Name: Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Poznaj mikroprzepływowe komory przepływowe z rekonstytuowaną krwią do oceny hemostazy i funkcji przechowywanych płytek krwi. Ta metoda pozwala badać adhezję płytek do kolagenu w warunkach przepływu hydrodynamicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Ten protokół jest zgodny z instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi dotyczącymi badań na próbkach ludzkich i uzyskano świadomą zgodę od wszystkich zaangażowanych dawców. Zgodę na opisane tu eksperymenty uzyskano od instytucjonalnej komisji rewizyjnej Szpitala Uniwersyteckiego w Antwerpii.
Uwaga: Wskaźniki temperatury zawsze dotyczą temperatury pokojowej, chyba że określono inaczej.
1. Ustawienie komory przepływowej przygotowania
<ol>
	<li>Przygotowanie torów, rurek i sworzni
	<ol>
		<li>Energicznie wymieszać zawiesinę kolagenu i rozcieńczyć w stosunku 1/20 w izotonicznym roztworze glukozy dostarczonym przez dostawcę do końcowego stężenia 50 μg/ml. 
		Uwaga: Używamy kolagenu ścięgien koni, składającego się głównie z włókien typu I. Kolagen koni typu I jest często określany jako kolagen "Horm" i jest złotym standardem dla tego typu testu9 zarówno z powodów historycznych, jak i biologicznych. Można również stosować kolagen ludzki typu III, ale włókna słabiej się pokrywają, a odpowiedź płytek krwi nie jest tak silna. Można również stosować inne powierzchnie powłokowe, na przykład czynnik von Willebranda (VWF), fibrynogen, fibronektynę, lamininę, witronektynę, trombospondynę-1 lub kombinacje tych16.</li>
		<li>Weź nowy jednorazowy biochip z pojemnika dostawcy. Wymiary użytych tutaj biochipów to 0,4 szer. x 0,1 wys. x 20 dł. w mm3.</li>
		<li>Odpipetować 0,8 μl do pasa (pasów) mikroprzepływowego biochipa na jednym końcu chipa i oznaczyć jako wylot. Upewnij się, że pas jest wypełniony w 5/6 roztworem powlekającym zawierającym kolagen przygotowanym w 1.1.1. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza. 
		Uwaga: Kanały są częściowo powlekane, aby uniknąć gromadzenia się włókien kolagenowych przy wejściu do kanału (patrz dyskusja).</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez 4 godziny lub przez noc w wilgotnym i zamkniętym pojemniku.</li>
		<li>Zatkać powleczone kanały, pipetując bufor blokujący (1,0% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej i 0,1% (w/v) glukozy w 10 mM roztworze soli fizjologicznej buforowanym kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) (HBS; 0,9% (w/v) NaCl, pH 7,4) na drugim końcu i oznaczyć jako wlot. Upewnij się, że pas ruchu jest całkowicie wypełniony buforem blokującym, unikając pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Przyciąć rurkę na równą długość (12 cm). Użyj jednego na linię i połącz każdą rurkę za pomocą kołka. Na przykład eksperyment porównujący dwa warunki, przebieg w duplikacie będzie wymagał przygotowania czterech odcinków rurek i czterech kołków.</li>
		<li>Przepłukać rurkę wodą destylowaną za pomocą strzykawki i igły 26 G lub dołączonych łączników.</li>
		<li>Nasycić rurkę buforem blokującym. Przechowywać w zamkniętym i wilgotnym pojemniku przez minimum 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie pompy i kolektora
	<ol>
		<li>Przepłukać pompę i kolektor wodą destylowaną, usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Odessać bufor blokujący z linii (linii) biochipa za pomocą zamocowanej końcówki 10 μl na wylocie. Oczyść powierzchnię biochipa precyzyjną chusteczką bezpyłową i denaturowanym alkoholem, aby usunąć odciski i kurz.</li>
		<li>Zamocuj biochip na zautomatyzowanym stoliku mikroskopowym. Jeśli w jednym przebiegu używany jest jednocześnie więcej niż jeden tor, podłącz rozdzielacz rozdzielacza ośmiopasmowego do gniazda biochipa. 
		Uwaga: Rozdzielacz kolektora ośmiopasmowego to element sprzętowy (rysunek S1) podłączony do pompy i biochipa. Umożliwia obsługę wszystkich dostępnych (ośmiu) torów na biochipie lub kombinacji pasów, które mogą być zdefiniowane przez operatora w dołączonym oprogramowaniu.</li>
		<li>Użyj kołków w wężyku, aby zamocować je we wlocie biochipa. Umieść drugi koniec rurki (bez szpilki) w stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml wypełnionej HBS. Przepłukać wszystkie rurki i ich połączone tory 1 ml HBS za pomocą pompy, aby usunąć resztki buforu blokującego i słabo przylegający kolagen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek krwi
<ol>
	<li>Pobranie i oddzielenie świeżej krwi pełnej od zdrowego ochotnika. 17
	<ol>
		<li>Zebrać pierwsze mililitry krwi do opróżnionej probówki zawierającej kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) jako antykoagulant i używać wyłącznie tej próbki do pełnej morfologii krwi (CBC) za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.</li>
		<li>Zebrać objętość krwi w odpowiednim antykoagulantu za pomocą opróżnionych rurek. Standardowymi antykoagulantami do eksperymentów w komorze przepływowej są heparyna lub hirudyna, gdy tworzenie fibryny nie jest częścią protokołu badania, oraz cytrynian sodu, gdy jest. 
		Uwaga: Heparyna była stosowana jako antykoagulant we wszystkich eksperymentach opisanych w wynikach. 
		Uwaga: Ilość krwi zależy od liczby eksperymentów, które mają być wykonane. Około 1 probówka (7 ml) na 3 pasy.</li>
		<li>Umieść rurki na rotatorze w oczekiwaniu na rozpuszczenie krwi. 
		Uwaga: Test należy zakończyć w ciągu 3 godzin od upuszczania krwi.</li>
