Name: Wyznaczanie czułości spektralnej komórek fotoreceptorowych w modelu owadów na podstawie nagrań wewnątrzkomórkowych in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę wewnątrzkomórkowych nagrań elektrofizjologicznych do badania czułości spektralnej fotoreceptorów w oku złożonym motyla. Technika ta pozwala przewidywać zakres widzenia barwnego owadów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy zmarłemu Rudy'emu Limburgowi za wykonanie obwodu ramienia kardana, Kimberly Jamison, Matthew McHenry i Raju Metherate za użyczenie nam sprzętu, a także Almutowi Kelberowi i Kentaro Arikawie za zachętę. Praca ta była wspierana przez stypendium badawcze dla absolwentów National Science Foundation (NSF) dla KJM oraz grant NSF IOS-1257627 dla ADB.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Nagrywanie wewnątrzkomórkowe może być trudną techniką do opanowania ze względu na wiele związanych z tym kroków technicznych. Aby eksperymenty zakończyły się sukcesem, należy wziąć pod uwagę kilka ważnych punktów. Po pierwsze, ważne jest, aby mieć odpowiednio izolowany wibracyjnie stół, na którym przeprowadzany jest eksperyment. Wielu badaczy korzysta ze stołów powietrznych, które całkowicie oddzielają blat od podstawy, zapewniając doskonałą izolację drgań. Nasz zestaw składa się z grubego marmurowego stołu z piaskownicą...

