Name: Biologia systemowa regulacji metabolicznej przez sygnalizację receptora estrogenowego w raku piersi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj metodę integracji danych transkryptomicznych, cistromowych i metabolomicznych w badaniu raka piersi z użyciem komórek MCF7. Technika ta pozwala zrozumieć rolę receptora estrogenowego w regulacji metabolizmu nowotworowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Institute of Food and Agriculture, U.S. Department of Agriculture, award ILLU-698-909 (ZME) i Pfizer, Inc (ZME). Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych.

1. Przygotowanie próbek RNA-Seq
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa i leczenie
	<ol>
		<li>Hodowla komórek MCF7 w ulepszonym MEM (IMEM) plus pożywka z czerwienią fenolową z 10% nieaktywnym cieplnie FBS, 1% penicyliną/streptomycyną w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2. 
		Uwaga: W całym badaniu stosuje się tę samą linię komórkową i ten sam warunek hodowli komórkowej.</li>
		<li>Wysiej 100 000 komórek MCF7 na dołek w płytkach 6-dołkowych. Wykonaj trzy egzemplarze dla każdego zabiegu. W dniu 3 usuń pożywkę i dodaj 2 ml świeżej pożywki z lub bez 10-8 M E2 do każdej studzienki. Inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5%CO2</li>.
		<li>Aby zebrać komórki, dodać 1 ml odczynnika do izolacji RNA (kwaśny tiocyjanian guanidyny-fenol-chloroform) do każdej studzienki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Następnie zebrać odczynnik lizatu komórkowego przez pipetowanie i umieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja RNA
	<ol>
		<li>Dodać 200 μl chloroformu do 1 ml odczynnika do lizatu komórkowego (1.1.3) i wirować przez 10 sekund. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odwirować próbki przy 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu przenieść fazę wodną (górną) do nowej probówki, nie naruszając pozostałych faz.</li>
		<li>Dodać 500 μl 100% izopropanolu do nowej probówki z przeniesioną fazą wodną i wymieszać przez odwrócenie. Inkubować w temperaturze -20 °C przez noc. Odwirować próbki o masie 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Obserwować osad na dnie probówki. Odrzucić supernatant i przemyć osad 750 μl 70% etanolu bez RNaz przez krótki wir.</li>
		<li>Odwirować próbki przy masie 6 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i odwirować próbkę przy 16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C w celu zebrania całego pozostałego etanolu. Usuń pozostały etanol, pipetując za pomocą końcówki do nakładania żelu i ustaw probówki do góry nogami do wyschnięcia na powietrzu na 10 minut. Rozpuść granulat w 20-50 μl uzdatnionej wody DEPC w zależności od wielkości granulek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść RNA za pomocą zestawu do czyszczenia RNA zgodnie z protokołem4. Zmierzyć stężenie RNA za pomocą zestawu do oznaczania opartego na fluorometrii zgodnie z protokołem9. 
	UWAGA: OD przy 260 nm jest mierzony w celu określenia stężenia RNA i stosunku OD przy 260 nm i 280 nm służy do określenia czystości próbki. Zaleca się sprawdzenie jakości RNA za pomocą testu Bio-analyzer.</li>
	<li>Weź około 0,5 do 1 μg oczyszczonego RNA do sekwencjonowania. 
	UWAGA: Centrum biotechnologiczne przygotowuje biblioteki sekwencjonowania i przeprowadza sekwencjonowanie odczytu na sparowanym końcu przy użyciu metod opisanych wcześniej2.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki ChIP-Seq
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa i leczenie
	<ol>
		<li>Wysiewaj 500 000 komórek MCF7 na 10 cm płytkę w pożywce wzrostowej. 
		UWAGA: Do każdego pociągnięcia użyto 16 płyt. W dniu 3 usuń pożywkę i dodaj 5 ml świeżej pożywki z lub bez 10-8 M E2 do każdej płytki. Traktuj komórki przez 45 minut (37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sieciowanie krzyżowe i zbieranie komórek
	<ol>
		<li>Dodaj 250 μl 37% formaldehydu do 5 ml pożywki do sieciowania chromatyny, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 min. Przerwij sieciowanie, myjąc komórki 5 ml lodowatego środka 1x MEM.</li>
		<li>Zbierz komórki w 250 μl buforu do lizy komórek (10 mM EDTA, 50 mM Tri HCl, 1% SDS, 0,5% N,N,N-dimetylododekan-1-aminy tlenku) na płytkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fragmentacja chromatyny
	<ol>
		<li>Sonikuj komórki przez 30 sekund x 8 przy amperze 30, aby osiągnąć wymagane rozmiary chromatyny. Schłodzić każdą próbkę na lodzie po sonikacji trwającej 30 sekund.</li>
		<li>Wirować przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie pipetować supernatant, nie naruszając osadu na dnie.</li>
		<li>Pobrać 5 μl podwielokrotności supernatantu i sprawdzić wielkość DNA za pomocą elektroforezy w 1,5% żelu agarozowym, jak opisano wcześniej10. Idealna wielkość DNA powinna wynosić od 200 do 500 pz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunoprecypitacja chromatyny
	<ol>
		<li>Zaoszczędź 25 μl lizatu komórkowego jako dane wejściowe. W probówce o pojemności 50 ml wymieszaj 4 ml lizatu komórkowego z 20 ml buforu IP (2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl i 0,5% Triton X), przeciwciałem ERα (500 μl F10 i 500 μl HC-20) i 500 μl kulek magnetycznych powlekających białka ProtA i ProtG. Inkubować mieszaninę przez obracanie w temperaturze 4 °C przez noc, aby umożliwić utworzenie kompleksu chromatyna-przeciwciało.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie i odwrotne sieciowanie
