Name: Izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Poznaj izolację neutrofili z krwi ludzkiej metodą gradientu gęstości w celu badania ich wpływu na wrażliwość komórek chłoniaka na terapię przeciwnowotworową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).

1. Izolacja neutrofili i kokultura z pierwotnymi komórkami białaczkowymi
UWAGA: Procedury zostały przeprowadzone za zgodą Komisji Etyki Szpitala w Lyonie, a wszyscy pacjenci podpisali świadomą zgodę.
<ol>
	<li>Izolacja pierwotnych komórek białaczkowych i neutrofili
	<ol>
		<li>Zbierz probówki z krwią obwodową na EDTA (1,8 mg EDTA na mililitr krwi) od pacjentów, u których zdiagnozowano przewlekłą białaczkę limfocytową (CLL).</li>
		<li>Dodać każde 15 ml krwi do sterylnej probówki o pojemności 50 ml i rozcieńczyć 15 ml RPMI (rozcieńczenie 1:1), a następnie ostrożnie i powoli dodać 15 ml roztworu gradientu gęstości na dno probówki, nie mieszając faz. Upewnić się, że roztwór gradientu gęstości znajduje się w temperaturze pokojowej dla przygotowania do sporządzenia.</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 35 minut przy suchej temperaturze i bez hamulca. Krew powinna podzielić się na cztery odrębne fazy, jak pokazano na rysunku 1A, od góry do dołu: płytki krwi i osocze, komórki jednojądrzaste (biały pierścień), roztwór gradientu gęstości, granulocyty i erytrocyty.</li>
		<li>Zebrać biały pierścień, który reprezentuje pierwotne komórki białaczkowe za pomocą plastikowej pipety Pasteura i przenieść do nowej probówki o pojemności 50 ml.
		<ol>
			<li>Napełnij probówkę PBS (zawiera wapń i magnez) łącznie do 50 ml i odwiruj przy 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Zawiesić osad z 5 ml PBS, a następnie dodać PBS w łącznej objętości 50 ml i odwirować przy 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Zawiesić osad z kompletną pożywką RPMI (RPMI 1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny) w celu zliczenia przy użyciu licznika żywotności komórek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odessać górne fazy, opuszczając fazę granulocytów i erytrocytów, i dodać PBS do 25 ml, a następnie dodać 3% dekstranu w 0,9% NaClup do łącznie 50 ml. Wymieszaj probówki 10 razy i trzymaj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez mieszania.</li>
		<li>Zebrać górną warstwę neutrofili ubogą w erytrofile i umieścić ją w czystej, sterylnej probówce o pojemności 50 ml i odwirować probówki o masie 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić każdą osadkę w 5 ml PBS, a następnie dodać bufor do lizy krwinek czerwonych w łącznej objętości 50 ml.</li>
		<li>Trzymaj probówki w ciemności przez 15 minut w temperaturze suchej stężenia, a następnie odwiruj przy 500 g przez 10 minut w temperaturze suchej smo. Przemyj granulki PBS (dodaj PBS w sumie do 50 ml), a następnie odwiruj przy 500 g przez 10 minut w suchej smosji.</li>
		<li>Ponownie zawiesić granulki z kompletną pożywką RPMI do liczenia za pomocą licznika żywotności komórek. Przechowywać 3 x 105 każdego typu komórek w 50 μl PBS-FBS (4%) w plastikowych probówkach o pojemności 5 ml, aby określić czystość ich izolacji za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wyglądu morfologicznego izolowanych populacji komórek
	<ol>
		<li>Aby to zrobić, ponownie zawieś każde 3 x 104 neutrofile i 3 x 104 komórki jednojądrzaste w 150 μl pełnej pożywki RPMI. Zamontuj szkiełka szklane, karty filtracyjne i komory na próbki w wirówce cytospinowej, upewniając się, że wirówka jest dobrze wyważona.</li>
		<li>Umieścić każdy typ komórki w komorze na próbkę i cytowirówce przy 750 x g na 10 minut w temperaturze pokojowej Wyjmij szkiełka, karty filtracyjne i komory na próbki z wirówki. Zdemontuj ostrożnie, aby nie uszkodzić komórek na suwaku. Wyrzuć karty filtracyjne i komory na próbki.</li>
		<li>Zabarwić komórki za pomocą zestawu do barwienia Giemsa i przechowywać szkiełka przez 1 godzinę do wyschnięcia. Zbadaj komórki pod mikroskopem ze 100-krotnym powiększeniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbadaj czystość izolowanych komórek za pomocą FACS
	<ol>
		<li>Oznacz izolowane pierwotne komórki białaczkowe przeciwciałem anty-ludzkim CD19 sprzężonym z APC (5 μl / 106 komórek). Oczyścić neutrofile mieszaniną przeciwciał anty-ludzkich wymienionych w tabeli 1 (5 μl/106 komórek). Inkubować komórki w ciemności przez 30 minut w temperaturze 4 oC.</li>
		<li>Przemyć komórki 500 μl PBS-FBS (4%), odwirować probówki o masie 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zawiesić każdy granulat w 200 μl PBS-FBS (4%).</li>
