Wyznaczanie czułości spektralnej komórek fotoreceptorowych w modelu owadów na podstawie nagrań wewnątrzkomórkowych in vivo

Ogólnym celem tej metody zapisu wewnątrzkomórkowego jest określenie wrażliwości spektralnej poszczególnych komórek fotoreceptorowych w oku ze związku owadów in vivo. Ta metoda może nam powiedzieć, czy na długości fal światła, na które komórka jest wrażliwa, mają wpływ pigmenty filtrujące. Główną zaletą tej techniki jest to, że znając czułość spektralną poszczególnych fotoreceptorów, możemy przewidzieć, jaki zakres kolorów może zobaczyć zwierzę.

Aby przygotować się do nagrania, włącz lampę ksenonową co najmniej 45 minut przed eksperymentem i włącz ściągacz mikroelektrod co najmniej 30 minut przed wyciągnięciem szklanych elektrod. Następnie włącz wszystkie urządzenia nagrywające. Upewnij się, że roleta jest domyślnie zamknięta, aby światło nie przechodziło przez światłowodowy.

Następnie wyciągnij drobne mikroelektrody ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikroelektrod. Wypełnij elektrody trzema molowymi chlorkami potasu. Aby przygotować próbkę, pod mikroskopem umieść pojedynczego motyla w małej plastikowej rurce z gorącym woskiem, tak aby głowa była nieruchoma i wystawała z jednego końca tuby.

Następnie przymocuj trąbkę, czułki i skrzydła woskiem. Następnie przytrzymaj brzuch suchym kawałkiem wosku. Utrzymuj rurkę nawilżoną, umieszczając w niej mokrą chusteczkę, za brzuchem próbki.

Upewnij się, że próbka jest całkowicie nieruchoma. Następnie zamontuj rurkę za pomocą małego kawałka wosku na małej platformie z przegubem kulowym, który jest przymocowany do podstawy magnetycznej. Pod mikroskopem preparacyjnym włóż srebrny drut do głowy przez część ustniczą, jako elektrodę referencyjną.

Przed eksperymentem przymocuj drut na stałe do platformy. Następnie wytnij mały otwór w lewej rogówce za pomocą żyletki i uszczelnij otwór wazeliną, aby zapobiec wysuszeniu. Po przecięciu rogówki należy jak najszybciej wprowadzić elektrodę rejestrującą do oka, ponieważ hemolimfa w oku szybko stwardnieje i uniemożliwi wprowadzenie elektrody.

Jeśli to możliwe, wykonaj sekcję na stanowisku, na którym będzie miało miejsce nagranie. Następnie podłącz przewód uziemiający stopnia czołowego do elektrody referencyjnej na platformie próbki za pomocą zacisków krokodylkowych. Zamontuj elektrodę na uchwycie elektrody.

Następnie włóż srebrny drut do roztworu chlorku potasu w mikroelektrodzie. Użyj źródła światła z nasadkami na gęsiej szyi, aby oświetlić próbkę pod stereoskopem, jednocześnie opuszczając elektrodę do oka. Wyreguluj uchwyt elektrody tak, aby mikroelektroda znajdowała się bezpośrednio nad otworem wcześniej wyciętym w rogówce.

Następnie opuść mikroelektrodę do oka za pomocą mikromanipulatora, aż do zamknięcia obwodu. Gdy znajdzie się w oku, wychyl stereoskop na zewnątrz klatki Faradaya. Wyłącz źródło światła oświetlające okaz i pozostaw owada w ciemności na 10 do 20 minut w celu adaptacji do ciemności.

Sprawdź rezystancję elektrody, przykładając prąd o natężeniu jednego nanoampera i zwracając uwagę na zmianę napięcia. Rezystancja powinna zwykle mieścić się w zakresie od 100 do 250 megaomów. Następnie aktywuj generator impulsów, aby dostarczyć błysk światła na czas trwania eksperymentu i skieruj światłowodowy w stronę oka.

Sprawdź oscyloskop pod kątem zmiany napięcia przy każdym mignięciu światła. Ujemna zmiana napięcia oznacza, że elektroda nie weszła jeszcze do ogniwa. Przesuwaj światłowodowy wokół próbki, aż do zaobserwowania maksymalnej objętościtage odpowiedź.