	<ol>
		<li>Użyj stojaka magnetycznego, aby zebrać kulki magnetyczne po stronie namagnesowanej, aby usunąć bufor myjący.</li>
		<li>Umyj kulki magnetyczne w 25 ml buforu do płukania I (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X i 150 mM NaCl). Aby dokładnie umyć kulki magnetyczne bez naruszania kompleksów DNA-białko, powoli dodaj 25 ml buforu do płukania do probówki wzdłuż boku, a następnie odwróć probówki, aż wszystkie kulki magnetyczne zostaną dobrze wymieszane z buforem do mycia, nie pojawiając się jako granulki. Alternatywnie użyj rotatora, aby odwrócić rurkę. Nie należy wirować próbek. Umyj koraliki magnetyczne tą samą metodą w poniższych krokach.</li>
		<li>Umyj kulki magnetyczne w 25 ml buforu do płukania II (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X i 500 mM NaCl).</li>
		<li>Przemyj kulki magnetyczne w 25 ml buforu do płukania III (1,6 mM EDTA, 10 mM Tris HCl, 1% NP-40, 1% deksycholanu i 250 mM LiCl).</li>
		<li>Umyj kulki magnetyczne w 25 ml 1x bufor TE (1 mM EDTA i 10 mM Tris HCl) dwukrotnie.</li>
		<li>Eluować DNA w 500 μl buforu elucyjnego (1% SDS i 10 mM NaHCO3), a następnie przydzielić 500 μl elucji DNA do 4 probówek. W przypadku DNA z danych wejściowych wymyj DNA w 125 μl buforu elucyjnego.</li>
		<li>Inkubować probówki w temperaturze 65 °C przez noc na bloku grzewczym. Przykryj rurki na bloku grzewczym folią aluminiową, aby ciepło było równomierne na wszystkich rurach. Umieść ciężarek na rurkach, aby nie mogły się otworzyć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja DNA
	<ol>
		<li>Schłodzić probówki w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wyizolować DNA z próbek pobieranych za pomocą zestawu do izolacji DNA ChIP. Postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta.
		<ol>
			<li>Rozgrzać bufor elucyjny w temperaturze 65 °C. Dodać 625 μl buforu wiążącego do każdej probówki. Jeśli osad się uformuje, dodać kolejne 250 μl buforu wiążącego, aż roztwór będzie klarowny.</li>
			<li>Załadować próbkę do kolumny i odwirować przy 16 000 x g przez 30 sekund. Przemyć próbkę buforem do przemywania o pojemności 250 μl. Pamiętaj, aby dodać etanol do bufora do płukania przy pierwszym użyciu. Powtórz pranie.</li>
			<li>Eluować DNA w 15 μl buforu elucyjnego. Połącz DNA tego samego ściągania z 4 probówek, aby uzyskać około 55 μl DNA.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyizolować wejściowe DNA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA.
		<ol>
			<li>Rozgrzać bufor elucyjny w temperaturze 65 °C. Dodać 625 μl buforu wiążącego do każdej probówki i inkubować przez 10 minut. Umieścić próbkę w kolumnie w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.</li>
			<li>Przemyć próbkę buforem płuczącym o pojemności 750 μl, odwirować przy 16 000 x g przez 1 min. Powtórzyć wirowanie w celu usunięcia pozostałego buforu. Eluować DNA do 30 μl EB.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmierz stężenie DNA za pomocą komercyjnego testu fluorochromowego z modyfikacją11.
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć 20x bufor TE do 1x TE jako bufor testowy do rozcieńczania odczynnika i próbek DNA. Weź 5 μl wyizolowanego DNA i rozcieńcz go do 50 μl w 1x TE.</li>
			<li>Z 2 μg/ml roztworu podstawowego DNA należy utworzyć wzorzec DNA w zakresie od ślepej próby do 1, 10, 100, 1000 μg/ml. Na płytce 96-dołkowej przydziel 25 μl każdego wzorca, a także rozcieńczenie DNA w dwóch egzemplarzach. (Zalecany jest trzykrotny egzemplarz dla standardu.)</li>
			<li>Przygotuj odczynnik roboczy, wykonując 200-krotne rozcieńczenie odczynnika dsDNA w buforze 1x TE w plastikowej probówce. Przykryj działający roztwór odczynnika folią aluminiową, aby uniknąć światła. Dodać 200 μl odczynnika roboczego do każdej próbki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Przykryj talerz folią aluminiową, aby uniknąć światła.</li>
			<li>Zmierzyć fluorescencję próbek za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (wzbudzenie przy 480 nm, emisja 520 nm). Wygeneruj standardową krzywą kwiatostanu DNA w funkcji stężenia DNA. Określić stężenia próbek na podstawie wygenerowanej krzywej wzorcowej DNA.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Weryfikacja eksperymentu ChIP z wykorzystaniem qPCR
	<ol>
		<li>Weź 2 μl wyizolowanego DNA i rozcieńcz go do 20 μl w wodzie. Ustawić reakcję qPCR w trzech egzemplarzach, mieszając 2,5 μl rozcieńczenia DNA, 5 μl mieszanki głównej Green I PCR, 1 μl startera i 1,5 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
		<li>Uruchom qPCR z systemem Fast Real-Time PCR za pomocą następującego programu: Krok 1: 95 °C przez 60 sekund, Krok 2: 95 °C przez 10 sekund, 60 °C przez 60 sekund, Powtórz Krok 2 39 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyślij próbkę DNA o stężeniu 10 ng do centrum biotechnologicznego w celu sekwencjonowania. 
	UWAGA: Centrum biotechnologiczne przygotowuje DNA ChIP do bibliotek zgodnie z instrukcją i przeprowadza sekwencjonowanie pojedynczego odczytu przy użyciu metod opisanych wcześniej2.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki do testów metabolomicznych
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa i leczenie
	<ol>