		<li>Analiza na cytometrze przepływowym przy użyciu następującej konfiguracji optycznej: laser 488 nm: FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP), PE (575/26 BP); laser 633 nm: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Upewnij się, że kompensacja kolorów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla pierwotnych komórek białaczkowych z autologicznymi neutrofilami
	<ol>
		<li>Zasiew: 2 x 105 komórek/ml pierwotnych komórek białaczkowych samych lub z autologicznymi neutrofilami w stosunku 1:10 w pełnej pożywce RPMI. Aby to zrobić, dostosuj liczbę komórek, rozcieńczając zawiesiny komórek i dodaj 2 x 105 komórek/ml pierwotnych komórek białaczkowych do 2 x 106 komórek/ml neutrofili. Dokładnie wymieszaj.</li>
		<li>Dodać 25 μM inhibitora kinazy tyrozynowej Brutona (Btk) (ibrutynibu) do komórek. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie komórek i analiza FACS
	<ol>
		<li>Zebrać komórki w plastikowych probówkach o pojemności 5 ml do analizy FACS i odwirować probówki o stężeniu 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć granulki 1 ml PBS-FBS (4%), a następnie odwirować przy 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zawiesić osady w Aneksynie V i PI za pomocą zestawu handlowego i inkubować komórki w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Analizować na cytometrze przepływowym, stosując strategię bramkowania z rysunku 2A i następującą konfigurację optyczną: Laser 488 nm: FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10BP), FITC (530/30 BP), PI (610/20 BP). Upewnij się, że kompensacja kolorów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Różnicowanie komórek HL60 wzdłuż szlaku granulocytarnego i ich kokultura z komórkami B chłoniaka RL w modelu 3D
<ol>
	<li>Różnicowanie ludzkich komórek promielocytarnych (HL60) w komórki podobne do neutrofili
	<ol>
		<li>Dostosuj liczbę komórek HL60 do 3 x 105komórek / ml, a następnie dodaj 1 μM kwas retinowy (RA) i 1,25% DMSO, aby wywołać ich różnicowanie. Wysiewać każdą 3 x 105 komórek HL60 na basenik na płytce 48-dołkowej, a następnie inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
		<li>Później zebrać komórki i odwirować przy 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki z pełną pożywką RPMI w celu zliczenia za pomocą licznika żywotności komórek.</li>
		<li>Następnie rozcieńczyć zawiesinę komórek w pełnej pożywce RPMI, aby dostosować liczbę komórek HL60 do 3 x 105 komórek/ml i ponownie wywołać ich różnicowanie poprzez dodanie 1 μM kwasu retinowego (RA) i 1,25% DMSO. Wysiewać każde 3 x 105 komórek HL60 na basenik na 48-dołkowej płytce i inkubować przez kolejne 48 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza różnicowania HL60 (HL60 diff)
	<ol>
		<li>Zebrać komórki i odwirować probówki o masie 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić osad z kompletną pożywką RPMI do liczenia za pomocą licznika żywotności komórek.</li>
		<li>Analiza zmian w ekspresji markerów powierzchniowych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Umieścić każde 3 x 105 niezróżnicowanych komórek HL60 (z hodowli komórkowej) i 3 x 105 komórekróżnicowych HL60 w plastikowych probówkach o pojemności 5 ml do analizy FACS i odwirować probówki o masie 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zawiesić granulki w 50 μl PBS-FBS (4%). Oznacz komórki anty-ludzkim CD11b sprzężonym z AF700 lub anty-ludzkim CD38 sprzężonym z APC (5 μl / 106 komórek). Inkubować komórki w ciemności przez 30 minut w temperaturze 4 oC.</li>
		<li>Przemyć 500 μl PBS-FBS (4%), a następnie odwirować przy 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić granulki w 200 μl PBS-FBS (4%).</li>
		<li>Analizuj na cytometrze przepływowym, stosując strategię bramkowania z rysunku 3A i następującą konfigurację optyczną: laser 488 nm: FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10BP); laser 633 nm: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).</li>
		<li>Aby przetestować zmiany morfologiczne w HL60diff, unieruchomij komórki na szkiełkach do badania mikroskopowego.
		<ol>
			<li>W tym celu należy ponownie zawiesić każde 3 x 104 niezróżnicowane komórki HL60 (z hodowli komórkowej) i 3 x 104 HL60 diff w 150 μl kompletnej pożywki RPMI. Zmontuj szkiełka szklane, karty filtracyjne i komory na próbki w wirówce cytospinowej, upewniając się, że wirówka jest zrównoważona.</li>
			<li>Umieścić każdy typ komórki w komorze na próbkę i cytowirówce z prędkością 1 500 obr./min na 10 minut w temperaturze suchej smo. Wyjmij szkiełka, karty filtracyjne i komory na próbki z wirówki. Zdemontuj ostrożnie, aby nie uszkodzić komórek na suwaku. Wyrzuć karty filtracyjne i komory na próbki.</li>
