Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest amplifikacja miejsc integracji retrowirusowej z puli genomowego DNA za pomocą metody PCR oraz sekwencjonowanie otrzymanej biblioteki DNA, aby możliwe było precyzyjne zmapowanie lokalizacji integracji w genomie referencyjnym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w podstawowej i klinicznej retrowirologii poprzez analizę rozkładu miejsc integracji w całym genomie gospodarza. Główną zaletą tej techniki jest głębokość sekwencjonowania DNA oraz fakt, że wiele próbek może zostać poddanych multipleksowaniu w jednym przebiegu sekwencjonowania.

Na dzień przed transfekcją wysiej 3,3 × 10⁶ komórek HEK293T w 10 ml uzupełnionego pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium do każdej z pięciu szalek 100 mm. Następnego dnia, przy użyciu dostępnych komercyjnie odczynników do transfekcji lub fosforanu wapnia, przeprowadź transfekcję komórek przy użyciu 10 µg plazmidu zawierającego pełnowymiarowe klony molekularne retrowirusów lub 9 µg otoczkowanych, elidowanych wektorów jednorundowych oraz 1 µg konstruktu ekspresyjnego VSV-G. Mieszaninę dodawaj do pożywki komórkowej kroplami.

Po transfekcji inkubować komórki w temperaturze 37°C w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% dwutlenku węgla. Po około 48 godzinach zebrać pożywkę komórkową zawierającą wirusy za pomocą pipety wolumetrycznej i przepuścić ją przez filtr 0,45 µm za pomocą przepływu grawitacyjnego. Następnie skoncentrować wirusy poprzez ultrawirowanie przy 200 000 g przez jedną godzinę w temperaturze 4°C.

Po wirowaniu usuń nadsącz, pozostawiając około 500 µL DMEM FPS, a następnie resuspenduj pellet wirusa. Dodaj 20 units DNazy i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Wyznacz stężenie p24, korzystając z zestawu do wychwytu antygenu p24 HIV-1 zgodnie z instrukcjami producenta.

Dzień przed infekcją wysiej 3,0 × 10⁵ komórek HEK293T w 2,5 ml DMEM FPS na dołek w płytce sześciodołkowej i inkubuj przez noc w inkubatorze do hodowli tkanek. Zainfekuj komórki, stosując końcowe stężenie wirusowego białka p24 wynoszące 500 ng/ml w 500 µl świeżego DMEM FPS. Inkubuj przez dwie godziny w inkubatorze do hodowli tkanek.

Po dwóch godzinach do każdej studni należy dodać dwa mililitry DMEM FPS uprzednio ogrzanego do 37 °C, a następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. 48 godzin po infekcji należy usunąć pożywkę i przemyć komórki dwoma mililitrami soli fizjologicznej z buforem fosforanowym. Komórki należy zebrać, dodając 0,5 mililitra Trypsyny-EDTA uprzednio ogrzanej do 37 °C, a po kilku sekundach wizualnie sprawdzić, czy komórki w studniach zostały odklejone.

Następnie dodaj dwa mililitry uprzednio ogrzanego DMEM FPS i resuspenduj komórki, delikatnie pipetując je w górę i w dół 10 razy za pomocą pipety wolumetrycznej. Przenieś roztwór do butelki hodowlanej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych zawierającej 18 mililitrów uprzednio ogrzanego DMEM FPS i umieść ją ponownie w inkubatorze do hodowli tkanek. Po upływie co najmniej pięciu dni od infekcji zbierz komórki w opisany wcześniej sposób i resuspenduj je w pięciu mililitrach uprzednio ogrzanego DMEM FPS poprzez pipetowanie.

Wirować roztwór przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy 2 500 G, następnie odessać i odrzucić nadsącz. Na koniec wyizolować DNA genomowe z osadu komórkowego za pomocą dostępnego komercyjnie zestawu. Eluować DNA z dołączonej kolumny wymiany jonowej przy użyciu 200 µL milimolarnego Tris-HCL o pH 8,5.

Po sonikacji DNA genomowego należy oczyścić sonikowane DNA za pomocą zestawu do oczyszczania produktów PCR. Następnie należy przeprowadzić naprawę końców DNA, używając zestawu do naprawy końców (end repair kit). Po ponownym oczyszczeniu DNA, należy przeprowadzić adycję końców A (A-tailing) przy użyciu enzymu Klenow Exo-Minus.