		<li>Wirować przez 15 minut przy 250 g w celu przygotowania osocza bogatopłytkowego (PRP). Nie używaj przerwy wirówki, aby zapobiec zakłóceniu luźno upakowanego granulatu.
		<ol>
			<li>Gdy zebrano więcej niż jedną probówkę, zebrać krew w jednej stożkowej probówce wirówkowej. 
			Uwaga: Wirowanie może odbywać się wolniej lub krócej, w zależności od preferowanej wydajności PRP i różnicowego "zanieczyszczenia" komórek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usuń i wyrzuć PRP i kożuchową sierść, w wyniku której powstają upakowane czerwone krwinki z niewielką liczbą płytek krwi. 
		Uwaga: Liczba płytek krwi w upakowanej frakcji krwinek czerwonych wynosi średnio 13 ±5 x 103 na μl (średnia ±SD, n = 12) w naszych rękach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rekonstytucja krwi
	<ol>
		<li>Rozmrażać osocze grupy krwi AB (Rh D ujemne) w temperaturze 37 °C przez 5 minut i 20 sekund na 4 ml.</li>
		<li>Oznaczyć hematokryt upakowanych krwinek czerwonych przygotowanych w 2.1.5 za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.</li>
		<li>Określić stężenie płytek krwi w przygotowanym przez bank krwi koncentracie płytek krwi, który zostanie użyty do odtworzenia powyższej frakcji krwinek czerwonych.</li>
		<li>Oblicz objętość upakowanych krwinek czerwonych i koncentratu płytek krwi, która da 40% hematokrytu i 250 x 10³ płytek krwi/μl w próbce o objętości 1 ml. 
		Uwaga: Inne docelowe miana komórek można ustawić dowolnie, w zależności od protokołu badania.</li>
		<li>Przenieść wypełnione krwinki czerwone i osocze do świeżej probówki za pomocą zaciśniętej końcówki pipety i dodawać koncentrat płytek krwi aż do osiągnięcia objętości próbki 1 ml. 
		Uwaga: W zależności od badanych zmiennych, frakcja osocza powinna być równa we wszystkich próbkach po odtworzeniu, ponieważ osocze ma znaczący wpływ na szybkość tworzenia się skrzeplin. Na przykład wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie lub osocze pobrane od różnych dawców lub na różnych antykoagulantach może mieć wpływ na wynik.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać rozpuszczoną krew przez odwrócenie i wykonać morfologię.</li>
		<li>Przygotować "ślepą" próbkę kontrolną, w której objętość frakcji płytek krwi jest zastąpiona tą samą objętością 0,9% (m/v) chlorku sodu w wodzie, w celu oznaczenia stężenia endogennych płytek krwi (tj. płytek krwi niepochodzących z banku krwi) w odtworzonej krwi przy użyciu morfologii krwi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etykietowania
	<ol>
		<li>Odmierzyć pipetą 1 ml odtworzonej krwi do probówki zawierającej 1 μl 5 mM kalceiny AM (5 μM stężenie końcowe). 
		Uwaga: Można stosować inne barwniki komórkowe14.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj, odwracając światło.</li>
		<li>Przed użyciem inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test perfuzji
<ol>
	<li>Skoncentruj cel na włóknach kolagenowych przylegających do dolnej części pasów. Najlepiej użyć ustawień kontrastu fazowego lub różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) dla tej strategii ustawiania ostrości. Wybierz opcję "Ustaw bieżące Z dla wybranych regionów kafelków" w oprogramowaniu eksperymentalnym, aby cyfrowo ustalić wybrane pozycje Z.</li>
	<li>Wybierz obszar zainteresowania (ROI) na pasie (xy) w oprogramowaniu eksperymentu mikroskopu, który będzie rejestrowany podczas eksperymentu. 
	Uwaga: Zwrot z inwestycji może być dowolnym obszarem powierzchni dowolnie wybranym w obrębie pasa perfuzji. Zaleca się, aby nie analizować powstawania skrzepliny w pobliżu wlotu i wylotu pasa ruchu, aby uniknąć skutków ubocznych zmiennego profilu przepływu w tym obszarze, nawet jeśli jest on stosunkowo niewielki. Obszar ROI powinien zawierać znaczną liczbę płytek krwi lub skrzeplin, aby umożliwić wyrównanie sygnału. W tym protokole ROI jest cyfrowo zszytym agregatem trzech obrazów o jednakowej wielkości obok siebie, w wyniku czego na środku pasa o długości 2 cm znajduje się 0,62 mm2.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj próbki, odwracając je i umieszczając je obok biochipa na zautomatyzowanym stoliku.</li>
	<li>Umieść rurkę połączoną z wlotem biochipa w probówkach zawierających odtworzone próbki krwi.</li>
	<li>Uruchom pompę przy 50 dynach/cm2 (lub innych naprężeniach ścinających, zgodnie z życzeniem) dla tych kanałów, które są połączone z probówkami zawierającymi odtworzone próbki krwi za pomocą oprogramowania pompy. 
	Uwaga: Można zastosować inne naprężenia ścinające.</li>
	<li>Rejestruj obrazy co 15 sekund przez 5 minut w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania do akwizycji i eksperymentowania mikroskopu. 
	Uwaga: W zależności od konfiguracji eksperymentalnej można użyć innych szeregów czasowych. 
	Uwaga: Zazwyczaj używamy powiększenia 100X (obiektyw 10X i obiektywy 10X), ale większe (lub mniejsze) powiększenie można z łatwością zastosować jako alternatywę.</li>
</ol>
4. Wypłukać
<ol>
	<li>Umyj wszystkie rurki podłączone do wylotu i podłączone do wielokanałowego kolektora lub pompy za pomocą wody destylowanej, następnie podchlorynu sodu (wybielacz) 0,5% (v/v) i na koniec 0,1 M NaOH w wodzie. Wyrzuć rurki przypięte do wlotu biochipa jako odpad niebezpieczny.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Określ kinetykę wzrostu skrzepliny za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Następujące polecenia są specyficzne dla ZEN2012.
	<ol>
		<li>Otwórz wtyczkę Analiza obrazu, aby określić pokrycie powierzchni płytek krwi.</li>