			<li>Zabarwić komórki za pomocą zestawu do barwienia Giemsa i przechowywać szkiełka przez 1 godzinę do wyschnięcia. Zbadaj komórki pod mikroskopem ze 100-krotnym powiększeniem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kultura trójwymiarowa (3D) 
	UWAGA: Upewnij się, że materiały użyte w tym eksperymencie są zimne, a eksperyment odbywa się na lodzie.
	<ol>
		<li>Zawiesić każde 5 x 104 komórek RL, samodzielnie lub zmieszanych z HL60diff w stosunku RL:HL60diff 1:10, z 300 μl macierzy błony podstawnej za pomocą 1 ml końcówki pipety przeciętej sterylnymi nożyczkami w celu poszerzenia otworu do około 2 do 3 mm. Na tym etapie unikaj pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Wysiewaj każde 300 μl zawiesiny komórek/dołka na płytce 24-dołkowej. Na tym etapie unikaj bąbelków. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2, następnie dodać 1 ml pełnej pożywki RPMI do każdego dołka i inkubować przez 7 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co dwa dni. Dodać 10 nM winkrystyny w 5 dniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza FACS
	<ol>
		<li>Po 7 dniach hodowli odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć każdą studzienkę 1 ml lodowatego PBS. Dodać 3 ml/dołek lodowatego PBS-EDTA (5 mM). Oderwij żel od dna studzienki, zeskrobując go za pomocą dna końcówki pipety o pojemności 200 μl. Delikatnie potrząsaj talerzem na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i delikatnie wstrząsnąć probówkami na lodzie przez kolejne 30 minut. Sprawdzić, czy nie ma jednorodnej zawiesiny komórek. (Jeśli tak nie jest, potrząsaj komórkami przez dłuższy czas lub dodaj więcej PBS-EDTA).</li>
		<li>Odwirować probówki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć granulki za pomocą PBS, a następnie odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zawiesić za pomocą PBS-FBS (4%) i znakować przeciwciałem anty-ludzkim CD19 sprzężonym z PE-Cy7 i przeciwciałem anty-ludzkim CD38 skoniugowanym z APC (5 μl / 106 komórek). Inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze 4 oC.</li>
		<li>Przemyć 500 μl PBS-FBS (4%), a następnie odwirować probówki o masie 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki z Aneksyną V i PI za pomocą dostępnego w handlu zestawu.</li>
		<li>Analiza na cytometrze przepływowym przy użyciu strategii bramkowania przedstawionej na rysunku 4A i następującej konfiguracji optycznej: laser 488 nm: FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10BP), FITC (530/30 BP), PI (610/20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); laser 633 nm: APC (660/20 BP). Upewnij się, że kompensacja kolorów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gocheva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+induces+cathepsin+protease+activity+in+tumor-associated+macrophages+to+promote+cancer+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion.</a> Genes Dev. 24, 241-255 (2010).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, Inflammation, and Cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li>
<li>Mitchem, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+decreases+tumor-initiating+cells%2C+relieves+immunosuppression%2C+and+improves+chemotherapeutic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses.</a> Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).</li>
<li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Complexity+Predicts+Breast+Cancer+Survival+and+Functionally+Regulates+Response+to+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li>
<li>Di Carlo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+role+of+polymorphonuclear+neutrophils+in+antitumor+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions.</a> Blood. 97, 339-345 (2001).</li>
<li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Cinderella+of+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).</li>
<li>Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+activation+and+regulation+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).</li>
<li>Kelbaek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+isolation+of+polymorphonuclear+leukocytes+from+large+blood+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Chem.+Clin.+Biochem.+Z.+F%C3%BCrKlin.+Chem.+Klin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes.</a> J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).</li>
<li>Aynaud, M. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Tribbles+3+protects+nuclear+DNA+from+cytidine+deamination+by+APOBEC3A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A.</a> J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).</li>