Alternatywnie, w przypadku fragmentacji poprzez trawienie endonukleazami restrykcyjnymi, należy przeciąć genomiczne DNA mieszaniną enzymów generujących nawisy 5'TA, a także enzymem niekompatybilnym, takim jak BglII, który tnie w regionie downstream od upstreamowego viral LTR. Przeciąć 10 µg genomicznego DNA w końcowej objętości 100 µL. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.

Należy upewnić się, że końcowe DNA zostało oczyszczone przy użyciu zestawu do oczyszczania PCR. Linker stosowany do DNA poddanego sonikacji musi zawierać kompatybilny nawis T 3', natomiast linker dla DNA trawionego enzymem MseI musi zawierać kompatybilny nawis 5'TA. Należy rozpocząć od wyżarzania krótkich i długich nici linkera w stężeniu 10 µM w 35 µL buforu Tris-HCL EDTA poprzez podgrzanie do 90 °C i powolne chłodzenie do temperatury pokojowej w krokach co 1 °C na minutę.

Następnie przygotuj co najmniej cztery równoległe reakcje ligacji dla każdej próbki genomowego DNA, zawierające 1,5 µM ligowanego linkera, 1 µg pofragmentowanego DNA oraz 800 j. ligazy T4 DNA w końcowej objętości 50 µL. Ligację prowadź przez noc w temperaturze 12 °C. W przypadku próbek przygotowanych metodą sonikacji, poddaj oczyszczoną reakcję ligacji trawieniu enzymem restrykcyjnym, który tnie poniżej upstream LTR.

Należy użyć 100 jednostek odpowiedniego enzymu zgodnie z zaleceniami producenta i inkubować przez noc. Należy upewnić się, że produkty końcowe zostały oczyszczone przy użyciu zestawu do oczyszczania produktów PCR. Pierwszą rundę reakcji PCR należy przygotować, używając odczynników przedstawionych tutaj.

Przeprowadź pierwszą rundę PCR, stosując następujące parametry: 94 °C przez dwie minuty, a następnie 30 cykli: 94 °C przez 15 sekund, 55 °C przez 30 sekund oraz 68 °C przez 45 sekund. Zakończ proces etapem 68 °C przez 10 minut. Połącz produkty reakcji z pierwszej rundy i oczyść DNA w sposób opisany wcześniej.

Następnie należy przygotować reakcje PCR drugiej rundy, zawierające odczynniki przedstawione tutaj. Należy zastosować te same parametry cykliczne, co w przypadku pierwszej rundy PCR. Po złączeniu i oczyszczeniu DNA z reakcji drugiej rundy należy przeprowadzić kontrolę jakości oraz sekwencjonowanie następnej generacji, a następnie przeanalizować miejsca integracji zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu.

Miejsca integracji z bibliotek preparowanych poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi, pokazane po lewej stronie, lub sonikację, pokazane po prawej stronie, zostały wyrównane przy użyciu oprogramowania web logo. Przedstawiono każde rozcieńczenie w serii miareczkowania, od czystego DNA na górze rysunku, do maksymalnego rozcieńczenia 1:15 625 na dole. Stopień pewności maleje wraz ze zwiększaniem rozcieńczenia DNA z zainfekowanych komórek.

Na tym obrazie przedstawiono logo sekwencji dla dopasowanej kontroli losowej obejmującej 50 000 unikalnych miejsc genomowych. Należy zauważyć, że w przeciwieństwie do nich, miejsca losowe wyrównane z zestawu danych MRC nie wykazały znaczących poziomów preferencji zasad. Po opanowaniu metody, biblioteki miejsc integracji mogą zostać przygotowane z DNA genomowego w ciągu trzech dni.

Mapowanie miejsc integracji, od początkowej infekcji po zakończenie analiz bioinformatycznych, może zatem zostać zrealizowane w ciągu około dwóch tygodni. Po zastosowaniu tej procedury można skatalogować tysiące, a nawet miliony unikalnych miejsc integracji retrowirusowej oraz przeprowadzić różnorodne analizy w celu ilościowego określenia powiązań między miejscami insercji a adnotacjami genomicznymi.