		<li>Wysiej 400 000 komórek MCF7 na 10 cm płytkę w pożywce wzrostowej. Do każdego zabiegu należy przygotować trzy próbki. Użyj dwóch płytek w każdej próbce, aby otrzymać wystarczającą liczbę komórek do wykrycia. W dniu 3 usuń pożywkę i dodaj do komórek 5 ml świeżej pożywki z lub bez 10-8 M E2. Utrzymuj komórki w obróbce przez 24 godziny (37 °C w nawilżonej atmosferze 5%CO2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek
	<ol>
		<li>Dodać 5 ml lodowatego 1x PBS do płytki, odessać PBS po krótkim przechyleniu płytki kilka razy. Powtórz dwa razy i usuń jak najwięcej PBS po ostatnim praniu.</li>
		<li>Do każdej płytki dodać 750 μl wstępnie schłodzonego acetonu i zeskrobać komórki. Połączyć komórki w acetonie z dwóch płytek w probówce o pojemności 2 ml na lodzie.</li>
		<li>Liczba komórek do normalizacji
		<ol>
			<li>Do każdego zabiegu należy użyć dwóch dodatkowych płytek do ilościowego oznaczania komórek. Aby odłączyć komórki od płytki, dodać 2 ml buforu HE (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075%NaHCO3 i 1 mM EDTA) do każdej płytki i inkubować przez 5 minut.</li>
			<li>Zebrać i dobrze wymieszać komórki, pipetując komórki w buforze HE. Użyj łącznie 20 μl roztworu komórek, aby policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C przed wysłaniem do centrum metabolomiki w celu identyfikacji i ilościowego określenia metabolitów za pomocą analizy spektrometrii mas chromatografii gazowej (GC-MS).</li>
</ol>
4. Analiza integracyjna
<ol>
	<li>Analiza danych sekwencyjnych RNA:
	<ol>
		<li>Przeprowadzanie kontroli jakości plików FASTQ za pomocą FastQC:Read QC (http://galaxy.illinois.edu)
		<ol>
			<li>Wybierz FastQC:Read w narzędziu NGS:QC i manipulacji. Prześlij plik z nieprzetworzonymi danymi z bieżącej historii. 
			UWAGA: Zaleca się podanie tytułu pliku wyjściowego, aby przypomnieć, do czego służyło zadanie, ponieważ może istnieć wiele danych wyjściowych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonaj, a plik wyjściowy pojawi się w Historii. Powtórz tę samą procedurę dla każdego pliku sekwencji. Przytnij adaptery za pomocą Clip w NGS:FASTX Toolkit.</li>
		<li>Wyrównaj odczyty do hg19 przy użyciu Tophat2 z adnotacją referencyjną genomu RefSeq12 (wartości domyślne).
		<ol>
			<li>Wybierz Tophat2 w narzędziu do analizy NGS:RNA. Wskaż sparowany typ biblioteki (pojedynczy koniec lub sparowany koniec).</li>
			<li>Prześlij wejściowy plik FASTQ z bieżącej historii. Wybierz genom referencyjny. Wybierz ustawienia domyślne. Lub użyj pełnej listy parametrów, aby zmodyfikować.</li>
			<li>Wykonaj, a wygeneruje dwa pliki wyjściowe: jeden to ścieżka skrzyżowań UCSC BED, drugi to lista odczytanych wyrównań w formacie BAM.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Prześlij pliki BAM do narzędzia do analizy danych sekwencjonowania. Obliczanie wartości wyrażeń za pomocą narzędzia do określania wysokości błędu.</li>
		<li>Zidentyfikuj geny regulowane w górę w różny sposób za pomocą narzędzia do analizy ekspresji przy użyciu wartości domyślnych i zmiany krotności >2 i wartości p <0,05. Podobnie, zidentyfikuj geny regulowane różnicowo w dół za pomocą narzędzia do analizy ekspresji, używając wartości domyślnych i zmiany krotności <0,5 i wartości p <0,05.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych ChIP-Seq:
	<ol>
		<li>Wyrównaj FASTQ Odczytuje do hg19 za pomocą Bowtie213 (wartości domyślne) w Galaxy.
		<ol>
			<li>Wybierz Bowtie2 w narzędziu NSC:Mapping. Sprawdź, czy biblioteka jest sparowana z wiązaniami (pojedynczy koniec vs sparowany koniec). Prześlij plik FASTQ z bieżącej historii.</li>
			<li>Wybierz genom referencyjny. Użyj domyślnych ustawień parametrów. Wykonaj, a wygeneruje plik wyjściowy z zmapowaną sekwencją odczytaną jako plik BAM. Powtórz procedurę dla każdego pliku sekwencji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zidentyfikuj piki za pomocą MACS14 wartość odcięcia wartości p 6,0e-7 i FDR 0,01, jak opisano wcześniej2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych metabolomicznych:
	<ol>
		<li>Konwertuj nazwy chemiczne metabolitów na KEGG_IDs.</li>
		<li>Identyfikacja metabolitów regulowanych różnicowo poprzez porównanie poziomów wykrytych w pojeździe i w pojeździe. Próbki poddane działaniu E2 (w tym badaniu zastosowano 2-krotne odcięcie).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza integracyjna:
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj geny, które mają miejsca wiązania ERα za pomocą narzędzia do analizy danych sekwencjonowania. Przekształć regiony w funkcję genów, używając 20 kb jako odcięcia odległości.</li>
		<li>Zidentyfikuj geny regulowane w różny sposób w górę i w dół na podstawie analizy danych RNA-Seq za pomocą zmiany fałdowania >2 i zmiany krotności <0,5, odpowiednio, z wartością p <0,05 jako odciętą. Porównaj z listą genów zawierających miejsce wiązania ERα, korzystając z porównania diagramu Venna.</li>
		<li>Skorzystaj z tej listy, aby zidentyfikować szlaki metaboliczne modulowane E2 za pomocą modułu Metscape15 Cytoscape.
		<ol>
			<li>Wybierając moduł Metscape z aplikacji, wybierz opcję Zbuduj sieć, a następnie opcję opartą na ścieżce.</li>
			<li>Wybierz organizm (człowieka). Wybierz plik danych z nieregulowanej listy związków E2 (KEGG ID) oraz listy genów regulowanych w górę E2.</li>
			<li>Wybierz Związek -Reakcja -Enzym-Gen jako typ sieci. Wybierz związek/geny jako zapytanie.</li>
