Name: Procedura indukująca jaskrę w modelu szczura in vivo i preparat siatkówki z pełnym mocowaniem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę indukcji jaskry u szczura poprzez wstrzyknięcie hipertonicznego roztworu soli do żyły nadtwardówkowej. Technika umożliwia badanie utraty komórek zwojowych siatkówki i strategii ochrony nerwów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C. Linn jest wspierany przez grant NIH (NIH NEI EY022795).

Wszystkie procedury z wykorzystaniem zwierząt były zgodne ze standardami Komitetu Instytutu Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) na Uniwersytecie Western Michigan.
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>W tym badaniu wykorzystaj samce i samice szczurów w wieku 3 miesięcy.</li>
	<li>Trzymaj zwierzęta w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody.</li>
</ol>
2. Przygotowanie koktajlu KAX do znieczulenia zwierząt
<ol>
	<li>Rozpuścić 50 mg ksylazyny (20 mg/ml) w 5 ml ketaminy (100 mg/ml) z 1 ml acepromazyny (10 mg/ml) i 3 ml wody destylowanej. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Wysterylizować filtrem strzykawkowym i przechowywać ten roztwór w butelce z surowicą o pojemności 10 ml.</li>
</ol>
3. Wtrysk KAX
<ol>
	<li>Zważyć zwierzę (g) i umieścić je w klatce do momentu, gdy będzie gotowe do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo 0,1 ml KAX/100 g masy ciała zwierzęcia za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 28 G.</li>
	<li>Pozwól, aby zwierzę straciło przytomność. Sprawdź odruchy, szczypiąc stopy i ogon.</li>
	<li>Trzymaj wszystkie zwierzęta bezpiecznie w laboratorium na czas operacji.</li>
	<li>Po operacji umieść zwierzęta w ich klatkach i utrzymuj je w komfortowym stanie do czasu odzyskania przytomności. Zwierzęta należy zwracać do obiektu tylko wtedy, gdy się obudzą i wznowią normalne zachowanie.</li>
</ol>
4. Przygotowanie do operacji i montażu mikroigieł
<ol>
	<li>Przygotować sterylny 2 M roztwór NaCl.</li>
	<li>Użyj ściągacza do mikroelektrod (Rysunek 1C), aby wyciągnąć jedną grubościenną, polerowaną, standardową i cienkościenną rurkę borokrzemianową o średnicy wewnętrznej 0,86 mm do dwóch drobno zwężających się szklanych mikroigieł (Rysunek 1D, Rysunek 1E).</li>
	<li>Napełnić jedną mikroigłę z poprzedniego etapu solą fizjologiczną 2 M za pomocą igły do zasypywania strzykawki i strzykawki o pojemności 1 ml (Rysunek 1B) . Wystuknij pęcherzyki powietrza z końcówki elektrody.</li>
	<li>Napełnić drugą strzykawkę o pojemności 1 ml 2 M NaCl. Podłącz igłę 18 G, a następnie przymocuj rurkę polietylenową na długość (około 10 cali) (Rysunek 1A). Za pomocą tłoka strzykawki napełnić rurkę polietylenową solą fizjologiczną przez igłę.</li>
	<li>Gdy zarówno mikroigła, jak i rurka zostaną wypełnione solą fizjologiczną, ostrożnie je połącz. Wyeliminuj powietrze z połączenia między nimi (Rysunek 2).</li>
	<li>Drobno ukosuj końcówkę mikroigły, zeskrobując ją bardzo delikatnie o słoje ręcznika papierowego.</li>
	<li>Sprawdź opór mikroigły, delikatnie naciskając tłok na strzykawce, aż na ręczniku papierowym będzie widoczny drobny strumień płynu. Strumień cieczy nie powinien być szerszy niż 0,5 mm.</li>
</ol>
5. Przygotowanie zwierzęcia
<ol>
	<li>Nałóż 1-2 krople znieczulenia miejscowego na rogówkę (roztwór okulistyczny chlorowodorku proparakainy, USP, 0,5%). Poczekaj, aż nie wystąpi odruch oczny.</li>
	<li>Przytnij wąsy nożyczkami.</li>
	<li>Nasącz aplikator z bawełnianą końcówką roztworem betadyny i wymazówką wokół oka eksperymentalnego.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu przymocuj hemostat, aby zacisnąć dolną powiekę, aby wybrzuszyć oko, odsłonić żyłę nadtwardówkową i ograniczyć ruchy gałek ocznych. (Rysunek 3, grot strzałki)</li>
