Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro
March 19th, 2016
Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest naśladowanie transfuzji płytek krwi in vitro i przetestowanie jej przy użyciu hemostazy na kolagenie, z przepływem hydrodynamicznym i mikroskopią w czasie rzeczywistym. Pacjenci z małopłytkowością są leczeni przechowywanymi koncentratami płytek krwi. Nasza metoda ma pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu zakrzepicy i hemostazy, ze szczególnym uwzględnieniem jakości i funkcji przechowywanych w ten sposób koncentratów płytek krwi.
Wartością dodaną tej techniki jest to, że naśladuje ona przepływ krwi, a tym samym uwzględnia wpływy reologiczne na uczestniczące komórki i biomolekuły. Obecna metoda ocenia wiązanie się płytek krwi z kolagenem. Można go jednak również stosować do innych tkanek adhezyjnych, w tym blaszki miażdżycowej, komórek śródbłonka lub specyficznych białek macierzy, takich jak czynnik von Willebranda i fibrynogen.
Zacznij od przygotowania biochipa. Zwirować i rozcieńczyć zapas kolagenu od jednego do 20 w izotonicznym roztworze glukozy producenta do końcowego stężenia 50 mikrogramów na mililitr. Następnie pipetować 0,8 mikrolitra do pasów nowego jednorazowego biochipa.
Wypełnij wszystkie tory na jednym końcu chipa i oznacz go jako koniec wylotu. Następnie sprawdź chip, aby upewnić się, że każdy pas jest wypełniony roztworem w 5/6 długości i nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie inkubuj chip w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery godziny lub przez noc w nawilżonym i zamkniętym pojemniku.
Później zablokuj zakodowane kanały, pipetując bufor blokujący na drugi koniec linii. Następnie dla każdej linii wytnij 12-centymetrowe odcinki rurki i przymocuj szpilkę do każdej długości rurki, aby można je było przymocować do biochipa. Przepłukać rurki wodą destylowaną ze strzykawki i łącznika.
Następnie nasącz je buforem blokującym i zamknij w nawilżonym pojemniku na co najmniej godzinę. Następnie przygotuj pompę i kolektor. Najpierw przepłucz pompę i kolektor wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
Następnie przymocuj biochip do zautomatyzowanego stolika mikroskopu. Umieść jeden koniec długości w 1,5-mililitrowej tubie wypełnionej HBS, a następnie przymocuj je drugim końcem do wlotów biochipa. Umieść kołki kolektora w wylotach biochipa.
Następnie przepłukać system HBS za pomocą pompy. W ten sposób usunięty zostanie wszelki pozostały bufor blokujący lub słabo przylegający kolagen. Na tym kończą się przygotowania komory przepływowej.
Zacznij od zebrania ostatnich próbek krwi od zdrowych ochotników do stożkowej probówki wirówkowej. Wirować próbkę przez około 15 minut w temperaturze 250 Gs.Do nie używać hamulca, ponieważ zakłóci to luźno upakowaną dolną fazę. Usunąć i wyrzucić osocze bogatopłytkowe i okrywę koralową.
Należy zachować upakowane krwinki czerwone zawierające jak najmniejszą liczbę płytek krwi, aby wytworzyć zrekonstytuowaną krew. Teraz rozpocznij rozmrażanie czterech mililitrów plazmy typu AB w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut i 20 sekund. W międzyczasie określ hematokryt przygotowanych upakowanych krwinek czerwonych za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.
Następnie należy określić stężenie płytek krwi w skoncentrowanym roztworze płytek krwi przygotowanym przez bank krwi, który ma być użyty do rozpuszczenia krwi pełnej. Oblicz wymagane objętości na jeden mililitr odtworzonej krwi z 40% hematokrytem i 250 000 płytek krwi na mikrolitr. Teraz, za pomocą przyciętej końcówki pipety, przenieś wymaganą objętość czerwonych krwinek, osocza i koncentratu płytek krwi do pożądanego stężenia i końcowej objętości jednego mililitra.
Wymieszać rozpuszczoną krew z delikatnymi inwersjami i wykonać pełną morfologię krwi. Następnie weź przygotowaną probówkę do mikrowirówki zawierającą Calceinę AM i dodaj do niej jeden mililitr odtworzonej krwi. Wymieszaj krew z barwnikiem, stosując delikatne inwersje.
Następnie inkubować rozpuszczoną krew przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W oprogramowaniu wybierz obszar zainteresowania na torze perfuzji. Skoncentruj się na włóknach kolagenowych przylegających do dolnej części pasów przy 100-krotnym powiększeniu.
