Name: Wytwarzanie wystających domen ludzkiego norowirusa w E. coli do krystalografii rentgenowskiej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania domeny P norowirusa ludzkiego w E. coli do krystalografii rentgenowskiej. Protokół zapewnia czyste białko dimerowe w mniej niż cztery tygodnie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundusze na to badanie zostały zapewnione przez fundację CHS. Doceniamy platformę krystalizacji białek w ramach klastra doskonałości CellNetworks Uniwersytetu w Heidelbergu w zakresie badań przesiewowych kryształów oraz Europejskiego Ośrodka Promieniowania Synchrotronowego w zakresie dostarczania urządzeń do promieniowania synchrotronowego.

1. Klonowanie domen P
<ol>
	<li>Określ region kodujący domenę P przez wyrównanie sekwencji szczepów norowirusa (np. szczep GII.10, GenBank: AF504671, pdb-ID: 3ONU)6. Ponadto usuń elastyczny obszar na końcu C-końcowym domeny P (Rysunek 2A). Optymalizuj kodon DNA pod kątem ekspresji E. coli i uwzględniaj miejsca restrykcyjne BamHI (N-końcowy) i NotI (C-końcowy) w celu subklonowania regionu kodującego domenę P do wektora ekspresji pMalc2x6,7, 
	Uwaga: Region kodowania domeny P jest optymalizowany i syntetyzowany przez usługę komercyjną. Region kodowania domeny P (wstaw) ma około 1 kb długości i jest dostarczany w standardowym wektorze transferu.</li>
	<li>Trawić 2 μg wektora przenoszenia z każdym 1 μl enzymów restrykcyjnych BamHI (20 000 U/ml) i NotI (10 000 U/ml) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z dostarczonymi przez producenta.</li>
	<li>Oddzielić strawioną wkładkę od 1% żelu agarozowego przez 20 minut pod napięciem 135 V i oczyść DNA insercji z żelu za pomocą dostępnego w handlu zestawu.</li>
	<li>Przygotować wektor ekspresji pMalc2x, trawiąc 2 μg tego wektora z każdym 1 μl enzymów restrykcyjnych BamHI (20 000 U/ml) i NotI (10 000 U/ml) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Oczyścić wektor z żelu agarozowego, jak opisano powyżej (1.3). Uwaga: Obie próbki (1.2 i 1.4) mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Związać oczyszczoną wstawkę do strawionego wektora pMalc2x w miejscach restrykcyjnych BamHI i NotI za pomocą 1 μl ligazy T4-DNA (400 000 U / ml) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) (Figura 2B i 2C). Użyj co najmniej 20 ng wektora pMalc2x i stosunku wektor:wstawienie 1:3 (masa cząsteczkowa). Mieszanka do podwiązywania wynosi zwykle ~ 20 μl.</li>
	<li>Przekształć 2 μl mieszaniny ligacyjnej w 50 μl chemicznie kompetentnych komórek bakteryjnych E. coli DH5α przy użyciu standardowego protokołu przemiany (10 min na lodzie, szok termiczny 45 s w temperaturze 42 °C) i hodować w 600 μl pożywki S.O.C. przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Odwirować przekształcone komórki przez 3 minuty przy 1 000 x g, Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 30 μl podłoża S.O.C.
	<ol>
		<li>Umieść mieszaninę transformacyjną na płytkach LB-Agar, zawierających 100 μg/ml ampicyliny do selekcji, i hoduj przez noc w temperaturze 37 °C. Wybierz co najmniej pięć kolonii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla każdej z pięciu kolonii należy zaszczepić 2-3 ml kultury pożywki LB uzupełnionej 50 μg/ml ampicyliny (LB-amp) i hodować przez wytrząsanie przez noc z prędkością 160 obr./min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wyodrębnij plazmidy z hodowli nocnej za pomocą komercyjnego zestawu. Sprawdź obecność wstawki domeny P poprzez sekwencjonowanie za pomocą startera do przodu pMalc2x (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3') i startera odwrotnego (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').</li>
</ol>
2. P Wyrażenie domeny
<ol>
	<li>Przekształć 1 μl (150 ng/μl - 400 ng/μl) wektora kodującego pMalc2x białko fuzyjne domeny MBP-His-P w 50 μl kompetentnych komórek BL21 E. coli przy użyciu standardowego protokołu transformacji (10 min na lodzie, szok termiczny 45 s w 42 °C) i hoduj w 600 μl pożywki S.O.C. przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Subkultura do 120 ml LB-amp przez noc w temperaturze 160 prędkości obrotowej i 37 °C.</li>
	<li>Zaszczepić dziewięć litrów (np. 6 x 5-litrowych kolb z 1,5 l każda) LB-amp z subkulturą (1:100). Hoduj komórki, wstrząsając z prędkością 160 obr./min i 37 °C, aż OD600 osiągnie 0,4 - 0,6. Następnie obniżyć temperaturę do 22 °C na ~ 1 godzinę, a następnie indukować ekspresję białka za pomocą 0,66 mM izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG)8. Hoduj komórki przez noc w temperaturze 22 °C (~ 18 h). 
	Uwaga: Temperatura może się zmieniać, ale zalecamy użycie 22 °C lub niższej.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie (10,543 x g, 15 min, 4 °C). Odrzucić supernatant i zamrozić osad komórkowy w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. 1. etap oczyszczania i rozszczepienia proteazy
<ol>
	<li>Przygotuj, które są używane podczas etapów oczyszczania białek z roztworów podstawowych, aby zagwarantować odtwarzalność i stabilność eksperymentów. Przygotować cztery różne do chromatografii powinowactwa do immobilizowanych jonów metali (IMAC), z których każdy zawiera inne stężenie imidazolu (10 mM, 20 mM, 50 mM i 250 mM). Na potrzeby SEC należy przygotować żelowy bufor filtracyjny (GFB) o wyższym stężeniu soli, ale bez imidazolu. Użyj wody dejonizowanej i przefiltruj wszystkie przed użyciem o wielkości porów 0,45 μm. 
	Uwaga: Szczegółowy schemat przygotowania bufora znajduje się w Tabeli 1.</li>