</ol>
6. Wstrzyknięcie soli fizjologicznej wywołującej jaskrę
<ol>
	<li>Po przygotowaniu zespołu mikroigłowego i zwierzęcia należy rozpocząć wstrzykiwania.</li>
	<li>Gdy potwierdzi się, że zwierzę nie reaguje na szczypanie stóp/ogona, ostrożnie przebij żyłę nadtwardówkową mikroigłą, zbliżając się pod małym kątem od 10 do 20 stopni do żyły (ryc. 3, biała strzałka). Udane wkłucie do żyły jest widoczne, gdy krew dostanie się do końcówki mikroigły (ryc. 3, strzałka).</li>
	<li>Powoli i ręcznie wstrzyknąć do żyły około 50 μl soli fizjologicznej. Powinno to zająć około 10 sekund. Żyły bledną na biało, gdy sól krąży w układzie naczyniowym (ryc. 4, grot strzałki). Niektóre obszary mogą zachować krwistoczerwony wygląd (Ryc. 4, strzałka).
	<ol>
		<li>Wykonać drugie wstrzyknięcie do żyły, naprzeciwko miejsca pierwszego, aby zapewnić dokładne uszkodzenie siatkówki w całej warstwie komórek zwojowych siatkówki. 
		Uwaga: W ciągu kilku minut powinno pojawić się wyraźne zmętnienie przez tęczówkę oka, gdy sól krąży w układzie naczyniowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeciwległe oko należy pozostawić nieleczone do stosowania jako kontrola wewnętrzna.</li>
</ol>
7. Odzyskiwanie zwierząt
<ol>
	<li>Usuń hemostat.</li>
	<li>Za pomocą bawełnianego aplikatora nanieść potrójną maść z antybiotykiem (bacytracyna, siarczan neomycyny, siarczan polimyzyny B) na miejsce zaciśnięte przez hemostat i na miejsca wstrzyknięcia. Uszkodzenie tkanek wokół oka nie występuje przy użyciu hemostatu.</li>
	<li>>Umieść znieczulone zwierzęta w klatkach na kocu z ciepłą wodą, aby zapobiec hipotermii. Trzymaj zwierzęta pod obserwacją, dopóki nie odzyskasz przytomności i normalnego zachowania. Przewieź obudzone zwierzęta z powrotem do kolonii zwierząt. Zwierzęta pozostają w kolonii do czasu złożenia ofiary.</li>
</ol>
8. Składanie ofiar ze zwierząt i usuwanie siatkówki
<ol>
	<li>Miesiąc po zabiegu wywołania jaskry zwierzęta są poddawane eutanazji przez uduszenie CO2 i wtórne nakłucie klatki piersiowej.
	<ol>
		<li>Umieść zwierzę w komorze i bezpiecznie załóż pokrywę.</li>
		<li>Otwórz zawory CO2 i regulatora gazu, aby umożliwić wyparcie tlenu w komorze o 20% objętości / min CO2</li>.
		<li>Odczekaj od czterech do 5 minut, aż zwierzę zginie.</li>
		<li>Wyłącz oba zawory.</li>
		<li>Wyjąć zwierzę z komory i wykonać wtórne nakłucie klatki piersiowej sterylnym skalpelem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po eutanazji za pomocą skalpela przeciąć tkankę łączną w jamie oczodołu otaczającej oko, uważając, aby nie przeciąć samej gałki ocznej.</li>
	<li>Ostrożnie użyj nożyczek o zakrzywionych krawędziach, aby przeciąć nerw wzrokowy i pozostałą tkankę, aby wydobyć nienaruszoną gałkę oczną. Umieść wyekstrahowaną gałkę oczną na sterylnej jednorazowej szalce Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm zawierającej świeży PBS.</li>
	<li>Zrób muszlę oczną z gałki ocznej. Aby to zrobić, wykonaj małe nacięcie skalpelem tuż za granicą między tęczówką a twardówką. Wykonaj to nacięcie na obwodzie oka małymi sprężynowymi nożyczkami, aby usunąć półkulę rogówki z gałki ocznej. Półkula połączona z nerwem wzrokowym pozostaje.</li>
	<li>Znajdź bardzo cienką różowo-beżową siatkówkę wewnątrz muszli ocznej zwierzęcia poddanego eutanazji. Przytrzymaj pigmentowaną warstwę siatkówki za pomocą kleszczyków, aby ustabilizować muszlę oczną. Użyj kolejnej pary zamkniętych kleszczy, aby bardzo delikatnie usunąć całą nienaruszoną siatkówkę z tylnej części oka. Unikaj bezpośredniego szczypania, ciągnięcia lub szarpania siatkówki.</li>
