Name: Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Poznaj metodę łączenia zapisu elektrofizjologicznego z obrazowaniem komórkowym w mechanosensorycznych zakończeniach nerwowych mieszków włosowych myszy. Technika umożliwia wizualizację i badanie farmakologii kanałów mechanotransdukcji in situ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została częściowo sfinansowana przez projekt UK Medical Research Council G0601253 dla G.S.B. i R.W.B.

Pobieranie tkanek pośmiertnych na myszach musi odbywać się przy użyciu zatwierdzonych metod etycznych. W Wielkiej Brytanii zwichnięcie szyjki macicy jest zatwierdzoną przez rząd metodą dla dorosłych myszy (metoda wymieniona w Wykazie 1 w brytyjskiej ustawie o zwierzętach (procedury naukowe) z 1986 r. i dyrektywie europejskiej 2010/63/UE). Przepisy te są egzekwowane lokalnie na Uniwersytecie w Aberdeen przez Komisję ds. Dobrostanu Zwierząt i Oceny Etyki, która dokonała przeglądu i zatwierdziła wszystkie procedury stosowane w poniższym protokole.
Uwaga: Te metody zostały użyte w badaniach opisanych w Banks et al.7
1. Przygotowanie uszu do elektrofizjologii
<ol>
	<li>Przed sekcją przygotuj standardową sól fizjologiczną, taką jak sól fizjologiczna Lileya (1956) i nasyc ją 90% O2/5% CO2 . Sól fizjologiczna Lileya (mM) składa się z: NaHCO3 (12), KCl (4), KH2PO4 (1), NaCl (138,8), MgCl2 (1), CaCl2 (2) i glukozy (11).</li>
	<li>Humanitarna eutanazja dorosłej myszy bez uszkadzania czaszki w pobliżu uszu. Tutaj używamy myszy C57 / Bl6J i MF1, ale można użyć dowolnego standardowego szczepu myszy laboratoryjnej. Najlepiej użyć myszy o wadze <25 g, jeśli zapis elektryczny ma być połączony z etykietowaniem barwnikiem styrylowym, ponieważ etykietowanie u większych myszy jest mniej wiarygodne, często można je znaleźć tylko w ograniczonych obszarach.</li>
	<li>Usuń głowę dużymi nożyczkami lub nożycami do kości.</li>
	<li>Umieść głowę grzbietem do góry w zagazowanym Liley's w naczyniu preparacyjnym z szerokim dnem (zwykle wygodne jest 50 cm) na stoliku stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego. Regularnie (~10 min) śluzować lub zanurzać głowicę w zagazowanym roztworze soli.</li>
	<li>Ostrożnie naciąć i oddzielić skórę u podstawy ucha zewnętrznego (małżowiny usznej) za pomocą nożyczek sprężynowych i kleszczy #3, odsłaniając chrząstkę zewnętrznego przewodu słuchowego (EAM). Zidentyfikuj gałęzie nerwu trójdzielnego (podział żuchwy, MDV) i wielkich nerwów usznych, gdy wyłaniają się one z czaszki w szczelinie stawu żuchwowego i wystają przez podstawę chrząstki, aby unerwić odpowiednio wklęsłą (przednią) i wypukłą (tylną) stronę skóry małżowiny usznej.</li>
	<li>W pobliżu czaszki zidentyfikuj, gdzie dwie gałęzie nerwowe wychodzą w rowku między szczęką a wyrostkiem sutkowatym. Zmaksymalizuj ich długość, delikatnie odciągając małżowinę uszną od czaszki i przeciąć nerwy jak najbliżej czaszki.</li>
	<li>Usuń małżowinę uszną z głowy za pomocą nożyczek sprężynowych, uważając, aby uniknąć dystalnych kikutów podzielonych nerwów i minimalizując ilość gęstej sierści u podstawy ucha, która jest usuwana.</li>
	<li>Przenieś małżowinę uszną do elastycznego naczynia wyłożonego gumą silikonową (PDMS) wypełnionego zagazowanym płynem Lileya. Otwórz EAM, dzieląc go w najwęższym (najbardziej przednim) punkcie. Spłaszcz małżowinę uszną, przednią stronę skóry (wklęsłą) do dołu i ostrożnie przypnij do PDMS na krawędziach za pomocą ~6-8 regularnie rozmieszczonych bardzo drobnych (~0,2 mm średnicy) szpilek przeciw owadom.</li>
	<li>Całkowicie usuń skórę tylnej części małżowiny usznej i częściowo usuń chrząstkę małżowiny usznej przez rozwarstwienie kleszczami #3, upewniając się, że przednia skóra pozostaje nienaruszona.</li>
	<li>Trzymając czubek cienkiej szpilki do owadów za pomocą kleszczy #3, delikatnie rozciągnij gałęzie (zwykle 2) MDV, które wyłaniają się z tyłu między skórą a chrząstkami EAM. Przypnij je do PDMS za pomocą najdelikatniejszych możliwych szpilek do owadów, przebijając tkankę łączną przylegającą do ich odciętych końców, a nie same pnie nerwowe.</li>
	<li>Usuń większość otaczającej je tkanki łącznej, ostrożnie unikając uszkodzeń spowodowanych nadmiernym ciągnięciem lub cięciem.</li>
</ol>
2. Konfiguracja zapisu elektrofizjologicznego 
<ol>
	<li>Przypnij skórę małżowiny usznej do wyłożonej PDMS podstawy komory nagraniowej za pomocą drobnych szpilek owadów wokół krawędzi (~6-8 na ucho), umieszczając oczyszczone nerwy u podstawy ucha w pobliżu dwóch elektrod ssących – jednej do nagrywania (w celu pobrania nerwu), a drugiej elektrody obojętnej (w celu dostarczenia neutralnego sygnału do wzmacniacza różnicowego, patrz7).</li>
	<li>W przypadku elektrody rejestrującej ostrożnie dopasuj aperturę i wewnętrzną średnicę otworu do łącznej grubości dwóch nerwów, tak aby pasowały jak najściślej i na jak największą długość.</li>
	<li>Wciągnąć nerwy do elektrody poprzez delikatne odsysanie ze strzykawki o pojemności 2 ml przymocowanej do drugiego końca rurką z gumy silikonowej. Upewnij się, że nerwy są proste, nie są złożone ani podwojone.</li>
	<li>Rozwijaj dopasowanie o wysokiej rezystancji elektrycznej/impedancji, używając silniejszego ssania do wciągania tkanki łącznej lub tkanki tłuszczowej, aby utworzyć zatyczkę, która szczelnie uszczelnia otwór wokół nerwu.</li>
	<li>W razie potrzeby napełnij drugą (obojętną) elektrodę solą fizjologiczną przez odsysanie (może ona napełnić się przez działanie kapilarne).</li>
	<li>Umieść identyczne przewody nagrywające (srebrne lub platynowe) w wewnętrznym otworze elektrod nagrywających, aby stykały się z solą fizjologiczną a nerwem (nagrywającym) lub zwężonym, wypolerowanym ogniowo końcem (obojętnym) elektrody. Każda elektroda jest lutowana indywidualnie do różnych rdzeni dwużyłowego ekranowanego. Umieścić elektrodę do kąpieli (uziemiającą) (osad Ag/AgCl) w kąpieli i uziemić ją do ekranu dwużyłowego podłączonego do elektrod rejestrujących.</li>
	<li>Wprowadź aktywność elektryczną z dwóch elektrod do oddzielnych kanałów wzmacniacza różnicowego, filtruj (pasmo przepuszczane 0,2-2 kHz) i view na ekranie oscyloskopu. Sprawdź, czy poziomy szumów elektrycznych kanału A (nagrywanie) i kanału B (obojętny) wyglądają podobnie. Na tym etapie może nie być możliwe zobaczenie normalnych spontanicznych potencjałów czynnościowych w kanale A, zanim obie elektrody zostaną zrównoważone.</li>
	<li>Wyrównaj wszelkie różnice w szumie tła między elektrodami poprzez zwiększenie impedancji elektrod nagrywających (kanał A) lub obojętnych (kanał B). W tym celu należy zassać otoczkę (tkankę łączną) otoczki (tłuszczu) głębiej do elektrody i/lub przyłożyć większą siłę ssącą do strzykawki o pojemności 50 ml.
	<ol>
		<li>Po "zbalansowaniu" w ten sposób przełącz się z powrotem na zapis różnicowy (A-B) i poszukaj spontanicznych potencjałów czynnościowych (AP) w śladzie lub podczas głaskania włosów na brzegu małżowiny usznej. Jeśli nie obserwuje się żadnej aktywności (skoków), należy ponownie sprawdzić ścisłe dopasowanie nerwu w elektrodzie rejestrującej i otoczki łącznej w elektrodzie obojętnej – zwykle im ściślejsza (wyższa rezystancja) uszczelka i im bardziej równa impedancja w dwóch elektrodach, tym lepiej. Przy odrobinie wprawy pozwoli to osiągnąć dobrej jakości (>2:1) stosunek sygnału do szumu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestruj elektroneurogram za pomocą interfejsu laboratoryjnego i oprogramowania do elektrofizjologii działającego na komputerze. Wyjście audio impulsowe jest bardzo przydatne i można je osiągnąć, przepuszczając neurogram przez wzmacniacz audio i powiązany głośnik audio. Dostosuj próg tak, aby znajdował się tuż powyżej szumu linii bazowej (identyfikowanego przez brak "syczenia" białego szumu).</li>
	<li>Aby zwiększyć dostęp leku lub fluorescencyjnego barwnika styrylowego do lancetowatych zakończeń, ostrożnie oderwij podskórną warstwę tłuszczową w pobliżu brzegu małżowiny usznej, otwierając okienko o wymiarach ~5 mm x 5 mm, odsłaniając skórę właściwą i podstawę mieszków włosowych (ryc. 1A, B).</li>
	<li>Przypnij z powrotem fałd ~1 mm oczyszczonej z tkanki tłuszczowej skóry ucha na wiodącym brzegu (na poziomie właśnie wytworzonego okienka, jeśli ma to zastosowanie), pozostawiając wyraźną szczelinę wypełnioną solą fizjologiczną między przynależnymi warstwami skóry. Delikatnie pogłaszcz włoski wystające wzdłuż zagiętej krawędzi szpilką lub uziemionymi cienkimi kleszkami, nie dotykając skóry, aby zlokalizować obszar maksymalnego wyjścia AP na oscyloskopie oraz charakterystyczne "kliknięcia" i "trzaski" w wyjściu audio.</li>
</ol>
3. Rejestrowanie potencjałów czynnościowych wywołanych bodźcem
<ol>
	<li>Sondę do stymulacji mechanicznej – polerowane ogniowo szkło z mikroelektrody borokrzemianowej o średnicy 10 cm przymocowane do ceramicznego siłownika piezoelektrycznego – należy ustawić tak, aby ruch był równoległy do fałdu skórnego. Umieść końcówkę około 0,5-1 mm od fałdu skórnego, tak aby dotykała włosów, ale nie skóry. Sprawdź skuteczność stymulacji, powoli przesuwając ręcznie końcówkę sondy, aby odchylić włoski i obserwować/słuchać wybijania.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania można sterować mechaniczną stymulacją 1-3 włosów (np. 3 sekundy przy sinusoidach 5 Hz, co 10 sekund. Przemieszczenie sondy 200-500 μm) i rejestrować reakcje wywołane stymulacją w nerwach.</li>
	<li>Podawaj kilka identycznych ciągów stymulacji mechanicznej w odstępach 10 sekund. Zoptymalizuj pozycję sondy pod kątem powtarzalności, a następnie zmniejsz częstotliwość stymulacji zgodnie z protokołem eksperymentalnym (np. częstotliwość powtarzania kropli z 10 sekund do 30 sekund).</li>
	<li>Użyj oprogramowania do rozróżniania aktywności podobnej do AP, np. za pomocą prostego progu ustawionego na ~2x amplitudę szumów o wysokiej częstotliwości i ~25% największych AP.</li>
	<li>Należy zaliczyć AP przekraczające próg jako "zdarzenia", określając ilościowo częstotliwość i charakterystykę wytwarzanych AP.</li>
</ol>
4. Nagrywanie Wywoływane bodźcem Wypalanie w połączeniu z N-(3-trietyloamoniopropylo)-4-(4-(dibutyloamino)styrylem) Etykietowanie dibromku pirydyny
<ol>
	<li>Aby zbadać wpływ barwników styrylowych na wywołane bodźcem wypalanie aferentne i etykietowanie końcowe, dodaj odpowiednie stężenie wybranego barwnika styrylowego do roztworu do kąpieli i kontynuuj zapis elektryczny.</li>
	<li>Po wymaganym czasie ekspozycji (zwykle co najmniej 30 minut) należy przygotować preparat do oglądania mieszków włosowych. Rozłóż płat skóry, usuwając kołki mocujące, i odsłoń oczyszczony obszar skóry, aby odsłonić etykietę końcową.</li>
	<li>Zmyj zewnętrzny barwnik solą fizjologiczną bez barwnika, dokonując 3 całkowitych podmian soli fizjologicznej.</li>
	<li>Inkubować w końcowej zmianie zagazowanej, bezbarwnej soli fizjologicznej przez 10-15 minut, aby umożliwić wypłukanie najbardziej uporczywych zanieczyszczeń barwnikiem z odsłoniętych/zewnętrznych membran.</li>
	<li>Usunąć niezinternalizowany barwnik pozostający na błonach za pomocą środka sekwestrującego (sulfobutylowana beta-cyklodekstryna, 1 mM, 5 min) w soli fizjologicznej.</li>
	<li>Przenieść komorę zapisu na stolik pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego i sprzęgnąć komorę z mechanizmem ruchu stolika/suwaka.</li>
	<li>Oświetlić preparat światłem wzbudzającym odpowiednim dla barwnika styrylowego. Użyj obiektywu mikroskopu fluorescencyjnego 10X lub 25X, aby obserwować znakowanie mieszków włosowych (ryc. 1).</li>
</ol>

