Biologia systemowa regulacji metabolicznej przez sygnalizację receptora estrogenowego w raku piersi

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zrozumienie bezpośredniej regulacji metabolicznej ER alfa w raku piersi, przy użyciu danych transkryptomu, systromu i metabolomu całego genomu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii nukleoreceptorów i nowotworów, takie jak rola niektórych czynników transkrypcyjnych w regulacji metabolizmu, aby przyczynić się do agresywności komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona globalny obraz genów i wynikających z nich niuansów regulacji metabolicznej.

Procedurę zademonstruje Yiru Chen, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Po wyhodowaniu komórek MCF7 zgodnie z protokołem tekstowym, zbierz komórki, dodając jeden mililitr odczynnika do izolacji RNA do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Użyj pipety, aby zebrać lizat komórkowy i przenieść go do 1,5 mililitrowej probówki.

Aby wyizolować RNA, dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do jednego mililitra lizatu komórkowego i wiruj przez 10 sekund. Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut, odwirować próbki w temperaturze 16 000 x g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Po odwirowaniu ostrożnie przenieś górną fazę wody do nowej probówki.

Dodaj 500 mikrolitrów 100% izopropanolu do fazy wodnej i wymieszaj przez odwrócenie. Następnie inkubuj przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnego ranka odwirować próbki w temperaturze 1600 x g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Wyrzuć supernatant i dodaj 750 mikrolitrów 70% etanolu wolnego od RNaz i krótko wiruj. Odwirować próbki w temperaturze 6 000 x g i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie usunąć supernatant i odwirować próbki w temperaturze 16 000 x g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę.

Za pomocą końcówki do nakładania żelu usuń pozostały etanol za pomocą pipetowania. I ustaw rurki do góry nogami, aby wyschły na powietrzu przez 10 minut. Następnie dodaj od 20 do 50 mikrolitrów wody DEPC, aby rozpuścić osad, a następnie oczyścić i określić ilościowo RNA zgodnie z protokołem tekstowym.

Po wyhodowaniu komórek MCF7 zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj 250 mikrolitrów 16% formaldehydu do pięciu mililitrów pożywki do komórek, aby usieciować chromatynę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie użyj pięciu mililitrów lodowatego 1X, aby umyć komórki i zatrzymać reakcję sieciowania. Zbierz komórki w 250 mikrolitrach buforu do lizy komórek na płytkę.

Następnie, aby rozdrobnić chromatynę do wymaganych rozmiarów, należy poddać komórki sonikacji osiem razy przez 30 sekund każda z amperem 30. Schłodzić każdą próbkę na lodzie po każdych 30 sekundach sonikacji. Następnie, po odwirowaniu próbek w temperaturze 16 000 x g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, ostrożnie pipetować supernatant, nie naruszając osadu na dnie.

Nałożyć pięciomikrolitrową porcję supernatantu na 1% żel agarozowy i przeprowadzić elektroforezę w celu określenia wielkości DNA. Idealna długość fragmentu powinna wynosić od 200 do 500 par zasad. Aby przeprowadzić immunoprecypitację chromatyny, zaoszczędź 25 mikrolitrów lizatu komórkowego jako wejście.

Następnie w 50-mililitrowej probówce wymieszaj cztery mililitry lizatu komórkowego z 20 mililitrami buforu IP, przeciwciała ER Alpha oraz kulek magnetycznych kodowanych białkiem A i białkiem G. Inkubować mieszaninę przez rotację w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby umożliwić utworzenie kompleksów chromatyna-przeciwciało. Po użyciu płuczących do przemycia kulek, zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj 500 mikrolitrów buforu elucyjnego do kulek i eluuj DNA do czterech probówek.

W przypadku próbek wejściowych DNA eluować do 125 mikrolitrów buforu elucyjnego. Następnie umieść rurki w bloku grzewczym i przykryj je folią, a na wierzchu połóż ciężarek, aby zapobiec ich otwarciu. Inkubuj probówki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc.

Aby wyizolować DNA z próbek pobieranych za pomocą zestawu do izolacji DNA ChIP, należy schłodzić probówki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. W międzyczasie podgrzej bufor elucyjny do 65 stopni Celsjusza. Dodaj 625 mikrolitrów buforu wiążącego do każdej probówki.