	<li>Użyj małych nożyczek sprężynowych, aby przeciąć obszar, w którym nerw wzrokowy jest nadal przyczepiony do siatkówki.</li>
	<li>Pamiętaj, aby odciąć wszelkie resztki nabłonka barwnikowego lub tkanki twardówki z siatkówki.</li>
	<li>Za pomocą pipety transferowej bardzo delikatnie przenieś izolowaną siatkówkę na czystą, pokrytą Sylgardem szalkę Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm zawierającą świeży PBS.</li>
</ol>
9. Przygotowanie całej siatkówki
<ol>
	<li>Po umieszczeniu w naczyniu sylgardowym użyj kleszczy i jednej igły do kaktusa, aby przypiąć siatkówkę na miejscu. Utrzymuj warstwę komórek zwojowych siatkówki skierowaną do góry, a nerw wzrokowy do dołu. Półkulisty kształt siatkówki jest zauważalny nawet po fiksacji. Krzywizna siatkówki będzie się zwijać w kierunku sufitu, gdy warstwa komórek zwojowych siatkówki znajdzie się w pożądanej orientacji.</li>
	<li>Użyj małych nożyczek, aby przeciąć siatkówkę na cztery ćwiartki, tworząc kształt czterolistnej koniczyny promieniującej z głowy nerwu wzrokowego.</li>
	<li>Przypnij ćwiartki siatkówki dodatkowymi igłami kaktusowymi, aby siatkówka była jak najbardziej płaska bez rozciągania (ryc. 5).</li>
	<li>Przypięte siatkówki umieścić w naczyniu sylgardowym za pomocą 3 ml 4% paraformaldehydu O/N w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
10. Barwienie siatkówki przeciwciałami
Uwaga: Wybarwiaj siatkówki przeciwciałami pierwszorzędowymi i wtórnymi do oglądania neuronów w siatkówce (Rysunek 6).
<ol>
	<li>Przepłukać stałe, płasko zamontowane siatkówki trzy razy po 2 minuty w PBS.</li>
	<li>Przepuszczalność siatkówki za pomocą 1% Triton X-100 z 1% płodowej surowicy bydlęcej w PBS przez 60 min.</li>
	<li>Przepłukać siatkówki trzy razy po 2 minuty każda, w PBS.</li>
	<li>Spłukać dwukrotnie 0,1% Triton X-100 w PBS, 5 minut na pranie.</li>
	<li>Spłucz dwukrotnie PBS, 5 minut na pranie.</li>
	<li>Inkubować z 1% Triton X-100 i 1% płodową surowicą bydlęcą w PBS w temperaturze pokojowej przez 45 min.</li>
	<li>Spłukać dwukrotnie 0,1% Triton X-100 w PBS, 5 minut na pranie.</li>
	<li>Spłucz dwukrotnie PBS, 5 minut na pranie.</li>
	<li>Inkubować każdą siatkówkę w 3 ml 1% płodowej surowicy bydlęcej w PBS z oczyszczonym mysim anty-szczurzym CD90 / mysim CD90.1 (rozcieńczenie 1:300) O/N w RT.</li>
	<li>Przepłukać siatkówkę raz 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Spłucz dwukrotnie PBS, 5 minut na pranie.</li>
	<li>Inkubuj każdą siatkówkę w 3 ml PBS (bez FBS) z wtórnym kozim anty-mysim IgG Alexa Fluor 594 (1:300) O/N w RT.</li>
	<li>Obficie umyć siatkówki za pomocą PBS.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu preparacyjnego ostrożnie usuń igły kaktusa z siatkówki.</li>
	<li>Delikatnie przenieś siatkówki na szkiełka mikroskopowe za pomocą pipety transferowej. Upewnij się, że utrzymujesz orientację z warstwą komórek zwojowych siatkówki skierowaną do sufitu. Półkulisty kształt siatkówki jest zauważalny nawet po fiksacji. Krzywizna siatkówki będzie się zwijać w kierunku sufitu, gdy warstwa komórek zwojowych siatkówki znajdzie się w pożądanej orientacji.</li>
	<li>Nadmiar PBS należy wchłonąć za pomocą KimWipe lub innego podobnego materiału chłonnego. Uważaj, aby nie wchłonąć siatkówki.</li>
	<li>Dodać 5 kropli 1/2 glicerolu i 1/2 PBS wagowo jako podłoże montażowe.</li>
	<li>Przykryj siatkówkę szkiełkiem nakrywkowym, unikając pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Zabezpiecz szkiełko nakrywkowe za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, kleju lub innego kleju.</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych lub konkurujących ze sobą interesów, które mogliby ujawnić.