			<li>Zbuduj sieć. Powtórz czynność, używając związku i genów regulowanych w dół E2.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hamilton, K. J., Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+hormone+physiology%3A+reproductive+findings+from+estrogen+receptor+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Estrogen hormone physiology: reproductive findings from estrogen receptor mutant mice.</a> Reprod Biol. 14 (1), 3-8 (2014).</li>
<li>Madak-Erdogan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+of+gene+and+metabolic+regulation+by+estrogen+receptors+alpha+and+beta%2C+and+their+coregulators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics of gene and metabolic regulation by estrogen receptors alpha and beta, and their coregulators.</a> Mol Syst Biol. 9, 676(2013).</li>
<li>Gong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+identifies+gene+networks+regulated+by+estrogen+receptor+alpha+%28ERalpha%29+and+ERbeta+that+control+distinct+effects+of+different+botanical+estrogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Recept+Signal%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis identifies gene networks regulated by estrogen receptor alpha (ERalpha) and ERbeta that control distinct effects of different botanical estrogens.</a> Nucl Recept Signal. 12, e001(2014).</li>
<li>Bergamaschi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forkhead+transcription+factor+FOXM1+promotes+endocrine+resistance+and+invasiveness+in+estrogen+receptor-positive+breast+cancer+by+expansion+of+stem-like+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The forkhead transcription factor FOXM1 promotes endocrine resistance and invasiveness in estrogen receptor-positive breast cancer by expansion of stem-like cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 16 (5), 436(2014).</li>
<li>Madak-Erdogan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+extranuclear+pathway+inputs+in+the+regulation+of+global+gene+expression+by+estrogen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Nuclear and extranuclear pathway inputs in the regulation of global gene expression by estrogen receptors.</a> Mol Endocrinol. 22 (9), 2116-2127 (2008).</li>
<li>Madak-Erdogan, Z., Lupien, M., Stossi, F., Brown, M., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+collaboration+of+estrogen+receptor+alpha+and+extracellular+signal-regulated+kinase+2+in+regulating+gene+and+proliferation+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic collaboration of estrogen receptor alpha and extracellular signal-regulated kinase 2 in regulating gene and proliferation programs.</a> Mol Cell Biol. 31, 226-236 (2011).</li>
<li>Madak-Erdogan, Z., Ventrella, R., Petry, L., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+roles+for+ERK5+and+cofilin+as+critical+mediators+linking+ERalpha-driven+transcription%2C+actin+reorganization%2C+and+invasiveness+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel roles for ERK5 and cofilin as critical mediators linking ERalpha-driven transcription, actin reorganization, and invasiveness in breast cancer.</a> Mol Cancer Res. 12 (5), 714-727 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quant-iT%E2%84%A2+PicoGreen+%C2%AE+dsDNA+Reagent+and+Kits%22">Quant-iT™ PicoGreen ® dsDNA Reagent and Kits</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049">http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/3551/original/Quant-iT_Picogreen_dsDNA.pdf?1423512049</a> (2008).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Quant-iT%E2%84%A2+Assays+for+high-throughput+quantitation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+oligos%22">Quant-iT™ Assays for high-throughput quantitation of DNA, RNA, and oligos</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/F-065432%20quantit%20htp_FLR.pdf</a> (2006).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36(2013).</li>
<li>Langdon, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+genetic+programming+optimised+Bowtie2+on+genome+comparison+and+analytic+testing+%28GCAT%29+benchmarks%5BTitle%5D)+AND+%22BioData+Min%22%5BJournal%5D)">Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing (GCAT) benchmarks.</a> BioData Min. 8, (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq(MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metscape%3A+a+Cytoscape+plug-in+for+visualizing+and+interpreting+metabolomic+data+in+the+context+of+human+metabolic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Metscape: a Cytoscape plug-in for visualizing and interpreting metabolomic data in the context of human metabolic networks.</a> Bioinformatics. 26, 971-973 (2010).</li>
<li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7 (3), (2006).</li>
<li>Mokry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+double+fragmentation+ChIP-seq+provides+nucleotide+resolution+protein-DNA+binding+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient double fragmentation ChIP-seq provides nucleotide resolution protein-DNA binding profiles.</a> PLoS One. 5 (11), e15092(2010).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Hah, N., Kraus, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone-regulated+transcriptomes%3A+lessons+learned+from+estrogen+signaling+pathways+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Hormone-regulated transcriptomes: lessons learned from estrogen signaling pathways in breast cancer cells.</a> Mol Cell Endocrinol. 382, 652-664 (2014).</li>
</ol>