		<li>Ustaw próg fluorescencji w zakładce Analizuj interaktywnie, aby zdefiniować intensywność piksela, która koreluje z sygnałem dodatnim, czyli przylegającą płytką krwi lub przylegającymi płytkami</li> krwi.
		<li>Użyj narzędzia Utwórz tabele, aby automatycznie wygenerować arkusz kalkulacyjny, który będzie zawierał oddzielne obszary powierzchni (w μm2) tych "obiektów" zawierających piksele z sygnałem między wybranymi progami. Jest to wykonywane dla każdego punktu czasowego. 
		Uwaga: Po wybraniu progów fluorescencji oprogramowanie analityczne automatycznie wykrywa "obiekty" w polu widzenia, które spełniają kryteria. Obiekty te są skrzeplinami, małymi agregatami płytek krwi lub pojedynczymi płytkami krwi i pokrywają pewną liczbę pikseli. Każdy obiekt jest wymieniony w arkuszu kalkulacyjnym osobno.</li>
		<li>Zapisz te arkusze kalkulacyjne w formacie xml i otwórz je w programie arkusza kalkulacyjnego w celu dalszych obliczeń.</li>
		<li>Zsumuj pola powierzchni wybranych obiektów przez zsumowanie i podziel wynik przez całkowitą powierzchnię pola pomiarowego (μm2). Spowoduje to uzyskanie względnego pokrycia powierzchni (%). Zrób to dla każdego punktu czasowego.</li>
		<li>Wykreślić te pokrycia powierzchni w funkcji czasu perfuzji i obliczyć nachylenie za pomocą regresji liniowej, uzyskując kinetykę wzrostu skrzepliny w tym konkretnym stanie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Broos, K., Feys, H. B., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K., Deckmyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+at+work+in+primary+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Platelets at work in primary hemostasis.</a> Blood Rev. 25, 155-167 (2011).</li>
<li>Stalker, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+in+the+hemostatic+response+and+its+relationship+to+the+platelet-signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network.</a> Blood. 121, 1875-1885 (2013).</li>
<li>Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+platelet+adhesion+to+artery+subendothelium+is+mediated+by+factor+VIII-Von+Willebrand+factor+bound+to+the+subendothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium.</a> Nature. 279, 636-638 (1979).</li>
<li>Savage, B., Saldivar, E., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+platelet+adhesion+by+arrest+onto+fibrinogen+or+translocation+on+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor.</a> Cell. 84, 289-297 (1996).</li>
<li>Westein, E., de Witt, S., Lamers, M., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+in+vitro+thrombus+formation+with+novel+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices.</a> Platelets. 23, 501-509 (2012).</li>
<li>Varga-Szabo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium+sensor+STIM1+is+an+essential+mediator+of+arterial+thrombosis+and+ischemic+brain+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The calcium sensor STIM1 is an essential mediator of arterial thrombosis and ischemic brain infarction.</a> J Exp Med. 205, 1583-1591 (2008).</li>
<li>Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+geometries+exacerbate+pathological+thrombus+formation+poststenosis+in+a+von+Willebrand+factor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner.</a> Proc Natl Acad Sci USA. , (2013).</li>
<li>Grabowski, E. F., Yam, K., Gerace, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hemostasis+in+flowing+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hemostasis in flowing blood.</a> Am J Hematol. 87 (Suppl 1), S51-S55 (2012).</li>
<li>Roest, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chamber-based+assays+to+measure+thrombus+formation+in+vitro%3A+requirements+for+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization.</a> J Thromb Haemost. 9, 2322-2324 (2011).</li>
<li>Heemskerk, J. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+surfaces+to+measure+thrombus+formation+under+flow%3A+possibilities+for+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Collagen surfaces to measure thrombus formation under flow: possibilities for standardization.</a> J Thromb Haemost. 9, 856-858 (2011).</li>
<li>Shrivastava, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+platelet+storage+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">The platelet storage lesion.</a> Transfus Apher Sci. 41, 105-113 (2009).</li>
<li>Miyaji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+platelet+aggregation+of+platelet+concentrate+during+storage+recovers+in+the+body+after+transfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Decreased platelet aggregation of platelet concentrate during storage recovers in the body after transfusion.</a> Transfusion. 44, 891-899 (2004).</li>
<li>Goodrich, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+in+vitro+platelet+quality+measurements+with+in+vivo+platelet+viability+in+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Correlation of in vitro platelet quality measurements with in vivo platelet viability in human subjects.</a> Vox Sang. 90, 279-285 (2006).</li>
<li>Van Aelst, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboflavin+and+amotosalen+photochemical+treatments+of+platelet+concentrates+reduce+thrombus+formation+kinetics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Riboflavin and amotosalen photochemical treatments of platelet concentrates reduce thrombus formation kinetics in vitro.</a> Vox Sang. 108, 328-339 (2015).</li>