Protokół ten opisuje metodę wywoływania stanów podobnych do jaskry w modelu szczura in vivo . Procedura ta wykorzystuje wstrzyknięcie hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej w celu wywołania bliznowacenia w siatce beleczkowej 29, 32. Rozwijająca się tkanka bliznowata blokuje odpływ cieczy wodnistej, która zwiększa ciśnienie w komorze przedniej. Wraz ze zmniejszonym odpływem i wzrostem ciśnienia soczewka zawieszona na elastycznych więzadłach wpycha się z powrotem do komory ciała szklistego. Ciało ...

Jaskra to grupa chorób oczu atakujących neurony w siatkówce, a konkretnie komórki zwojowe siatkówki1-2. Aksony tych komórek zbiegają się, stając się nerwem wzrokowym przenoszącym informacje wizualne do mózgu, w którym postrzegany jest wzrok. Uszkodzenia RGC i ich aksonów powodują zatem wady wizualne.
Podstawowe cechy związane z zaburzeniami jaskry to zwyrodnienie i śmierć RGC, podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) oraz bańki i atrofia dysku nerwu wzrokowego. Cechy te prowadzą do utraty pola widzenia lub całkowitej, nieodwracalnej ślepoty. Obecnie jaskra spowodowała ślepotę u 70 milionów ludzi na całym świecie 3. W związku z tym jest to trzecia co do wielkości przyczyna ślepoty na świecie 4.
Dokładny mechanizm śmierci RGC w jaskrze pozostaje nieznany. Przeprowadzono wiele badań, aby rozwikłać tę tajemnicę. Wiadomo jednak, że głównym czynnikiem ryzyka jaskry jest wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego spowodowany nieregularnym krążeniem cieczy wodnistej (AH) w przedniej komorze oka. AH działa jako przezroczysty i bezbarwny zamiennik krwi w jałowej przedniej komorze oka. Odżywia otaczające komórki, usuwa wydzielane produkty przemiany materii z procesów metabolicznych, transportuje neuroprzekaźniki i umożliwia krążenie leków i komórek zapalnych w oku w stanach patologicznych 1.
Utrzymanie krążenia cieczy wodnistej obejmuje ciało rzęskowe i siatkę beleczkową. Ciecz wodnista jest wytwarzana przez ciało rzęskowe. Następnie przepływa do przedniej komory, aby utrzymać ogólny stan zdrowia tkanki oka. 75 - 80% odpływu cieczy wodnistej jest aktywnie wydzielane przez niepigmentowy nabłonek rzęskowy, gdy płyn jest filtrowany przez trzy warstwy gąbczastej tkanki w mięśniu rzęskowym. Płyn wydostaje się przez siatkę beleczkową i przez kanał Schlemma, który opróżnia się do układu krwionośnego 5. Pozostałe 20 - 25% odpływu omija siatkę beleczkową i jest biernie wydzielane przez ultrafiltrację i dyfuzję przez szlak błony naczyniowej oka. Szlak ten wydaje się być względnie niezależny od ciśnienia wewnątrzgałkowego 1.
Gdy produkcja i odpływ cieczy wodnistej nie są zrównoważone, w oku narasta ciśnienie. Jak stwierdzono, ten wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego jest głównym czynnikiem ryzyka rozwoju jaskry. Takie ciśnienie powoduje uszkodzenie skomplikowanych warstw neuronów w siatkówce w tylnej części oka. Uszkodzenie aksonów komórek zwojowych siatkówki nerwu wzrokowego powoduje, że mózg nie otrzymuje już dokładnych informacji wizualnych. W rezultacie percepcja wzroku zostaje utracona i może dojść do całkowitej ślepoty.
Do tej pory nie ma lekarstwa na jaskrę. Istnieją różne metody leczenia, które mają na celu przede wszystkim obniżenie ciśnienia wewnątrzgałkowego. Należą do nich klasy leków miejscowych, takich jak blokery receptora beta1-adrenergicznego lub miejscowe analogi prostaglandyn. Beta-blokery obniżają ciśnienie wewnątrzgałkowe poprzez zmniejszenie wytwarzania cieczy wodnistej 7. Prostaglandyny działają w celu zmniejszenia ciśnienia wewnątrzgałkowego poprzez zwiększenie odpływu cieczy wodnistej 8-14. Agoniści receptorów alfa-adrenergicznych i inhibitory anhydrazy węglanowej są również stosowane jako wtórne metody leczenia. Agoniści receptorów alfa-adrenergicznych zwiększają odpływ przez szlak naczyniowo-twardówkowy 15-17. Inhibitory anhydrazy węglanowej zmniejszają produkcję AH poprzez hamowanie enzymatyczne 18. W leczeniu jaskry stosuje się również znacznie bardziej inwazyjne procedury. Trabekuloplastyka laserowa służy do zwiększenia odpływu cieczy wodnistej 19. Inna terapia chirurgiczna, zwana trabekulektomią, tworzy alternatywne miejsce drenażu do filtrowania AH, gdy tradycyjna ścieżka beleczkowa jest zablokowana 20-21.
Te opcje leczenia są znane z skutecznego zmniejszania IOP. Jednak do 40% pacjentów z jaskrą wykazuje prawidłowy poziom IOP, co wskazuje na potrzebę bardziej kompletnych metod terapeutycznych. 22,23 Ponadto śmierć komórek zwojowych siatkówki obserwowana w jaskrze jest nieodwracalna po jej rozpoczęciu, a obecne leczenie nie zatrzymuje postępu choroby 24-28. Uwypukliło to potrzebę skutecznych terapii neuroprotekcyjnych, które mają na celu przetrwanie samych neuronów. Opracowanie modeli jaskry ma kluczowe znaczenie dla tego rozwoju.
W tym badaniu demonstrujemy metodę wywoływania efektów podobnych do jaskry u dorosłych szczurów rasy Long Evans przy użyciu zmodyfikowanej procedury pierwotnie opisanej przez Morrisona29. W tej procedurze wstrzyknięcie 2 M hipertonicznego soli fizjologicznej do nadtwardówkowego splotu żylnego wywołuje stany podobne do jaskry poprzez bliznowacenie tkanki w celu zmniejszenia odpływu cieczy wodnistej w siatce beleczkowej, co prowadzi do wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego i znacznej utraty RGC w ciągu jednego miesiąca od zabiegu 30-31. Procedury wywołujące jaskrę, takie jak ta opisana tutaj, mogą być kluczem do odblokowania nowych osiągnięć w leczeniu jaskry.