<ol><li>Cahusac, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transient+receptor+potential+%28TRP%29+channel+agonists+and+antagonists+on+slowly+adapting+type+II+mechanoreceptors+in+the+rat+sinus+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Peripher.+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (4), 300-309 (2009).</li>
<li>Fagan, B. M., Cahusac, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+glutamate+receptor+mediated+transmission+at+mechanoreceptors+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin.</a> Neuroreport. 12, 341-347 (2001).</li>
<li>Price, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+sodium+channel+BNC1+is+required+for+normal+touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation.</a> Nature. 407 (6807), 1007-1011 (2000).</li>
<li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo2+is+the+major+transducer+of+mechanical+forces+for+touch+sensation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice.</a> Nature. 516 (7529), 121-125 (2014).</li>
<li>Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+in+the+innervation+of+mystacial+vibrissal+follicle-sinus+complexes+in+the+rat+and+cat%3A+a+confocal+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study.</a> J. Comp. Neurol. 449 (2), 103-119 (2002).</li>
<li>Li, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+organization+of+lanceolate+mechanosensory+complexes+at+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles.</a> eLife. 3, 01901(2014).</li>
<li>Banks, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+modulation+of+synaptic-like+vesicle+recycling+in+mechanosensory+lanceolate+nerve+terminals+of+mammalian+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles.</a> J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).</li>
<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200-203 (1992).</li>
<li>Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+dynamics+in+rat+fast+and+slow+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals.</a> J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).</li>
<li>Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+fluorescent+staining+and+destaining+of+living+vertebrate+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).</li>
<li>Meyers, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+up+the+senses%3A+FM1-43+loading+of+sensory+cells+through+nonselective+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels.</a> J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).</li>
<li>Drew, L. J., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM1-43+is+a+permeant+blocker+of+mechanosensitive+ion+channels+in+sensory+neurons+and+inhibits+behavioural+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli.</a> Molecular Pain. 3 (1), 1(2007).</li>
<li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM1-43+reveals+membrane+recycling+in+adult+inner+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea.</a> J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).</li>
<li>Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+endocytosis+in+outer+hair+cells+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea.</a> Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).</li>
<li>Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autogenic+modulation+of+mechanoreceptor+excitability+by+glutamate+release+from+synaptic-like+vesicles%3A+evidence+from+the+rat+muscle+spindle+primary+sensory+ending%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending.</a> J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).</li>
<li>Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gadolinium+and+FM1-43+as+blockers+of+stretch-evoked+firing+of+rat+muscle+spindle+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Phys.+Soc%22%5BJournal%5D)">Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents.</a> Proc. Phys. Soc. 21 (PC22), (2010).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+cutaneous+low-threshold+mechanosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons.</a> Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opracowaliśmy stosunkowo prosty preparat, który można szybko wypreparować, ma niską gęstość mieszków włosowych i pozwala na stosunkowo selektywną stymulację mechaniczną niewielkiej liczby mieszków włosowych. Jest łatwo dostępny do zapisu elektrofizjologicznego i obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek, w tym reakcji na aplikację barwnika w celu wizualizacji mechanicznie stymulowanych mieszków włosowych, tj. obrazowania mieszków włosowych z określonymi odpowiedziami elektrofizjologicznymi. Chociaż tego nie zrobiliśmy, system ten wydaje się również łatwo podatny na podział nerwu czuciowego na rejestrację pojedynczej jednostki (pojedynczego aksonu czuciowego) i użycie ukierunkowanej ekspresji GFP do wizualizacji morfologii zakończenia czuciowego.
Wykorzystaliśmy preparat do skóry ucha do zbadania charakterystyki internalizacji i uwalniania barwników styrylowo-pridyniowych z membrany fluorescencyjnej7, techniki pierwotnie opracowanej do badania miejscowego recyklingu błony pęcherzykowej w zakończeniach synaptycznych8. W synapsach obrazowanie jest również łatwo łączone z jednoczesnym elektrofizjologicznym zapisem odpowiedzi w zidentyfikowanych końcach8,9. To właśnie w tych wczesnych badaniach po raz pierwszy zauważyliśmy, że barwniki były również internalizowane przez zakończenia mechanosensoryczne10. W przypadku neuronów czuciowych w hodowli i komórkach rzęsatych ślimaka znaczna część znakowania przez barwniki styrylowo-pirydyniowe wydaje się obejmować barwniki przechodzące przez kanały mechanosensoryczne, które następnie blokują11,12. Barwniki następnie znakują błony wewnątrzkomórkowe, a to znakowanie jest nieodwracalne. Jednak w komórkach rzęsatych, które nie są stymulowane mechanicznie13,14 oraz w pełni zróżnicowanych pierwotnych zakończeniach nerwów czuciowych in situ, takich jak zakończenia Ia w wrzecionach mięśniowych15 i w zakończeniach lancetowatychtutaj 7, znakowanie barwnikiem styrylowym wydaje się odzwierciedlać endocytozę błony, ponieważ znakowanie jest odwracalne i nie blokuje odpowiedzi mechanosensorycznych7,15,16. Chociaż nie można całkowicie wykluczyć pewnej internalizacji barwnika przez przenikanie kanału w tych zakończeniach, z ciągłego wypalania podczas inkubacji barwnika i odwracalności znakowania jasno wynika, że zdecydowana większość znakowania w zróżnicowanych końcach in situ odbywa się przez internalizację z recyklingiem błony pęcherzykowej. W związku z tym ta prosta technika jest chętnie stosowana do połączonego elektrycznego i optycznego monitorowania szeregu końcowych funkcji mechanosensorycznych w tkankach ex vivo .
Podobnie jak w przypadku większości technik praktycznych, powtarzalność będzie wymagała powtórzeń i praktyki. Omówione zostaną teraz niektóre z kluczowych punktów, na które warto zwrócić szczególną uwagę. Przez cały czas trwania sekcji i rejestracji należy zmaksymalizować żywotność i przeżycie tkanek, upewniając się, że preparat jest stale napełniony solą fizjologiczną, w pełni nasyconą 95%O2/5%CO2. Upewnij się, że mieszki włosowe nie są przemieszczane podczas tego procesu, co będzie stymulować czuciowe wypalanie końcowe. Albo należy użyć systemu perfuzji z przepływem laminarnym, albo ostrożnie przepuścić gaz przez kąpiel narządową za pomocą cienkich rurki w pewnej odległości od preparatu, albo ostrożnie odświeżać roztwory co 20-30 minut, utrzymując preparat przez cały czas poniżej powierzchni soli fizjologicznej. Elektrody rejestrujące ssanie są wytwarzane przez modyfikację ostrych pipet borokrzemianowych z ostrymi elektrodami, zwykle używanych do rejestracji wewnątrzkomórkowej. Najpierw ostrożnie odłam ostre końcówki kleszczami #3, aby uzyskać odpowiednią średnicę wewnętrzną, aby pasowała do nerwów i wypoleruj ogniem przez bardzo krótkie (<1 sek.) wystawienie na działanie płomienia palnika Bunsena (patrz 2.4 i 2.5). Aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu podczas nagrywania, ważne jest, aby impedancja elektryczna (rezystancja) w tych dwóch elektrodach była zarówno zmaksymalizowana, jak i równa. Zrób to, zwracając uwagę na następujące elementy w dwóch elektrodach. W przypadku elektrody rejestrującej upewnij się, że średnica wewnętrzna jest ściśle dopasowana do nerwu, a maksymalna długość nerwu jest wciągana do elektrody rejestrującej. Spróbuj użyć tkanki łącznej otaczającej nerw, aby skutecznie uszczelnić końcówkę elektrody. Alternatywnie lub dodatkowo narysuj wąski koniec odpowiednio zwężającego się kawałka tkanki tłuszczowej wzdłuż nerwu. Następnie zatkaj końcówkę elektrody, stosując silne ssanie przez ~1 minutę za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml dołączonej do rurki. W przypadku dobrze uszczelnionej końcówki zastosowanie silnego ssania po prostu wzmocni skuteczność korka i nie wciągnie więcej płynu ani nerwów. Aby jednak uniknąć uszkodzenia nerwów, upewnij się, że tkanka łączna amortyzuje nerw przed uciskiem na otaczający materiał i chrząstkę EAM. Obojętna elektroda powinna jak najwierniej naśladować rezystancję/impedancję elektrody nagrywającej. Pomaga w tym staranne polerowanie końcówki do jak najmniejszego otworu bez faktycznego jej uszczelniania. Jeśli potrzebny jest dalszy opór, należy zatkać koniec obojętnej elektrody tłuszczową tkanką łączną, jak opisano powyżej dla elektrody rejestrującej.
Elektroceramika zapewnia znakomitą kontrolę nad przemieszczeniami mechanicznymi, zarówno przestrzennymi, jak i czasowymi. Należy jednak uważać na wykonanie połączeń elektrycznych – wysoka temperatura je niszczy, dlatego nie należy używać gorącego lutu. Użyj kleju epoksydowego z metalem lub użyj specjalistycznego gniazda wtykowego zalecanego przez dostawcę. To zarówno mocno go utrzyma, jak i ustanowi łączność elektryczną. Przymocuj sondę stymulującą szkło do elektroceramiki za pomocą standardowej żywicy epoksydowej. Wypoleruj ogniowo końcówkę standardowej rurki kapilarnej ze szkła borokrzemianowego o średnicy 10 cm x 1,5 mm, używanej do wykonywania łatek lub ostrych elektrod do zapisu elektrofizjologicznego, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia tkanek. Jeśli wymagana jest stymulacja pojedynczych mieszków włosowych, wypoleruj końcówkę, aby pasowała do pojedynczego włosa, i umieść sondę z pojedynczym włoskiem w otwartym otworze. Daje to znakomitą kontrolę nad pojedynczym włosem. W przypadku znakowania barwnikiem styrylowym jest on na ogół bardziej jednorodny w tkankach pochodzących od młodszych zwierząt. Nie jest do końca jasne, dlaczego, ale prawdopodobnie odzwierciedla to mniejszy uraz mechaniczny i skuteczniejsze usuwanie głębokich tkanek z młodszych tkanek. Dokładnie usuń spienioną warstwę przypominającą spieniony polistyren pokrywającą podstawy mieszków włosowych. Unikaj jednak bycia zbyt energicznym, ponieważ grozi to usunięciem warstwy splotu nerwowego i związanych z nią lancetowatych zakończeń. Jeśli reakcja elektryczna na ruch mieszków włosowych jest niewielka lub nie ma jej wcale, a zastosowanie barwnika styrylowego prowadzi do dominującego znakowania gruczołów łojowych (żółto/białego), z wyraźną autofluorescencją podstawy łodygi włosa, a nie lancetowatych końcówek (pomarańczowo-żółtych), zbyt entuzjastyczny klirens uszkodził leżące poniżej tkanki. Wreszcie, użycie środka chelatującego barwnik przed obrazowaniem znacznie poprawia kontrast obrazu i jakość ostatecznych obrazów.
Technika ta może być przydatna w wielu dalszych badaniach. Mogą one obejmować, na przykład, badania przesiewowe w kierunku kanałów mechanosensorycznych odpowiedzialnych za reakcje wywołane rozciąganiem, poprzez inkubację preparatu z farmakologicznymi ligandami selektywnymi dla kanałów kandydujących lub badania przesiewowe linii myszy z takimi kanałami genetycznie usuniętymi. To ostatnie można połączyć z oceną fluorescencyjną wszelkich zmian w morfologii terminala spowodowanych manipulacją genetyczną w liniach myszy, np. z ekspresją GFP sprzężoną z Npy2r17. Ostatnim przykładem może być badanie roli pęcherzyków synaptycznych (SLV)7 w tych lancetowatych zakończeniach poprzez badanie wpływu modulatorów obrotu SLV (Ca, Mg, latrotoksyna, ligandy receptora glutaminianu) na reakcje wywołane rozciąganiem i wychwytywanie/uwalnianie barwnika styrylowego. W ten sposób ta nowa technika otwiera szereg potencjalnie interesujących kierunków badań w neuronauce mechansensorycznej.

