Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila
31 stycznia 2016
Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.
Ogólnym celem chromogennej wielokrotnej hybrydyzacji in situ (WISH) jest ułatwienie mapowania wzorów rozmieszczenia mRNA w nienaruszonych embrionach Drosophila. Dzięki tej metodzie można bezpośrednio porównać lokalizację mRNA trzech różnych genów w obrębie tego samego embrionu. Wielokolorowa metoda WISH może być wykorzystana do szybkiego i niezawodnego generowania map ekspresji genów w rozwijających się organizmach. Może to dostarczyć istotnych wskazówek na temat interakcji regulacyjnych genów, aktywnego rozwoju embrionalnego lub organogenezy. Główną zaletą tej techniki jest to, że wzory ekspresji mRNA różnych genów są wizualizowane w charakterystycznych i kontrastujących kolorach. W ten sposób można z wysoką dokładnością wyróżnić unikalne i nakładające się miejsca ekspresji. Stosując standardowe procedury, należy zebrać, zdechorionować, utrwalić i odwitelinizować wymagane embriony. Przechowywać je w metanolu w zamrażarce do momentu użycia. Teraz należy rozpocząć pracę z embrionami w temperaturze pokojowej. W pierwszej studni płytki 12-dołkowej umieścić wkładkę i dodać dwa mililitry metanolu. Przenieść żądaną liczbę embrionów do wkładki, która będzie służyć do transportu embrionów przez całą procedurę. Następnie rehydratować embriony, stosując inkubacje trwające trzy minuty w serii malejących stężeń metanolu. Rozpocząć od 75% methanol w PBS. Następnie zastosować 50% methanol w PBS-T. Potem użyć 25% methanol w PBS-T i zakończyć dwiema inkubacjami w czystym PBS-T. Następnie przeprowadzić wstępną utrwalanie embrionów w 4% paraformaldehyde w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć utrwalacz, wykonując cztery przemycia w PBS-T. Podczas etapów przemywania odmrozić i przygotować roztwory robocze Proteinase K oraz glicyny. Po przemyciach przeprowadzić permeabilizację embrionów w świeżo przygotowanej Proteinase K przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Zatrzymać reakcję, wykonując dwa jednominutowe przemycia w świeżo przygotowanej glicynie. Następnie przeprowadzić końcowe utrwalanie embrionów w 4% paraformaldehyde w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wypłukać paraformaldehyd, wykonując cztery przemycia w PBS-T po trzy minuty każde. Następnie przenieść embriony do buforu prehybrydyzacyjnego. Mogą być one przechowywane w zamrażarce do momentu użycia. Rozpocząć od rozdzielenia embrionów w buforze prehy do probówek o pojemności dwóch mililitrów. Do każdej probówki odpiwetować około 15 µL osiadłych embrionów. Teraz inkubować embriony w 65
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono procedurę wielocelowej chromogennej hybrydyzacji in situ w całym preparacie (MC-WISH) dla embrionów Drosophila. Metoda ta umożliwia jednoczesne wykrywanie trzech różnych wzorów rozmieszczenia mRNA przy użyciu kontrastujących kolorystycznie osadów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Analiza ekspresji genów
Wstęp
- Mapowanie wzorców rozmieszczenia mRNA jest kluczowe dla zrozumienia interakcji regulacyjnych genów.
- Metoda MC-WISH umożliwia porównanie ekspresji genów w obrębie tego samego zarodka.
- Technika ta pozwala na precyzyjne wyróżnienie unikalnych oraz nakładających się miejsc ekspresji.
- Znajduje ona zastosowanie w badaniu rozwoju embrionalnego oraz organogenezy.
Cel badania
- Aby ułatwić mapowanie wzorców rozmieszczenia mRNA w nienaruszonych embrionach Drosophila.
- Aby zapewnić szybką i niezawodną metodę generowania map ekspresji genów.
- Aby pogłębić zrozumienie oddziaływań genetycznych podczas rozwoju.
Zastosowane metody
- Zbiór i fiksacja embrionów Drosophila.
- Rehydratacja poprzez seryjne zmniejszanie stężenia metanolu.
- Permeabilizacja z użyciem Proteinazy K.
- Postfiksacja i hybrydyzacja w buforze przedhybrydyzacyjnym.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja wzorców ekspresji mRNA w różnych kolorach.
- Możliwość jednoczesnego porównania ekspresji trzech różnych genów.
- Wysoka precyzja w identyfikacji nakładających się miejsc ekspresji.
- Potencjalne zastosowania w badaniu mechanizmów regulacji genów.