<table><tbody><tr><td>Chlorowodorek ksylazyny, Minimum 99%</td><td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwań, USP, 100mg/ml&nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>Butelka 10 ml</td></tr><tr><td>Maleinian acepromazyny, 10 mg / ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>Butelka 50 ml</td></tr><tr><td>Butelka surowicy, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td> Strzykawka insulinowa ze <td>szkła borokrzemianowego</td></tr><tr><td>1 ml&nbsp;</td><td>Igła VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Rozwiązanie S7653</td><td>2 M&nbsp;</td></tr><tr><td>Ściągacz mikroelektrod&nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Ciężkie, polerowane, standardowe i cienkościenne rurki borokrzemianowe&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>bez filamentu, igła</td></tr><tr><td>strzykawkowa Microfil 0,86 mm do napełniania mikropipet</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>Igła Luer-Lock o rozmiarze 18 Fisher</td><td>Scientific</td><td>1130421</td><td>Igła strzykawkowa</td></tr><tr><td>Elastyczna rurka polietylenowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>Średnica 0,034 cala, około 10 cali&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorowodorek proparakainy roztwór okulistyczny, USP, 0.5%</td> <td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&nbsp; sterylna butelka&nbsp;</td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Zacisk Hemostat StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td><td>zakrzywiona</td></tr><tr><td>krawędź Potrójna maść antybiotykowa&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela #11</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Jednorazowa szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10x Koncentrat</td><td>Sigma, Nauki przyrodnicze&nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x rozcieńczenie&nbsp;</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki pięknej&nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe 3 ml, polietylenowe, niesterylne</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 lub 52947-948</td><td>Podziałka 1 i 2 ml</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Easy Grip Szalka Petriego&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Igły</td><td></td><td></td><td></td>kaktusowe</tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>PX0055-3 lub 818715.0100</td><td>Przekształcony w 4% roztwór&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Wytwarzany zarówno w roztworze 1%, jak i 0,1%&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Oczyszczony mysz Anti-Rat CD90/mysz CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat 554892</td><td>rozcieńczenie 1:300&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kozia anty-mysz&nbsp;</td><td>Technologie życiowe&nbsp;</td><td>A11005</td><td>Rozcieńczenie 1:300&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Corning&nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G5516-100 ml&nbsp;</td><td>50% glicerolu do 50% PBS, wagowo&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Grubość 1 22 x 50 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>C2 Zaćmienie Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

procedura indukująca jaskrę w modelu szczura in vivo i preparat siatkówki z pełnym mocowaniem