Lancetowate zakończenia aksonów czuciowych unerwiające mieszki włosowe u ssaków tworzą palisady wokół nabłonka łodygi włosa. Ich celem jest wykrycie mechanicznego przemieszczenia otaczających je włosów. Są mieszanką szybko i wolno adaptujących się końcówek, które głównie wytwarzają krótkie impulsy aktywności w odpowiedzi na ruch włosów. Aktywność ustaje bardzo szybko, gdy ruch ustaje, nawet w przypadku ciągłego przemieszczenia. W tym miejscu opisano rozwój tego mysiego modelu małżowiny usznej do badań korelacyjnych struktury i funkcji w końcówkach lancetowatych. Małżowina uszna ma wiele korzystnych cech do badania tych zakończeń. Po pierwsze, małżowina uszna to zasadniczo dwie warstwy skóry ułożone tyłem do siebie, z niewielką ilością innej tkanki pomiędzy nimi, która zakłóca dostęp do mieszków włosowych i końcówek. Skóra jest bardzo cienka i łatwa do wypreparowania dzięki minimalnej ilości twardej tkanki łącznej. Unerwienie jest łatwo dostępne i możliwe do zidentyfikowania. Chociaż mieszki włosowe są obecne, są one stosunkowo słabo rozmieszczone, co ułatwia mechaniczną stymulację pojedynczych lub małych grup mieszków włosowych. Cienka warstwa skóry właściwej zapewnia dobry dostęp do zakończeń nerwowych za pomocą leków farmakologicznych i barwników. To sprawia, że są one szczególnie idealne do badań obrazowych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Obrazowanie może odbywać się w żywych terminalach lub po fiksacji i dalszym przetwarzaniu histologicznym.
Reakcje neuronów mechanosensorycznych unerwiających mieszki włosowe były tradycyjnie badane u wibrysów gryzoni1,2 oraz, w mniejszym stopniu, w izolowanych preparatach skórnych3,4. Nauczyły nas one wiele o ogólnych zasadach fizjologii mechanosensorycznej w zakończeniach nerwowych otaczających łodygę włosa. Preparat wibrysalny pozwala na znakomitą kontrolę nad ruchem pojedynczego mieszka włosowego. Jednak rozszyfrowanie danych wyjściowych może być trudne ze względu na ich złożoność, ponieważ pęcherzyki wibrysalne zawierają co najmniej 8 różnych typów anatomicznie odrębnych zakończeń mechanosensorycznych5, a dopasowanie tych typów morfologicznych do określonych reakcji elektrofizjologicznych jest nadal kwestią sporną. Preparat na skórę myszy / nerw odpiszczelowy jest najczęściej stosowany w stanie depilacji do badania reakcji na dotyk i ból. Unerwienie mieszków włosowych w takim preparacie jest mniej złożone, ale gęstość mieszków włosowych oraz obecność trzech różnych typów mieszków włosowych (włosy ochronne, szydło/auchene i zygzakowate) w tak bliskiej odległości6, oznacza, że badanie specyficznych reakcji pojedynczego mieszka włosowego lub pojedynczego rodzaju zakończenia jest ponownie wyzwaniem. Co więcej, przygotowanie to obejmuje złożoną sekcję. Wreszcie, zarówno w przypadku preparatów wibrysalnych, jak i innych preparatów skórnych, trudno jest uwidocznić zaangażowane zakończenia, gdy preparaty ex vivo są jeszcze żywe. W związku z tym cięcie tkanek jest wymagane nawet w liniach myszy wykazujących ekspresję GFP. Alternatywnie wymaga dalszego przetwarzania histologicznego/immunologicznego, takiego jak utrwalenie i/lub inkubacja przeciwciał w celu immunofluorescencji.
Dlatego opracowaliśmy preparat małżowiny usznej i użyliśmy go do wykonania zapisów elektrycznych z ograniczonej populacji aferentów mieszków włosowych i wykazaliśmy, że w tych lancetowatych końcach zachodzi cykl błonowy, o czym świadczy pobieranie barwników styrylowo-pirydynowych. Na koniec wykazaliśmy, że barwnik nie zakłóca wrażliwości mechanicznej, co wskazuje, że nie blokuje kanałów mechanotransdukcji. Przedstawiono wyniki prostych protokołów stymulacji i analizy.

