby przesunąć próbkę krwi na tor i rozpocząć eksperyment. Podczas eksperymentu nagrywaj obrazy co 15 sekund przez pięć minut. Określ kinetykę wzrostu skrzepliny za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

W tym przypadku wykorzystywany jest Zen 2012. Zacznij od otwarcia analizy obrazu wtyczki, aby określić pokrycie powierzchni płytek krwi. Ustaw próg fluorescencji na karcie interaktywnej analizy, aby zdefiniować intensywność pikseli, która koreluje z sygnałem dodatnim, który pochodziłby z przylegających płytek krwi

Następnie użyj opcji utwórz tabele, aby automatycznie wygenerować arkusz kalkulacyjny z listą powierzchni sygnałów dodatnich dla każdego punktu czasowego. Zapisz te arkusze kalkulacyjne w formacie XML i otwórz je w programie arkusza kalkulacyjnego w celu dalszych obliczeń. W każdym punkcie czasowym oblicz łączną powierzchnię wybranych obiektów i wyraź tę wartość jako procent pokrytej powierzchni.

Następnie wykreśl dane w funkcji czasu perfuzji i oblicz nachylenie za pomocą regresji liniowej. Modeluje to kinetykę wzrostu skrzepliny w tym konkretnym warunku eksperymentalnym. Trzy identyczne próbki odtworzonej krwi pełnej były jednocześnie perfundowane na powierzchniach pokrytych kolagenem.

W rezultacie uzyskano współczynnik zmienności wynoszący 8,7%, co sugeruje akceptowalną zmienność wewnątrztestową i wewnątrzlaboratoryjną do porównania testów. Transfuzję symulowano poprzez odtworzenie krwi z brakującym składnikiem. Przeprowadzono kilka rekonstytucji ze zmniejszającymi się stężeniami płytek krwi.

Zgodnie z oczekiwaniami, mniejsza liczba płytek krwi powodowała mniejszą adhezję w funkcji czasu perfuzji. Następnie badano wpływ obniżenia temperatury po pobraniu krwi i podczas perfuzji. Stwierdzono, że skrzepliny narastają wolniej, gdy krew została schłodzona do temperatury pokojowej.

W porównaniu z próbką utrzymywaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cały czas trwania badania. Podczas krążenia płytki krwi wiążą się z miejscami uszkodzenia naczyń w warunkach podwyższonego obciążenia ściany. Zgodnie z oczekiwaniami, zmiana samej szybkości w mikroprzepływowych komorach przepływowych zmieniła całkowitą adhezję płytek krwi.

Warunki te zmieniają również kinetykę wzrostu skrzepliny. Po obejrzeniu tego filmu należy dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty w komorze przepływowej mikroprzepływowej przy użyciu odtworzonej krwi w celu sprawdzenia jakości i funkcji przechowywanych koncentratów płytek krwi. Tę technikę można wykonać w około siedem godzin.

Eksperymenty z mikroprzepływową komorą przepływową utorowały drogę naukowcom zajmującym się transfuzją płytek krwi do zbadania wpływu zmiennych związanych z dawstwem, przygotowaniem i przechowywaniem. Jednym z istotnych przykładów jest inaktywacja patogenów. Podaliśmy przykład tylko jednego obiektu eksperymentalnego.

Jednak różnice w stężeniu wapnia, naprężeniach przezroczystych i powłokach powierzchniowych mogą być wykorzystane do odpowiedzi na różne pytania badawcze. Podobnie jak w przypadku tej procedury, można wykonać inne pomiary w mikroprzepływowych komorach przepływowych, aby uzyskać odpowiedzi na dodatkowe pytania. Na przykład wydajność zmagazynowanych płytek krwi do koagulacji w przepływie.