Właściwości elektryczne komórek, takich jak neurony, są obserwowane poprzez pomiar przepływu jonów przez błony komórkowe jako zmiany napięcia lub prądu. Opracowano szereg technik elektrofizjologicznych do pomiaru zdarzeń bioelektrycznych w komórkach. Neurony znajdujące się w oczach zwierząt są dostępne, a ich obwody są często mniej złożone niż w mózgu, co czyni te komórki dobrymi kandydatami do badań elektrofizjologicznych. Typowe zastosowania elektrofizjologii oka obejmują elektroretinografię (ERG)1,2 i wewnątrzkomórkowy zapis mikroelektrod. ERG polega na umieszczeniu elektrody w oku zwierzęcia lub na jego oku, zastosowaniu bodźca świetlnego i zmierzeniu zmiany napięcia jako sumy odpowiedzi wszystkich pobliskich komórek3-6. Jeśli ktoś jest szczególnie zainteresowany scharakteryzowaniem wrażliwości spektralnej poszczególnych komórek fotoreceptorowych, często wiele typów komórek jednocześnie reaguje z różną siłą na dany bodziec; w związku z tym określenie wrażliwości określonych typów komórek na podstawie danych ERG może być trudne, zwłaszcza jeśli w oku znajduje się kilka różnych rodzajów spektralnie podobnych komórek fotoreceptorowych. Jednym z potencjalnych rozwiązań jest stworzenie transgenicznej Drosophila z genem fotoreceptora (opsyny) ulegającym ekspresji w większości komórek R1-6 w oku, a następnie wykonanie ERG7. Potencjalne wady tej metody obejmują brak lub niską ekspresję białka fotoreceptora8 oraz długie ramy czasowe dla generacji i badań przesiewowych zwierząt transgenicznych. W przypadku oczu z mniejszą liczbą rodzajów spektralnie odrębnych fotoreceptorów, adaptacja oka za pomocą kolorowych filtrów może pomóc w obniżeniu udziału niektórych typów komórek w ERG, umożliwiając w ten sposób oszacowanie maksimów czułości spektralnej9.
Zapis wewnątrzkomórkowy to kolejna technika, w której cienka elektroda napala komórkę na pal i stosuje się bodziec. Elektroda rejestruje tylko odpowiedź pojedynczego ogniwa, dzięki czemu nagrywanie i analizowanie wielu pojedynczych komórek może dać określone czułości fizjologicznie różnych typów komórek10-14. Chociaż nasz protokół koncentruje się na analizie czułości spektralnej, podstawowe zasady zapisu wewnątrzkomórkowego za pomocą ostrych elektrod można modyfikować do innych zastosowań. Korzystając na przykład z innego przygotowania próbki i używając ostrych elektrod kwarcowych, można nagrywać z głębszej części płata wzrokowego lub innych obszarów mózgu, w zależności od zadawanego pytania. Na przykład czasy odpowiedzi poszczególnych komórek fotoreceptorów15, aktywność komórek w płatach wzrokowych16 (blaszka, rdzeń lub lobula17), mózgu18 lub innych zwojach19 mogą być również rejestrowane za pomocą podobnych technik, lub bodźce barwne można zastąpić polaryzacją20-22 lub bodźcami ruchowymi23,24.
Fototransdukcja, proces, w którym energia świetlna jest absorbowana i przekształcana w sygnał elektrochemiczny, jest starożytną cechą wspólną dla prawie wszystkich współczesnych typów zwierząt25. Barwnikiem wzrokowym znajdującym się w komórkach fotoreceptorów i odpowiedzialnym za inicjację fototransdukcji wzrokowej jest rodopsyna. Rodopsyny u wszystkich zwierząt składają się z białka opsyny, członka rodziny 7 transbłonowych receptorów sprzężonych z białkiem G, i związanego z nim chromoforu, który pochodzi z siatkówki lub podobnej cząsteczki26,27. Sekwencja aminokwasów opsyny i struktura chromoforu wpływają na absorbancję rodopsyny do różnych długości fal światła. Kiedy foton jest absorbowany przez chromofor, rodopsyna zostaje aktywowana, inicjując kaskadę białka G w komórce, która ostatecznie prowadzi do otwarcia kanałów jonowych związanych z błoną28. W przeciwieństwie do większości neuronów, komórki fotoreceptorów ulegają stopniowanym zmianom potencjału, które można zmierzyć jako względną zmianę amplitudy odpowiedzi ze zmieniającym się bodźcem świetlnym. Zazwyczaj dany typ fotoreceptora wykazuje ekspresję tylko jednego genu opsyny (choć istnieją wyjątki8,10,29-31). Wyrafinowane widzenie kolorów, podobne do tych, które można znaleźć u wielu kręgowców i stawonogów, uzyskuje się za pomocą złożonego oka składającego się z setek lub tysięcy komórek fotoreceptorów, z których każda wyraża jeden lub czasami więcej typów rodopsyny. Informacje wizualne są przechwytywane poprzez porównywanie odpowiedzi na mozaikę fotoreceptorów za pośrednictwem złożonej sygnalizacji neuronalnej w oku i mózgu, co skutkuje percepcją obrazu wraz z kolorem i ruchem.
Po zmierzeniu surowych reakcji komórki fotoreceptora na różne długości fal światła za pomocą zapisu wewnątrzkomórkowego, możliwe jest obliczenie jej czułości spektralnej. Obliczenia te opierają się na zasadzie jednowariancji, która mówi, że odpowiedź komórki fotoreceptorowej zależy od liczby absorbowanych przez nią fotonów, ale nie od szczególnych właściwości absorbowanych przez nią fotonów32. Każdy foton, który zostanie wchłonięty przez rodopsynę, wywoła ten sam rodzaj odpowiedzi. W praktyce oznacza to, że surowa amplituda odpowiedzi komórki wzrośnie albo z powodu wzrostu natężenia światła (więcej fotonów do pochłonięcia), albo z powodu przesunięcia długości fali w kierunku szczytowej czułości (większe prawdopodobieństwo, że rodopsyna zaabsorbuje tę długość fali). Wykorzystujemy tę zasadę, odnosząc odpowiedzi komórkowe o znanej intensywności i tej samej długości fali do odpowiedzi o różnych długościach fal i tej samej intensywności, ale nieznanej względnej czułości. Typy komórek są często identyfikowane na podstawie długości fali, przy której osiąga się ich czułość.
Tutaj pokazujemy jedną metodę wewnątrzkomórkowego zapisu i analizy wrażliwości spektralnej fotoreceptorów w oku motyla, koncentrując się na uczynieniu tej metody bardziej dostępną dla szerszej społeczności badawczej. Chociaż zapis wewnątrzkomórkowy pozostaje powszechny w literaturze, szczególnie w odniesieniu do widzenia kolorów u owadów, stwierdziliśmy, że opisy materiałów i metod są zwykle zbyt krótkie, aby umożliwić odtworzenie tej techniki. Przedstawiamy tę metodę w formacie wideo, aby umożliwić jej łatwiejszą replikację. Opisujemy również technikę przy użyciu łatwo dostępnego i niedrogiego sprzętu. Zajmujemy się typowymi zastrzeżeniami, które często nie są zgłaszane, a które spowalniają badania podczas optymalizacji nowej i złożonej techniki.