Najlepiej użyć kontrastu fazowego lub różnicowego kontrastu interferencyjnego. Wybierz opcję ustaw bieżącą literę Z dla wybranych regionów kafelków, aby cyfrowo ustalić wybrane pozycje Z. Ognisko optyczne przed perfuzją powinno być skierowane na kolagen ameloblast, ale może to być trudne.
Alternatywą jest ustawienie ostrości mikroskopu na początkowych przylegających płytkach krwi. Teraz delikatnie wymieszaj próbki i umieść je obok biochipa. Następnie należy umieścić rurkę podłączoną do obserwowanego pasa do odtworzonej krwi.
Następnie, korzystając z oprogramowania sterującego pompą, należy zastosować ciśnienie 50 dyny na centymetr kwadratowy, aby przesunąć próbkę krwi na tor i rozpocząć eksperyment. Podczas eksperymentu nagrywaj obrazy co 15 sekund przez pięć minut. Określ kinetykę wzrostu skrzepliny za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
W tym przypadku wykorzystywany jest Zen 2012. Zacznij od otwarcia analizy obrazu wtyczki, aby określić pokrycie powierzchni płytek krwi. Ustaw próg fluorescencji na karcie interaktywnej analizy, aby zdefiniować intensywność pikseli, która koreluje z sygnałem dodatnim, który pochodziłby z przylegających płytek krwi
.Następnie użyj opcji utwórz tabele, aby automatycznie wygenerować arkusz kalkulacyjny z listą powierzchni sygnałów dodatnich dla każdego punktu czasowego. Zapisz te arkusze kalkulacyjne w formacie XML i otwórz je w programie arkusza kalkulacyjnego w celu dalszych obliczeń. W każdym punkcie czasowym oblicz łączną powierzchnię wybranych obiektów i wyraź tę wartość jako procent pokrytej powierzchni.
Następnie wykreśl dane w funkcji czasu perfuzji i oblicz nachylenie za pomocą regresji liniowej. Modeluje to kinetykę wzrostu skrzepliny w tym konkretnym warunku eksperymentalnym. Trzy identyczne próbki odtworzonej krwi pełnej były jednocześnie perfundowane na powierzchniach pokrytych kolagenem.
W rezultacie uzyskano współczynnik zmienności wynoszący 8,7%, co sugeruje akceptowalną zmienność wewnątrztestową i wewnątrzlaboratoryjną do porównania testów. Transfuzję symulowano poprzez odtworzenie krwi z brakującym składnikiem. Przeprowadzono kilka rekonstytucji ze zmniejszającymi się stężeniami płytek krwi.
Zgodnie z oczekiwaniami, mniejsza liczba płytek krwi powodowała mniejszą adhezję w funkcji czasu perfuzji. Następnie badano wpływ obniżenia temperatury po pobraniu krwi i podczas perfuzji. Stwierdzono, że skrzepliny narastają wolniej, gdy krew została schłodzona do temperatury pokojowej.
W porównaniu z próbką utrzymywaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cały czas trwania badania. Podczas krążenia płytki krwi wiążą się z miejscami uszkodzenia naczyń w warunkach podwyższonego obciążenia ściany. Zgodnie z oczekiwaniami, zmiana samej szybkości w mikroprzepływowych komorach przepływowych zmieniła całkowitą adhezję płytek krwi.
Warunki te zmieniają również kinetykę wzrostu skrzepliny. Po obejrzeniu tego filmu należy dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać eksperymenty w komorze przepływowej mikroprzepływowej przy użyciu odtworzonej krwi w celu sprawdzenia jakości i funkcji przechowywanych koncentratów płytek krwi. Tę technikę można wykonać w około siedem godzin.
Eksperymenty z mikroprzepływową komorą przepływową utorowały drogę naukowcom zajmującym się transfuzją płytek krwi do zbadania wpływu zmiennych związanych z dawstwem, przygotowaniem i przechowywaniem. Jednym z istotnych przykładów jest inaktywacja patogenów. Podaliśmy przykład tylko jednego obiektu eksperymentalnego.