	<li>Rozmrozić osad komórkowy z dziewięciolitrowej hodowli i rozpuścić w 150 ml PBS w temperaturze 4 °C. Zawiesinę komórek poddać sonifikacji trzykrotnie przez 2 minuty (moc 130 W, amplituda 20%, częstotliwość impulsów 50%), aby rozbić komórki. Utrzymuj zawiesinę komórkową na lodzie podczas sonikacji.</li>
	<li>Odwirować sonikowaną zawiesinę komórkową (43,667 x g, 30 min, 4 °C) w celu oddzielenia resztek komórkowych od supernatantu zawierającego wyrażone białko. Zebrać sklarowany osad i wyrzucić osad.</li>
	<li>Przepłukać i zrównoważyć 10 ml (= objętość 1 kolumny [CV]) zawiesiny kulek agarozowych niklu (Ni)-NTA z 10 mM buforem imidazolowym w kolumnie chromatograficznej. Dodać zrównoważone kulki Ni do supernatantu z etapu 3.3 zawierającego wyrażone białko fuzyjne domeny MBP-His-P i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C z powolną rotacją.</li>
	<li>Po inkubacji nanieść całą mieszaninę białka niklu i kulek na kolumnę chromatograficzną. Powoli przemyć kolumnę każdymi 5 CV imidazolowych o pojemności 10 mM, 20 mM i 50 mM, zaczynając od 10 mM, następnie 20 mM i kończąc na 50 mM (rysunek 3A).</li>
	<li>Eluować białko fuzyjne domeny MBP-His-P za pomocą 250 mM buforu imidazolu (Figura 3A). Podczas elucji sprawdź OD280nm, aby zweryfikować elucję białka fuzyjnego (wzrost OD280nm). Kontynuuj elucję, aż OD280nm spadnie do ~ 0,1. Przemyć kulki nadmierną ilością 250 mM buforu imidazolowego (co najmniej 10 CV), a następnie co najmniej 10 CV 10 mM buforu imidazolowego. Zachowaj koraliki na drugi etap oczyszczania (sekcja 4).</li>
	<li>Sprawdź obecność białka fuzyjnego domeny MBP-His-P za pomocą SDS-PAGE za pomocą 12% żelu poliakryloamidowego SDS (10 x 8 cm)9 (Figura 3A). Wykonać elektroforezę żelową przy 45 A i 200 V przez 45 minut.</li>
	<li>Zagęścić (np. przy użyciu komercyjnego koncentratora) eluowane białko fuzyjne domeny MBP-His-P do końcowego stężenia ~ 3 mg / ml. Rozszczepić fuzję domeny MBP-His-P proteazą HRV-3C podczas dializy w stosunku do 2 litrów 10 mM buforu imidazolu (~ 1:100) przez noc w temperaturze 4 °C (Figura 3A). W zależności od końcowej objętości skoncentrowanego białka dializę należy wykonywać w kasecie dializacyjnej lub rurce do dializy. 
	Uwaga: Ilość proteazy HRV-3C do rozszczepienia białka oblicza się na podstawie specyficznej aktywności proteazy (2 U/μl, 1 U wystarcza do rozszczepienia 100 μg białka) i ilości eluowanego białka fuzyjnego, która zmienia się w zależności od poziomu ekspresji i może być oszacowana na podstawie wyniku SDS-PAGE (3.7).</li>
</ol>
4. 2. etap oczyszczania
<ol>
	<li>Zrównoważyć kulki niklu z kroku 3.6 w 10 mM buforze imidazolowym.</li>
	<li>Inkubować dializowane białko z etapu 3.7 (zawierające rozszczepioną domenę P, białko MBP i proteazę HRV) ze zrównoważonymi kulkami niklu (4.1) przez 30 minut w temperaturze 4 °C z powolnymi obrotami.</li>
	<li>Nałóż mieszaninę kulek niklu na kolumnę i zbierz przepływ (rozszczepioną domenę P) (rysunek 3B). Zmierz stężenie białka wychodzącego z kolumny, aż OD280 nm osiągnie ~ 0,1, 
	Uwaga: MBP-His powinien pozostać związany z koralikami Ni-koralikami (Rysunek 3B).</li>
	<li>Sprawdź obecność rozszczepionej domeny P za pomocą SDS-PAGE z 12% żelem, jak opisano powyżej (Rysunek 3B). Zagęścić eluowaną domenę P do ~ 3 mg/ml i dializować przez noc w temperaturze 4 °C przeciwko GFB w celu późniejszego oczyszczenia SEC.</li>
</ol>
5. Trzeci etap oczyszczania
<ol>
	<li>Umyć pompy i rury systemu oczyszczania HPLC i wstępnie zrównoważyć kolumnę SEC (patrz Lista materiałów) z GFB.</li>
	<li>Wprowadzić domenę P do kolumny z szybkością przepływu 1 ml/min za pomocą superpętli (do 12 ml) lub pętli (do 3 ml), w zależności od objętości zagęszczonej próbki. Po zakończeniu wstrzykiwania należy zwiększyć szybkość przepływu do 2,5 ml/min.</li>
	<li>W miarę wzrostu OD i schodzenia domeny P z kolumny, zbierz frakcje 1,5 ml. Sprawdź frakcje za pomocą SDS-PAGE z 12% żelem (Rysunek 4A i 4B). Zebrać tylko najczystsze frakcje i skoncentrować do ~ 3 mg/ml i ~ 8 mg/ml. 
	Uwaga: Po ~110 ml (objętość pustka) większość zanieczyszczeń jest wymywana z kolumny SEC o objętości złoża 320 ml. Domena P jest zwykle eluowana jako dimer. Czas/objętość elucji dimeru domeny P zależy od stopnia przygotowania (pg) kolumny SEC.</li>
</ol>
6. Krystalizacja domeny P
<ol>
	<li>Użyj domeny P przy ~ 3 mg/ml i 8 mg/ml do wstępnego badania przesiewowego krystalizacji. Przygotować co najmniej 100 μl domeny P na stężenie do wstępnych badań przesiewowych z 384 dostępnymi na rynku warunkami przesiewowymi. Przeprowadzić badanie przesiewowe w temperaturze 18 °C na 96-dołkowej płytce, gdzie zbiornik zawiera 100 μl roztworu macierzystego, a kropla składa się z 0,2 μl roztworu macierzystego i 0,2 μl białka.</li>
	<li>Powtórz i zoptymalizuj udane warunki krystalizacji. Dlatego używaj płytek 15-dołkowych, które zawierają 3 rzędy. Ustaw pierwszy rząd ze 100% roztworem macierzystym, drugi rząd ze 90% roztworem macierzystym i 10% wodą, a trzeci rząd z 80% roztworem macierzystym i 20% wodą. Jako objętość zbiornika należy użyć kropli o wielkości 2 μl (1 μl białka + 1 μl roztworu macierzystego) i 500 μl roztworu macierzystego.</li>
	<li>Użyj zoptymalizowanych warunków krystalicznych do kokrystalizacji domeny P z ligandami. Przygotować płytki zgodnie z opisem w ppkt 6.2. Zamiast kropli o wielkości 2 μl, należy ustawić krople zawierające 1 μl roztworu macierzystego, 1 μl białka i 1 μl liganda o stężeniu 1 mg/ml.</li>
	<li>Zbieranie zestawów danych monokryształów za pomocą promieniowania synchrotronowego. Przeprowadź wymianę molekularną przy użyciu opublikowanych struktur domeny P o wysokim podobieństwie sekwencji jako początkowy model wyszukiwania6,10-13. 
	Uwaga: Obecność liganda objawia się jako niemodelowana plama o gęstości elektronów.</li>
</ol>