<table><tbody><tr><td>Poczwarki motyli</td><td></td><td></td><td>Kilka dostępnych lokalnych gatunków wymaga zezwoleń USDA na wysyłkę. Carolina Bio Supply ma kilka gatunków owadów, które można zamówić na terenie USA bez konieczności uzyskania dodatkowych pozwoleń</td></tr><tr><td>Duży plastikowy cylinder</td><td></td><td></td><td>Każda komora, która pozostaje nawilżona, będzie działać</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów, rozmiar 2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>100% Desert Mesquite</td><td>Honey Trader Joe's</td><td></td><td>Każdy roztwór miodu lub sacharozy będzie działał</td></tr><tr><td>Lampa ksenonowa</td> łukowa <td>Wyroby Instruments</td><td>66003</td><td>Oriel jest teraz częścią Newport Corporation</td></tr><tr><td>Universal Power Supply</td><td>Oriel Instruments</td><td>68805</td><td>Oriel jest teraz częścią Newport</td></tr><tr><td>Corporation Optical Track</td><td>Oriel Instruments</td><td>11190</td><td>Oriel jest teraz częścią Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Large (2x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td><td>Oriel jest teraz częścią Newport Corporation</td></tr><tr><td>Przewoźnik kolejowy, mały (4x)</td> <td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel jest teraz częścią Newport</td></tr><tr><td>Corporation Thread Adapter, 8-32 Male na 1/4-20 Męskie, zestaw 10</td><td>Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>Optyczna stacja montażowa, 1,0 cala, 0,5 cala Średnica nierdzewna, 8-32 i 1/4-20 (5x)</td> <td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt optyczny bez poślizgu, 2 cale, 0,5 cala. Średnica słupków, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>Stałe mocowanie obiektywu, 50,8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>Stałe mocowanie obiektywu, 25,4 mm</td> Zespół soczewki kondensatora <td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>Wypukła soczewka krzemionkowa, 50,8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>Sześciopozycyjne koło filtrów, x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>Piasta do mocowania koła filtra</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>Wklęsła soczewka krzemionkowa, 25,4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt kolimatora</td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>Sonda wiązki kolimacyjnej</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>Konwerter tulejowy, zakończenie SMA do standardowej tulejki 11 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>Ten adapter umożliwia dopasowanie światłowodu do uchwytu kolimatora&nbsp;</td></tr><tr><td>600 &mu; Średnica m Światłowodowy obtykalny UV-vis</td><td>Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel jest teraz częścią Newport Corporation</td></tr><tr><td>Migawka z jednostką napędową</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr> UV <tr><td>Fused Silica Metallic ND Filter, 0,1 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr> UV <tr><td>Fused Silica Metallic ND Filter, 0,3 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr> UV <tr><td>Fused Silica Metallic ND Filter, 0,5 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>Metaliczny filtr ND z topionej krzemionki UV, 1,0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr><tr><td>Metaliczny filtr ND z topionej krzemionki UV, 2,0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr> UV <tr><td>Metaliczny filtr ND z topionej krzemionki, 3,0 OD</td><td>Lampa Newport</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal</td><td>Optyka oceaniczna Spektrometr</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Optyka oceaniczna</td><td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite Software</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interference filtr pasmowo-przepustowy, 300 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 310 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 320 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 330 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 340 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 350 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 360 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 370 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 380 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 390 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 400 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 410 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 420 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 430 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 440 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 450 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 460 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 470 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 480 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 492 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 500 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 510 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 520 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 532 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 540 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 550 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 560 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 570 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 580 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 589 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 600 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 610 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 620 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 632 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 640 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 650 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 660 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 671 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 680 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 690 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy interferencyjny, 700 nm&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67771</td><td></td></tr><tr><td>Klatka</td><td></td><td></td> Faradaya <td>Sprawdzi się każda metalowa konstrukcja, którą można uziemić i która pasuje do eksperymentalnej konfiguracji.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy, powiększenie 6X, 12X, 25X, 50X</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>Wild M5</td><td>Każdy mikroskop stereoskopowy zrobi to</td></tr><tr><td>Statyw mikroskopu z wahadłowym ramieniem i ciężką podstawą</td><td>Instrumenty</td><td></td> McBaina <td>Każda ciężka podstawa z ramieniem zrobi</td></tr> ramię <tr><td>Cardana</td><td></td><td></td><td>Zbudowany na zamówienie, patrz <silny>Rysunek 4< / silny></td></tr><tr><td>Oświetlacz o wysokiej intensywności Fiber-lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>MI-150</td><td>Do oświetlania próbki</td></tr><tr><td>Światłowód na gęsiej szyi Fiber-lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>EEG 2823</td><td>Każdy światłowód na gęsiej szyi zrobi to</td></tr><tr><td>Marmurowy stół</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podniesiony drewniany stół</td><td></td><td></td><td>Należy wyciąć otwór w tym stole, aby piaskownica mogła spoczywać na marmurowym stole pod spodem</td></tr><tr><td>Drewniane pudełko wypełnione piaskiem</td><td></td><td></td><td>zbudowane na zamówienie, dowolne pudełko z piaskiem</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Carl Zeiss - Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt</td><td></td><td></td><td></td>elektrody</tr><tr><td>Stopień</td><td></td><td></td><td></td>próbki</tr><tr><td>Przewody z zaciskiem krokodylkowym do uziemienia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izolowany drut</td><td></td><td></td><td></td>miedziany</tr><tr><td>Drut srebrny o średnicy 0,125 mm</td><td></td><td></td> AGW0510 <td></td></tr> BNC World Precision Instruments <tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przedwzmacniacz ze sceną czołową</td><td>Dagan Corporation</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>Humbug Reduktor szumów</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>Oscyloskop, 30 MHz, 2 kanały, Dual Trace, Alt-triggering, bez sondy</td><td>EZ Digital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC T-adapter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powerlab hardware 2/20</td><td>ADI instruments</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Labchart</td><td>Instrumenty ADI</td><td>Wykres 5</td><td></td></tr><tr><td>Generator impulsów 10 MHz</td><td>BK Precision</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet szklanych</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu, 3 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczelinowa plastikowa rurka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wosk</td><td></td><td></td><td></td>o niskiej temperaturze topnienia</tr><tr><td>Lutownica Weller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platforma z kulą i gniazdem Podstawa magnetyczna</td><td>Hama zdjęcia i wideo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwukrawędziowa stal węglowa, łamliwa żyletka</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wyznaczanie czułości spektralnej komórek fotoreceptorowych w modelu owadów na podstawie nagrań wewnątrzkomórkowych in vivo