<li>Van Aelst, B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V., Feys, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+c+light+pathogen+inactivation+treatment+of+platelet+concentrates+preserves+integrin+activation+but+affects+thrombus+formation+kinetics+on+collagen+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet c light pathogen inactivation treatment of platelet concentrates preserves integrin activation but affects thrombus formation kinetics on collagen in vitro.</a> Transfusion. , (2015).</li>
<li>de Witt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+platelet+function+defects+by+multi-parameter+assessment+of+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation.</a> Nat Commun. 5, 4257(2014).</li>
<li>Cazenave, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+washed+platelet+suspensions+from+human+and+rodent+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood.</a> Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).</li>
<li>Jackson, S. P., Nesbitt, W. S., Westein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+platelet+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Dynamics of platelet thrombus formation.</a> J Thromb Haemost. 7 (Suppl 1), 17-20 (2009).</li>
<li>Diedrich, B., Remberger, M., Shanwell, A., Svahn, B. M., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+randomized+trial+of+a+prophylactic+platelet+transfusion+trigger+of+10+x+10%289%29+per+L+versus+30+x+10%289%29+per+L+in+allogeneic+hematopoietic+progenitor+cell+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A prospective randomized trial of a prophylactic platelet transfusion trigger of 10 x 10(9) per L versus 30 x 10(9) per L in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplant recipients.</a> Transfusion. 45, 1064-1072 (2005).</li>
<li>Neeves, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+variability+in+platelet+accumulation+on+type+1+fibrillar+collagen+in+microfluidic+flow+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one+%22%5BJournal%5D)">Sources of variability in platelet accumulation on type 1 fibrillar collagen in microfluidic flow assays.</a> PloS one . 8, e54680(2013).</li>
<li>Born, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+blood+platelets+by+adenosine+diphosphate+and+its+reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal.</a> Nature. 194, 927-929 (1962).</li>
<li>Cattaneo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+Standardization+of+Light+Transmission+Aggregometry%3A+A+Consensus+of+the+Working+Party+from+the+Platelet+Physiology+Subcommittee+of+SSC%2FISTH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH.</a> J Thromb Haemost. 11, 1183-1189 (2013).</li>
<li>Deckmyn, H., Feys, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+quality+control+of+platelets+for+transfusion%5BTitle%5D)+AND+%22ISBT+Sci+Series%22%5BJournal%5D)">Assays for quality control of platelets for transfusion.</a> ISBT Sci Series. 8, 221-224 (2013).</li>
<li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulants+%28thrombin+inhibitors%29+and+aspirin+synergize+with+P2Y12+receptor+antagonism+in+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis.</a> Circulation. 108, 2697-2703 (2003).</li>
<li>Casari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor+mutation+promotes+thrombocytopathy+by+inhibiting+integrin+alphaIIbbeta3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor mutation promotes thrombocytopathy by inhibiting integrin alphaIIbbeta3.</a> J Clin Invest. 123, 5071-5081 (2013).</li>
<li>Gitz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+platelet+survival+after+cold+storage+by+prevention+of+Glycoprotein+Ib%CE%B1+clustering+in+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Improved platelet survival after cold storage by prevention of Glycoprotein Ibα clustering in lipid rafts.</a> Haematologica. , (2012).</li>
<li>Maurer-Spurej, E., Labrie, A., Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+Quality+Testing+of+Blood+Platelet+Transfusions+with+Dynamic+Light+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Part+Syst+Char%22%5BJournal%5D)">Routine Quality Testing of Blood Platelet Transfusions with Dynamic Light Scattering.</a> Part Part Syst Char. 25, 99-104 (2008).</li>
<li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers+-+a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide.</a> Platelets. 23, 229-242 (2012).</li>
<li>Zwaginga, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-based+assays+for+global+assessment+of+hemostasis.+Part+2%3A+current+methods+and+considerations+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 2: current methods and considerations for the future.</a> J Thromb Haemost. 4, 2716-2717 (2006).</li>
<li>Zwaginga, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-based+assays+for+global+assessment+of+hemostasis.+Part+1%3A+Biorheologic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow-based assays for global assessment of hemostasis. Part 1: Biorheologic considerations.</a> J Thromb Haemost. 4, 2486-2487 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Eksperymenty w komorze przepływowej mikroprzepływowej są doskonałym narzędziem do badania funkcji płytek krwi w przepływającej krwi i są wykorzystywane do oceny hemostazy in vitro w różnych kontekstach eksperymentalnych. Pomimo słabej standaryzacji międzylaboratoryjnej9 wykazaliśmy, że w naszym laboratorium zmienność doświadczalna jest akceptowalna. Pozwala to na wiarygodne porównanie (sparowanych) próbek w ramach danego badania. Zostało to potwierdzone za pomocą dobrze udokumentowanego zjawiska zmian...