<ol><li>Ahmed, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+norovirus+in+cases+of+gastroenteritis%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).</li>
<li>Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of calicivirus.</a> J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).</li>
<li>Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+resolution+structural+characterization+of+recognition+of+histo-blood+group+antigens+by+Norwalk+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).</li>
<li>Marionneau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus+binds+to+histo-blood+group+antigens+present+on+gastroduodenal+epithelial+cells+of+secretor+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals.</a> Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).</li>
<li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346, 755-759 (2014).</li>
<li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+GII.10+and+GII.12+norovirus+protruding+domains+in+complex+with+histo-blood+group+antigens+reveal+details+for+a+potential+site+of+vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability.</a> J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).</li>
<li>Fath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+RNA+and+codon+optimization%3A+a+standardized+tool+to+assess+and+enhance+autologous+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.</a> PLoS One. 6 (e17596), (2011).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Processing+of+Rotation+Diffraction+Data+from+Crystals+of+Initially+Unknown+Symmetry+and+Cell+Constants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants.</a> J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).</li>
<li>Mccoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D-Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D-Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+binding+to+a+conserved+epitope+promotes+norovirus+particle+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly.</a> J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).</li>
<li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+broad+detection+of+genogroup+II+noroviruses+by+a+monoclonal+antibody+that+binds+to+a+site+occluded+in+the+viral+particle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle.</a> J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).</li>
<li>Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+noroviruses%27+fondness+for+histo-blood+group+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li>
<li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy protokół ekspresji i oczyszczania domen P norowirusa w wysokiej jakości i ilości. Norowirusy nie są dobrze przebadane, a dane strukturalne są stale potrzebne. O ile nam wiadomo, produkcja domen P przy użyciu innych protokołów (np. domen P oznaczonych GST) była do tej pory problematyczna i brakowało wystarczających danych strukturalnych na temat interakcji norowirus-gospodarz. Dzięki opisanej tutaj metodzie w ostatnim czasie znacząco przyczyniliśmy się do zrozumienia molekularnych szczegół...

