Name: Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj metodę amplifikacji PCR miejsc integracji retrowirusowej z DNA genomowego, sekwencjonowania nowej generacji i mapowania do genomu referencyjnego. Technika ta umożliwia analizę rozkładu miejsc integracji w genomie gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni naszym kolegom Stephenowi Hughesowi i Henry'emu Levinowi za rady, które były kluczowe dla ustanowienia protokołu NGS do sekwencjonowania miejsc integracji retrowirusowej w laboratorium Engelmana. Prace te były wspierane przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia granty AI039394 i AI052014 (dla A.N.E.) oraz AI060354 (Centrum Badań nad AIDS Uniwersytetu Harvarda).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano protokół analizy miejsc integracji retrowirusowej, począwszy od początkowego etapu infekcji wirusem, poprzez mapowanie wzorców dystrybucji genomu. Protokół ten ma zastosowanie do każdego retrowirusa i każdego typu komórek zakaźnych. Co więcej, proces testowy jest dość wrażliwy, z potencjałem do odzyskania zadowalającej liczby unikalnych miejsc integracji z seryjnych rozcieńczeń genomowego DNA równoważnego infekcji zainicjowanej MOI 6,4 x 10-5. Ta czułość sprawia, że protokół jest szczególnie przydatny ...

Integracja wirusowego DNA (vDNA) z genomem komórki gospodarza jest niezbędnym krokiem w cyklu życia retrowirusa. Integracja odbywa się za pomocą enzymu wirusowego integrazy (IN), który przeprowadza dwa odrębne procesy katalityczne, które prowadzą do powstania stabilnie wprowadzonego prowirusa 1. Podjednostki IN angażują się w końce liniowego vDNA, który jest generowany przez odwrotną transkrypcję, tworząc intasomy wyższego rzędu z końcami vDNA utrzymywanymi razem przez multimer IN 2-4. IN rozszczepia końce 3' vDNA za niezmiennymi sekwencjami 5'-CA-3' w procesie znanym jako przetwarzanie 3', pozostawiając zagłębione końce 3' z reaktywnymi grupami hydroksylowymi na każdym końcu vDNA 5-8. Intasom jest następnie importowany do jądra jako część dużego zestawu białek gospodarza i wirusa, znanego jako kompleks preintegracji () 9-11. Po napotkaniu docelowego komórkowego DNA (tDNA), IN wykorzystuje grupy 3'-hydroksylowe vDNA do rozszczepienia górnych i dolnych nici tDNA w sposób rozłożony w czasie i jednocześnie łączy vDNA z grupami fosforanowymi tDNA 5' w procesie przenoszenia nici 12,13.
Retrowirusy wykazują preferencje dotyczące integracji stron w skali lokalnej i globalnej. Lokalnie, miejsca integracji konsensusu składają się ze słabo konserwatywnych sekwencji tDNA palindromicznych, które rozciągają się od około pięciu do dziesięciu pz w górę i w dół od miejsc insercji vDNA 14,15. Na całym świecie retrowirusy celują w określone adnotacje chromatyny 16. Istnieje siedem różnych rodzajów retrowirusowych - alfa przez epsilon, lenti i spuma. Lentiwirusy, do których zalicza się HIV-1, sprzyjają integracji w organizmach aktywnie transkrybowanych genów 17, podczas gdy gammaretrowirusy preferencyjnie integrują się z miejscami startowymi transkrypcji (TSS) i aktywnymi regionami wzmacniającymi 18-20. W ostrym kontraście, spumawirus jest silnie ukierunkowany na regiony heterochromatyczne, takie jak ubogie w geny domeny związane z blaszkami 21. Lokalne preferencje zasad tDNA są w dużej mierze podyktowane specyficznymi sieciami kontaktów nukleoprotein między IN a tDNA 13,22,23. W przypadku lentiwirusów i gammaretrowirusów integracja względem adnotacji genomowych jest w dużej mierze regulowana przez interakcje między IN a pokrewnymi czynnikami komórkowymi 24-27. Zmiana specyfiki sieci interakcji IN-tDNA 13,22,23,28 oraz zakłócenie lub przeprojektowanie interakcji czynnika IN-gospodarz 25-27,29-32 są sprawdzonymi strategiami retargetowania integracji odpowiednio na poziomie lokalnym i globalnym.
Moc procedur sekwencjonowania DNA używanych do katalogowania miejsc integracji retrowirusowej ogromnie wzrosła w ciągu ostatnich dziesięcioleci. Miejsca integracji zostały odzyskane w pionierskich pracach przy użyciu pracochłonnych technik oczyszczania i ręcznego klonowania, aby uzyskać zaledwie kilka unikalnych miejsc na badanie 33,34. Połączenie amplifikacji LM-PCR połączeń DNA LTR-gospodarza z możliwością mapowania poszczególnych miejsc integracji do genomów ludzkich i mysich przekształciło pole, a liczba miejsc odzyskanych z egzogennych zakażeń komórkami hodowli tkankowej wzrosła do kilkuset do tysięcy17,18. Nowsze połączenie LM-PCR z metodologią NGS spowodowało gwałtowny wzrost głębokości bibliotek. W szczególności pirosekwencjonowanie dało rzędu dziesiątek tysięcy unikalnych miejsc integracji 30,35-38, podczas gdy biblioteki zsekwencjonowane za pomocą grupowania DNA mogą dać miliony unikalnych sekwencji 19-21,39. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół LM-PCR do amplifikacji i sekwencjonowania miejsc integracji retrowirusowej przy użyciu grupowania DNA NGS. Metoda ta włącza wymagane sekwencje adapterowe do starterów PCR, a tym samym bezpośrednio do amplifikowanych cząsteczek DNA, wykluczając w ten sposób wymóg dodatkowego etapu ligacji adaptera przed sekwencjonowaniem 40. Ogólny opis obejmuje również proces analizy bioinformatycznej, począwszy od analizowania surowych danych sekwencjonowania połączeń DNA między LTR-gospodarzem a połączeniami DNA gospodarza LTR, a skończywszy na mapowaniu unikalnych miejsc integracji i odpowiednich cech genomu. Zgodnie z precedensem ustanowionym na podstawie wcześniejszych protokołów metodologicznych w tej dziedzinie 36,38,41-43, można opracować niestandardowe skrypty, aby pomóc w ukończeniu określonych etapów w procesie bioinformatycznym. Użyteczność i czułość protokołu zilustrowano reprezentatywnymi danymi poprzez amplifikację, sekwencjonowanie i mapowanie miejsc integracji HIV-1 z komórek hodowli tkankowej zakażonych przy przybliżonej wielokrotności infekcji (MOI) 1,0, a także serii miareczkowania tego DNA rozcieńczonego przez niezakażone DNA komórkowe w 5-krotnych krokach do maksymalnego rozcieńczenia 1:15,625, aby uzyskać przybliżony równoważny MOI 6,4 x 10-5.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>Standardowa pożywka do hodowli komórkowych, kompatybilna z komórkami HEK293T</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30088.03</td><td>Różne partie surowicy mogą wymagać wstępnego badania przesiewowego w celu optymalnej produkcji wirusa</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Antybiotyki, które należy dodać do</td></tr><tr><td>DMEM Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>Służy do mycia komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td>Służy do oddzielania przylegających komórek od płytek do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td>Odczynnik do transfekcji DNA</td></tr><tr><td>0,45 i mikro; m Filtry</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-35B</td><td>Służy do filtrowania pożywek do hodowli komórkowych zawierających cząstki wirusa</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>Służy do degradacji przeniesionego plazmidowego DNA z zapasów wirusów</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 Test wychwytywania antygenu</td><td>ABL Inc.</td><td>5447</td><td>Służy do ilościowego określania wydajności produkcji wirusa</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Zestaw tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Służy do oczyszczania genomowego DNA z komórek</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>Dzięki temu modelowi sonikatora wykonaj dwie rundy cyklu pracy, 5%; intensywność, 3; cykle na serię, 200; czas, 80 sekund</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td><td>Zaleca się dostępną na rynku wodę, aby zmniejszyć możliwość zanieczyszczenia krzyżowego próbki</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Purification Zestaw</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Służy do oczyszczania DNA podczas budowy biblioteki</td></tr><tr><td>End-It DNA End-Repair</td><td>Kit Epicentre</td><td>ER81050</td><td>Służy do naprawy końcówek DNA sonikowanych próbek DNA</td></tr><tr><td>Fragment Klenowa (3'-5' egzo&ndash;)</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0212S</td><td>Używany z dATP do naprawionych fragmentów DNA z ogonem A</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0141</td><td>Trifosforan deoksyadenozyny</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>Endonukleaza restrykcyjna do rozszczepienia genomowego DNA</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>Endonukleaza restrykcyjna w celu zahamowania amplifikacji sekwencji HIV-1 U5</td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>Enzym do kowalencyjnego łączenia kompatybilnych końców DNA</td></tr><tr><td>Oligonukleotydy DNA</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>na zamówienie</td><td>Niech firma oczyści oligonukleotydy. Oczyszczanie metodą HPLC wystarcza dla DNA < 30 nukleotydów; STRONA oczyszcza dłuższe DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Advantage 2 Polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639202</td><td>Komercyjna mieszanka zawierająca polimerazę DNA do PCR</td></tr><tr><td>dNTP (roztwory 100 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td>Rozcieńczyć cztery substancje chemiczne na lodzie sterylną wodą, aby osiągnąć pośrednie stężenia wzmacniające 2,5 mM każdy dNTP</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Spektrofotometr do oznaczania stężenia DNA</td></tr><tr><td>Fluorymetr kubitowy</td><td>Life Technologies</td><td>Fluorometr Qubit&reg; 3.0</td><td>używany do potwierdzania koncentracji DNA w bibliotece miejsca integracji</td></tr><tr><td>2200 System TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>Test oparty na taśmie w celu potwierdzenia rozkładu wielkości DNA biblioteki miejsca integracji</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>Używany do NGS</td></tr></tbody></table>

amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego dna miejsc integracji retrowirusowej

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retrowirusy wykazują preferencje integracji sygnatur zarówno w skali lokalnej, jak i globalnej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół (1) generowania różnorodnych bibliotek miejsc integracji retrowirusowej przy użyciu amplifikacji PCR (LM-PCR) za pośrednictwem ligacji i sekwencjonowania nowej generacji (NGS), (2) mapowania lokalizacji genomowej każdego połączenia wirus-gospodarz za pomocą BEDTools oraz (3) analizy danych pod kątem istotności statystycznej. Genomowe DNA wyekstrahowane z zakażonych komórek jest fragmentowane przez trawienie enzymami restrykcyjnymi lub przez sonikację. Po odpowiedniej naprawie końca DNA, dwuniciowe łączniki są ligowane na końcach DNA, a częściowo zagnieżdżony PCR jest przeprowadzany przy użyciu starterów komplementarnych zarówno do końca długiego końcowego powtórzenia (LTR) wirusa, jak i ligowanego DNA łącznikowego. Startery PCR przenoszą sekwencje wymagane do grupowania DNA podczas NGS, negując wymóg oddzielnej ligacji adaptera. Kontrola jakości (QC) jest przeprowadzana w celu oceny rozkładu wielkości fragmentów DNA i włączenia adaptera DNA przed NGS. Pliki wyjściowe sekwencji są filtrowane pod kątem odczytów zawierających LTR, a sekwencje definiujące LTR i konsolidator są przycinane. Przycięte sekwencje komórek gospodarza są mapowane do genomu referencyjnego za pomocą BLAT i są filtrowane pod kątem minimalnej 97% tożsamości do unikalnego punktu w genomie referencyjnym. Unikalne miejsca integracji są badane pod kątem sekwencji i rozmieszczenia sąsiednich nukleotydów (nt) w odniesieniu do różnych cech genomu. Korzystając z tego protokołu, biblioteki ośrodków integracji o wysokiej złożoności mogą zostać zbudowane z genomowego DNA w ciągu trzech dni. Cały protokół, który obejmuje egzogenne zakażenie wirusowe podatnych komórek hodowli tkankowej do analizy miejsca integracji, można zatem przeprowadzić w ciągu około jednego do dwóch tygodni. Najnowsze zastosowania tej technologii dotyczą podłużnej analizy miejsc integracji pacjentów zakażonych wirusem HIV.

Tabela 4 przedstawia wyniki reprezentatywnego eksperymentu ilustrującego czułość metody NGS w odzyskiwaniu miejsc integracji z hodowli zakażonych komórek. DNA komórkowe od niezakazonych komórek wykorzystano do seryjnego rozcieńczania DNA genomowego z infekcji, w której każda komórka zawierała średnio jedną integrację 40. Rozcieńczenia przygotowywano w pięciokrotnych krokach aż do maksymalnego rozcieńczenia 1:15 625. DNA genomowe w serii miarecznej poddano nastę...

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest amplifikacja miejsc integracji retrowirusowej z puli genomowego DNA za pomocą metody PCR oraz sekwencjonowanie otrzymanej biblioteki DNA, aby możliwe było precyzyjne zmapowanie lokalizacji integracji w genomie referencyjnym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w podstawowej i klinicznej retrowirologii poprzez analizę rozkładu miejsc integracji w całym genomie gospodarza. Główną zaletą tej techniki jest głębokość sekwencjonowania DNA oraz fakt, że wiele próbek może zostać poddanych multipleksowaniu w jednym przebiegu sekwencjonowania.Na dzień przed transfekcją wysiej 3,3 × 10⁶ komórek HEK293T w 10 ml uzupełnionego pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium do każdej z pięciu szalek 100 mm. Następnego dnia, przy użyciu dostępnych komercyjnie odczynników do transfekcji lub fosforanu wapnia, przeprowadź transfekcję komórek przy użyciu 10 µg plazmidu zawierającego pełnowymiarowe klony molekularne retrowirusów lub 9 µg otoczkowanych, elidowanych wektorów jednorundowych oraz 1 µg konstruktu ekspresyjnego VSV-G. Mieszaninę dodawaj do pożywki komórkowej kroplami.Po transfekcji inkubować komórki w temperaturze 37°C w nawilżonym inkuba