Hemostaza wymaga połączonej i regulowanej aktywności komórek, białek, jonów i tkanek w ograniczonym kontekście czasoprzestrzennym1. Niekontrolowana aktywność może prowadzić do krwotoku lub zakrzepicy oraz zachorowalności lub śmiertelności w spektrum zaburzeń związanych z krzepnięciem krwi. Eksperyment z mikroprzepływową komorą przepływową to trudna technika, która naśladuje hemostazę in vitro. Takie podejście pozwala na badanie złożonych wzajemnych oddziaływań procesów biorących udział w hemostazie z wiodącą rolą dla płytek krwi.
Po uszkodzeniu naczyniowym, płytki krwi przylegają do odsłoniętych białek (gliko)macierzy podśródbłonkowej, aby zapobiec utracie krwi. Po adhezji płytki krwi aktywują się i agregują w odpowiedzi na sygnalizację auto- i parakrynną, co ostatecznie prowadzi do powstania sieci płytek krwi, stabilizowanej przez fibrynę i powodującej mocną, uszczelniającą ranęskrzeplinę 2. W przeciwieństwie do większości innych testów czynnościowych płytek krwi, eksperymenty z komorami przepływowymi uwzględniają fizyczny parametr przepływu krwi, a tym samym wpływ reologii na uczestniczące komórki i biomolekuły3,4.
Eksperymenty w komorze przepływowej przyniosły przełomowe spostrzeżenia na temat hemostazy i zakrzepicy poprzez zmianę kluczowych parametrów wpływających na procesy hemostatyczne, w tym matrycę adhezyjną, profile reologii i przepływu, skład komórkowy, obecność toksyn lub leków, siłę jonową i wiele innych. W ciągu ostatnich dwóch dekad eksperymenty z komorami przepływowymi o niskiej przepustowości, wymagające dużych objętości próbek (10-100 ml), przekształciły się w komory mikroprzepływowe, często składające się z małych komór z równoległymi płytkami i zawierające nowoczesną technologię perfuzji krwi pełnej w kontrolowanych warunkach ścinania ścian5. Mikroskalowanie znacznie zwiększyło przepustowość testów, głównie dlatego, że konfiguracja sprzętu została uproszczona i wymagana jest mniejsza objętość (krwi), dzięki czemu eksperyment jest bardziej dostępny i wszechstronny. Na przykład krew pochodząca od małych zwierząt laboratoryjnych może być teraz wykorzystywana bez konieczności składania zwierząt w ofierze. Próbki krwi genetycznie zmodyfikowanych myszy pomogły zatem w identyfikacji kluczowych cząsteczek promujących lub hamujących hemostazę oraz w uzyskaniu nowych podstawowych informacji6.
Specjalistyczne laboratoria badawcze często nadal używają specjalnie wykonanych komór przepływowych, na przykład z polidimetylosiloksanu (PDMS)7, który polimeryzuje na litografowanych formach, które mogą być drukowane przez oprogramowanie. Powstała w ten sposób komora jest niedroga, jednorazowa i można ją łatwo zdemontować w celu analizy post hoc. Co więcej, w zasadzie każdy projekt statku, w tym bifurkacje lub ostre zakręty, może być zbudowany na rozkaz. Ta zaleta jest również jego wadą, ponieważ standaryzacja była już głównym problemem w eksperymentach z komorami przepływowymi, a komory wykonane na zamówienie PDMS nie pomogły w tym. Na domiar złego, powłoka (warunki), sondy fluorescencyjne, antykoagulant, temperatura i czas między pobraniem próbki a analizą są słabo ustandaryzowane8. Standaryzacja tych zmiennych jest trudna, ale mimo to wymagana, aby umożliwić porównanie wyników między laboratoriami. Temat ten jest głównym tematem podkomitetu Międzynarodowego Towarzystwa Zakrzepicy i Hemostazy w Podkomitecie Naukowym i Normalizacyjnym ds. Bioreologii9,10.
Koncentraty płytek krwi (PC) są przetaczane pacjentom cierpiącym na różne choroby, które powodują małopłytkowość i/lub krwawienie. Wiadomo jednak, że płytki krwi w PC odczulają, zwłaszcza w zależności od czasu przechowywania11, co jest procesem degradacji związanym ze starzeniem się i powszechnie nazywanym zmianą spichrzania płytek krwi. Czasami twierdzi się, że takie płytki krwi przywracają krążenie po przetoczeniu12, ale dowody na to są nieliczne. Ponadto funkcjonalność płytek krwi tworzących PC nie jest rutynowo badana, ponieważ związek między takimi testami a skutecznością terapeutyczną lub profilaktyczną jest niejasny13. Mikroprzepływowe komory przepływowe oferują środki do badania funkcji płytek krwi w PC w celu optymalizacji łańcucha manipulacji między pobraniem a wydaniem. Jest to potężne narzędzie badawcze do bezpośrednich (sparowanych) porównań komputerów PC, ponieważ wcześniej opublikowaliśmy14,15 i jest opisane tutaj.