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Zapis wewnątrzkomórkowy to potężna technika używana do określenia, jak pojedyncza komórka może zareagować na dany bodziec. W badaniach nad wzrokiem zapis wewnątrzkomórkowy był historycznie powszechną techniką stosowaną do badania wrażliwości poszczególnych komórek fotoreceptorów na różne bodźce świetlne, która jest nadal stosowana. Jednak w literaturze nadal brakuje szczegółowej metodologii dla badaczy chcących powtórzyć eksperymenty z zapisem wewnątrzkomórkowym w oku. Tutaj przedstawiamy owada jako model do badania fizjologii oka w bardziej ogólnym ujęciu. Komórki fotoreceptorów owadów znajdują się blisko powierzchni oka i dlatego są łatwo dostępne, a wiele mechanizmów związanych z widzeniem jest zachowanych w całej gromadzie zwierząt. Opisujemy podstawową procedurę wewnątrzkomórkowego zapisu in vivo komórek fotoreceptorowych w oku motyla, mając na celu uczynienie tej techniki bardziej dostępną dla badaczy z niewielkim wcześniejszym doświadczeniem w elektrofizjologii. Przedstawiamy podstawowy potrzebny sprzęt, jak przygotować żywego motyla do nagrania, jak wprowadzić szklaną mikroelektrodę do pojedynczej komórki, a na końcu samą procedurę nagrywania. Wyjaśniamy również podstawową analizę surowych danych odpowiedzi w celu określenia czułości spektralnej poszczególnych typów komórek. Chociaż nasz protokół koncentruje się na określaniu czułości spektralnej, inne bodźce (np. światło spolaryzowane) i odmiany metody mają zastosowanie do tej konfiguracji.

W przypadku wielu elementów układu rejestracji opis pisemny nie dostarcza wystarczającej ilości szczegółów. Rysunek 1 przedstawia schemat komponentów wchodzących w skład kompletnego układu rejestracji. Na Rysunku 2 naniesiono widma dla światła białego oraz dla każdego filtru interferencyjnego, aby zobrazować, dlaczego konieczny jest współczynnik korekcji oraz co jest niezbędne do jego obliczenia. Rysunek 3 prezentuje zdjęcia i schemat ramienia Cardana wykorzysty...