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Jaskra jest chorobą ośrodkowego układu nerwowego wpływającą na komórki zwojowe siatkówki (RGC). Aksony RGC tworzące nerw wzrokowy przenoszą bodźce wzrokowe do mózgu w celu percepcji wzrokowej. Uszkodzenie RGC i ich aksonów prowadzi do utraty wzroku i/lub ślepoty. Chociaż konkretna przyczyna jaskry nie jest znana, głównym czynnikiem ryzyka choroby jest podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe. Procedury indukujące jaskrę w modelach zwierzęcych są cennym narzędziem dla naukowców badających mechanizm śmierci RGC. Takie informacje mogą prowadzić do opracowania skutecznych terapii neuroprotekcyjnych, które mogą pomóc w zapobieganiu utracie wzroku. Protokół w tej pracy opisuje metodę wywoływania stanów podobnych do jaskry w modelu szczurzym in vivo, w którym 50 μl 2 M hipertonicznego soli fizjologicznej wstrzykuje się do nadtwardówkowego splotu żylnego. Blanszowanie naczyń wskazuje na udane wstrzyknięcie. Ta procedura powoduje utratę RGC w celu symulacji jaskry. Miesiąc po wstrzyknięciu zwierzęta są uśmiercane i usuwa się oczy. Następnie rogówka, soczewka i ciało szkliste są usuwane, aby utworzyć muszlę oczną. Siatkówka jest następnie odklejana z tylnej części oka i przypinana do szalek sylgarda za pomocą igieł kaktusowych. W tym momencie neurony w siatkówce mogą zostać wybarwione w celu analizy. Wyniki tego laboratorium pokazują, że około 25% RGC zostaje utraconych w ciągu jednego miesiąca od zabiegu w porównaniu z kontrolami wewnętrznymi. Procedura ta pozwala na ilościową analizę śmierci komórek zwojowych siatkówki w modelu jaskry szczura in vivo.

W tej sekcji przedstawiono komponenty aparatury oraz procedurę stosowaną w celu wywołania stanu podobnego do jaskry w modelu jaskry u szczura in vivo. Prezentujemy poszczególne narzędzia i sprzęt wykorzystywane do wykonania wstrzyknięcia soli hipertonicznej, co powoduje wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego. Pokazujemy wstrzyknięcie do splotu żylnego nadtwardówkowego z charakterystycznym efektem blaknięcia oraz wynikającym z tego zmętnieniem komory przedniej. Opisujemy również proce...

Jaskra charakteryzuje się uszkodzeniem komórek zwojowych siatkówki. Indukowanie jaskry w modelach zwierzęcych może zapewnić wgląd w badania nad tą chorobą. W tym miejscu przedstawiamy procedurę, która indukuje utratę RGC w modelu szczura in vivo i demonstrujemy przygotowanie całych siatkówk do analizy.

Procedura indukująca jaskrę w modelu szczura in vivo i preparat siatkówki z pełnym mocowaniem