<li>Ziòłkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+three-dimensional+cell+culture+and+anticancer+drug+activity+evaluation+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip.</a> Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).</li>
<li>Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+the+isolation+of+neutrophils+in+high+yield+without+the+use+of+dextran+or+density+gradient+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers.</a> J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).</li>
<li>Behnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+immune+complexes+induce+neutrophil+extracellular+trap+release+by+human+neutrophil+granulocytes+via+Fc%CE%B3RIIIB+and+Mac-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Baltim.Md+1950%22%5BJournal%5D)">Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1.</a> J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).</li>
<li>Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+not+less+sensitive+than+other+blood+leukocytes+to+the+genomic+effects+of+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids.</a> PloS One. 7, 44606(2012).</li>
<li>Dorward, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+advance%3A+autofluorescence-based+sorting%3A+rapid+and+nonperturbing+isolation+of+ultrapure+neutrophils+to+determine+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production.</a> J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. , e50586(2013).</li>
<li>Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaplasmaphagocytophilum+reduces+neutrophil+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo.</a> Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).</li>
<li>Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22ActaHaematol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis of neutrophils.</a> ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).</li>
<li>Dalton, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-60+cell+line+was+derived+from+a+patient+with+FAB-M2+and+not+FAB-M3%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3.</a> Blood. 71, 242-247 (1988).</li>
<li>Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+normal+and+transformed+epithelial+cells%3A+Their+contributions+to+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).</li>
<li>Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+cultures%3A+current+trends+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond.</a> Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).</li>
<li>Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2C+Neutrophils%2C+and+Cancer%3A+A+Double+Edged+Sword%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword.</a> New J. Sci. , 271940(2014).</li>
<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).</li>
<li>Shojaei, F., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractoriness+to+antivascular+endothelial+growth+factor+treatment%3A+role+of+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells.</a> Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+promote+the+malignant+glioma+phenotype+through+S100A4%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res+Off+J+Am+Assoc+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4.</a> Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).</li>
<li>Teramukai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+neutrophil+count+as+an+independent+prognostic+factor+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer%3A+an+analysis+of+Japan+Multinational+Trial+Organisation+LC00-03%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer+Oxf.Engl+1990%22%5BJournal%5D)">Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03.</a> Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-6-STAT3+axis+mediates+a+reciprocal+crosstalk+between+cancer-derived+mesenchymal+stem+cells+and+neutrophils+to+synergistically+prompt+gastric+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression.</a> Cell Death Dis. 5, 1295(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj skuteczny, prosty, szybki i niedrogi protokół izolacji neutrofili z ludzkiej krwi o wysokiej czystości przy użyciu metody wirowania w gradionym gradicynie gęstości i na tym samym etapie komórki jednojądrzaste są również oddzielane i odzyskiwane. Wyizolowane populacje komórek są czyste ≥90%.
Dostępnych jest kilka metod izolacji neutrofili z ludzkiej krwi. Należą do nich podobne metody wykorzystujące nieciągłe gradienty11,12 lub wykorzystujące komercyjne zestawy do izola...

