Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Ogólnym celem tej procedury jest amplifikacja PCR miejsc integracji retrowirusowej z masowego genomowego DNA i sekwencjonowanie powstałej biblioteki DNA, tak aby można było zmapować precyzyjne lokalizacje integracji do genomu referencyjnego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu podstawowej i klinicznej retrowirusologii poprzez analizę rozmieszczenia miejsc integracji w całym genomie gospodarza. Główną zaletą tej techniki jest głębokość sekwencjonowania DNA oraz fakt, że wiele próbek może być multipleksowanych w jednym cyklu sekwencjonowania.

Na dzień przed transfekcją na płytce 3,3 razy od 10 do szóstego HEK293T komórek w 10 mililitrach uzupełnionej pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium w każdej z pięciu 100-milimetrowych szalek. Następnego dnia użyj dostępnych w handlu odczynników do transfekcji lub fosforanu wapnia, aby transfekować komórki za pomocą 10 mikrogramów plazmidu przenoszącego pełnowymiarowe retrowirusowe klony molekularne lub dziewięć mikrogramów otoczkowych, elilidowanych, pojedynczych okrągłych wektorów plus jeden mikrogram konstruktu ekspresji VSV-G. Dodawać mieszaninę do pożywki komórkowej kroplami.

Po transfekcji inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% dwutlenkiem węgla. Po około 48 godzinach zbierz pożywkę komórkową zawierającą wirusa za pomocą pipety objętościowej i przepuść ją przez filtr 0,45 mikrona za pomocą przepływu grawitacyjnego. Następnie należy zagęścić wirusa przez ultrawirowanie w temperaturze 200 000 G przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu usunąć supernatant do momentu, aż pozostanie około 500 mikrolitrów DMEM FPS i ponownie zawiesić osad wirusa. Dodać 20 jednostek DNazy i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Oznacz stężenie p24 za pomocą zestawu do wychwytywania antygenu HIV-1 p24 zgodnie z instrukcjami producenta.

Dzień przed zakażeniem płytka 3,0 razy 10 do piątej HEK293T komórki w 2,5 mililitra DMEM FPS na dołek na płytce sześciodołkowej i inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych. Zainfekuj komórki końcowym stężeniem wirusa p24 wynoszącym 500 nanogramów na mililitr w 500 mikrolitrach świeżego DMEM FPS. Inkubować przez dwie godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych.

Po dwóch godzinach dodaj dwa mililitry DMEM FPS podgrzanego do 37 stopni Celsjusza do każdej studzienki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora. 48 godzin po zakażeniu usuń pożywkę i umyj komórki dwoma mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Zbierz komórki, dodając 0,5 mililitra trypsyny-EDTA podgrzanej do 37 stopni Celsjusza, a po kilku sekundach sprawdź wzrokowo studzienki pod kątem przemieszczenia komórek.

Następnie dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanego DMEM FPS i ponownie zawieś komórki, delikatnie pipetując w górę iw dół 10 razy za pomocą pipety miarowej. Przenieść roztwór do kolby do hodowli tkankowej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych zawierającej 18 mililitrów wstępnie podgrzanego DMEM FPS i powrócić do inkubatora do hodowli tkankowych. Minimum pięć dni po zakażeniu zbierz komórki jak poprzednio i ponownie zawieś w pięciu mililitrach wstępnie podgrzanego DMEM FPS przez pipetowanie.

Odwirować roztwór przez pięć minut w temperaturze pokojowej o sile 2,500 Gs, a następnie odessać i wyrzucić supernatant. Na koniec wyekstrahuj genomowe DNA z osadu komórkowego za pomocą dostępnego na rynku zestawu. Eluować DNA z dostarczonej kolumny jonowymiennej za pomocą 200 mikrolitrów milimolowego Tris-HCL o pH 8,5.

Po sonikacji genomowego DNA, należy oczyścić sonifikowane DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Następnie napraw DNA za pomocą zestawu do naprawy końcówek. Po oczyszczeniu DNA jak poprzednio, A ogon DNA za pomocą enzymu Klenow Exo-Minus.