Ludzkie norowirusy są główną przyczyną ostrego zapalenia żołądka i jelit na całym świecie1. Wirusy te należą do rodziny Caliciviridae, której istnieje co najmniej pięć rodzajów, w tym Norowirus, Sapowirus, Zajęczak, Vesiwirus i Nebowirus. Pomimo ich dużego wpływu na system opieki zdrowotnej i szerokiej dystrybucji, badania nad ludzkimi norowirusami są utrudnione ze względu na brak solidnego systemu hodowli komórkowych. Do tej pory nie ma zatwierdzonych szczepionek ani strategii przeciwwirusowych.
Białko głównego kapsydu norowirusa, określane jako VP1, można podzielić na domenę powłoki (S) i wystającą domenę (P)2. Domena P jest połączona z domeną S za pomocą elastycznego obszaru zawiasu (H). Domena S tworzy rusztowanie wokół wirusowego RNA, podczas gdy domena P stanowi najbardziej zewnętrzną część kapsydu wirusa. Domena P łączy się w biologicznie istotne dimery, gdy ulega ekspresji w bakteriach. P dimer oddziałuje ze strukturami węglowodanowymi, zwanymi antygenami grupy krwi (HBGA), które są obecne jako rozpuszczalne antygeny w ślinie i znajdują się w niektórych komórkach gospodarza3. Uważa się, że interakcja domena P-HBGA jest ważna dla infekcji4. Rzeczywiście, niedawny raport ujawnił znaczenie syntetycznych HBGA lub bakterii eksprymujących HBGA dla zakażenia ludzkim norowirusem in vitro5.
Obecne badania dotyczące przyłączania komórek gospodarza przez norowirusy są głównie przeprowadzane z cząsteczkami wirusopodobnymi (VLP), które mogą być wyrażane w komórkach owadów lub z rekombinowanymi domenami P wyrażonymi w Escherichia coli (E. coli). Aby zrozumieć oddziaływania domena P-HBGA w rozdzielczości atomowej, złożone struktury domeny P-HBGA można rozwiązać za pomocą krystalografii rentgenowskiej. W tym miejscu opisujemy protokół ekspresji i oczyszczania domeny P, który umożliwia wytwarzanie domeny P w dużej ilości i jakości, która może być wykorzystana do krystalografii rentgenowskiej. Co więcej, metoda ta może być stosowana do innych domen kaliciwirusa P i białek niestrukturalnych.
Domena P jest zoptymalizowana pod kątem ekspresji E. coli i sklonowana do standardowego wektora transferu. Domena P jest następnie ponownie klonowana do wektora ekspresji, który koduje znacznik polihistydyny (His) i białko wiążące mannozę (MBP), po których następuje miejsce cięcia proteazy. Białko fuzyjne domeny MBP-His-P ulega ekspresji w E. coli, po czym następują trzy etapy oczyszczania. Białko fuzyjne domeny MBP-His-P jest oczyszczane za pomocą immobilizowanej chromatografii powinowactwa jonów metali (IMAC). Następnie białko fuzyjne jest rozszczepiane proteazą ludzkiego rinowirusa (HRV)-3C, a domena P jest oddzielana od MBP-His przez dodatkowy etap oczyszczania IMAC. Na koniec domena P jest oczyszczana za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC). Oczyszczona domena P może być następnie wykorzystana do krystalografii rentgenowskiej. Badania przesiewowe warunków krystalizacji białek przeprowadza się za pomocą dostępnych na rynku zestawów przesiewowych wykorzystujących różne stężenia białek w domenie P. Obserwuje się wzrost kryształów i optymalizuje się najbardziej obiecujące warunki.
Dzięki opisanym tutaj metodom, możliwe jest przejście od genu do białka do struktury w czasie krótszym niż cztery tygodnie. Dlatego nasza metoda ekspresji, oczyszczania i krystalizacji domeny P jest odpowiednia do badania interakcji norowirus-gospodarz na poziomie molekularnym i dostarczania ważnych danych, które pomogą w nowoczesnym projektowaniu szczepionek i badaniach przesiewowych leków.