Wrodzone komórki odpornościowe stanowią zasadniczą część komórek w mikrośrodowisku guza i są związane z nowotworem złośliwym u pacjentów i zwierzęcych modeli raka1. Ostatnio coraz powszechniej docenia się, że przewlekłe odpowiedzi immunologiczne odgrywają kluczową rolę w promowaniu progresji nowotworu, przerzutów i oporności na chemioterapię2. Makrofagi są ważnymi wrodzonymi komórkami odpornościowymi, które, jak wykazano, bezpośrednio regulują odpowiedź komórek nowotworowych na chemioterapię 3,4. Jednak rola neutrofili, kluczowych graczy we wrodzonym układzie odpornościowym, w regulacji odpowiedzi guza na leczenie przeciwnowotworowe nie jest znana. Celem tych protokołów jest zastosowanie szybkiej i wiarygodnej metody oddzielania neutrofili od próbek krwi pacjenta z PBL oraz różnicowanie komórek HL60 wzdłuż szlaku granulocytarnego w celu zbadania ich roli w regulacji wrażliwości komórek chłoniaka na leki przeciwchłoniakowe.
Neutrofile są najliczniejszym składnikiem komórkowym wrodzonego układu odpornościowego we krwi 5 i działają jako pierwsza linia obrony przed inwazją mikroorganizmów 6. Neutrofile odgrywają zasadniczą rolę w zwiększaniu efektywnej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, oprócz zmiennych funkcji efektorowych w kilku stanach patologicznych 7. Dlatego w badaniach in vitro wymagana jest szybka i wiarygodna metoda izolowania neutrofili z innych komórek krwi, taka jak metoda separacji w gradiencie gęstości. Zastosowanie tej metody do izolacji neutrofili ułatwi dalsze badania nad funkcjami immunologicznymi in vivo i ex vivo, w których pośredniczą neutrofile.
Zdolność do uzyskania czystych populacji neutrofili jest ważnym pierwszym krokiem do badania pacjentów z chorobami immunologicznymi 8. Metoda separacji w gradionym spadku gęstości jest idealną techniką, w której uzyskuje się wysoką wydajność komórek. Metoda polega na dodaniu roztworu gradientu gęstości na dnie probówki zawierającej rozcieńczoną krew ludzką, a następnie odwirowaniu przy 300 g przez 35 minut bez przerwy. Pierścień komórek jednojądrzastych pojawia się na granicy faz, a neutrofile znajdują się poniżej pierwszego. Metoda ta ma znaczące zalety w stosunku do innych dostępnych metod, takich jak zestawy do izolacji neutrofili, które są znacznie droższe9. Ponadto izolowanie neutrofili z ludzkiej krwi za pomocą komercyjnych zestawów wykorzystujących przeciwciała skierowane do markera powierzchniowego specyficznego dla ludzkich neutrofili zwiększa ryzyko aktywacji lub różnicowania komórek. Metoda separacji w gradimencie gęstości pozwala na wyizolowanie neutrofili w krótkim czasie. Na tym samym etapie oddzielane i odzyskiwane są również komórki jednojądrzaste. Jest to podstawowa technika, w której uzyskuje się wysoką wydajność czystych komórek w celu osiągnięcia integralności funkcjonalnej.
Aby naśladować mikrośrodowisko guza, przeprowadzono eksperymenty 3D. Biorąc pod uwagę krótki okres półtrwania neutrofili in vitro, eksperymenty 3D na świeżych ludzkich neutrofilach nie są rozstrzygające. Z tego powodu komórki promielocytowe (HL60) są indukowane do różnicowania się w komórki podobne do neutrofili za pomocą induktorów różnicowania dimetylosulfotlenku (DMSO) i kwasu retinowego (RA). Stosowanie zróżnicowanych komórek HL60 (różnica HL60) zapobiegnie różnym reakcjom neutrofili z powodu izolacji od różnych dawców.
Modele hodowli 3D in vitro stanowią etap pośredni między modelami 2D in vitro a modelami in vivo. W hodowli 2D komórki rozprzestrzeniają się na plastikowej powierzchni, tworząc nienaturalne przyczepy komórkowe do zdeponowanych białek, które są denaturowane na tej syntetycznej powierzchni. I odwrotnie, komórki w hodowli 3D tworzą naturalne przyczepy komórka-komórka, ponieważ komórki i macierz zewnątrzkomórkowa, którą syntetyzują, są naturalnym materiałem, do którego są przyczepione. Z tego powodu modele kokultur 3D, zwłaszcza między komórkami rakowymi a innymi typami komórek, były bardzo przydatne do wskazania ich udziału we wzroście guza, angiogenezie i przerzutach. W rezultacie hodowle 3D sprawiają, że hodowla komórkowa naśladuje warunki fizjologiczne, które istnieją in vivo 10.

