Obrazowanie wideo i mapy czasoprzestrzenne do analizy motoryki przewodu pokarmowego u myszy

Ogólnym celem tej techniki jest identyfikacja zmian w neuronalnej regulacji motoryki okrężnicy u myszy przy użyciu obrazowania wideo. Technika ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki jelitowej, takie jak to, czy subtelne mutacje genetyczne w genach neuronalnych wpływają na motorykę okrężnicy. Główną zaletą tej metody jest fakt, że tkanka stanowi cystę wobec braku dopływu bodźców z ośrodkowego układu nerwowego, w związku z czym metoda ta pozwala na badanie zaangażowania jelitowego układu nerwowego w kontrolę motoryki przewodu pokarmowego.

Technika ta znajduje zastosowanie w terapii chorób neurorozwojowych, takich jak autyzm, ponieważ mutacje genów zmieniające funkcję synaptyczną w mózgu mogą również wpływać na motorykę jelit. W pierwszej kolejności należy użyć pęsety i nożyczek, aby wykonać nacięcie naskórka nad warstwami mięśni brzucha dolnego. Następnie otwórz jamę brzuszną wzdłuż linii środkowej aż do mostka.

Nawilżyć tkankę solą fizjologiczną, a następnie za pomocą pęsety delikatnie unieść kątnicę na wysokość czterech do pięciu centymetrów ponad brzuszną jamę ciała. Następnie, używając precyzyjnych nożyczek do dysekcji, przyciąć krezkę, dbając o to, aby nie dotykać, nie rozciągać ani nie przecinać tkanki przewodu pokarmowego. Usunąć pęcherz, jądra oraz każdą inną nadmiarową tkankę.

Następnie, używając grubych nożyczek sekcyjnych, wykonaj dwa pionowe nacięcia w kości miednicy, około 0,5 cm od linii środkowej po każdej stronie okrężnicy, a następnie za pomocą cienkich nożyczek oddziel odbytnicę od przylegających tkanek miednicy. Odetnij krezkę od okrężnicy i wypłucz całą tkankę okrężnicy w zlewce zawierającej sól fizjologiczną. Aby usunąć pellety fekaliów oraz pozostałą zawartość jelit, odetnij najpierw około jednego centymetra z końcówki pipety 200 µL i połącz pipetę ze strzykawką 5 mL wypełnioną solą fizjologiczną.

Następnie, po usunięciu kąbnicy i odbytnicy, umieść szpilkę entomologiczną w najbardziej proksymalnym końcu okrężnicy, w miejscu, gdzie widoczne są prążkowanie błony śluzowej, aby zorientować tkankę. Teraz delikatnie chwyć tkankę za koniec proksymalny, wprowadź końcówkę pipety do światła jelita i przepłucz okrężnicę solą fizjologiczną do pojemnika na odpłady. Następnie, używając tej samej strzykawki i końcówki pipety, przepłucz świeżą solą fizjologiczną wszelkie zanieczyszczenia z rurek podłączonych do dwukomorowej komory organowej.

Przygotuj kąpiel organową w taki sposób, aby komory były stale przepłukiwane solą fizjologiczną napowietrzoną karbogenem, i używaj sondy temperatury, aby regularnie potwierdzać, że temperatura soli fizjologicznej utrzymuje się w przedziale od 33 do 37 stopni Celsjusza. Użyj gumowego korka z wstawioną w centrum szklaną rurką o średnicy wewnętrznej 5 mm, aby utrzymać ciśnienie w zbiorniku dopływowym. Następnie całkowicie zanurz fragment jelita grubego o długości od 5 do 7 cm w komorze kąpieli organowej i za pomocą pęsety oraz standardowej bawełnianej nici krawieckiej połącz proksymalny koniec jelita z rurką wlotową, a dystalny koniec jelita z rurką wylotową.

Po wyznaczeniu bazowego dystansu między proksymalną a dystalną kaniulacją jelita grubego, inkubuj tkankę w soli fizjologicznej przez 30 minut w celu wyrównania ciśnienia osmotycznego. Aby zarejestrować ruchy jelit, podczas aklimatyzacji jelita grubego, ustaw kamerę wideo 10 do 15 centymetrów nad kąpielą organową na standardowym statywie laboratoryjnym i skonfiguruj odpowiednie oprogramowanie do przechwytywania obrazu. Po przygotowaniu kamery nagraj cztery 15-minutowe segmenty wideo jelita grubego w warunkach kontrolnych.

Następnie należy przeprowadzić superfuzję badanego leku do kąpieli organowej przez 30 do 60 minut, rejestrując kolejne cztery 15-minutowe segmenty wideo. Na koniec roztwór testowy należy zastąpić świeżym sol fizjologicznym i zarejestrować cztery kolejne 15-minutowe segmenty wideo podczas godzinnego okresu wypłukiwania. Można wówczas wygenerować mapy czasowo-przestrzenne okrężnicy w odpowiedzi na poszczególne okresy traktowania.

Aby ocenić, czy mutacje synaptyczne zmieniają wędrujące kompleksy motoryczne jelita grubego (CMMC), gdy układ nerwowy jelit jest poddawany perturbacjom farmakologicznym, w niniejszym doświadczeniu do komory kąpieli organowej z preparatem jelita grubego dodano tropisetron, antagonistę receptorów 5-HT3 i 4. W obecności tropisetronu myszy NL3R451C wykazały spadek częstotliwości CMMC w porównaniu z rodzeństwem typu dzikiego. Chociaż w warunkach kontrolnych nie zaobserwowano istotnych różnic w kurczliwości między typem dzikim a myszami NL3R451C, tropisetron znacząco zredukował częstotliwość CMMC zarówno u myszy typu dzikiego, jak i NL3R451C.

Ponadto tropisetron wywarł silniejszy wpływ na częstotliwość CMMC u myszy NL3R451C w porównaniu z zwierzętami typu dzikiego. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, można ją zrealizować w cztery godziny. Podczas wykonywania tej procedury należy upewnić się, że kąpiel organowa jest utrzymywana w stałej temperaturze, posiada ciągły dopływ karbogenu, a przelewanie się soli fizjologicznej jest zapobiegane przez podciśnienie.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne techniki, takie jak immunocytochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład czy u myszy wykazujących zaburzenia motoryki okrężnicy występują zmiany w proporcjach neuronów lub liczbie komórek? Opracowanie tej metody umożliwiło szeroki zakres badań nad motoryką jelit u świnek morskich, królików, szczurów i innych gatunków, a w szczególności w tym przypadku u myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak identyfikować zmiany w regulacji neuronalnej motoryki okrężnicy przy użyciu obrazowania wideo.