Jednak różnice w stężeniu wapnia, naprężeniach przezroczystych i powłokach powierzchniowych mogą być wykorzystane do odpowiedzi na różne pytania badawcze. Podobnie jak w przypadku tej procedury, można wykonać inne pomiary w mikroprzepływowych komorach przepływowych, aby uzyskać odpowiedzi na dodatkowe pytania. Na przykład wydajność zmagazynowanych płytek krwi do koagulacji w przepływie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie bada przetoczenie płytek krwi i hemostazy za pomocą rekonstytucji krwi i mikrofluidycznych komór przepływowych. Podkreśla wpływ uszkodzeń płytek krwi podczas przechowywania na funkcję hemostazy in vitro.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hematologia
- Zatorowość
- Hemostaza
Tło
- Pacjenci z małopłytkowością otrzymują przechowywane koncentraty płytek.
- Uszkodzenia płytek krwi podczas przechowywania mogą wpływać na funkcję hemostazy.
- Zrozumienie funkcji płytek krwi jest kluczowe dla poprawy wyników przetoczeń.
- Obecne metody oceniają interakcje płytek z kolagenem i innymi tkankami adhezywnymi.
Cel badania
- Aby naśladować przetoczenie płytek in vitro.
- Aby ocenić funkcję hemostazy na kolagenie w warunkach przepływu hydrodynamicznego.
- Aby zbadać jakość i funkcjonalność przechowywanych koncentratów płytek.
Stosowane metody
- Techniki rekonstytucji krwi.
- Mikrofluidyczne komory przepływowe do mikroskopii w czasie rzeczywistym.
- Ocenianie wiązania płytek do kolagenu.
- Zastosowanie do innych tkanek adhezywnych, takich jak plama miażdżycowa.
Główne wyniki
- Wykazane efekty uszkodzeń przechowywania na funkcji płytek.
- Dostarczyło informacji na temat zdolności hemostazy przechowywanych płytek.
- Pokazano istotność przepływu hydrodynamicznego w ocenie interakcji płytek.
- Podkreślono potencjalne zastosowania do różnych tkanek adhezywnych.
Wnioski
- Badanie oferuje nową metodę oceny skuteczności przetoczeń płytek.
- Wyniki mogą wpłynąć na praktyki kliniczne dotyczące przechowywania i przetoczeń płytek.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć implikacje dla zatorowości i hemostazy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to evaluate platelet transfusion efficacy under physiologically relevant flow conditions, addressing a critical gap in preclinical assessment of blood product quality. By simulating hemostasis in microfluidic chambers using reconstituted blood, the method provides quantitative, real-time readouts of platelet function that support go/no-go decisions in transfusion medicine development. The approach de-risks translational advancement by linking storage variables to functional outcomes, thereby improving predictive confidence in platelet product performance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding platelet function and storage lesion impact on hemostasis.
- Operational Value: Enables functional target validation of platelet concentrates under controlled shear stress and temperature conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating platelet concentration, storage duration, and temperature cycling with thrombus growth kinetics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening of platelet-modulating compounds or storage interventions.
- Reproducibility: Delivers quantitative surface coverage measurements with low intra-assay variation (8.7% CV), enabling reliable compound evaluation.
- Scalability: Supports multiplexed testing of three identical reconstituted blood samples simultaneously over collagen-coated surfaces.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models thrombocytopenia treatment scenarios using reconstituted blood to mimic clinical platelet transfusion.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by measuring hemostatic function on collagen under hydrodynamic flow.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement decisions by quantifying the impact of blood donation, transport, component separation, storage, and pathogen inactivation on platelet function.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical assessment, enabling continuous evaluation of platelet product quality across the processing chain.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of platelet storage lesions and pathway clarification of hemostasis under flow.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for evaluating platelet adhesion and thrombus growth kinetics.
- Analytics: Generates quantitative thrombus growth kinetics via image analysis and linear regression, enabling cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by simulating transfusion and measuring functional outcomes in disease-relevant shear conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for assessing platelet product quality across multiple storage variables and processing steps.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in platelet function by reducing mechanistic ambiguity in storage lesion effects.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through controlled perfusion, blocking, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking storage duration, temperature, and shear rate to functional platelet outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of platelet processing optimizations based on empirical hemostasis data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic handling, blood reconstitution, and real-time microscopy.
- Dependent on automated microscope stage, pump-manifold system, and biocompatible biochips.
- Necessitates cross-team standardization of hematocrit, platelet concentration, and perfusion pressure settings.
- Involves adaptation considerations for varying shear rates, temperature profiles, and surface coatings (e.g., collagen, VWF, fibrinogen).
- Practical limitations include the need for air bubble-free channel filling and precise Z-focus maintenance during perfusion.