Elektrofizjologiczna technika zapisu wewnątrzkomórkowego jest demonstrowana i używana do określania wrażliwości spektralnej pojedynczych komórek fotoreceptorowych w złożonym oku motyla.

Wyznaczanie czułości spektralnej komórek fotoreceptorowych w modelu owadów na podstawie nagrań wewnątrzkomórkowych in vivo

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Ogólnym celem tej metody rejestracji wewnątrzkomórkowej jest określenie czułości widmowej poszczególnych komórek fotoreceptorów w złożonym oku owada in vivo. Metoda ta pozwala ustalić, czy długości fal światła, na które komórka jest wrażliwa, są modyfikowane przez pigmenty filtrujące. Główną zaletą tej techniki jest to, że znając czułość widmową poszczególnych fotoreceptorów, możemy przewidzieć zakres kolorów, które widzi dane zwierzę.Aby przygotować się do rejestracji, włącz lampę ksenonową co najmniej 45 minut przed eksperymentem, a wyciągarkę mikroelektrod co najmniej 30 minut przed wyciąganiem elektrod szklanych. Następnie włącz cały sprzęt rejestrujący. Upewnij się, że migawka jest domyślnie zamknięta, aby światło nie przenikało przez kabel światłowodowy.Następnie, za pomocą wyciągacza mikroelektrod, przygotuj cienkie mikroelektrody z borokrzemianowego szkła. Wypełnij elektrody roztworem chlorku potasu o stężeniu 3 M. Aby przygotować preparat, pod mikroskopem przymocuj pojedynczego motyla wewnątrz małej plastikowej rurki za pomocą gorącego wosku w taki sposób, aby głowa była unieruchomiona i wystawała z jednego końca rurki.Następnie przytwierdź cewówkę, czułki i skrzydła za pomocą wosku. Po tym utrwal odwłok, przyciskając go suchym kawałkiem wosku. Utrzymuj wilgotność w probówce, umieszczając w jej wnętrzu, za odwłokiem preparatu, wilgotną chusteczkę.Upewnij się, że preparat jest całkowicie unieruchomiony. Następnie przymocuj probówkę za pomocą niewielkiego kawałka wosku do małej platformy z przegubem kulowym, która jest przytwierdzona do podstawy magnetycznej. Pod mikroskopem stereoskopowym wprowadź srebrny drut do głowy przez otwór gębowy, aby służył jako elektroda odniesienia.Przed eksperymentem na stałe przymocuj drut do platformy. Następnie, za pomocą żyletki, wykonaj mały otwór w lewej rogówce i uszczelnij go wazeliną, aby zapobiec wysychaniu. Po wykonaniu nacięcia rogówki jak najszybciej wprowadź elektrodę rejestrującą do oka, ponieważ hemolimfa w oku szybko twardnieje, co uniemożliwi wprowadzenie elektrody.Jeśli to możliwe, przeprowadź sekcję w aparaturze, w której będzie odbywał się pomiar. Następnie, za pomocą klipsów krokodylkowych, podłącz przewód uziemiający głowicy wzmacniacza do elektrody referencyjnej na platformie z preparatem. Zamocuj elektrodę w uchwycie do elektrod.Następnie wprowadź srebrny drut do roztworu chlorku potasu w mikroelektrodzie. Użyj źródła światła z regulowanymi ramionami (tzw. gęsią szyją), aby oświetlić preparat pod stereomikroskopem podczas wprowadzania elektrody do oka. Ustaw uchwyt elektrody tak, aby mikroelektroda znajdowała się bezpośrednio nad wcześniej wykonanym otworem w rogówce.Następnie, za pomocą mikromanipulatora opuść mikroelektrodę do oka, aż do zamknięcia obwodu. Po wprowadzeniu elektrody do oka wysuń stereoskop poza klatkę Faradaya. Wyłącz źródło światła oświetlające preparat i pozostaw owada w ciemności przez 10 do 20 minut w celu adaptacji do ciemności.Sprawdź rezystancję elektrody, przyłożąc prąd o natężeniu 1 nA i odnotowując zmianę napięcia. Rezystancja powinna zazwyczaj mieścić się w zakresie od 100 do 250 MΩ. Następnie uruchom generator impulsów, aby dostarczyć błysk światła przez cały czas trwania eksperymentu, i skieruj kabel światłowodowy w stronę oka.Monitoruj oscyloskop pod kątem zmiany napięcia przy każdym błysku światła. Ujemna zmiana napięcia oznacza, że elektroda nie wniknęła jeszcze do komórki. Przesuwaj światłowód wokół preparatu, aż do uzyskania maksymalnej odpowiedzi napięciowej.Aby wywołać depolaryzacyjną odpowiedź świetlną, należy obracać mikromanipulator w przód i w tył, co