<table><tbody><tr><td>Specyfikacja RPMI 1640&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS zawiera wapń i magnez)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-alanylo-L-glutamina (L-glutamina)</td><td>Technologie życia</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina streptomycyna (Pen Strep)</td><td>Technologie życia</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor kinazy tyrozynowej Brutona (Btk) (Ibrutynib)&nbsp;</td><td>CliniSciences</td><td>A3001</td><td></td></tr><tr><td>Winkrystyna&nbsp;</td>Matryca membrany podstawnej <td>EG labo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Umieścić w temperaturze 4 oC przez noc (O/N) przed dniem eksperymentu</td></tr><tr><td>Bufor do lizy krwinek czerwonych&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll (Pancoll)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>Dextran&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Euromedex</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia V-FLOUS do aneksji&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11&nbsp; 988&nbsp; 549&nbsp; 001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RAL 555 Zmodyfikowany zestaw do barwienia Giemsa</td><td>Cosmos Biomedical</td><td>CB361550-0000</td><td></td></tr><tr><td>Cytometria przepływowa LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific Mikroskop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMR-XA</td> Celometr <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Auto T4 Licznik żywotności komórek</td><td>Nexcelom&nbsp; Biologią</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofile są najliczniejszym (40% do 75%) typem białych krwinek i jednymi z pierwszych komórek zapalnych, które migrują w kierunku miejsca zapalenia. Są kluczowymi graczami we wrodzonym układzie odpornościowym i odgrywają główną rolę w biologii raka. Neutrofile zostały zaproponowane jako kluczowe mediatory transformacji złośliwej, progresji guza, angiogenezy i modulacji odporności przeciwnowotworowej; poprzez uwalnianie rozpuszczalnych czynników lub ich interakcję z komórkami nowotworowymi. Aby scharakteryzować specyficzne funkcje neutrofili, pożądana jest szybka i niezawodna metoda izolacji in vitro neutrofili z ludzkiej krwi. W tym miejscu zademonstrowano metodę separacji w gradionym stopniu zaawansowania w celu wyizolowania neutrofili, a także komórek jednojądrzastych z krwi. Procedura polega na starannym nałożeniu roztworu gradientu gęstości, takiego jak Ficoll, na rozcieńczoną krew uzyskaną od pacjentów z rozpoznaną przewlekłą białaczką limfocytową (CLL), a następnie odwirowaniu, izolacji warstwy jednojądrowej, oddzieleniu neutrofili od erytrofili przez dekstran, a następnie lizie pozostałych erytrocytów. Wykazano, że metoda ta izoluje neutrofile ≥ czystości 90%. Aby naśladować mikrośrodowisko guza, przeprowadzono eksperymenty trójwymiarowe (3D) przy użyciu macierzy błony podstawnej, takiej jak Matrigel. Biorąc pod uwagę krótki okres półtrwania neutrofili in vitro, nie można przeprowadzić eksperymentów 3D na świeżych ludzkich neutrofilach. Z tego powodu komórki promielocytowe HL60 różnicują się wzdłuż szlaku granulocytarnego za pomocą induktorów różnicowania: dimetylosulfotlenku (DMSO) i kwasu retinowego (RA). Celem naszych eksperymentów jest zbadanie roli neutrofili we wrażliwości komórek chłoniaka na leki przeciwchłoniakowe. Jednak metody te można uogólnić w celu zbadania interakcji neutrofili lub komórek podobnych do neutrofili z szerokim zakresem typów komórek w różnych sytuacjach.

