Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Ogólnym celem projektu Chromogenic Multi-target WISH jest ułatwienie mapowania wzorców dystrybucji mRNA w nienaruszonych zarodkach Drosophila. Dzięki tej metodzie lokalizacje mRNA trzech różnych genów mogą być bezpośrednio porównane w obrębie tego samego zarodka. Wielokolorowy WISH może być używany do generowania map ekspresji genów w rozwijających się organizmach w szybki i niezawodny sposób. Może to dostarczyć ważnych wskazówek na temat interakcji regulacyjnych genów, aktywnego i embrionalnego rozwoju lub organogenezy. Główną zaletą tej techniki jest to, że wzorce ekspresji mRNA różnych genów są wizualizowane w charakterystycznych i kontrastujących kolorach. W ten sposób unikalne i nakładające się na siebie witryny wyrażeń mogą być wyróżniane z dużą dokładnością. Korzystając ze standardowych procedur, zbierz, zdechorionować, utrwalić i zdewitylizować wymagane zarodki. Przechowuj je w metanolu w zamrażarce, aż będą potrzebne. Teraz zacznij od zarodków w temperaturze pokojowej. Włóż wkładkę do pierwszego dołka płytki 12-dołkowej i dodaj dwa mililitry metanolu. Przenieś żądaną ilość zarodków do wkładki, która jest używana do przenoszenia zarodków przez cały zabieg. Teraz ponownie nawodnij zarodki za pomocą trzyminutowych inkubacji w zmniejszającej się serii metanolu. Zacznij od 75% metanolu w PBS. Następnie dodaj 50% metanolu w PBS-T. Następnie użyj 25% metanolu w PBS-T i zakończ dwiema inkubacjami w czystym PBS-T. Następnie umieść zarodki w 4% paraformaldehydzie w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć utrwalacz, przemywając go czterema razy w PBS-T. Podczas etapów mycia rozmrozić i przygotować roztwory robocze dla proteinazy K i glicyny. Po umyciu należy przepuszczać zarodki w świeżo przygotowanej proteinazie K przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Zatrzymaj reakcję, przemywając dwie jednominutowe płukanki w świeżo przygotowanej glicynie. Następnie umieść zarodki w 4% paraformaldehydzie wyprodukowanym w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wypłukać paraformaldehyd czterema płukaniami w PBS-T po trzy minuty. Następnie przenieś zarodki do buforu prehybrydyzacyjnego. Można je przechowywać w zamrażarce do czasu, gdy będą potrzebne. Zacznij od rozprowadzenia zarodków w buforze prehy do dwóch mililitrowych probówek. Do każdej probówki wsypać około 15 mikrolitrów osiadłych zarodków. Teraz inkubuj zarodki w 65