spowoduje niewielkie pionowe ruchy elektrody, jednocześnie lekko uderzając w podstawę uchwytu elektrody lub korzystając z funkcji buzz w przedwzmacniaczu. Należy kontynuować wprowadzanie niewielkich korekt, aż na oscyloskopie pojawi się depolaryzacyjna odpowiedź świetlna. Następnie należy dostosować położenie kabla światłowodowego, aby uzyskać jak największy sygnał depolaryzacyjny.Wprowadzaj niewielkie korekty za pomocą mikromanipulatora i w razie potrzeby korzystaj z funkcji „buzz” we wzmacniaczu, aby upewnić się, że elektroda stabilnie rejestruje aktywność komórki. Stabilny zapis powinien charakteryzować się minimalnymi lub żadnymi zmianami potencjału spoczynkowego, niskim poziomem szumów tła oraz konsekwentnie silną odpowiedzią depolaryzacyjną. Niezbędne jest uzyskanie stabilnego zapisu, w którym potencjał spoczynkowy błony nie jest zaszumiony i nie zmienia się w czasie.Odpowiedzi powinny być duże i dodatnie, bez hiperpolaryzacji. Po ustabilizowaniu układu uruchom oprogramowanie i zamknij okno dialogowe o nazwie „Experiments Gallery”, aby otworzyć wyskakujące okno z czterema kanałami. Ustaw skalę napięcia w prawym górnym rogu okna oprogramowania na 500 millivolts.Następnie kliknij Start w prawym dolnym rogu, aby rozpocząć rejestrację. Zminimalizuj kanały trzeci i czwarty, a następnie dostosuj skalę osi X i Y. Pozostaw oprogramowanie w stanie działania przez cały czas trwania eksperymentu.W przypadku stymulacji białym światłem zarejestruj do 10 pojedynczych odpowiedzi, ustawiając koło filtrów ND na najwyższą wartość OD, która wciąż wywołuje odpowiedź. Tutaj zmiana odpowiedzi została pokazana dla 3,0 OD oraz 2,0 OD. Następnie zarejestruj tę samą liczbę odpowiedzi dla zakresu od 3,5 do 0,0 OD, dla każdej kombinacji, aby uzyskać krzywą zależności odpowiedzi od natężenia logarytmicznego. Przed zarejestrowaniem odpowiedzi komórki na wszystkie długości fal przy użyciu filtrów interferencyjnych, najpierw szybko wyznacz długość fali szczytowej.Bez żadnego filtra ND w torze światła, umieść w nim filtr przepuszczający UV i krótko zaobserwuj amplitudę odpowiedzi. Powtórz procedurę z filtrem przepuszczającym światło niebieskie, zielone i czerwone, co powinno pozwolić określić, gdzie będzie znajdować się szczyt odpowiedzi. Zapisz długość fali filtra, która daje maksymalną odpowiedź, przed zmianą na inny filtr interferencyjny.Między pomiarami z zastosowaniem kolejnych filtrów należy pozwolić komórce na odpowiedź na jeden lub dwa błyski białego światła bez żadnego filtra w torze świetlnym, aby pomóc w monitorowaniu, czy maksymalna odpowiedź nie ulega stopniowemu zmniejszeniu. Następnie należy przeprowadzić pomiary z innymi filtrami interferencyjnymi, dopuszczając do 10 odpowiedzi na filtr. Jest to przykład znacznej ujemnej zmiany napięcia, którą obserwuje się tuż przed wejściem do komórki.Przedstawiono tutaj czysty zapis, który charakteryzuje się niskim poziomem szumu tła oraz dużą odpowiedzią depolaryzacyjną, wynoszącą zazwyczaj co najmniej 40 millivoltów. A tutaj znajduje się przykład słabego zapisu, ze względu na ujemną zmianę potencjału po głównym piku. To jest kolejny przykład nieprawidłowego zapisu.Potencjał spoczynkowy ulega dużym fluktuacjom, a znaczna ilość szumu tła może maskować amplitudę odpowiedzi. Jest to reprezentatywny przykład czułości spektralnej uzyskanej z pojedynczego pomiaru. Typy komórek są klasyfikowane na podstawie szczytowej czułości przy podobnej długości fali oraz ogólnego kształtu widma czułości.Następnie uśrednia się wyniki dla tych samych typów komórek, a średnią czułość nanosi się na wykres z paskami błędu standardowego dla każdej długości fali. Wykres ten przedstawia czułości spektralne trzech typowych typów komórek występujących u owada. Po opanowaniu tej techniki, procedura ta zajmuje około dwóch godzin.Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać eksperymenty behawioralne, aby ustalić, czy wszystkie typy komórek fotoreceptorowych przyczyniają się do dyskryminacji barw.