amplification-next-generation-sequencing-genomic-dna-mapping

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Linear-amplifikacja (LAM)-PCR to metoda opracowana w celu określenia dokładnych pozycji integracji wektorów wirusowych w genomie. Technika ta ewoluowała, aby stać się lepszą metodą badania dynamiki klonalnej u pacjentów z terapią genową, bezpieczeństwa biologicznego nowych technologii wektorowych, różnorodności komórek T, modeli rakowych komórek macierzystych itp.

PCR za pośrednictwem amplifikacji liniowej – lokalizacja elementów genetycznych i charakterystyka nieznanego DNA flankującego

Ten manuskrypt opisuje procedurę eksperymentalną i analizę oprogramowania dla dwukierunkowego testu miejsca integracji, który może jednocześnie analizować DNA połączenia wektor-gospodarz w górę i w dół. Dwukierunkowe produkty PCR mogą być używane na dowolnej platformie sekwencjonowania niższego szczebla. Uzyskane dane są przydatne do wysokoprzepustowego, ilościowego porównania zintegrowanych celów DNA.

Dwukierunkowa metodologia PCR w miejscu integracji retrowirusowej i przepływ pracy analizy danych ilościowych

Tutaj opisujemy protokół mapowania całego genomu miejsc integracji wektorów retrowirusowych opartych na wirusie mysiej białaczki Moloneya w komórkach ludzkich.

Skanowanie retrowirusowe: mapowanie miejsc integracji MLV w celu zdefiniowania regionów regulatorowych specyficznych dla komórki

Indywidualne sekwencjonowanie prowirusowe o pełnej długości (FLIPS) zapewnia efektywną i wysokoprzepustową metodę amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, prawie pełnej długości (nienaruszonych i wadliwych) prowirusów HIV-1 i pozwala na określenie ich potencjalnej zdolności replikacyjnej. Projekt FLIPS pozwala przezwyciężyć ograniczenia poprzednich testów zaprojektowanych do sekwencjonowania utajonego rezerwuaru HIV-1.

Amplifikacja prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji

Prezentujemy proces inżynierii genomu do generowania nowych modeli in vitro dla zakażenia HIV-1, które podsumowują integrację prowirusową w wybranych miejscach genomu. Ukierunkowanie na osoby zgłaszające pochodzące od wirusa HIV jest ułatwione dzięki manipulacji genomem specyficznej dla danego miejsca za pośrednictwem CRISPR-Cas9. Dostępne są szczegółowe protokoły generowania klonów pojedynczych komórek, badań przesiewowych i weryfikacji prawidłowego celowania.

Inżynieria genomu oparta na CRISPR-Cas9 do generowania modeli reporterowych Jurkat dla zakażenia HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa

Mutageneza insercyjna jest niezbędnym narzędziem w genetyce postępowej do identyfikacji funkcjonalnych elementów genomu. W tym miejscu opisujemy InSET (InSET) badanie przesiewowe oparte na insercji dla funkcjonalnych elementów i transkryptów, metodę wykrywania miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej opartej na lentiwirusie.

Identyfikacja funkcjonalnie istotnych miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej

Izolacja genomowego DNA z ogonów myszy

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Sekwencjonowanie puli DNA jest szybką i kosztowo efektywną strategią wykrywania rzadkich wariantów związanych ze złożonymi fenotypami w dużych kohortach. W niniejszym materiale opisujemy analizę obliczeniową sekwencjonowania nowej generacji pul 32 genów związanych z nowotworami przy użyciu pakietu oprogramowania SPLINTER. Metoda ta jest skalowalna i może być zastosowana do dowolnego analizowanego fenotypu.

Wykrywanie rzadkich wariantów genomicznych z sekwencjonowania pulującego przy użyciu SPLINTER

Poznaj metodę amplifikacji PCR miejsc integracji retrowirusowej z DNA genomowego, sekwencjonowania nowej generacji i mapowania do genomu referencyjnego. Technika ta umożliwia analizę rozkładu miejsc integracji w genomie gospodarza.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Przeglądaj więcej filmów