University of Illinois otrzymał grant Investigator Initiated od firmy Pfizer Inc. ZME, a YCZ otrzymał wsparcie płacowe z tego grantu.

W tym artykule opisaliśmy generowanie i analizę integracyjną RNA-Seq, ChIP-Seq i danych metabolomicznych z komórek MCF-7 traktowanych E2. Opracowaliśmy zestaw protokołów strategicznych w celu wykorzystania najbardziej wydajnych metod i przyjaznych dla użytkownika oprogramowania, które prowadzą do biologicznie istotnych odkryć. Według naszej wiedzy, nasze badanie jest pierwszym, w którym zintegrowano dane -omiczne z trzech różnych analiz i zidentyfikowano nowe szlaki metaboliczne, które ERα bezpośrednio regulował w komórk...

Estrogeny są ważnymi regulatorami wielu procesów fizjologicznych zarówno u kobiet, jak i mężczyzn, w tym tkanek rozrodczych, tkanek metabolicznych, mózgu i kości1. Oprócz korzystnego działania w tych tkankach, estrogeny napędzają również nowotwory, które powstają w tkankach sutkowych i rozrodczych. Estrogeny działają głównie poprzez ER, aby wywołać efekty specyficzne dla typu komórki. Głębokie sekwencjonowanie transkryptów regulowanych przez ERα za pomocą RNA-Seq i analiza miejsc wiązania ERα DNA w całym genomie za pomocą ChIP-Seq okazało się przydatne do zrozumienia, jak ERα działa w różnych tkankach i nowotworach, które z nich wynikają. My i inni opublikowaliśmy profile ekspresji genów związane z różnymi receptorami (ERα vs. ERβ)2,3, różnymi ligandami3-5 i różnymi koregulatorami2,4,6,7.
RNA-Seq to główna metoda badania transkryptomu, oferująca wyższą precyzję i wydajność w porównaniu do analizy ekspresji genów opartej na mikromacierzyach8. RNA uzyskane z linii komórkowych2-4,7, tkanki lub próbki guza są sekwencjonowane, mapowane do dostępnych zespołów genomowych i identyfikowane są geny regulowane różnicowo. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest stosowana do analizy czynnika transkrypcyjnego i koregulatora wiązania chromatyny ze znanymi miejscami wiązania regulatorowego. ChIP-Seq (ChIP, po którym następuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości) zapewnia bezstronne wykrywanie globalnych miejsc wiązania. Metabolomika jest kolejnym coraz częściej stosowanym podejściem biologii systemowej, które mierzy ilościowo, dynamiczną wieloparametryczną reakcję żywych systemów na różne bodźce, w tym chemikalia i zaburzenia genetyczne.
Wykonując globalne profilowanie metaboliczne, można uzyskać funkcjonalny odczyt z komórek, tkanek i krwi. Ponadto informacje z eksperymentów transkryptomowych nie zawsze odzwierciedlają rzeczywiste zmiany poziomu enzymów, które przyczyniają się do szlaków biochemicznych. Połączona analiza danych dotyczących transkryptomu i metabolomu pozwala nam zidentyfikować i skorelować zmiany w ekspresji genów z rzeczywistymi zmianami metabolitów. Wykorzystanie informacji ze wszystkich tych wielkoskalowych zbiorów danych dostarcza szczegółów mechanistycznych, aby zrozumieć rolę czynników transkrypcyjnych regulujących złożone systemy biologiczne, zwłaszcza te, które odnoszą się do rozwoju człowieka i chorób takich jak rak i cukrzyca.
Złożona natura genomu ssaków sprawia, że trudno jest zintegrować i w pełni zinterpretować dane uzyskane z eksperymentów transkryptomu, cistromu i metabolomu. Identyfikacja funkcjonalnych zdarzeń wiązania, które prowadziłyby do zmian w ekspresji genów docelowych, jest ważna, ponieważ po zidentyfikowaniu funkcjonalnych miejsc wiązania; Późniejsza analiza, w tym analiza motywu wiązania transkrypcji (TF), może być przeprowadzana z większą dokładnością. Prowadzi to do identyfikacji biologicznie znaczących kaskad i mechanizmów TF. Również bezpośrednie porównanie eksperymentów RNA-Seq i ChIP-Seq nie zawsze jest możliwe, ponieważ dane z każdego eksperymentu mają różne skale i szumy, a w niektórych przypadkach znaczące sygnały są przesłonięte przez szum populacyjny. Nie znamy żadnego badania, w którym zintegrowano informacje z tych trzech niezależnych, ale powiązanych podejść, aby zrozumieć bezpośrednią regulację metaboliczną przez ERα w raku piersi. Dlatego naszym ogólnym celem w tym artykule jest powiązanie produktywnych zdarzeń wiązania z ekspresją genów i zmianami metabolitów. Aby osiągnąć ten cel, połączyliśmy dane z RNA-Seq, ChIP-Seq i eksperymentów metabolomicznych oraz zidentyfikowaliśmy te indukowane estrogenem zdarzenia wiązania ERα, które doprowadziłyby do zmian ekspresji genów w szlakach metabolicznych. Po raz pierwszy udostępniamy kompletny zestaw protokołów (rysunek 1) do generowania ChIP-Seq, RNA-Seq i profilowania metabolomicznego oraz przeprowadzania integracyjnej analizy danych w celu odkrycia nowych obwodów genowych regulujących metabolizm linii komórkowych raka piersi.