<table><tbody><tr><td>PDMS - Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Elastyczny, obojętny, półprzezroczysty stały polimer silikonowy.</td></tr><tr><td>Nr 3 Kleszcze Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Austerlitz Szpilki do owadów</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Bardzo cienkie szpilki do bezpiecznego mocowania preparatu małżowiny usznej do PDMS przy minimalnym uszkodzeniu.</td></tr><tr><td>Przedwzmacniacz różnicowy AC</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL104A</td><td>Wzmacnianie wielkości przychodzącego elektroneurogramu aferentnego. Zapis różnicowy minimalizuje zewnętrzny szum elektryczny i dryft linii bazowej.&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtr górno/dolnoprzepustowy</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL125</td><td>Kondycjonowanie sygnału, poprzez redukcję zewnętrznego szumu elektrycznego w celu zapewnienia najlepszego stosunku sygnału do szumu.</td></tr><tr><td>Spike Trigger</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL201</td><td>Ustawia próg detektora zdarzeń i wyświetla go na oscyloskopie. Pokazuje to skuteczność wykrywania potencjału czynnościowego.&nbsp;</td></tr><tr><td>Wzmacniacz audio i głośniki</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL120S</td><td>Przydatne monitorowanie dźwięku pod kątem obecności elektrycznego odpalania końcówek sensorycznych podczas regulacji przygotowania stymulacji mechanicznej w dół mikroskopu&nbsp;</td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>Digitimer</td><td>PM3380A</td><td>Używamy tego starego modelu, ale wystarczy dowolny standardowy oscyloskop.</td></tr><tr><td>Piezo electroceramic&nbsp; wafel</td><td>Morgan Electroceramics, Southampton UK</td><td>PZT507</td><td>Elektrofizjologia/interfejs komputerowy</td></tr><tr><td>Elektroceramika piezoelektryczna&nbsp; zasilacz</td><td>Domowe</td><td></td><td>wyjście 0-200 V DC do napędzania przemieszczenia płytki ceramicznej, ze zmiennym elektronicznym sterowaniem wyjściem za pomocą oprogramowania do nagrywania/stymulacji i interfejsu komputerowego. Korzystamy z oprogramowania Spike2 oraz interfejsu komputerowego 1401micro.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do elektrofizjologii</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>Spike2 v7</td><td>Oprogramowanie do rejestracji, stymulacji i analizy danych w elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Interfejs laboratoryjny</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>1401 micro</td><td>Electrophysiology interface, między wzmacniaczem/filtrami a komputerem. Wprowadza elektroneurogram, a także napędza ruch elektroceramiczny.</td></tr><tr><td>FM1-43/Synaptogreen C4</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70020</td><td>Sonda z membraną fluorescencyjną, która odwracalnie dzieli się na zewnętrzną płatek błon komórkowych. Stosowany głównie do monitorowania endo-/egzocytozy błony pęcherzykowej.</td></tr><tr><td>Advasep 7</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70029</td><td>sulfonowana pochodna b-cyklodekstryny, która chelatuje FM1-43 (i inne barwniki styrylowo-pirydynowe) z odsłoniętych błon, pozostawiając zinternalizowany barwnik wyraźniej widoczny poprzez obniżenie znakowania tła/fluorescencji.</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Monochromatyczna, chłodzona kamera CCD - model podstawowy</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu 3D Volocity</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Oprogramowanie do przechwytywania i analizy obrazu.</td></tr></tbody></table>

połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych myszy

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

Opisano nowatorską technikę preparacji i rejestracji do monitorowania odpalania aferentnego wywołanego mechanicznym przemieszczeniem włosów w małżowinie usznej myszy. Technika ta jest bardzo opłacalna i łatwa do wykonania przy użyciu materiałów powszechnie spotykanych w większości laboratoriów elektrofizjologicznych lub łatwych do zakupu. Preparacja jest prosta i szybka, a przemieszczenie mechaniczne zapewnia ogólna płytka elektroceramiczna kontrolowana przez zastrzeżone oprogramowanie. To samo oprogramowanie rejestruje i analizuje również wyniki elektroneurogramu. Rejestracja wywołanej aktywności nerwów odbywa się za pomocą komercyjnego wzmacniacza różnicowego podłączonego do polerowanych ogniowo standardowych mikroelektrod szklanych. Podano pomocne wskazówki dotyczące poprawy jakości preparatu, stymulacji i warunków nagrywania, aby zoptymalizować jakość nagrywania. System nadaje się do oznaczania właściwości elektrofizjologicznych i optycznych lancetowatych końcówek palisadowych zakończeń mieszków włosowych, a także wyników ich farmakologicznej i/lub genetycznej manipulacji. Podano przykład połączenia zapisu elektrycznego ze stymulacją mechaniczną i znakowaniem barwnikiem styrylowo-pirydynowym witalnym.