<table><tbody><tr><td>Rurka próżniowa BD z EDTA&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368856</td><td></td></tr><tr><td>Rurka próżniowa BD z heparyną</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>368480</td><td></td></tr><tr><td>Rurka próżniowa BD z cytrynianem sodu</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>366575</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin Probówka do krwi</td><td>Roche</td><td>6675751 001</td><td></td></tr><tr><td>Odkurzacz BD Eclipse</td><td>Becton, Dickinson i Spółka</td><td>368650</td><td>Igła do pobierania krwi z fabrycznie przymocowanym uchwytem</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 100-1 000</td><td>Greiner bio-one</td><td>740290</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 2-200</td><td>Greiner bio-one</td><td>739280</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 1-10</td><td>Eppendorf</td><td>A08928</td><td></td></tr><tr><td>Tubka 5 ml</td><td>Simport</td><td>11691380</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>1888271</td><td></td></tr><tr><td>Tubka stożkowa 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Strzykawka</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki precyzyjne</td><td>Kimtech</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Vena8 Fluoro+ Biochips</td><td>Cellix</td><td>188V8CF-400-100-02P10</td><td>Nazwany w <silny>Rysunek S1 A jako 'Biochip'Vena8</td></tr> <tr><td>Rurka</td><td>Cellix</td><td>TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F</td><td>Nazwany w <silny>Rysunek S1</silny> B jako "Jednorazowe rurki"</td></tr><tr><td>Igły Vena8</td><td>Cellix</td><td>SS-P-B1IC-B1OC-PACK200</td><td>Nazwane w <silne>Rysunek S1</mocne> B jako 'Pin'Złącza</td></tr> <tr><td>do jednowejściowych biochipów</td><td>Cellix</td><td>CONNECTORS-B1IC-PACK100</td><td></td></tr><tr><td>Multiflow8 connect</td><td>Cellix</td><td>MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS</td><td>Nazwany w Rysunek S1 B jako "Rurki wielokrotnego użytku" i "Splitter"</td></tr><tr><td>Pudełko nawilżane</td><td>Cellix</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie pompa mikroprzepływowa</td><td>Cellix</td><td>N/A</td><td>Venaflux Assay</td></tr><tr><td>Horm</td><td>Collagen Takeda/Nycomed</td><td>1130630</td><td>Natywny kolagen ścięgien koni (typ I) Uzupełnia się izotoniczny roztwór glukozy do rozcieńczania kolagenu</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana HEPES (HBS)</td> <td>w przygotowaniu domowym</td><td>10</td><td>mM sól fizjologiczna buforowana kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) (0,9% (w/v) NaCl, pH 7,4)</td></tr><tr><td>Bufor blokujący</td><td>w domu przygotowanie</td><td>w przygotowaniu domowym</td><td>1,0% (w/v) albumina surowicy bydlęcej i 0,1% (w/v) glukoza w HBS</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Sondy molekularne</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz 10%</td> <td>w domu przygotowanie</td><td>w domu</td><td></td></tr><tr><td>przygotowanie 0,1 M NaOH</td><td>w domu przygotowanie</td><td>w domu</td><td></td></tr><tr><td>przygotowanie Alkohol denaturowany</td><td>Fiers</td><td>T0011.5</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix</td><td>188-MIRUS-PUMP-EVO</td><td>z Multiflow8. Nazwany w Rysunek S1 A jako "Pompa" i "Kolektor"</td></tr> <tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>wyposażony w kamerę colibri-LED i CCD o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Mikroskop programowy&nbsp;</td>Analizator hematologiczny <td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>ZEN 2012</td></tr><tr><td></td><td>Sysmex</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>521-0095</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator płytek</td><td>krwi Helmer</td><td>PF-48i</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna do inkubacji</td><td>GFL</td><td>1013</td><td></td></tr><tr><td>Marka pipet</td><td></td><td>A03429</td><td></td></tr><tr><td>Wałek rurowy</td><td>Ratek</td><td>BTR5-12V</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne urządzenie dokujące</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewarka do rur</td><td>Terumo BCT</td><td>AC-155</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Płytki krwi przygotowane do transfuzji stopniowo tracą funkcję hemostatyczną podczas przechowywania. Funkcję płytek krwi można badać za pomocą różnych (pośrednich) eksperymentów in vitro, ale żaden z nich nie jest tak wszechstronny jak komory przepływowe mikroprzepływowe. W tym protokole odtworzenie świeżej krwi małopłytkowej z zapisanymi płytkami krwi w banku krwi służy do symulacji transfuzji płytek krwi. Następnie odtworzona próbka jest perfuzjowana w mikroprzepływowych komorach przepływowych, które naśladują hemostazę na odsłoniętych białkach macierzy podśródbłonkowej. Efekty oddawania krwi, transportu, separacji składników, przechowywania i inaktywacji patogenów można mierzyć w sparowanych projektach eksperymentalnych. Pozwala to na wiarygodne porównanie wpływu każdej manipulacji w przygotowaniu składników krwi na hemostazę. Nasze wyniki pokazują wpływ cyklicznych zmian temperatury, szybkości ścinania, stężenia płytek krwi i czasu przechowywania na funkcję płytek krwi. Podsumowując, protokół ten analizuje funkcję płytek krwi w banku krwi, co ostatecznie pomaga w optymalizacji łańcucha przetwarzania, w tym upuszczania krwi, transportu, przygotowania komponentów, przechowywania i transfuzji.