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie znacznego ubytku komórek zwojowych siatkówki w siatkówce szczura poprzez indukcję warunków przypominających jaskrę. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu jaskry i neuroprotekcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że powoduje ona stopniową utratę komórek zwojowych siatkówki, podobnie jak ma to miejsce w przebiegu jaskry u ludzi.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyciągnąć dwie szpiczaste szklane mikroiigły z ciężkiej polerowanej standardowej cienkościennej rurki borokrzemianowej za pomocą wyciągarki do mikroelektrod. Następnie jedną mikroigłę należy wypełnić roztworem soli 2 M, używając strzykawki o pojemności 1 ml. Należy usuń pęcherzyki powietrza z końcówki elektrody poprzez delikatne opukiwanie.Następnie należy napełnić drugą strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem NaCl o stężeniu 2 M. Podłączyć ją do igły o rozmiarze 18 G, a następnie przymocować igłę do 10-calowego wężyka polietylenowego. Za pomocą tłoka strzykawki napełnić wężyk polietylenowy solą fizjologiczną poprzez igłę.Gdy zarówno mikroigła, jak i cewka zostaną wypełnione solą fizjologiczną, należy je ostrożnie połączyć. Pozbyć się powietrza z połączenia, opukując pęcherzyki powietrza. Następnie lekko potrzeć końcówkę mikroigły o ręcznik papierowy, aby ją precyzyjnie zeszlifować.Sprawdź opór mikroigły, delikatnie naciskając tłok strzykawki, aż na ręczniku papierowym pojawi się cienki strumień cieczy. Strumień cieczy nie powinien być szerszy niż 0.5 mm, aby zapewnić odpowiednią integralność końcówki igły. W tej procedurze, po znieczuleniu zwierzęcia koktajlem KAX, sprawdź odruchy, uszczypując jego łapy lub ogon, aby upewnić się, że zwierzę jest nieprzytomne.Następnie należy przyciąć wibrysy za pomocą nożyczek. Po tym kroku aplikator z bawełnianą końcówką należy nasączyć roztworem betadyny i przemyć obszar wokół oka eksperymentalnego. Pod mikroskopem, używając kleszczyków hemostatycznych, należy zacisnąć dolną powiekę, aby uwypuklić gałkę oczną, odsłonić żyłę nadtwardówkową i ograniczyć ruchomość oka.Następnie ostrożnie nakłuj żyłę nadtwardówkową mikroigłą pod kątem od 10 do 20 stopni względem żyły. Nakłucie żyły uznaje się za udane, gdy zauważalny jest dopływ krwi do końcówki mikroigły. Powoli wstrzyknij do żyły 50 µL soli fizjologicznej.Żyły stają się białe, gdy sól krąży w układzie naczyniowym, choć niektóre obszary mogą zachować krwistoczerwoną barwę. Najbardziej krytycznym krokiem w tej procedurze jest wstrzyknięcie 2 M soli fizjologicznej. Niezbędne jest wystąpienie blaknięcia naczyń krwionośnych, aby zapewnić pomyślny wynik.Kluczowe dla tej procedury jest utrzymanie stabilnego położenia igły oraz kąta 20 stopni. Następnie należy wykonać drugie wstrzyknięcie do żyły, aby zapewnić całkowite uszkodzenie warstwy komórek zwojowych siatkówki. W ciągu kilku minut, w miarę krążenia soli w układzie naczyniowym, przez tęczówkę oka powinno być widoczne wyraźne zmętnienie.Następnie za pomocą skalpela przetnij tkankę łączną w jamie oczodołowej otaczającą oko, uważając, aby nie uszkodzić samego gałki ocznej. Następnie ostrożnie przetnij nerw wzrokowy oraz pozostałą tkankę, aby za pomocą nożyczek z zakrzywionym ostrzem wydobyć nienaruszoną gałkę oczną. Umieść wydobytą gałkę oczną w sterylnym szalce Petriego zawierającej świeży PBS.Następnie przygotuj miseczkę oczną z gałki ocznej, wykonując skalpelem niewielkie nacięcie tuż za granicą między tęczówką a twardówką. Kontynuuj nacięcie wzdłuż obwodu oka, aby usunąć półkulę rogówkową z gałki ocznej. Przytrzymując pęsetą warstwę pigmentową siatkówki w celu stabilizacji miseczki ocznej, użyj drugiej pęsety, aby delikatnie oddzielić różowo-beżową, nienaruszoną siatkówkę od tylnej części oka.Następnie odetnij lub oderwij pęsetą obszar, w którym nerw wzrokowy przylega do siatkówki. Należy upewnić się, że z siatkówki usunięto wszelkie pozostałości nabłonka barwnikowego lub tkanki twardówki. Następnie ostrożnie przenieś wyizolowaną siatkówkę do czystej, pokrytej Sylgardem szalki Petriego zawierającej świeży PBS.Po umieszczeniu w szalce z Sylgardem, przypnij siatkówkę w odpowiednim miejscu. Warstwa komórek zwojowych siatkówki powinna być skierowana do góry, a nerw wzrokowy do dołu. Następnie przetnij siatkówkę na cztery ćwiartki, nadając jej kształt czterolistnej koniczyny promieniującej od tarczy nerwu wzrokowego.Następnie przyszpil kwadranty siatkówki dodatkowymi igłami kaktusa, aby siatkówka była jak najbardziej płaska, unikając jej rozciągania. Po tym czasie utrwal przyszpiloną siatkówkę w naczyniu z Sylgard w 3 mL 4% paraformaldehydu przez noc w temperaturze pokojowej, przed przeprowadzeniem standardowych procedur barwienia. Poniżej przedstawiono porównanie kontrolnego oka nieleczonego oraz oka eksperymentalnego miesiąc po wstrzyknięciu soli fizjologicznej indukującej jaskrę.Komórki zwojowe siatkówki są znakowane przeciwciałem przeciwko Thy 1.1. Procedura ta prowadzi do zmniejszenia liczby RGC, defasykulacji aksonów z głównych pęczków aksonalnych oraz zaburzenia kolistości pozostałych RGC. Są to charakterystyczne defasykulowane aksony będące wynikiem wstrzyknięcia soli fizjologicznej.Na obrazie widoczne jest naczynie krwionośne w obrębie siatkówki oraz pęczki aksonów. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura ta zajmuje 30 minut. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, aby zawsze używać nowej, ostrej mikroiigły skośnej.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunocytochemia, Western Blot, hybrydyzacja in situ, sekwencjonowanie mRNA lub analiza behawioralna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z jaskrą, na przykład w kwestii tego, jak utrata komórek zwojowych siatkówki wpływa na ostrość widzenia zwierząt. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie jaskry do eksploracji strategii neuroprotekcyjnych u szczurów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wywołać znaczną utratę komórek zwojowych siatkówki u szczura, wykorzystując iniekcję hipertonicznego roztworu soli do żyły nadtwardówkowej.