<table><tbody><tr><td>Domena P DNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>GeneArt Synteza genów</td></tr><tr><td>pMalc2x&nbsp; wektor</td><td>Na żądanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136L</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw</td> <td>do ekstrakcji żeluQiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>Ekonomiczno-kolumnowa kolumna chromatograficzna</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td>2,5 x 10 cm, możliwość użycia w innym</td></tr><tr><td>rozmiarze Ni-NTA Agaroza</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20</td><td>GE Healthcare</td><td>różne</td><td>odcięcie 10 kDa, 30 kDa i 50 kDa stosowane</td></tr><tr><td>Wydajność podklonowania DH5&alpha; Competent Cells</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) Chemicznie kompetentny E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>C6000-03</td><td></td></tr><tr><td>HRV 3C Proteaza</td><td>Merck Millipore</td><td>71493</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-34</td><td>Kolumna SEC</td></tr><tr><td>JCSG Podstawowe pakiety</td><td>Qiagen</td><td>różne</td><td>4 przesiewy z każdym 96 dołkami Węglowodany</td></tr><tr><td></td><td>Dextra Laboratories, Wielka Brytania</td><td>różne</td><td>produkty grupy krwi</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie wystających domen ludzkiego norowirusa w e. coli do krystalografii rentgenowskiej

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Kapsyd norowirusa składa się z pojedynczego głównego białka strukturalnego, określanego jako VP1. VP1 jest podzielony na domenę powłoki (S) i domenę wystającą (P). Domena S tworzy ciągłe rusztowanie wokół wirusowego RNA, podczas gdy domena P tworzy kolce wirusa w domenie S i zawiera determinanty antygenowości i interakcji gospodarz-komórka. Domena P wiąże struktury węglowodanowe, tj. antygeny grupy histo-krwi, które uważa się za ważne w przypadku infekcji norowirusowych. W tym protokole opisujemy metodę wytwarzania wysokiej jakości domen P norowirusa o wysokiej wydajności. Białka te można następnie wykorzystać do krystalografii rentgenowskiej i testu ELISA w celu zbadania antygenowości i interakcji między komórkami gospodarza.
Domena P jest najpierw klonowana do wektora wyrażeń, a następnie wyrażana w bakteriach. Białko jest oczyszczane przy użyciu trzech etapów, które obejmują unieruchomioną chromatografię powinowactwa do jonów metali i chromatografię wykluczania wielkości. Zasadniczo możliwe jest klonowanie, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja białek w czasie krótszym niż cztery tygodnie, co sprawia, że protokół ten jest szybkim systemem do analizy nowo pojawiających się szczepów norowirusa.

Schemat opisanego protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Protokół obejmuje 6 głównych części, w tym klonowanie genu docelowego, ekspresję, trzystopniowe oczyszczanie oraz krystalizację. Rysunek 2 ilustruje konstrukcję ekspresyjną (EC) oraz charakterystykę wektora ekspresyjnego pMalc2x. Sekwencja wieliego miejsca klonowania (MCS) wektora pMalc2x zawiera miejsca cięcia restrykcyjnego i proteolitycznego. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne ...