Jeśli utworzy się środek strącający, dodaj kolejne 250 mikrolitrów buforu wiążącego, aż roztwór będzie klarowny. Załadować próbkę do kolumny i odwirować przy 16 000 x g przez 30 sekund. Następnie użyj 250 mikrolitrów buforu do płukania, aby dwukrotnie umyć kolumnę.

Za pomocą 15 mikrolitrów buforu elucyjnego wymyj DNA. Połącz DNA z czterech probówek tego samego pulldownu, aby uzyskać 55 mikrolitrów DNA. Zmierz stężenie DNA i przeprowadź QPCR zgodnie z protokołem tekstowym.

Używając komórek MCF7 hodowanych zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj do płytki pięć mililitrów lodowatego 1X PBS. Następnie przechyl płytkę kilka razy przed wyjęciem PBS. Powtórz jeszcze dwa razy, usuwając jak najwięcej PBS po ostatnim praniu.

Dodaj 750 mikrolitrów wstępnie schłodzonego acetonu do każdej płytki i zeskrob komórki. Następnie połącz komórki z dwóch płytek w dwumililitrową probówkę na lodzie. Aby policzyć komórki do normalizacji, dla każdego zabiegu użyj dwóch dodatkowych płytek do ilościowego oznaczania komórek.

Następnie, aby oderwać komórki od płytek, dodać dwa mililitry buforu HE i inkubować przez pięć minut. Dokładnie wymieszać komórki, pipetując do buforu HE. Następnie użyj 20 mikrolitrów roztworu komórkowego w hemocytometrze, aby policzyć liczbę komórek pod mikroskopem.

Próbki należy przechowywać w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza przed zastosowaniem chromatografii gazowej i spektrometrii mas w celu identyfikacji i ilościowego określenia metabolitów. Wykonaj analizę integracyjną zgodnie z protokołem tekstowym. Rysunek ten pokazuje integralność i ogólną jakość próbek RNA oczyszczonych do eksperymentu RNA-Seq.

Analiza pokazuje, że wszystkie próbki mają ostre i czyste pasma 18S i 28S RRNA, co wskazuje na integralność i czystość próbek. Numer integralności RNA (RIN) równy 10 wskazuje na nienaruszony RNA. Sześć oznacza częściowo zdegradowane RNA, a trzy oznacza próbkę, która jest silnie zdegradowana.

W tych eksperymentach wszystkie próbki RNA otrzymały wartości RIN od 9,6 do 9,9. Przeprowadzenie sekwencjonowania o bardzo wysokiej przepustowości zaowocowało około 18 milionami wysokiej jakości odczytów sekwencjonowania na próbkę. Reprezentatywny raport szybkiej kontroli jakości, który analizuje ogólną jakość surowych danych, jest pokazany tutaj.

Dla każdego odczytu wynik jakości wynosił od 32 do 34 dla pierwszych pięciu par zasad i od 36 do 38 od sześciu do 100 par zasad. Spośród 17 990 863 odczytów wygenerowanych z tej próby, większość z nich miała wynik jakości wyższy niż 34. Rysunek ten przedstawia przegląd około 100 metabolitów reprezentowanych przez piki, które pokazują zmiany w komórkach MCF7 spowodowane leczeniem estradiolem.

W poniższej tabeli przedstawiono 10 najważniejszych metabolitów, u których wystąpiły znaczące zmiany w porównaniu z leczeniem E2. Ta tabela zawiera listę szlaków, które były regulowane w górę i w dół po leczeniu E2. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zwróceniu uwagi na zdrowie komórek i jakość próbek, które będą analizowane. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak sekwencjonowanie egzomu lub GRO-Seq, które opierają się na danych sekwencjonowania, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak tożsamość dodatkowych MRNA, wzmacniających MRNA lub długich niekodujących RNA, których transkrypcja jest indukowana przez leczenie. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się receptorami jądrowymi do zbadania regulacji metabolicznej przez receptory jądrowe w systemach hodowli komórkowych lub u myszy.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować i integrować dane z wielu podejść omicznych. Nie zapominaj, że praca z Trizolem, formaldehydem i metanolem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej, takich jak rękawice i fartuchy laboratoryjne.