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Źródło: Bosco, A., et al.  In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy. J. Vis. Exp. (2015) Ten film przedstawia obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry. Transgeniczna mysz z mikroglejem siatkówki wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego jest umieszczana pod oftalmoskopem. Oświetlenie w podczerwieni służy do zlokalizowania głowy nerwu wzrokowego (ONH), a...

Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Protokoły immunohistochemiczne są używane do badania lokalizacji określonego białka w siatkówce. Techniki obrazowania wapnia są wykorzystywane do badania dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.

Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

Tutaj prezentujemy protokół indukcji nadciśnienia ocznego w mysim oku, który powoduje utratę komórek zwojowych siatkówki, co obserwuje się w jaskrze. Mikrogranulki magnetyczne są wstrzykiwane do przedniej komory i przyciągane do kąta tęczówkowo-rogówkowego za pomocą magnesu, aby zablokować odpływ cieczy wodnistej.

Magnetyczny model okluzji mikrokulek do wywoływania jaskry zależnej od nadciśnienia ocznego u myszy

Poniższy raport opisuje, jak odtworzyć model gryzoni nietętniczej przedniej niedokrwiennej neuropatii nerwu wzrokowego (rNAION), używając odpowiednich parametrów barwnika, soczewki kontaktowej i lasera. Ujawniamy również odpowiednie kroki do oceny zmiany rNAION in vivo.

Model gryzoni nonartericznej przedniej niedokrwiennej neuropatii nerwu wzrokowego (rNAION)

Ten protokół opisuje nowatorską metodę badania formy chemicznej neurostymulacji całych siatkówek szczurów in vitro za pomocą neuroprzekaźnika glutaminianu. Neurostymulacja chemiczna jest obiecującą alternatywą dla konwencjonalnej neurostymulacji elektrycznej neuronów siatkówki w leczeniu nieodwracalnej ślepoty spowodowanej chorobami zwyrodnieniowymi fotoreceptorów.

Metodologia biomimetycznej neuromodulacji chemicznej siatkówki szczura za pomocą neuroprzekaźnika glutaminianu in vitro

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane przez zastosowanie szwu okołokończynowego u szczurów i myszy, co prowadzi do funkcjonalnego i strukturalnego pogorszenia komórek zwojowych siatkówki zgodnego z jaskrą.

Model jaskry indukowanej szwem okołolimbowym u szczurów i myszy

Retinopatia indukowana tlenem (OIR) może być używana do modelowania chorób niedokrwiennych siatkówki, takich jak retinopatia wcześniaków i proliferacyjna retinopatia cukrzycowa, a także służyć jako model dla badań potwierdzających słuszność koncepcji w ocenie leków antyangiogennych w chorobach neowaskularnych. OIR indukuje solidną i powtarzalną neowaskularyzację w siatkówce, którą można określić ilościowo.

Model retinopatii indukowanej tlenem w chorobach niedokrwiennych siatkówki u gryzoni

Retinopatia cukrzycowa jest jedną z głównych przyczyn ślepoty. Histologia, test rozpadu bariery krew-siatkówka i angiografia fluorescencyjna są cennymi technikami pozwalającymi zrozumieć patofizjologię siatkówki, co może jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność badań przesiewowych leków przeciwko retinopatii cukrzycowej.

Ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie nowego modelu neurodegeneracji jaskry opartej na 360° termicznej kauteryzacji rąbkowego splotu naczyniowego, wywołującej podostre nadciśnienie oczne.

Kauteryzacja pełnego koła rąbka splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni

Poznaj metodę indukcji jaskry u szczura poprzez wstrzyknięcie hipertonicznego roztworu soli do żyły nadtwardówkowej. Technika umożliwia badanie utraty komórek zwojowych siatkówki i strategii ochrony nerwów.

Procedura indukująca jaskrę w modelu szczura in vivo i preparat siatkówki z pełnym mocowaniem

Przeglądaj więcej filmów