Aby wygenerować depolaryzacyjną odpowiedź świetlną, obracaj mikromanipulator do przodu i do tyłu, co powoduje niewielkie ruchy elektrody w pionie, jednocześnie lekko stukając w podstawę uchwytu elektrody lub korzystając z funkcji brzęczenia na przedwzmacniaczu. Kontynuuj dokonywanie niewielkich regulacji, aż na oscyloskopie pojawi się depolaryzująca odpowiedź na światło. Następnie wyreguluj światłowodowy, aby znaleźć największy sygnał depolaryzujący.

Dokonaj niewielkich regulacji za pomocą mikromanipulatora i w razie potrzeby użyj funkcji brzęczenia na wzmacniaczu, aby upewnić się, że elektroda stabilnie rejestruje ogniwo. Stabilne nagranie powinno mieć niewielkie lub żadne zmiany w potencjale spoczynkowym, niski poziom szumów tła i niezmiennie dużą odpowiedź depolaryzacyjną. Niezbędne jest stabilne nagranie, w którym spoczynkowy potencjał błony nie jest zaszumiony i nie zmienia się w czasie.

Odpowiedzi powinny być duże i pozytywne, bez hiperpolaryzacji. Gdy konfiguracja jest stabilna, otwórz oprogramowanie i zamknij okno dialogowe o nazwie Galeria eksperymentów"aby otworzyć wyskakujące okienko z czterema kanałami. Dostosuj skalę napięcia w prawym górnym rogu okna oprogramowania na 500 miliwoltów.

Następnie kliknij Start w prawym dolnym rogu, aby rozpocząć nagrywanie. Zminimalizuj kanały trzeci i czwarty oraz dostosuj skalę X i Y. Następnie pozwól oprogramowaniu działać przez czas trwania eksperymentu.

W przypadku stymulacji światłem białym nagraj do 10 indywidualnych odpowiedzi, z kołem filtra ND ustawionym na najwyższą średnicę zewnętrzną, która nadal wywołuje odpowiedź. W tym miejscu zmiana odpowiedzi jest pokazana przy 3,0 OD i 2,0 OD. Następnie zarejestruj tę samą liczbę odpowiedzi od 3,5 do 0,0 OD, w każdej kombinacji, aby uzyskać krzywą intensywności logarytmu odpowiedzi. Przed zarejestrowaniem odpowiedzi komórki na wszystkie długości fal za pomocą filtrów interferencyjnych, najpierw szybko znajdź szczytową długość fali.

Bez filtra ND na ścieżce światła umieść tam filtr przepuszczający promieniowanie UV i krótko obserwuj amplitudę odpowiedzi. Powtórz procedurę z niebieskim filtrem nadawczym, zielonym filtrem nadawczym i czerwonym filtrem nadawczym, co powinno dać pewne wyobrażenie o tym, gdzie będzie szczytowa odpowiedź. Nagrywaj pod długością fali filtra, która daje maksymalną odpowiedź przed zmianą na inny filtr interferencyjny.

Pomiędzy nagrywaniem z kolejnymi filtrami pozwól komórce zareagować na jeden lub dwa błyski białego światła bez żadnego filtra na ścieżce światła, aby pomóc monitorować, czy szczytowa odpowiedź pogarsza się w czasie. Następnie nagrywaj z innymi filtrami zakłócającymi i pozwól na maksymalnie 10 odpowiedzi na filtr. Jest to przykład dużej ujemnej zmiany napięcia, która jest widoczna tuż przed wejściem do ogniwa.

Pokazane tutaj jest czyste nagranie, które ma niewiele szumów tła i dużą odpowiedź depolaryzacyjną, zwykle wynoszącą co najmniej 40 miliwoltów. A oto przykład słabego nagrania, spowodowanego ujemną zmianą potencjału po głównym szczycie. To kolejny przykład złego nagrania.

Potencjał spoczynkowy ulega dużym wahaniom, a duża ilość szumu tła może przesłonić amplitudę odpowiedzi. Jest to reprezentatywny przykład czułości spektralnej uzyskanej z pojedynczego nagrania. Typy komórek są klasyfikowane według szczytowej czułości przy podobnej długości fali i ogólnego kształtu widma czułości.

Te same typy komórek są następnie uśredniane, a średnia czułość jest wykreślana ze standardowymi słupkami błędów dla każdej długości fali. Ten wykres przedstawia czułość spektralną trzech typowych typów komórek występujących u owadów. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około dwie godziny.

Po tej procedurze można przeprowadzić eksperymenty behawioralne w celu ustalenia, czy wszystkie typy komórek fotoreceptorowych przyczyniają się do dyskryminacji kolorów.