Układ do rejestracji elektrofizjologicznej, z usuniętą podskórną tkanką tłuszczową w celu odsłonięcia mieszków włosowych, przedstawiono na Rycina 1AFragment tego odsłoniętego obszaru przedstawiono w większym powiększeniu w oświetleniu w polu jasnym w Rycina 1BZagięcie brzegu małżowiny usznej do góry i do tyłu w tym obszarze odsłania powierzchnię naskórka. Dzięki temu włosy znajdujące się na krawędzi zagięcia wystają poziomo, co stwarza idealne warunki do stymulacji mechanicznej za pomocą tępej sondy (nie pokazano). Rysunek 1C wykazuje, że po ekspozycji na barwnik i ponownym przywróceniu brzegu do pozycji rozłożonej, stymulowane mieszki w tym miejscu zostały oznakowane barwnikiem styrylo-pirydyniowym. Elektroneurogramy z preparatów zazwyczaj wykazują ciągłą aktywność potencjałów czynnościowych (AP) nawet w przypadku braku wymuszonego ruchu sondy z włókna szklanego, w tym potencjały czynnościowe o największej amplitudzie (Rysunek 2Ai-iii). Aktywność występuje z częstotliwością około 10–20 impulsów/s (ślad „spikes”), nie wykazując struktury ani oznak toniczności, ponieważ autokorelacja odstępów między okresami stymulacji jest niemal płaska. Podczas stymulacji 5 Hz, 100 µm mechaniczna stymulacja łodyg włosa sprawia, że całkowita liczba impulsów zazwyczaj wzrasta do 20–50 impulsów/s lub 4–10 na cykl sinusoidalny. Konstrukcja histogramów cykli wykazuje następnie silne dostrojenie (tzw. „blokadę fazową”) odpowiedzi (Rysunek 2Bi-iii)). Jest to proces wysoce powtarzalny, choć faza przebiegu fali, z którą zsynchronizowane są odpowiedzi, zależy od ich położenia, t. j. w którym punkcie ruchu wibrująca sonda styka się z włosem. Prosta detekcja progu (linia pozioma przecinająca ślady neurogramu w A(i-iiiDo niniejszej analizy wykorzystano )). Funkcjonalność oprogramowania rejestrującego można jednak często wykorzystać w bardziej zaawansowany sposób, aby rozróżnić cechy wielkości i kształtu potencjałów czynnościowych (spike'ów). Pozwala to na wyizolowanie odpowiedzi konkretnych włókien doprowadzających na podstawie tych charakterystyk, co umożliwia przeprowadzenie analizy pseudo-pojedynczych jednostek (pseudo-single-unit recording).
<img alt="Schemat neuroanatomiczny z elektrodami, tkanką tłuszczową i znakowanymi zakończeniami nerwowymi, mikroskopia." src="/files/ftp_upload/53854/53854fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Układ rejestracji elektrofizjologicznej i znakowanie lancetowatych zakończeń aferentnych mieszków włosowych za pomocą dibromku N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino) styryl) pirydynium. (A) Przygotowanie małżowiny usznej do eksperymentu elektrofizjologicznego, przedstawiające orientację małżowiny, położenie nerwów, elektrody rejestrujące oraz odsłonięty obszar unerwienia mieszków po usunięciu tkanki tłuszczowej. (B) W oświetleniu w polu jasnym widocznych jest kilka mieszków włosowych w obszarze oczyszczonym z nadkładającej tkanki tłuszczowej aż do skóry właściwej. Ciemne, zazwyczaj dwuklatkowe kształty to gruczoły łojowe. (C) Powiększony widok obszaru zaznaczonego ramką w B), pokazujący dwa zakończenia lancetowate znakowane barwnikiem styrylowym dibromkiem N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino) styryl) pirydynium, obrazowane za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej po stymulacji mechanicznej. Z7, za zgodą autora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Dane neurogramu, histogramy liczby impulsów i wykresy przemieszczenia do analizy aktywności neuronalnej." src="/files/ftp_upload/53854/53854fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: (A) Aktywność wywołana bodźcem zarejestrowana z małżowiny usznej myszy. (Ai-iii) Przykłady aktywności z ciągłych neurogramów z małżowin usznych w standardowym roztworze soli Lileya, pochodzące z 3 różnych eksperymentów. Każdy zapis przedstawia 5 s odcinek około 5 min po rozpoczęciu rejestracji, obejmujący 3 s okres sinusoidalnego przemieszczania niewielkiej liczby trzonów włosów. Stymulacja mechaniczna była powtarzana co 30 s przez cały czas ciągłego zapisu, który zazwyczaj trwał 1-2 h. Specjalne pliki skryptów oznaczały poszczególne zdarzenia przekraczające próg ustawiony przez kursor poziomy (impulsy), a także początek każdego cyklu sinusoidalnego (okres). (Aiv) Sygnał sterujący sinusoidalnym przemieszczeniem. (B) Analiza aktywności impulsowej wywołanej bodźcem. (Bi-iii) Histogramy cykli w przedziałach 3°, sporządzone odpowiednio z próbek neurogramów (Ai-iii), pokazujące odpowiedzi domniemanego zakończenia lancetowatego na stymulację mechaniczną poprzez sinusoidalne przemieszczenie trzonów włosów przez szklaną sondę z częstotliwością 5 Hz. Należy zwrócić uwagę na wyraźne blokowanie fazowe w różnych fazach cyklu, w zależności od ich położenia względem pozycji początkowej sondy mechanicznej. (Biv) Znormalizowana sinusoida przemieszczenia sondy; rzeczywista amplituda wynosiła około 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Przedstawiono prostą i nowatorską technikę rejestrowania wyładowań doprowadzających z powodu mechanicznej stymulacji lancetowatych końcówek końcówek palisadowych, unerwiających mysie, skóry uszu, mieszków włosowych.

Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych myszy

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie szybkiej i prostej metody łączącej obrazowanie żywych komórek z rejestracją elektrofizjologiczną w terminalach neuronów, które są wyjątkowo trudne do zaadresowania i wrażliwe mechanicznie. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych pytań dotyczących mechanosensoryki, takich jak rola pęcherzyków przypominających synaptyczne lub farmakologia potencjalnych kanałów mechanotransdukcyjnych w pełnie zróżnicowanych terminalach in situ.Główną zaletą tej techniki jest jej prostota, która mimo to zapewnia wizualny dostęp do w pełni zróżnicowanych zakończeń nerwowych do badań fizjologicznych. Chociaż metoda ta koncentruje się na aferentności mieszków włosowych, może ona również dostarczyć informacji na temat innych mechanosensorycznych układów o niskim progu pobudzenia, takich jak wrzeciona mięśniowe, zakończenia sensoryczne Merkla oraz baroreceptory. Zastosowania tej techniki rozszerzają się na opracowywanie nowych celów terapeutycznych w celu regulacji czujników mechanicznych, w tym terapii nieprawidłowej regulacji ciśnienia krwi.Po dekapitacji młodej dorosłej myszy, umieść głowę stroną grzbietową do góry w napowietrzonym roztworze Lileya, w naczyniu o szerokości dna 50 centymetrów, pod stereomikroskopem sekcyjnym. Co około 10 minut dokładnie płucz obszar sekcji silanem w gazie. Następnie, ostrożnie naciśnij i oddziel skórę u podstawy małżowiny usznej, używając sprężynowych nożyczek łukowych oraz pęsety numer trzy.Odsłoń unerwienie oraz chrząstkę przewodu słuchowego zewnętrznego. Zidentyfikuj gałęzie gałęzi żuchwowej nerwu trójdzielnego oraz nerwów małżowinowych, które wyłaniają się z czaszki w szczelinie stawu żuchwowego. Te dwie gałęzie nerwowe przechodzą przez chrząstkę, aby unerwić wklęsłe i wypukłe powierzchnie skóry małżowiny usznej.Następnie, w bruździe między żuchwą a wyrostkiem sutkowatym, zidentyfikuj miejsce wyjścia gałęzi nerwu trójdzielnego. Odsłoń ich przebieg, delikatnie odsuwając małżowinę uszną od czaszki. Po odsłonięciu przetnij nerwy jak najbliżej czaszki.Następnie, używając nożyczek sprężynowych, odetnij małżowinę uszną od głowy. Unikaj przecinania dystalnych kikutów podzielonych nerwów i zminimalizuj ilość gęstej sierści. Przenieś małżowinę uszną do naczynia wyłożonego gumą silikonową, wypełnionego napowietrzonym roztworem Lileya.Następnie otwórz przewód słuchowy zewnętrzny, przecinając go w jego najwęższym punkcie. Następnie spłaszcz małżowinę uszną stroną wklęsłą do dołu i przypnij tę stronę wzdłuż krawędzi za pomocą regularnie rozmieszczonych, bardzo cienkich szpilek entomologicznych. Następnie całkowicie usuń odsłoniętą skórę grzbietową z małżowiny oraz leżącej pod nią chrząstki, stosując rozcięcie tępe za pomocą nożyczek.W tym kroku należy uważać, aby nie uszkodzić skóry przedniej. Następnie, używając pęsety, chwyć cienką szpilkę entomologiczną i delikatnie rozciągnij przecięte gałęzie części żuchwowej, które wyłaniają się z tyłu pomiędzy skórą a chrząstką zewnętrznego przewodu słuchowego. Przymocuj te gałęzie nerwowe do płytki za pomocą najcieńszych możliwych szpilek.Nabijamy tkankę łączną, łącząc ich odcięte końce, a nie same fragmenty nerwu. Przygotowanie tkanki należy zakończyć poprzez usunięcie większości otaczającej tkanki łącznej z okolic odgałęzień nerwowych, unikając jednak uszkodzenia nerwów poprzez nadmierne ciągnięcie lub wycinanie. Aby potraktować mechanoreceptory mieszków włosowych barwnikami witalnymi lub lekami, należy ostrożnie oddzielić pianowatą chrząstkę włóknistoolastyczną podskórnej warstwy tłuszczowej wzdłuż pięciu milimetrów brzegu małżowiny usznej.W związku z tym należy wyciąć kwadratowe okno, odsłaniając skórę właściwą i podstawę mieszków włosowych. Użycie młodego myszy minimalizuje przyleganie przedniej i tylnej warstwy skóry oraz utrudnienia związane z usuwaniem leżącej poniżej chrząstki. Oba te czynniki zwiększają prawdopodobieństwo uzyskania poprawnego barwienia.Zacznij od przeniesienia preparatu na wyłożone silikonem dno komory rejestracyjnej. Używając cienkich szpilek entomologicznych, przymocuj ucho wzdłuż krawędzi, umieszczając odsłonięte nerwy u podstawy ucha w pobliżu dwóch elektrod ssących. Jedna służy do rejestracji, a druga, elektroda obojętna, dostarcza sygnału neutralnego do wzmacniacza różnicowego.W przypadku elektrody rejestrującej należy starannie dopasować otwór i średnicę wewnętrzną otworu do grubości nerwu wybranego do rejestracji. Po wykonaniu tej czynności parametr ten zazwyczaj pozostaje stały dla całej serii eksperymentów. Odpowiedni odcinek nerwu musi ściśle przylegać wewnątrz elektrody.Aby wciągnąć nerw do elektrody, należy zastosować delikatne ssanie za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml, podłączonej za pomocą rurki silikonowej. W elektrodzie rejestrującej należy upewnić się, że nerwy są proste i nie są zagięte ani zwinięte, delikatnie wycofując i ponownie wsuwając nerw za pomocą cienkiej szpilki entomologicznej podczas ssania. Następnie należy wciągnąć nieco otaczającej tkanki łącznej lub miękką, plastyczną tkanką tłuszczową, aby utworzyć w otworze elektrody szczelne zamknięcie.Opracowanie zrównoważonej impedancji między elektrodami jest niezbędne dla wysokiej jakości rejestracji różnicowej. Kluczowe w tym procesie jest stworzenie szczelnego, wodoodpornego uszczelnienia o wysokiej rezystancji wokół nerwu. Następnie, jeśli nie wypełniła się ona samoistnie w wyniku działania kapilarnego, należy wypełnić elektrodę obojętną solą fizjologiczną metodą zasysania.Następnie należy umieścić identyczne srebrne druty rejestrujące w wewnętrznych otworach elektrod rejestrującej i obojętnej. Z drugiej strony druty powinny zostać podłączone do oddzielnych rdzeni dwurdzeniowego kabla ekranowanego. Należy upewnić się, że drut w elektrodzie rejestrującej styka się z roztworem soli fizjologicznej i znajduje się blisko nerwu, nie naruszając przy tym szczelności.Wprowadź przewód do końcówki elektrody pomocniczej. Następnie umieść elektrodę odniesienia, w postaci peletu srebrowo-chlorkowego, w kąpieli. Podłącz tę elektrodę do ekranu dwurdzeniowego kabla połączonego z elektrodą rejestrującą.Wyświetl ich poszczególne sygnały na oscyloskopie, aby sprawdzić, czy poziomy szumów elektrycznych w obu kanałach są podobne. Spontaniczne potencjały czynnościowe w elektrodzie rejestrującej mogą nie być widoczne do momentu zrównoważenia obu elektrod. Aby skorygować różnice w szumie tła, zwiększ impedancję jednego z kanałów, wciągając więcej tkanki łącznej tłuszczowej do wnętrza elektrody.Gdy tło elektrod zostanie wyrównane, należy przełączyć urządzenie na rejestrację różnicową i poszukiwać spontanicznych potencjałów czynnościowych lub wywołać je, pocierając włosy na brzegu małżowiny usznej wypolerowaną ogniowo szklaną rurką. Następnie należy zarejestrować elektroneurogram za pomocą interfejsu komputerowego. Neurogram należy przekazać do systemu nagłaśniającego, aby impulsy były słyszalne tuż powyżej poziomu szumów tła.Ten przekaźnik informacji zwrotnej słuchowej jest bardzo przydatny podczas przeprowadzania eksperymentów. Następnie, poprzez manualną stymulację włosów, potwierdź, że unerwienie mieszków w pobliżu oczyszczonego obszaru jest nienaruszone. Teraz odwiń od jednego do dwóch milimetrów brzegu skóry ucha na poziomie oczyszczonego okna w tkance tłuszczowej, aby odsłonić znajdujące się pod spodem włosy.Pozostaw wypełnioną solą fizjologiczną szczelinę między przeciwstawnymi warstwami skóry. Słuchając uważnie, delikatnie pogłaszcz szklaną rurką włosy wystające wzdłuż zgiętej krawędzi. Nie dotykaj skóry.W razie potrzeby należy sprawdzić oscyloskop, aby ocenić sygnał wyjściowy. W celu kontrolowanego rejestrowania potencjałów czynnościowych wywołanych bodźcem należy użyć mechanicznej sondy z dziesięciocentymetrowego szkła borokrzemowego do mikroelektrod, wypolerowanego ogniowo, przymocowanej do ceramicznego aktuatora piezoelektrycznego. Sonda powinna być ustawiona tak, aby poruszała się równolegle do fałdu skóry i dotykała włosów, a nie skóry.Umieść go około pół milimetra do jednego milimetra nad powierzchnią skóry. Następnie ręcznie zweryfikuj stymulację, nasłuchując sygnału dźwiękowego podczas ruchu sondy. Teraz skonfiguruj oprogramowanie, aby sterować mechaniczną stymulacją niewielkiego obszaru włosów.Na przykład zaprogramuj trzy symulacje trwające po dwie sekundy z sinusoidami o częstotliwości 5 Hz w odstępach dziesięciu sekund. Wymaga to przesunięcia sondy w zakresie od 200 do 2 000 mikronów. Następnie zastosuj powtarzalną stymulację automatyczną, aby sprawdzić spójność zarejestrowanych odpowiedzi w nerwach.Powinno być możliwe uzyskanie powtarzalnych wyników. Gdy wyniki będą spójne, należy zmniejszyć częstotliwość powtórzeń do co 30 sekund. Dalsze instrukcje znajdują się w protokole tekstowym.Aby zbadać właściwości kanałów mechanosensorycznych i oznakować zakończenia mechanosensoryczne wokół mieszków włosowych, należy dodać 10 µM FM1-43 do roztworu i pozostawić na 60 minut, kontynuując stymulację włosów za pomocą oscylującej sondy. Barwnik ten blokuje potencjalne kanały transdukcyjne oraz neurony sensoryczne w hodowlach oraz w komórkach rzęsek ślimaka.Nie blokuje ono jednak wyładowań w dojrzałych włóknach doprowadzających mieszków włosowych in situ. Barwienie zakończeń wykazuje, że barwnik dociera do terminali, które nadal reagują na stymulację mechaniczną przez cały czas ekspozycji na barwnik. Elektroneurogramy wykonane zgodnie z opisanym protokołem zazwyczaj wykazywały utrzymującą się aktywność potencjałów czynnościowych nawet w przypadku braku stymulacji manualnej, w tym potencjały czynnościowe o największej amplitudzie.Aktywność spontaniczna występowała z częstotliwością około 10-20 impulsów na sekundę, nie wykazując żadnej struktury ani oznak toniczności. Autokorelacja odstępów między okresami stymulacji była zawsze dość płaska. Podczas mechanicznej stymulacji trzonów włosów z częstotliwością 5 Hz i amplitudą 500 µm ogólna aktywność zazwyczaj wzrastała do około 50 impulsów na sekundę.Konstrukcja histogramów cykli wykazała silną synchronizację odpowiedzi, z czterema do dziesięciu impulsami na cykl sinusoidalny. Było to dość powtarzalne; oczywiście faza przebiegu, do której zablokowane były odpowiedzi, zależała od miejsca kontaktu wibrującej sondy z włosem oraz kierunku jej ruchu w tym punkcie. Następnie zbadano farmakologię kanałów w lancetowatych zakończeniach nerwowych mieszków włosowych.Kanały nadal reagowały nawet po ekspozycji na FM1-43, który może blokować niektóre kanały mechanosensoryczne, takie jak te w neuronach sensorycznych w kulturze lub w komórkach rzęsistych ślimaka ex vivo. Po opanowaniu techniki, przygotowanie do rozpoczęcia rejestracji elektroneurogramów może zająć od 60 do 90 minut. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest uzyskanie wysokiej rezystancji kontaktu elektrycznego na elektrodach, a w przypadku łączenia metody z wizualizacją mieszków, należy użyć małych myszy, aby poprawić penetrację barwnika i przejrzystość optyczną.Koncepcję tej metody zaadaptowaliśmy z pomysłu opracowanego pierwotnie przez naszego bliskiego współpracownika, obecnie emerytowanego profesora Clarke'a Slatera oraz jego studenta studiów magisterskich Nakula Kaina, gdy poinformowaliśmy ich o możliwej roli pęcherzyków synaptoopodobnych w mechanosensoryce wrzecionek mięśniowych oraz o potrzebie opracowania lepszej metody ich wizualizacji przy użyciu FM1-43. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić badania z wykorzystaniem takich metod jak farmakologia i znakowanie barwnikami witalnymi, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące tego, które kanały są mechanotransduktorami i które terminale są zróżnicowane in situ, a także czy stymulacja mechaniczna może modulować pobieranie i uwalnianie barwnika poprzez regulację recyklingu pęcherzyków synaptoopodobnych. Należy pamiętać, że toksyczność FM1-43 nie została oceniona i należy go traktować jako substancję niebezpieczną.