<table><tbody><tr><td>Mieszanka trójglicerydów</td><td>Sigma</td><td>17810-1AMP-S</td><td></td></tr><tr><td>Kwas oleinowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O1257-10MG</td><td>Kwas oleinowy - proszek rozpuszczalny w wodzie&nbsp;</td></tr><tr><td>Technologie TRIzol Reagent</td><td>Life&nbsp;</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Technologie Dynabeads Protein A</td><td>Life&nbsp;</td><td>10006D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Life technologie&nbsp;</td><td>10007D</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td>Izolacja DNA próbki wejściowej&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji ZYMO ChIP-DNA&nbsp;</td><td>Badania Zymo&nbsp;</td><td>D5205</td><td>ChIP DNA Czyste i Koncentrator</td></tr><tr><td>Quant-iT&ordf; PicoGreen&uml; Zestaw do oznaczania dsDNA</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P7589</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>Zestaw DNazy bez RNaz</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>Oczyszczanie RNA</td></tr><tr><td>Woda uzdatniona DEPC&nbsp;</td><td>LIFE TECH 462224</td><td></td> Dysmubrator soniczny <td>bez dnazy/rnazy</td></tr><tr><td>model 120</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB120110</td><td>Z sondą 1/8&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Obudowa dźwiękowa Fisher Scientific</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB-432-A</td><td>Do redukcji dźwięku</td></tr><tr><td>&nbsp; Probówki Eppendorf 5,0 ml</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>0030 119.401</td><td>200 tubek (2 torebki po 100 szt.)</td></tr><tr><td>Losowa mieszanka podkładów&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>DNTP MIX</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Odwrotna transkryptaza</td><td>NEB</td><td>M0253S</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR Green Master</td><td>ROCHE</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP160100</td><td>1,5% żel agarozowy&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania kubitowego RNA HS Technologie</td><td>żywotności&nbsp;</td><td>Q32852</td><td>Kwantyfikacja RNA (100 testów)&nbsp;</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy w tabletkach&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>4693116001</td><td>Każda tabletka wystarcza na 10 ml buforu do lizy</td></tr><tr><td>PhosSTOP Fosfatase Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche&nbsp;</td><td>4906845001</td><td>Każda tabletka wystarcza na 10 ml buforu do lizy</td></tr><tr><td>Zestawy do oznaczania kubitów</td><td>Technologie życia&nbsp;</td><td>Q32850</td><td>Do 100 testów</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Rotator probówkowy ORFLO</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5 Czytnik płytek wielofunkcyjnych&nbsp;</td><td>Mikrowirówka PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Diagenode</td><td>B04000001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szybki system PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Nauki stosowane&nbsp;</td><td></td><td></td>4351405</tr></tbody></table>

biologia systemowa regulacji metabolicznej przez sygnalizację receptora estrogenowego w raku piersi

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

Wraz z pojawieniem się podejścia -omicznego, nasze zrozumienie chorób przewlekłych, takich jak rak i zespół metaboliczny, uległo poprawie. Jednak skuteczna eksploracja informacji w dużych zbiorach danych, które są uzyskiwane z mikromacierzy ekspresji genów, eksperymentów z głębokim sekwencjonowaniem lub profilowania metabolicznego, jest niezbędna do odkrycia, a następnie skutecznego ukierunkowania na krytyczne regulatory chorych fenotypów komórkowych. Receptor estrogenowy α (ERα) jest jednym z głównych czynników transkrypcyjnych regulujących programy genów, które są ważne w przypadku raka piersi reagującego na estrogen. Aby zrozumieć rolę sygnalizacji ERα w metabolizmie raka piersi, wykorzystaliśmy dane transkryptomiczne, cystromiczne i metabolomiczne z komórek MCF-7 leczonych estradiolem. W niniejszym raporcie opisano generowanie próbek do eksperymentów RNA-Seq, ChIP-Seq i metabolomicznych oraz integracyjną analizę obliczeniową uzyskanych danych. Podejście to jest przydatne w określaniu nowych mechanizmów molekularnych i obwodów regulacyjnych genów, które są regulowane przez określony czynnik transkrypcyjny, który wpływa na metabolizm normalnych lub chorych komórek.

Transkryptomika 
W celu analizy genów różnicowo wyrażonych pod wpływem traktowania E2 zdecydowaliśmy się na przeprowadzenie eksperymentu RNA-Seq. Oprócz dostarczania informacji o poziomach mRNA, dane z RNA-Seq mogą być również wykorzystywane do monitorowania zmian w niekodujących RNA (długie niekodujące RNA, mikroRNA) oraz zdarzeń alternatywnego splicingu. Nie przedstawiliśmy informacji na temat analizy niekodujących RNA ani alternatywnie transkrybowanych genów, ponieważ zakresem nasze...

Integracja danych z eksperymentów sekwencjonowania całego genomu i eksperymentów metabolomicznych jest wyzwaniem. W niniejszej pracy po raz pierwszy przedstawiono generację, analizę i integrację danych dotyczących transkryptomu, cistromu i metabolomu z komórek raka piersi leczonych estradiolem.

Biologia systemowa regulacji metabolicznej przez sygnalizację receptora estrogenowego w raku piersi