Tutaj opisujemy metodę ekspresji i oczyszczania wysokiej jakości domen wystających (P) norowirusa (P) w E. coli do wykorzystania w badaniach krystalografii rentgenowskiej. Metoda ta może być stosowana do innych domen kaliciwirusa P, a także białek niestrukturalnych, tj. białka wirusa sprzężonego z genomem (VPg), proteazy i polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp).

Wytwarzanie wystających domen ludzkiego norowirusa w E. coli do krystalografii rentgenowskiej

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest produkcja i oczyszczanie domeny wystającej ludzkiego norowirusa w E.coli w celu uzyskania białka o ekstremalnie wysokiej czystości do krystalografii rentgenowskiej. Nasz protokół ekspresji, oczyszczania i krystalizacji białek jest szybki, niezawodny i może być stosowany w przypadku białek strukturalnych oraz niestrukturalnych. Zaletą tego protokołu jest uzyskanie białek o bardzo wysokiej czystości, które mogą tworzyć kryształy dyfrakcyjne o wysokiej rozdzielczości.Z naszego doświadczenia wynika, że w przypadku białek o mniejszej rozpuszczalności protokół może wymagać modyfikacji. Przykładowo, można zmienić pożywkę wzrostową lub temperaturę inkubacji podczas ekspresji białka. W pierwszej kolejności należy przeprowadzić transformację 1 µL wektora pMalc2x, kodującego białko fuzyjne MBP-His-P, do 15 µL kompetentnych komórek E.coli BL21, stosując standardowy protokół transformacji.Dodaj 600 µL pożywki SOC do komórek. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Przeszczep przetransformowane komórki do 120 mL pożywki LB-ampicyliny i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C przy 160 rpm.Zaszczep dziewięć litrów pożywki LB-ampicylina subkulturą. Hoduj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy prędkości wytrząsania 160 rpm, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość od 0,4 do 0,6. Następnie obniż temperaturę do 22 °C na około jedną godzinę.Ważne jest, aby odczekać do momentu, gdy temperatura osiągnie 22 °C, przed indukcją niskim stężeniem IPTG, aby umożliwić ekspresję białka rozpuszczalnego. Zaindukuj ekspresję białka za pomocą 0,66 mM IPTG. Po indukcji hoduj komórki przez noc w temperaturze 22 °C.Zebrać komórki poprzez wirowanie. Odlać nadsącz i zamrozić osad komórkowy w temperaturze -20°C. Przygotować bufory wykorzystywane w etapach oczyszczania białka z roztworów stokowych, zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami w protokole tekstowym.Rozmrozić pellet komórkowy z dziewięciolitrowej hodowli i rozpuścić w 150 mililitrach soli fizjologicznej z buforem fosforanowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Poddać zawiesinę komórkową sonikacji trzykrotnie przez dwie minuty w celu rozbicia komórek. Odwirować sonikowaną zawiesinę komórkową, aby oddzielić szczątki komórkowe od nadosadu zawierającego ekspresowane białko fuzyjne MBP-His-P domain.Zebrać nadsącz i odrzucić osad. Przemyć i zrównoważyć 10-mililitrową zawiesinę kulek agarozowych nikiel-NTA buforem z 10 milimolarnym imidazolem w kolumnie chromatograficznej. Dodać zrównoważone kulki niklowe do nadsączu zawierającego ekspresowane białko fuzyjne domeny MBP-His-P i inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy wolnej rotacji.Po inkubacji całą mieszaninę kulek niklowych z białkiem nanieś na kolumnę chromatograficzną. Przemyj powoli kolumnę za pomocą pięciu CV buforów imidazolowych o stężeniach odpowiednio 10 millimolar, 20 millimolar i 50 millimolar w temperaturze czterech stopni Celsiusza. Eluuj białko fuzyjne MBP-His-P domain przy użyciu buforu imidazolowego 250 millimolar w temperaturze czterech stopni Celsiusza.Podczas elucji należy kontrolować gęstość optyczną przy 280 nanometrach, aby zweryfikować elucję białka fuzyjnego. Elucję należy kontynuować do momentu, aż gęstość optyczna przy 280 nanometrach spadnie do około 0,1. Pracując w temperaturze czterech stopni Celsjusza, należy przemyć kulek nadmiarem buforu z 250 millimolarnym imidazolem, a następnie buforu z 10 millimolarnym imidazolem.Zachowaj kuleczki do drugiego etapu oczyszczania. Obecność białka fuzyjnego MBP-His-P domain należy potwierdzić za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), stosując 12% żel poliakryloamidowy SDS. Następnie należy skoncentrować eluowane białko fuzyjne MBP-His-P domain do końcowego stężenia około 3 mg/mL.Ilość proteazy niezbędna do skutecznego odcięcia domeny MBP-His-P musi zostać starannie obliczona. Zależy ona od całkowitej ilości eluowanego białka fuzyjnego oraz od wyniku analizy SDS-PAGE. Przeprowadź cięcie białka fuzyjnego z domeną MBP-His-P za pomocą proteazy HRV 3C podczas dializy przeciwko dwóm