combined-recording-mechanically-stimulated-afferent-output-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestracje metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell z dendrytów włókien nerwu słuchowego w obrębie synaps wstążkowych komórek rzęskowych wewnętrznych w ślimaku ssaków.

Rejestracje postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęskowymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstążkowej

Ten film demonstruje połączone nagrywanie mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych małżowiny usznej myszy. Przedstawiono w nim etapy mechanicznej stymulacji zakończeń nerwowych mieszków włosowych przed i po ekspozycji na barwnik z membrany fluorescencyjnej, elektrofizjologię rejestrującą generowane potencjały czynnościowe oraz wizualizację znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych.

Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych myszy

Ten film demonstruje protokół stymulacji korzenia nerwu słuchowego i rejestrowania prądów postsynaptycznych w przyśrodkowych neuronach olivocochlear w wycinkach klina mózgu myszy.

Stymulacja korzeni nerwów słuchowych i nagrania prądu postsynaptycznego w klinie mózgu myszy

Skóra ssaków zawiera różnorodny wachlarz struktur - takich jak mieszki włosowe i zakończenia nerwowe - które wykazują charakterystyczne wzorce organizacji przestrzennej. Analiza skóry jako płaskiego mocowania wykorzystuje dwuwymiarową geometrię tej tkanki do tworzenia pełnowymiarowych obrazów struktur skóry o wysokiej rozdzielczości.

Obrazowanie skóry myszy metodą flat mount i jego zastosowanie do analizy wzorca mieszków włosowych i morfologii aksonów czuciowych

Neurony czuciowe mięśni są zaangażowane w sygnalizację proprioceptorową, a także informują o stanie metabolicznym i zdarzeniach związanych z urazami. Opisujemy preparat mięśniowo-nerwowy dorosłej myszy in vitro do badań nad mięśniami aferentnymi aktywowanymi rozciąganiem.

Preparat mięśniowo-nerwowy dorosłej myszy in vitro do badania właściwości wypalania aferentów mięśniowych

Ten film demonstruje protokół przeprowadzania jednowłóknistych zapisów elektrofizjologicznych na preparacie in vitro mysiego nerwu jelita grubego.

Metody in vitro Charakterystyka funkcjonalna zakończeń aferentnych jelita grubego myszy

Tutaj opisujemy nowatorskie przygotowanie do obrazowania żywych lancetowatych końcówek czuciowych końcówek palisadowych, które unerwiają mieszki włosowe skóry uszu myszy podczas barwienia i odbarwiania barwnikami styrylowo-pirydyniowymi.

Monitorowanie optyczne znakowania żywych zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych skóry ucha myszy ex vivo

Ten protokół opisuje metody rejestrowania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u pourodzonych szczurzych szczeniąt. Aby zbadać rozwój funkcjonalny zewnętrznych komórek rzęsatych, opisano krok po kroku eksperymentalną procedurę rejestracji klamry krosowej całej komórki w izolowanych zewnętrznych komórkach rzęsatych.

Rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu

Opracowaliśmy technikę, która jednocześnie rejestruje zarówno elektrokortykografię, jak i lokalne potencjały pola w odpowiedzi na nocyceptywne bodźce laserowe od swobodnie poruszających się szczurów. Technika ta pomaga ustalić bezpośredni związek sygnałów elektrokorowych na poziomie mezoskopowym i makroskopowym, co ułatwia badanie nocyceptywnego przetwarzania informacji w mózgu.

Jednoczesne zapisy lokalnych potencjałów pola korowego i elektrokortykogramy w odpowiedzi na nocyceptywne bodźce laserowe od swobodnie poruszających się szczurów

Zapis jednowłóknisty to skuteczna technika elektrofizjologiczna, która ma zastosowanie do ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Wraz z przygotowaniem nienaruszonego DRG z przyczepionym nerwem kulszowym badany jest mechanizm niewydolności przewodzenia. Oba protokoły poprawiają zrozumienie związku obwodowego układu nerwowego z bólem.

Zastosowanie zapisu pojedynczego włókna in vivo i nienaruszonego zwoju korzenia grzbietowego z przyczepionym nerwem kulszowym w celu zbadania mechanizmu uszkodzenia przewodzenia

Badanie to przedstawia podejście in vivo do obrazowania dwufotonowego do wizualizacji struktur niskoprogowych zakończeń aksonów mechanoreceptorów (LTMR) w skórze przedniej łapy myszy. Wykorzystując powtarzalne, wysokorozdzielcze obrazowanie poszczególnych aksonów, metoda ta stanowi nową platformę do badania struktury i funkcji skórnego obwodu czuciowego podczas rozwoju oraz u dorosłych.

Dwufotonowe obrazowanie wewnątrzżyciowe morfologii aksonów dotykowych u skóry myszy

Poznaj metodę łączenia zapisu elektrofizjologicznego z obrazowaniem komórkowym w mechanosensorycznych zakończeniach nerwowych mieszków włosowych myszy. Technika umożliwia wizualizację i badanie farmakologii kanałów mechanotransdukcji in situ.

Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych myszy (Wideo) | JoVE Journal

Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych myszy

Przeglądaj więcej filmów