Aby zademonstrować zmienność wewnątrzanalizy, trzy identyczne zrekonstytuowane próbki krwi pełnej perfundowano jednocześnie przez powierzchnie powlekane kolagenem (Rysunek 1). Przyniosło to współczynnik zmienności wynoszący 8,7%. Statystyka ta wskazuje na akceptowalną zmienność wewnątrzanalizy i wewnątrzlaboratoryjną, co pozwala na wiarygodne porównanie powiązanych próbek.
Wlot komercyjnej komory przepływowej, k...

Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest imitacja transfuzji płytek krwi in vitro oraz przetestowanie jej poprzez analizę hemostazy na kolagenie, z wykorzystaniem przepływu hydrodynamicznego i mikroskopii w czasie rzeczywistym. Pacjenci z małopłytkowością są leczeni za pomocą przechowywanych koncentratów płytek krwi. Nasza metoda ma pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie zakrzepicy i hemostazy, ze szczególnym uwzględnieniem jakości i funkcji takich przechowywanych koncentratów płytek krwi.Wartością dodaną tej techniki jest to, że naśladuje ona przepływ krwi, a tym samym uwzględnia wpływy reologiczne na uczestniczące komórki i biomolekuły. Przedstawiona metoda ocenia wiązanie płytek krwi z kolagenem. Może ona jednak zostać zastosowana również do innych tkanek adhezyjnych, w tym do blaszki miażdżycowej, komórek śródbłonka lub specyficznych białek macierzy, takich jak czynnik Von Willebranda i fibrynogen.Rozpocznij od przygotowania biochipu. Wymieszaj w wirówce i rozcieńcz roztwór zapasowy kolagenu w stosunku 1:20 w izotonicznym roztworze glukozy producenta do stężenia końcowego 50 µg/mL. Następnie pipetuj 0,8 µL do kanałów nowego jednorazowego biochipu.Wypełnij wszystkie kanały po jednym końcu chipa i oznacz go jako koniec wylotowy. Następnie sprawdź chip, aby upewnić się, że każdy kanał jest wypełniony roztworem w 5/6 objętości i nie ma w nim pęcherzyków powietrza. Następnie inkubuj chip w temperaturze 4 °C przez cztery godziny lub przez noc w zamkniętym, wilgotnym pojemniku.Następnie zablokuj zakodowane kanały, pipetując bufor blokujący do przeciwległego końca ścieżek. Następnie dla każdej ścieżki odetnij 12-centymetrowe odcinki rurki i przymocuj do każdego z nich pinezkę, aby można było je podłączyć do biochipa. Przepłucz odcinki rurek wodą destylowaną za pomocą strzykawki i konektora.Następnie nasyć je buforem blokującym i zamknij w wilgotnym pojemniku na co najmniej jedną godzinę. W kolejnym kroku przygotuj pompę oraz kolektor. Najpierw przepłucz pompę i kolektor wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.Następnie przymocuj biochip do stolika automatycznego mikroskopu. Włóż jeden koniec przewodów do probówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej buforem HBS, a następnie podłącz ich drugi koniec do wlotów biochipu. Umieść piny kolektora w wylotach biochipu.Następnie, za pomocą pompy, przepłucz system roztworem HBS. W ten sposób usunięty zostanie wszelki pozostały bufor blokujący lub słabo przylegający kolagen. To kończy przygotowanie komory przepływowej.Zacznij od połączenia świeżo pobranych próbek krwi od zdrowych ochotników w stożkowej probówce do wirowania. Wirować próbkę przez około 15 minut przy 250 Gs. Nie używać hamulca, ponieważ zakłóci on luźno upakowaną fazę dolną. Usunąć i zutylizować osocze bogatobradycytozowe oraz warstwę leukocytarną.Zabezpiecz skondensowane erytrocyty zawierające jak najmniej płytek krwi, aby przygotować krew rekonstytuowaną. Następnie rozpocznij rozmrażanie 4 mL plazmy grupy AB w temperaturze 37 °C przez 5 minut i 20 sekund. W międzyczasie określ poziom hematokrytu przygotowanych skondensowanych erytrocytów, korzystając z automatycznego analizatora hematologicznego.Następnie należy oznaczyć stężenie płytek w koncentracie krwineczek płytkowych przygotowanym w banku krwi, który zostanie użyty do rekonstytucji krwi pełnej. Obliczyć objętości niezbędne do przygotowania jednego mililitra rekonstituowanej krwi o hematokrycie 40% i stężeniu 250 000 płytek na mikrolitr. Następnie, używając przyciętej końcówki pipety, przenieść wymaganą objętość erytrocytów, osocza oraz koncentratu płytek do uzyskania pożądanego stężenia i objętości końcowej jednego mililitra.Wymieszać zrekonstytuowaną krew poprzez delikatne odwracanie probówki, a następnie wykonać morfologię krwi. Następnie pobrać przygotowaną probówkę do mikrocentryfugi zawierającą Calcein AM i dodać do niej 1 mL zrekonstytuowanej krwi. Wymieszać krew z barwnikiem poprzez delikatne odwracanie probówki.Następnie inkubować zrekonstytuowaną krew przez pięć minut w temperaturze 37 °C. W oprogramowaniu zaznaczyć obszar zainteresowania w kanale perfuzyjnym. Ustawić ostrość na włókna kolagenu przytwierdzone do dna kanałów przy powiększeniu 100x.W idealnym przypadku należy zastosować kontrast fazowy lub różnicowy kontrast interferencyjny. Wybierz opcję ustawienia stałego prądu Z dla wybranych obszarów kafelków (set current Z for selected tile regions), aby cyfrowo utrwalić wybrane pozycje Z. Przed perfuzją ostrość optyczna powinna być ustawiona na kolagen ameloblastów, jednak może to być trudne do osiągnięcia.Alternatywnym rozwiązaniem jest ustawienie ostrości mikroskopu na początkowo przylegających płytkach krwi. Następnie należy delikatnie wymieszać próbki i umieścić je obok biochipu. Potem wprowadza się rurkę podłączoną do obserwowanej ścieżki do zrekonstytuowanej krwi.Następnie, korzystając z oprogramowania sterującego pompą, przyłóż ciśnienie 50 dyne na centymetr kwadratowy, aby przesunąć próbkę krwi do kanału i rozpocznij eksperyment. W trakcie eksperymentu rejestruj obrazy co 15 sekund przez pięć minut. Wyznacz kinetykę wzrostu skrzepu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.W tym przypadku wykorzystano oprogramowanie Zen 2012. Należy rozpocząć od otwarcia wtyczki do analizy obrazu (image analysis), aby określić stopień pokrycia powierzchni przez płytki krwi. W zakładce analizy interaktywnej (analyze interactive) należy ustawić próg fluorescencji, aby zdefiniować intensywność pikseli korelującą z sygnałem dodatnim, pochodzącym od przylegających płytek krwi.Następnie użyj funkcji tworzenia tabel, aby automatycznie wygenerować arkusz kalkulacyjny z listą pól powierzchni sygnałów dodatnich dla każdego punktu czasowego. Zapisz te arkusze w formacie XML i otwórz je w programie do kalkulacji w celu przeprowadzenia dalszych obliczeń. Dla każdego punktu czasowego oblicz całkowite pola powierzchni wybranych obiektów i wyraź tę wartość jako procent powierzchni pokrytej.Następnie przedstaw dane na wykresie w funkcji czasu perfuzji i oblicz nachylenie prostej za pomocą regresji liniowej. Pozwala to na zamodelowanie kinetyki wzrostu zakrzepu dla danego warunku eksperymentalnego. Trzy identyczne próbki zrekonstytuowanej krwi pełnej poddano jednoczesnej perfuzji przez powierzchnie pokryte kolagenem.Przełożyło się to na współczynnik zmienności wynoszący 8,7%, co sugeruje akceptowalną zmienność wewnątrz serii i wewnątrzlaboratoryjną dla porównania testów. Transfuzję symulowano poprzez rekonstrukcję krwi z dodatkiem brakującego komponentu. Wykonano kilka rekonstrukcji ze spadającymi stężeniami płytek krwi.Zgodnie z oczekiwaniami, niższa liczba płytek krwi skutkowała mniejszą adhezją w funkcji czasu perfuzji. Następnie zbadano wpływ obniżonych temperatur po pobraniu krwi oraz podczas perfuzji. Stwierdzono, że skrzepy tworzą się wolniej, gdy krew została schłodzona do temperatury pokojowej.W porównaniu z próbką utrzymywaną w temperaturze 37 °C przez cały czas trwania badania. Podczas krążenia płytki krwi wiążą się z miejscami uszkodzeń naczyń w warunkach podwyższonego naprężenia ścinającego ścianek. Zgodnie z oczekiwaniami, zmiana szybkości ścinania w mikrofluidycznych komorach przepływowych zmieniła całkowitą adhezję płytek krwi.Warunki te zmieniają również kinetykę wzrostu zakrzepu. Po obejrzeniu tego filmu widz powinien dobrze rozumieć, jak przeprowadzić eksperymenty w mikrofluidycznej komorze przepływowej z użyciem rekonstruowanej krwi w celu przetestowania jakości i funkcji przechowywanych koncentratów płytek krwi. Technikę tę można przeprowadzić w około siedem godzin.Eksperymenty z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych utorowały drogę badaczom w dziedzinie transfuzji płytek krwi do zbadania wpływu zmiennych związanych z donacją, przygotowaniem i przechowywaniem. Odpowiednim przykładem jest inaktywacja patogenów. Przedstawiliśmy przykład tylko jednego obiektu badawczego.Niemniej jednak, zmiany w stężeniu wapnia, naprężeniu ścinającym i powłokach powierzchniowych mogą być wykorzystane do odpowiedzi na różne pytania badawcze. Podobnie jak w przypadku tej procedury, w mikrofluidycznych komorach przepływowych można przeprowadzić inne pomiary w celu uzyskania dodatkowych odpowiedzi. Na przykład można badać wydajność krążków krwi płytkowych przechowywanych w kontekście koagulacji w przepływie.

