Izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne

Ogólnym celem tych procedur jest szybkie wyizolowanie wysoce oczyszczonych neutrofili z próbek ludzkiej krwi poprzez wirowanie w gradifikacji gęstości w celu zbadania ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na terapię nowotworową przy użyciu dwóch modeli hodowli komórek D i trzech D. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące interakcji między wrodzonym układem odpornościowym a rakiem, takie jak rola odpowiedzi komórek nowotworowych za pośrednictwem neutrofili w terapii raka. Główną zaletą separacji w gradiencie gęstości jest możliwość wyizolowania czystych populacji komórek odpornościowych w krótkim czasie bez narażania komórek na bodźce zmieniające funkcjonowanie.

Aby wyizolować pierwotne komórki białaczkowe i neutrofile, zacznij od dodania 15 mililitrów krwi potraktowanej EDTA z próbek pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową do indywidualnych, sterylnych probówek o pojemności 50 mililitrów. Rozcieńczyć krew 15 mililitrami RPMI. Następnie ostrożnie i powoli dodaj 15 mililitrów roztworu gradientu gęstości o temperaturze pokojowej pod krwią, uważając, aby nie wymieszać warstw.

Po oddzieleniu komórek przez odwirowanie widoczne będą cztery odrębne fazy. Płytki krwi i osocze na górze, biały pierścień komórek jednojądrzastych, roztwór gradientu gęstości oraz granulocyty i erytrocyty na dole. Za pomocą plastikowej pipety pastwiskowej najpierw przenieś biały pierścień pierwotnych komórek białaczkowych do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Umyj komórki do 50 mililitrów PBS z wapniem i magnezem. I ponownie zawieś podniebienie w pięciu mililitrach świeżego PBS. Następnie dodaj 45 dodatkowych mililitrów PBS do komórek i ponownie odwiruj komórki.

Po drugim płukaniu ponownie zawieś podniebienie w pełnym podłożu RPMI. I policz liczbę żywotnych pierwotnych komórek białaczkowych. Następnie usuń warstwy osocza płytkowego i gradientu gęstości i dodaj 25 mililitrów PBS i 25 mililitrów dekstryny w chlorku sodu do fazy erytrocytów granulocytów.

Wymieszaj probówki dziesięć razy przez odwrócenie. Następnie pozwól komórkom osiąść przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec równoważenia przenieś górną warstwę ubogich neutrofili w czerwone krwinki do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów i odwiruj komórki.

Ponownie zawiesić podniebienie w pięciu mililitrach PBS i poddać lizie czerwone krwinki za pomocą 45 mililitrów buforu do lizy czerwonych krwinek. Po 15 minutach w ciemności w temperaturze pokojowej ponownie odwiruj komórki i umyj podniebienie w 50 mililitrach PBS. Pod koniec płukania ponownie zawiesić komórki w kompletnym podłożu RPMI i policzyć liczbę żywotnych neutrofili.

Rozcieńczyć obie grupy komórek do 300 000 komórek na 50 mikrolitrów stężenia RPMI i podzielić próbki między odpowiednią liczbę pięciu mililitrowych probówek faksowych. Po odwirowaniu ponownie zawieś granulki w 50 mikrolitrach PBS uzupełnionego FBS. Aby określić czystość wyizolowanych podzbiorów komórek, oznacz aliquant pierwotnych komórek białaczkowych przeciwciałem anty humanCD19 sprzężonym z APC i aliquant oczyszczonych neutrofili mieszaniną przeciwciał anty ludzkich, jak podano w tabeli, przez 30 minut w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji umyj komórki w 500 mikrolitrach PBS uzupełnionego FBS i ponownie zawieś podniebienia w 200 mikrolitrach świeżego PBS FBS. Następnie przeanalizuj czystość populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej, zwracając uwagę na kompensację koloru próbek. Aby wspólnie hodować pierwotne komórki białaczkowe z neutrofilami autologicznymi, zobacz 200 000 komórek na mililitr samych komórek białaczkowych lub z autologiem neutrofili na 24-dołkowej płytce w kompletnym pożywce RPMI.

Dokładnie wymieszaj komórki. Następnie potraktuj komórki inhibitorem kinazy tyrozynowej Brutton przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2. Następnego dnia zbierz aliquant komórek w pięciomililitrowej plastikowej tubie faksowej.