Opisana tutaj metoda rozdziału w gradiencie gęstości pozwala na uzyskanie pierwotnych komórek białaczyczych oraz niestymulowanych neutrofili izolowanych z krwi pacjentów z CLL. Rysunek 1A przedstawia poszczególne warstwy krwi uzyskane po wirowaniu w gradiencie gęstości (od góry do dołu: płytki krwi i osocze, biały pierścień reprezentuje komórki mononuklearne, roztwór gradientu gęstości, granulocyty i erytrocyty). Rysunki 1B i 1C ukazują różnice w wyglądzi...

Neutrofile to najliczniejszy rodzaj białych krwinek. Opisano tutaj izolację neutrofili z krwi ludzkiej metodą separacji w gradinie gęstości i różnicowanie ludzkich komórek promielocytowych (HL60) wzdłuż szlaku granulocytarnego; w celu zbadania ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na leki przeciwchłoniakowe.

Izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Ogólnym celem opisanych procedur jest szybka izolacja wysoko oczyszczonych neutrofili z próbek ludzkiej krwi za pomocą wirowania w gradiencie gęstości, aby zbadać ich rolę w wrażliwości komórek chłoniaka na terapię przeciwnowotworową z wykorzystaniem dwu- i trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych. Metody te mogą pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące interakcji między wrodzonym układem odpornościowym a nowotworem, na przykład w kwestii tego, jaką rolę w terapii nowotworowej odgrywają odpowiedzi komórek nowotworowych pośredniczone przez neutrofile. Główną zaletą separacji w gradiencie gęstości jest możliwość wyizolowania czystych populacji komórek odpornościowych w krótkim czasie, bez narażania komórek na bodźce zmieniające ich funkcje.Aby wyizolować pierwotne komórki białaczkowe i neutrofile, należy rozpocząć od dodania 15 ml krwi opracowanej z EDTA z próbek pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową do poszczególnych, sterylnych probówek o pojemności 50 ml. Krew należy rozcieńczyć 15 ml RPMI. Następnie należy ostrożnie i powoli dodać 15 ml roztworu do gradientu gęstości w temperaturze pokojowej pod krew, dbając o to, aby nie zmieszać warstw.Po rozdzieleniu

neutrophil-isolation-analysis-to-determine-their-role-lymphoma-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie pokazujemy izolację cytotoksycznych neutrofili o wysokiej gęstości i neutrofili o niskiej gęstości z krwi myszy z nowotworem przez nieciągłe wirowanie w gradinie sacharozy.