microfluidic-flow-chambers-using-reconstituted-blood-to-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Ten protokół replikuje fizjologiczny lub patologiczny przepływ krwi in vitro, aby pomóc w określeniu odpowiedzi komórek w patologiach chorobowych. Wprowadzając komorę tłumiącą ciśnienie za pompą krwi, przepływ krwi przez naczynia krwionośne może zostać ponownie podsumowany i nałożony na monowarstwę śródbłonka naczyniowego lub kokulturę mimetyczną.

In vitro Model fizjologicznego i patologicznego przepływu krwi z zastosowaniem do badań przebudowy komórek naczyniowych

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Prezentowany tutaj jest protokół dla ustandaryzowanego modelu pętli hemodynamicznej in vitro. Model ten pozwala na przetestowanie hemokompatybilności probówek perfuzyjnych lub stentów naczyniowych zgodnie z normą ISO (Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna) 10993-4.

Model pętli hemodynamicznej in vitro do badania kompatybilności hemocytologicznej i aktywacji komórek gospodarza naczyniowych wyrobów medycznych

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Przedstawiamy procedurę wykonania i obsługi urządzenia mikrofluidycznego, które odtwarza heterogeniczne mikrośrodowiska nowotworowe in vitro. Zmienność apoptozy w obrębie tkanki nowotworowej została określona ilościowo przy użyciu barwników fluorescencyjnych, a następnie oceniono efektywny współczynnik dyfuzji leku chemioterapeutycznego, doksorubicyny, do tkanki nowotworowej.

Urządzenie mikrofluidyczne do odtwarzania mikrośrodowiska nowotworu in vitro

Dielektroforeza (DEP) jest skuteczną metodą manipulowania komórkami. Płytki drukowane (PCB) mogą stanowić niedrogie, wielokrotnego użytku i wydajne elektrody do bezkontaktowego manipulowania komórkami w urządzeniach mikroprzepływowych. Poprzez połączenie kanałów mikroprzepływowych opartych na PDMS z szkiełkami nakrywowymi na płytkach PCB, demonstrujemy manipulację i separację kulek oraz komórek w wielokanałowych urządzeniach mikroprzepływowych.

Separacja kulek i komórek w wielokanałowych urządzeniach mikroprzepływowych z wykorzystaniem dielektroforezy i przepływu laminarnego

To badanie wykorzystało wielodołkowy system mikroprzepływowy, znacznie zwiększając przepustowość badań toczenia komórek pod fizjologicznie istotnym przepływem ścinającym. Biorąc pod uwagę znaczenie zwijania komórek w wieloetapowej kaskadzie naprowadzania komórek oraz znaczenie naprowadzania komórek po ogólnoustrojowym dostarczeniu egzogennych populacji komórek u pacjentów, system ten oferuje potencjał jako platforma przesiewowa w celu ulepszenia terapii opartej na komórkach.

Systematyczna analiza walcowania komórek in vitro przy użyciu systemu mikroprzepływowego z wielodołkową płytką

Poznaj mikroprzepływowe komory przepływowe z rekonstytuowaną krwią do oceny hemostazy i funkcji przechowywanych płytek krwi. Ta metoda pozwala badać adhezję płytek do kolagenu w warunkach przepływu hydrodynamicznego.

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Przeglądaj więcej filmów