Następnie odwiruj komórki i umyj granulki w jednym mililitrze FBS PBS. Po drugim odwirowaniu oznacz komórki anineksyną pięć i jodkiem propidyny zgodnie z instrukcjami producenta przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie przeanalizuj neutrofile i pierwotne komórki białaczkowe za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zilustrowanej strategii bramkowania.

Aby skonfigurować kohodowlę trzech D, dodaj 50 000 limfocytów B chłoniaka RL samodzielnie lub wymieszaj z komórkami zróżnicowanymi HL60 w sterylnych 15-mililitrowych probówkach. Odwiruj próbki i ponownie zawieś granulki w 300 mikrolitrach matrycy membrany podstawnej, używając jednomilimetrowej końcówki pipety z otworem przyciętym na dwa do trzech milimetrów. Następnie inkubuj 300 mikrolitrów komórek w każdym dołku 24-dołkowej płytki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2.

Pod koniec inkubacji dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki RPMI do każdej studzienki i włóż kultury threeD do inkubatora na kolejne siedem dni ze zmianami pożywki co dwa dni. Piątego dnia dodaj do kultur dziesięć nanomolowców inkrystyny. Po tygodniu hodowli odessać pożywkę i umyć każdą studzienkę dwa razy jednym mililitrem lodowatego PBS.

Następnie dodaj trzy mililitry lodowatego PBS z EDTA do każdej studzienki i zeskrob dno studzienek końcówką pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby odłączyć żele. Delikatnie potrząsaj talerzem na lodzie przez 30 minut. Następnie przenieś zawiesiny komórek do pojedynczych sterylnych 15-mililitrowych probówek w celu delikatnego potrząsania lodem przez kolejne 30 minut.

Potwierdź pojawienie się jednorodnej zawiesiny komórek. Następnie odwiruj komórki, a następnie przepłucz PBS i ponownie zawieś granulki w świeżym PBS za pomocą FBS. Na koniec oznacz komórki odpowiednimi przeciwciałami i barwnikami żywotności, jak właśnie wykazano, i przeanalizuj zróżnicowane komórki RL i HL60 za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zilustrowanej strategii bramkowania.

Analiza wszystkich zdarzeń w izolowanych populacjach komórek za pomocą cytometrii przepływowej pokazuje, że ta metoda separacji skutkuje wysoce czystą pojedynczą pikową ekspresją CD19 w populacji pierwotnych komórek białaczkowych. I ponad 90 procent czystej populacji neutrofili dodatnich dla wspólnych antygenów leukocytów CD45 oraz antygenów CD15 i CD16 wyrażanych przez dojrzałe neutrofile. Badanie pierwotnych komórek białaczkowych z kultur co neutrofili pokazuje, że neutrofile wywierają ochronny wpływ na przeżycie komórek przed inhibitorem tyrozyny ibrutynibem przy znacznie większej liczbie żywotnych komórek białaczki pierwotnej w porównaniu z hodowlą samych komórek białaczkowych pierwotnych.

Zróżnicowane komórki HL60 są bardziej stabilne w trzech kulturach D niż neutrofile. Po indukcji rozwoju ich granulocytarnych komórek są mniejsze niż niezróżnicowane komórki HL60 i wyrażają wyższe poziomy CD11B i CD38. Zróżnicowane komórki HL60 wykazują również jądra wielopłatkowe.

Komórki te wykazują działanie ochronne na komórki RL ze znacznie większą liczbą żywotnych komórek RL w trzech kulturach D co po leczeniu winkrostyną w porównaniu z komórkami chłoniaka leczonymi winkrostyną hodowanymi samodzielnie. Po opanowaniu metody wirowania w gradionym gradieniu gęstości można zakończyć w ciągu 90 minut. Po ich opracowaniu, techniki te utorowały drogę naukowcom zajmującym się biologią nowotworów do zbadania wpływu różnych białych krwinek na złośliwość nowotworu w modelach przedklinicznych i próbkach pobranych od pacjentów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak szybko i niezawodnie wyizolować komórki jednojądrzaste i neutrofile, przeanalizować wpływ neutrofili na pośredniczenie w odpowiedziach komórek nowotworowych na środki przeciwnowotworowe i skonfigurować hodowlę trzech D co.