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zrozumienie bezpośredniej regulacji metabolicznej ER Alpha w raku piersi z wykorzystaniem danych transkryptomicznych, systromicznych i metabolomicznych w skali całego genomu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii nukleoreceptorów i nowotworów, takie jak rola określonych czynników transkrypcyjnych w regulacji metabolizmu przyczyniającej się do agresywności komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona globalnego obrazu genów oraz wynikających z nich niuansów regulacji metabolicznej.Procedurę zaprezentuje Yiru Chen, pracownik postdoc z mojego laboratorium. Po hodowli komórek MCF7 zgodnie z protokołem tekstowym, należy zebrać komórki, dodając jeden mililitr odczynnika do izolacji RNA do każdej studni, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Za pomocą pipety należy zebrać lizat komórkowy i przenieść go do probótek o pojemności 1,5 mililitra.Aby wyizolować RNA, do 1 ml lizatu komórkowego należy dodać 200 µL chloroformu i mieszać w wirówce typu vortex przez 10 sekund. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut próbki należy odwirować przy 16 000 x g i 4 °C przez 15 minut. Po wirowaniu wodną fazę górną należy ostrożnie przenieść do nowej probówki.Do fazy wodnej dodać 500 µL 100% izopropanolu i wymieszać poprzez odwracanie probówki. Następnie inkubować w temperaturze -20 °C przez noc. Następnego ranka próbki wirować przy 1600 × g i 4 °C przez 10 minut.Odlej nadsącz, dodaj 750 µL 70% etanolu wolnego od RNaz i krótko wymieszaj w wirówce typu vortex. Wirowrz próbki przy 6 000 x g w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Następnie usuń nadsącz i wiruj próbki przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez jedną minutę.Za pomocą końcówki do nakładania żelu usunąć pozostały etanol poprzez pipetowanie. Następnie ustawić probówki dnem do góry i pozostawić do wyschnięcia przez 10 minut. Po tym czasie dodać od 20 do 50 µL wody z DEPC w celu rozpuszczenia osadu, a następnie oczyścić i określić ilość RNA zgodnie z protokołem tekstowym.Po wyhodowaniu komórek MCF7 zgodnie z opisanym protokołem, dodaj do komórek 250 µl 16% formaldehydu do pięciu ml pożywki w celu sieciowania chromatyny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie użyj pięciu ml lodowatego 1X do wypłukania komórek i zatrzymania reakcji sieciowania. Zbierz komórki w 250 µl buforu do lizy komórek na płytkę.Następnie, aby pofragmentować chromatynę do wymaganych rozmiarów, poddaj komórki sonikacji osiem razy po 30 sekund każda przy natężeniu 30 A. Po każdej 30-sekundowej sonikacji schładzaj każdą próbkę na lodzie. Następnie, po odwirowaniu próbek z prędkością 16 000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, ostrożnie pobierz nadsącz za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć osadu na dnie.Na żel agarozowy 1% nanieś pięć µL aliquoty supernatantu, a następnie przeprowadź elektroforezę w celu określenia wielkości DNA. Optymalna długość fragmentu powinna wynosić od 200 do 500 par zasad. W celu przeprowadzenia immunoprecypitacji chromatyny, odstaw 25 µL lizatu komórkowego jako próbkę wejściową (input).Następnie w probówce o pojemności 50 ml wymieszaj 4 ml lizatu komórkowego z 20 ml buforu IP, przeciwciałem ER Alpha oraz magnetycznymi kulkami powlekanymi białkiem A i białkiem G. Inkubuj mieszaninę w rotacji w temperaturze 4 °C przez noc, aby umożliwić powstanie kompleksów chromatyna-przeciwciało. Po przemyciu kulek buforami do płukania, zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj do kulek 500 µl buforu elucyjnego i eluuj DNA do czterech probówek.W przypadku próbek wejściowych DNA, przeprowadź elucję do 125 µL buforu elucyjnego. Następnie umieść probówki w bloku grzejnym, przykryj je folią i połóż na wierzchu obciążnik, aby zapobiec ich otwarciu. Inkubuj probówki w temperaturze 65 °C przez noc.Aby wyizolować DNA z próbek po pulldownie przy użyciu zestawu do izolacji DNA z ChIP, schłodzić probówki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. W międzyczasie podgrzać bufor elucyjny do 65 °C. Do każdej probówki dodać 625 µL buforu wiążącego.Jeśli powstanie osad, należy dodać kolejne 250 µL buforu wiążącego, aż roztwór stanie się klarowny. Przenieś próbkę na kolumnę i wiruj przy 16 000 ×g przez 30 sekund. Następnie dwukrotnie przemyj kolumnę, używając po 250 µL buforu płuczącego.Wyługuj DNA, używając 15 µL buforu do elucji. Połącz DNA z czterech probówek z tego samego procesu pulldown, aby uzyskać 55 µL DNA. Zmierz stężenie DNA i przeprowadź qPCR zgodnie z protokołem tekstowym.Używając komórek MCF7 hodowanych zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać do płytki pięć mililitrów lodowatego 1X PBS. Następnie należy kilkakrotnie przechylić płytkę przed usunięciem PBS. Czynność tę powtórz jeszcze dwa razy, usuwając jak największą ilość PBS po ostatnim przemyciu.Do każdej płytki dodaj 750 µL schłodzonego wcześniej acetonu i zeskrob komórki. Następnie połącz komórki z dwóch płytek w probówce o pojemności 2 mL w lodzie. W celu policzenia komórek do normalizacji, dla każdej grupy badawczej użyj dwóch dodatkowych płytek do kwantyfikacji komórek.Następnie, aby odkleić komórki od płytek, należy dodać dwa mililitry buforu HE i inkubować przez pięć minut. Komórki należy dokładnie wymieszać, pipetując w buforze HE. Następnie 20 µL zawiesiny komórkowej należy nanieść do hemocytometru, aby policzyć liczbę komórek pod mikroskopem.Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C przed przeprowadzeniem analizy za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas w celu identyfikacji i oznaczenia ilościowego metabolitów. Należy przeprowadzić analizę integracyjną zgodnie z protokołem tekstowym. Rysunek ten przedstawia integralność i ogólną jakość próbek RNA oczyszczonych do eksperymentu RNA-Seq.Analiza wykazuje, że wszystkie próbki posiadają ostre i wyraźne prążki rRNA 18S i 28S, co świadczy o integralności i czystości próbek. Wartość wskaźnika integralności RNA (RNA Integrity Number, RIN) równa 10 oznacza nienaruszone RNA. Wartość 6 wskazuje na częściowo zdegradowane RNA, natomiast wartość 3 oznacza próbkę silnie zdegradowaną.W przeprowadzonych eksperymentach wszystkie próbki RNA uzyskały wartości RIN w zakresie od 9,6 do 9,9. Sekwencjonowanie o ultra wysokiej przepustowości pozwoliło na uzyskanie około 18 milionów wysokiej jakości odczytów sekwencyjnych na próbkę. Poniżej przedstawiono reprezentatywny raport Fast QC, który analizuje ogólną jakość surowych danych.Dla każdego odczytu wynik jakości wynosił od 32 do 34 dla pierwszych pięciu par zasad oraz od 36 do 38 od szóstej do 100 pary zasad. spośród 17 990 863 odczytów wygenerowanych z tej próbki, większość z nich miała wynik jakości wyższy niż 34. Na tej ilustracji przedstawiono przegląd około 100 metabolitów reprezentowanych przez piki, które wykazują zmiany w komórkach MCF7 pod wpływem traktowania estradiolami.W poniższej tabeli przedstawiono 10 metabolitów wykazujących istotne zmiany po podaniu E2. Tabela ta wymienia również szlaki metaboliczne, których aktywność została zwiększona lub zmniejszona w wyniku traktowania E2. Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, cały proces może zająć tydzień.Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zwracać uwagę na kondycję komórek oraz jakość próbek przeznaczonych do analizy. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody opierające się na danych sekwencyjnych, takie jak sekwencjonowanie egzomowe lub GRO-Seq, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tożsamości innych mRNA, mRNA enhancerów lub długich niekodujących RNA, których transkrypcja jest indukowana przez zastosowane zabiegi. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny receptorów jądrowych do badania regulacji metabolicznej przez receptory jądrowe w systemach hodowli komórkowych lub u myszy.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat analizy i integracji danych pochodzących z wielu podejść omicznych. Należy pamiętać, że praca z Trizol, formaldehydem i metanolem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak noszenie osobistych środków ochrony indywidualnej, w tym rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.