litrom buforu z 10 milimolarnym imidazolem przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W zależności od końcowej objętości stężonego białka, przeprowadź dializę w kasecie dializacyjnej lub w tubingu dializacyjnym. Przerównoważ odstawione kuleczki niklowe w buforze z 10 millilmolar imidazole. Inkubuj zdializowane białko zawierające odszczepioną domenę P, białko MBP oraz proteazę HRV z przerównoważonymi kuleczkami niklowymi przez 30 minut w temperaturze four degrees Celsius przy powolnej rotacji.Nałóż mieszaninę kulek niklowych na kolumnę i zbierz frakcję przepływową w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza. Jest to odszczepiona domena P. Pomiar stężenia białka należy prowadzić podczas jego elucji z kolumny, aż gęstość optyczna przy 280 nanometrach osiągnie wartość około 0,1.MBP-His powinien pozostać związany z kuleczkami niklowymi, a odcięta domena P jest eluowana w frakcji przepływowej. Obecność odciętej domeny P należy sprawdzić za pomocą SDS-PAGE z użyciem żelu 12%, analogicznie jak poprzednio. Po skoncentrowaniu elowanej domeny P do stężenia około trzech mg/ml, należy ją dializować przez noc w temperaturze czterech °C przeciwko buforowi do filtracji żelowej w celu późniejszej puryfikacji metodą chromatografii wykluczania cząsteczkowego.Przepłucz pompy i przewody systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej do oczyszczania oraz przeprowadź wstępne równoważenie kolumny do chromatografii wykluczania za pomocą buforu do filtracji żelowej. Nanieś domenę P na kolumnę przy szybkości przepływu 1 ml/min, używając superloopu lub pętli, w zależności od objętości stężonej próbki. Po zakończeniu iniekcji zwiększ szybkość przepływu do 2,5 ml/min.W miarę wzrostu gęstości optycznej i schodzenia domeny P z kolumny, należy zbierać frakcje o objętości 1,5 ml. Domena P jest zazwyczaj eluowana w formie dimeru. Po sprawdzeniu frakcji za pomocą SDS-PAGE z użyciem żelu 12%, należy połączyć tylko najczystsze frakcje i zagęścić je do stężenia około 3 mg/ml oraz około 8 mg/ml.Do wstępnego przesiewu krystalizacji należy użyć domeny P w stężeniach około 3 mg/ml oraz 8 mg/ml. Na potrzeby wstępnych testów z wykorzystaniem 384 dostępnych komercyjnie warunków przesiewowych należy przygotować co najmniej 100 µl domeny P dla każdego stężenia. Przesiew należy przeprowadzić w temperaturze 18 °C w formacie płytki 96-dołkowej, w której rezerwuar zawiera 100 µl roztworu macierzystego, a kropla składa się z 0,2 µl roztworu macierzystego i 0,2 µl białka.Zoptymalizuj warunki skutecznej krystalizacji, używając płytek 15-dołkowych z trzema rzędami. Jako objętość rezerwuaru zastosuj 500 µL roztworu macierzystego. Pierwszy rząd przygotuj z 100% roztworem macierzystym.Drugi rząd zawiera 90% roztworu macierzystego i 10% wody. Trzeci rząd zawiera 80% roztworu macierzystego i 20% wody. Przygotuj kroplę wiszącą o objętości 2 µL, mieszając równe objętości białka i roztworu macierzystego.Należy zastosować zoptymalizowane warunki krystalizacji do kokrystalizacji domeny P z ligandami. Płytki przygotowuje się w ten sam sposób co wcześniej, jednak zamiast kropli o objętości dwóch mikrolitrów, przygotowuje się krople zawierające 1 µL roztworu macierzystego, 1 µL białka oraz 1 µL ligandu o stężeniu 1 mg/mL. Przedstawiony tutaj reprezentatywny wynik SDS-PAGE obrazuje ilość eluowanego białka fuzyjnego MBP-His-domena P po pierwszym etapie oczyszczania, w którym białko fuzyjne MBP-His-domena P jest oczyszczane przy użyciu kulek agarozy niklowo-NTA.Po oddzieleniu MBP-His od odszczepionej domeny P, ilość elowanej odszczepionej domeny P jest również analizowana za pomocą SDS-PAGE. Po końcowym etapie oczyszczania przy użyciu chromatografii wykluczania cząsteczkowego, przesiewanie krystaliczne pozwoliło na optymalizację warunków krystalizacji. Tutaj przedstawiono wzór dyfrakcyjny domeny wystającej.W zasadzie możliwe jest sklonowanie, ekspresja, oczyszczenie i krystalizacja białek w czasie krótszym niż cztery tygodnie, co czyni niniejszy protokół szybkim systemem analizy nowo pojawiających się szczepów norowirusów. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że jakość jest ważniejsza niż ilość. Dzięki wysokiej jakości oczyszczonych domen P możliwe jest przeprowadzenie dodatkowych badań, w tym immunizacji w celu produkcji przeciwciał, eksperymentów NMR oraz badań opartych na metodzie ELISA.Ponadto oczyszczona domena P może być wykorzystywana do tworzenia kompleksów z fragmentami przeciwciał i nanoprzeciwciałami. Po zapoznaniu się z niniejszym protokołem powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat ekspresji i oczyszczania wysokiej jakości domen P norowirusa.