Alternatywnie, w celu fragmentacji przez restrykcyjne trawienie endonukleazy, należy przeciąć genomowe DNA za pomocą koktajlu enzymów, które generują zwisy 5'TA, a także niekompatybilnego enzymu, takiego jak BglII, który rozszczepia się poniżej wirusowego LTR. Wytnij 10 mikrogramów genomowego DNA w końcowej objętości 100 mikrolitrów. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Upewnij się, że końcowe DNA zostało oczyszczone za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Łącznik, który ma być używany z sonikowanym DNA, musi zawierać zgodny zwis T 3', podczas gdy łącznik dla DNA strawionego przez MseI musi zawierać zgodny zwis 5'TA. Rozpocznij od wyżarzania 10 mikromolowych krótkich i długich pasm łącznika w 35 mikrolitrach bufora Tris-HCL EDTA, podgrzewając do 90 stopni Celsjusza i powoli schładzając do temperatury pokojowej w krokach co jeden stopień Celsjusza na minutę.

Następnie przygotuj co najmniej cztery równoległe reakcje ligacji na próbkę genomowego DNA zawierającą 1,5 mikromolowego ligowanego łącznika, jeden mikrogram fragmentarycznego DNA i 800 jednostek ligazy DNA T4 w końcowej objętości 50 mikrolitrów. Wapnować przez noc w temperaturze 12 stopni Celsjusza. W przypadku próbek przygotowanych metodą sonikacji, oczyszczoną reakcję ligacji należy roztrawić enzymem restrykcyjnym, który rozszczepia się za LTR znajdującym się za nim.

Zużyć 100 jednostek odpowiedniego enzymu w warunkach zalecanych przez producenta przez noc. Upewnij się, że produkty końcowe są oczyszczane za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Przygotuj pierwszą rundę PCR, używając pokazanych tutaj odczynników.

Uruchom pierwszą rundę PCR, używając następujących parametrów: 94 stopnie Celsjusza przez dwie minuty, a następnie 30 cykli 94 stopni Celsjusza przez 15 sekund, 55 stopni Celsjusza przez 30 sekund, 68 stopni Celsjusza przez 45 sekund. Zakończ w temperaturze 68 stopni Celsjusza przez 10 minut. Połącz reakcje pierwszej rundy i oczyść DNA jak poprzednio.

Następnie przygotuj drugą rundę PCR zawierającą pokazane tutaj odczynniki. Stosować te same parametry cykliczne, co w przypadku pierwszej rundy PCR. Po zebraniu i oczyszczeniu DNA z reakcji drugiej rundy, przeprowadź kontrolę jakości i sekwencjonowanie nowej generacji, a następnie przeanalizuj miejsca integracji, korzystając ze szczegółowych instrukcji zawartych w pisemnej części protokołu.

Strony integracyjne z bibliotek przygotowane przez trawienie z enzymami restrykcyjnymi, jak pokazano po lewej stronie, lub sonikację, jak pokazano po prawej, zostały wyrównane za pomocą oprogramowania do tworzenia logo internetowego. Każde rozcieńczenie w serii miareczkowania jest przedstawione, od czystego DNA na górze rysunku do maksymalnego rozcieńczenia od 1 do 15 625 na dole. Stopień pewności zmniejsza się wraz ze wzrostem rozcieńczenia DNA zakażonej komórki.

Ten obraz przedstawia logo sekwencji dla dopasowanej losowej kontroli 50 000 unikalnych miejsc genomowych. Należy zauważyć, że losowe lokalizacje wyrównane z zestawu danych MRC nie wygenerowały znacznych poziomów preferencji podstawowych. Po opanowaniu, biblioteki witryn integracyjnych mogą zostać przygotowane z genomowego DNA w ciągu trzech dni.

Mapowanie ośrodka integracji, od początkowej infekcji do zakończonej bioinformatyki, można zatem zakończyć w ciągu około dwóch tygodni. Po tej procedurze można skatalogować tysiące, a nawet miliony unikalnych miejsc integracji retrowirusowej i przeprowadzić różnorodne analizy w celu ilościowego określenia powiązań między miejscami insercji i adnotacjami genomowymi.