systems-biology-metabolic-regulation-estrogen-receptor-signaling

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje technikę przygotowania próbek komórek raka piersi do profilowania metabolitów. Komórki raka piersi leczy się estradiolem, który wiąże się z receptorem estrogenowym alfa i powoduje zmianę składu metabolitów.

Przygotowanie próbek do metabolomiki: metoda przygotowania próbek komórek do profilowania metabolitów

Ten film opisuje test reporterowy oparty na komórkach w celu określenia aktywności estrogenowej związków pochodzenia roślinnego. Związek o aktywności podobnej do estrogenu naśladuje jego wiązanie z receptorami estrogenowymi i napędza transkrypcję genów enzymu reporterowego. Enzym reporterowy generuje bioluminescencję w reakcji, co wskazuje na aktywność estrogenową związku.

Test aktywności reporterowej receptora estrogenowego w celu zbadania aktywności estrogenowej fitoestrogenów

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Opracowaliśmy nowatorski model ex vivo do badania działania hormonów w ludzkiej piersi. Opiera się na mikrostrukturach tkankowych wyizolowanych z chirurgicznych próbek tkanki piersi, które zachowują architekturę tkanki, interakcje międzykomórkowe i sygnalizację parakrynną.

Model ex vivo do badania działania hormonów w ludzkiej piersi

Klinicznie, niedobór estrogenu u kobiet w okresie menopauzy może nasilać występowanie zaburzeń lipidowych i miażdżycy. Ustaliliśmy model niedoboru estrogenu in vivo za pomocą obustronnej owariektomii poprzez podwójne nacięcie grzbietowo-boczne u myszy apoE-/-. Model mysi ma zastosowanie do badań przesiewowych egzogennych metod leczenia estrogenów w dysfunkcji układu krążenia po menopauzie.

Mysi model niedoboru estrogenów in vivo do badań przesiewowych egzogennych metod leczenia estrogenów dysfunkcji układu krążenia po menopauzie

Zoptymalizowaliśmy dostępny na rynku test reporterowy receptora estrogenowego β do badania pokarmów dla naczelnych u ludzi i innych zwierząt pod kątem aktywności estrogenowej. Potwierdziliśmy ten test, pokazując, że znana estrogenna soja z ludzkiej żywności rejestruje się na wysokim poziomie, podczas gdy inne pokarmy nie wykazują żadnej aktywności.

Badania przesiewowe na obecność fitoestrogenów przy użyciu komórkowego receptora estrogenowego β testu reporterowego

Ten protokół opisuje budowę mikrofizjologicznego systemu do badania raka piersi in vitro przy użyciu pierwotnej ludzkiej tkanki piersi z gotowych materiałów.

Modelowanie raka piersi w tkance piersi u ludzi za pomocą systemu mikrofizjologicznego

Obecny protokół opisuje kompleksową strategię oceny działania farmakologicznego i mechanizmu salidrozydu w hamowaniu proliferacji i migracji komórek MCF-7.

Badanie działania farmakologicznego i mechanizmu molekularnego salidrozydu w hamowaniu proliferacji i migracji komórek MCF-7

W patogenezie przerzutów do kości angiogeneza jest procesem kluczowym, w związku z czym stanowi cel obrazowania i terapii. W niniejszej pracy przedstawiamy szczurzy model miejscowych przerzutów raka piersi do kości oraz opisujemy strategie nieinwazyjnego obrazowania angiogenezy in vivo z wykorzystaniem obrazowania rezonansem magnetycznym, wolumetrycznej tomografii komputerowej i ultrasonografii.

Wielomodalne obrazowanie angiogenezy w modelu przerzutów raka piersi do kości u szczurów nago z wykorzystaniem obrazowania rezonansem magnetycznym, wolumetrycznej tomografii komputerowej i ultradźwięków

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Poznaj metodę integracji danych transkryptomicznych, cistromowych i metabolomicznych w badaniu raka piersi z użyciem komórek MCF7. Technika ta pozwala zrozumieć rolę receptora estrogenowego w regulacji metabolizmu nowotworowego.

Biologia systemowa regulacji metabolicznej przez sygnalizację receptora estrogenowego w raku piersi

Przeglądaj więcej filmów