determination-photoreceptor-cell-spectral-sensitivity-an-insect-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film przedstawia protokół elektrofizjologicznego zapisu aktywności fotoreceptorów w oku unieruchomionej Drosophila, umożliwiając precyzyjny pomiar zmian napięcia w odpowiedzi na bodźce świetlne.

Elektrofizjologiczny zapis napięciowych odpowiedzi fotoreceptorów siatkówki Drosophila na bodźce świetlne

Film demonstruje rejestrowanie aktywności elektrycznej w neuronach fotoreceptorowych ommatidium Drosophila poprzez ustanowienie konfiguracji całej komórki. Podkreśla on aktywację przejściowych kanałów potencjału receptora przez impulsy świetlne, co skutkuje mierzalnymi wstrząsami kwantowymi.

Zapisy cęgów napięcia całej komórki z fotoreceptorów Drosophila

Ten film demonstruje procedurę wewnątrzkomórkowego zapisu in vivo komórek fotoreceptorowych w oku motyla i określania czułości spektralnej poszczególnych typów komórek. Technika ta umożliwia badanie wrażliwości poszczególnych komórek fotoreceptorów na różne bodźce świetlne.

Wewnątrzkomórkowy zapis in vivo wrażliwości spektralnej komórek fotoreceptorowych u motyla

Źródło: Wagner, K.  i inni., Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia wizualizację transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorów Drosophila przy użyciu białek TRPL znakowanych eGFP. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie transgenicznych muszek do obrazowania, przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych komórek fotoreceptorowych oraz ilościowe określenie transportu TRPL...

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Tutaj pokazujemy, jak określić ilościowo liczbę i rozkład przestrzenny aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster, wyróżnionych genetycznie zakodowanym markerem molekularnym, oraz ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.

Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Przedstawiono protokół badania desensytyzacji i odzyskiwania wrażliwości fotoreceptorów raków w funkcji czasu okołodobowego.

Odczulanie i odzyskiwanie fotoreceptorów raków po dostarczeniu bodźca świetlnego

Przedstawiamy protokół do elektrofizjologicznego charakterystyki bistabilnych fotopigmentów: (i) wykorzystanie przemieszczeń ładunku w cząsteczkach fotopigmentu po absorpcji fotonów i ich ogromnej ilości w fotoreceptorach, oraz (ii) wykorzystanie różnic w widmach absorpcyjnych rodopsyny i metarodopsyny. Protokoły te są przydatne do badań przesiewowych pod kątem mutacji wpływających na bistabilne systemy fotopigmentowe.

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

W tym filmie zaprezentowano metodę preparowania i hodowli neuronów komisuralnych z grzbietowej części rdzenia kręgowego szczura w 13. dniu embrionalnym (E13). Dysocjowane neurony komisuralne są użyteczne w badaniu komórkowych i molekularnych mechanizmów wzrostu i prowadzenia aksonów.

Disekcja i hodowla neuronów komisuralnych z embrionalnego rdzenia kręgowego

Poznaj metodę wewnątrzkomórkowych nagrań elektrofizjologicznych do badania czułości spektralnej fotoreceptorów w oku złożonym motyla. Technika ta pozwala przewidywać zakres widzenia barwnego owadów.

Wyznaczanie czułości spektralnej komórek fotoreceptorowych w modelu owadów na podstawie nagrań wewnątrzkomórkowych in vivo

Przeglądaj więcej filmów