Izolacja cytotoksycznych neutrofili z krwi myszy zawierającej nowotwór

Ten film pokazuje test badający rolę komórek podobnych do neutrofili w ochronie komórek chłoniaka przed cytotoksycznością środków chemioterapeutycznych. Powstaje kokultura 3D, składająca się z chłoniaka i komórek podobnych do neutrofili, i wystawia się ją na działanie winkrystyny - leku stosowanego w chemioterapii. Bezpośredni kontakt z komórkami podobnymi do neutrofili indukuje regulację w górę białek antyapoptotycznych w komórkach chłoniaka, sprzyjając w ten sposób ich przetrwaniu w obecności...

Określanie roli komórek neutrofilopodobnych we wrażliwości komórek chłoniaka na badany lek

Tutaj opisujemy protokół, który łączy dwie techniki proteomiczne, mianowicie dwuwymiarową elektroforezę (2DE) i spektrometrię mas (MS), w celu identyfikacji różnie wyrażonych/potranslacyjnych zmodyfikowanych białek wśród dwóch lub więcej grup próbek pierwotnych. Takie podejście, wraz z eksperymentami funkcjonalnymi, pozwala na identyfikację i charakterystykę markerów prognostycznych/celów terapeutycznych.

Od plamki 2DE-Gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z HS1 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Ten protokół opisuje szybką nieenzymatyczną dysocjację świeżych fragmentów tkanek ludzkich do jakościowej i ilościowej oceny komórek CD45+ (limfocytów/leukocytów) obecnych w różnych normalnych i złośliwych tkankach ludzkich. Dodatkowo, supernatant uzyskany z pierwotnego homogenatu tkankowego może być zbierany i przechowywany do dalszej analizy lub eksperymentów.

Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Opisany tutaj protokół reprezentuje łatwą i powtarzalną metodę, która wykorzystuje wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC) do pomiaru metabolizmu puryn na komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) hodowanych w różnych warunkach.

Test oparty na HPLC do monitorowania zewnątrzkomórkowego metabolizmu nukleotydów/nukleozydów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) jest najczęstszą białaczką w zachodnim świecie. Czynniki transkrypcyjne NFAT są ważnymi regulatorami rozwoju i aktywacji w wielu typach komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) w ludzkich komórkach PBL w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2.

Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolacji neutrofili z krwi pełnej, kożuchów lub błon leukaferezy, osiągając dobrą wydajność, wysoką czystość i minimalną aktywację komórek. Wykorzystujemy oczyszczanie gradientowe, sedymentację czerwonych krwinek (RBC) i lizę RBC, aby uzyskać wysokiej jakości / czysty preparat neutrofili.

Izolacja ludzkich neutrofili z krwi pełnej i kożuchów

Ten protokół zawiera zestaw testów funkcjonalnych neutrofili, które mają być używane jako metoda przesiewowa w celu pokrycia funkcji z różnych ścieżek sygnałowych. Protokół zawiera wstępną i prostą ocenę żywotności komórek, czystości, produkcji reaktywnych form tlenu, migracji w czasie rzeczywistym, fagocytozy oraz wstępną sugestię pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili

Tutaj oferujemy niezawodne podejście do izolacji neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej za pomocą izolacji magnetycznej (selekcja negatywna) i podłoża o nieciągłym gradinie gęstości. Zapewnia nietkniętą izolację komórek o wysokiej czystości (≥93%), ułatwiając dokładną analizę subpopulacji neutrofili, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w zdrowiu i chorobie.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o niskiej i normalnej gęstości z krwi pełnej

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.

Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Poznaj izolację neutrofili z krwi ludzkiej metodą gradientu gęstości w celu badania ich wpływu na wrażliwość komórek chłoniaka na terapię przeciwnowotworową.

Izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne

Przeglądaj więcej filmów