production-human-norovirus-protruding-domains-e-coli-for-x-ray

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie na mikrografiach elektronowych. Najpierw lokalizacja fluorescencji odbywa się przy użyciu mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej foto-indukcyjnie na ultracienkich przekrojach. Następnie obrazy te są dopasowywane do mikrografii elektronowych tego samego przekroju.

Nano-fEM: Lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

Źródło: Leuthold, M. M., et al. Wytwarzanie ludzkich domen wystających norowirusa w E. coli do krystalografii rentgenowskiej. J. Vis. Exp. (2016).Ten film demonstruje oczyszczanie rekombinowanej domeny P ludzkiego norowirusa P za pomocą chromatografii wykluczania wielkości, podkreślając oddzielenie białka docelowego od zanieczyszczeń o wyższej i niższej masie cząsteczkowej w oparciu o różnicową dostępność porów. Proces jest monitorowany za pomocą absorbancji UV i potwierdzany za pomocą analizy...

Oczyszczanie rekombinowanych białek domeny P pochodzących z bakterii ludzkiego norowirusa

Ten film demonstruje test do ilościowego oznaczania ludzkich cząsteczek wirusopodobnych do norowirusa (VLP) wiążących się z ludzkimi bakteriami jelitowymi. Zawiesiny bakteryjne miesza się z VLP i inkubuje, aby umożliwić tworzenie kompleksów VLP-bakterii. Kompleksy są następnie znakowane przeciwciałami specyficznymi dla VLP znakowanymi fluoroforem, a następnie wizualizacją i kwantyfikacją opartą na cytometrii przepływowej w celu zidentyfikowania procentu bakterii związanych z VLP.

Test do ilościowego określenia wiązania ludzkich norowirusów VLP z bakteriami jelitowymi

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Rutynowe metody wykrywania wykorzystujące amplifikację genomu wirusa są ograniczone przez ich niezdolność do odróżnienia cząsteczek zakaźnych od niezakaźnych. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów alternatywnych metod wspomagających dyskryminację zakaźnych cząstek norowirusa za pomocą wiązania aptamerów, dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Alternatywne metody in vitro do oznaczania integralności strukturalnej kapsydu wirusa

Ta metoda opisuje klonowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego Nsa1 do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), i ma zastosowanie do hybrydowej analizy strukturalnej innych białek zawierających zarówno uporządkowane, jak i nieuporządkowane domeny.

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

Opisujemy protokoły określania struktury domeny wiążącej IKK NEMO za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Metody te obejmują ekspresję, oczyszczanie i charakterystykę białek, a także strategie skutecznej optymalizacji kryształów i określania struktury białka w jego niezwiązanej formie.

Wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej IKK NEMO

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie wiązania eukariotycznego patogenu ludzkiego norowirusa z bakteriami. Po wykonaniu wstępnego testu przyłączenia wirusa-bakterii, cytometria przepływowa jest stosowana do wykrywania bakterii związanych z wirusem w populacji.

Ilościowe określanie cząstek wirusopodobnych do ludzkiego norowirusa wiążących się z bakteriami komensalnymi za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

Poznaj metodę ekspresji i oczyszczania domeny P norowirusa ludzkiego w E. coli do krystalografii rentgenowskiej. Protokół zapewnia czyste białko dimerowe w mniej niż cztery tygodnie.

Wytwarzanie wystających domen ludzkiego norowirusa w E. coli do krystalografii rentgenowskiej

Przeglądaj więcej filmów