Wnioski
- MC-WISH jest skuteczną metodą analizy rozmieszczenia mRNA w embrionach.
- Technika ta pozwala na zrozumienie dynamiki ekspresji genów podczas rozwoju.
- Może ona stanowić wartościowe narzędzie dla badaczy zajmujących się biologią rozwoju.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Wielokrotna chromogenna hybrydyzacja in situ w całym preparacie (MC-WISH) umożliwia bezpośrednie porównanie przestrzenne wzorców ekspresji wielu genów w obrębie nienaruszonych embrionów, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w walidacji celów poprzez wyjaśnianie koekspresji i relacji regulacyjnych. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania, zapewniając wysoką rozdzielczość i powtarzalne odczyty aktywności transkrypcyjnej w systemach rozwojowych istotnych dla danej jednostki chorobowej. Zastosowanie tej metody w embrionach Drosophila i zebrafish pozycjonuje ją jako skalowalne narzędzie do badania szlaków sygnałowych oraz przesiewu fenotypowego w przedklinicznych systemach modelowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie relacji przestrzennych między domenami ekspresji genów w celu wyjaśnienia oddziaływań w obrębie szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Wspomaga funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez bezpośrednią wizualizację unikalnych i nakładających się miejsc występowania mRNA z wysoką dokładnością.
- Wartość prognostyczna: Poprawia selekcję projektów w portfolio poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w sieciach regulacji genów podczas rozwoju embrionalnego i organogenezy.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez generowanie wiarygodnych, multipleksowych map ekspresji genów.
- Wartość operacyjna: Poprawa standaryzacji i powtarzalności testów dzięki jednoczesnej detekcji trzech gatunków mRNA w kontrastujących kolorach.
- Skalowalność: Ułatwienie ponownego wykorzystania platformy oraz wiarygodna ocena związków dzięki dostarczeniu ilościowych odczytów przestrzennych w nienaruszonych próbkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez zachowanie kontekstu przestrzennego ekspresji genów na różnych etapach rozwoju.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez określenie precyzyjnych miejsc ekspresji, co pozwala na dopasowanie biomarkerów i określenie istotności w kontekście choroby.
- Mechanistyczne ograniczanie ryzyka: Koncentruje się na wartości prognostycznej, umożliwiając bezpośrednie porównanie dynamiki transkrypcyjnej w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda MC-WISH wpisuje się w kontinuum odkryć – od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po identyfikację związków wiodących – dostarczając rozdzielczych przestrzennie danych transkrypcyjnych, które umożliwiają wczesne zrozumienie mechanizmów oraz ocenę gotowości analiz.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie bezpośredniego porównania wzorców rozmieszczenia mRNA w nienaruszonych embrionach.
- Screening: Zapewnia gotowość do analizy dzięki powtarzalnym, multipleksowym wynikom kolorymetrycznym, które pozwalają na bezpośrednie porównanie ekspresji genów.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary przestrzenne poprzez precypitację chromogenną, co ułatwia porównywanie warunków oraz analizę koekspresji.
- Badania translacyjne: Utrzymuje kontekst rozwojowy od etapu odkryć po fazy przedkliniczne, wspierając dopasowanie biomarkerów w modelach organogenezy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi reużywalną funkcjonalność w ramach projektów dzięki możliwości zastosowania w wielu systemach modelowych (Drosophila, zebrafish) oraz adaptowalności do różnych paneli genowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niepewności w zakresie koekspresji genów i oddziaływań regulacyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i skalowalność dzięki ustandaryzowanej detekcji chromogenicznej oraz procedurom pracy z zarodkami możliwymi do przechowywania w zamrażarce.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka związanego z celami poprzez wysokodokładne mapowanie przestrzenne.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając przejrzystych danych wizualnych dotyczących nakładania się i unikalności ekspresji w celu podejmowania decyzji go/no-go.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w dziedzinie embriologii, hybrydyzacji kwasów nukleinowych oraz technik detekcji chromogenicznej.
- Zależność od aparatury kolorymetrycznej opartej na fosfatazie alkalicznej oraz standardowej infrastruktury biologii molekularnej.
- Konieczność standaryzacji projektowania sond, znakowania haptenami oraz protokołów wywoływania barwy pomiędzy zespołami.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy przejściu z embrionów Drosophila na embriony rybek zebrafish ze względu na różnice w przenikalności i utrwalaniu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują głębokość penetracji sondy w embrionach na późniejszych etapach rozwoju oraz ograniczenie multipleksowania sygnału przez dostępną gamę barw chromogenów.
