Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych myszy

Przedstawiono prostą i nowatorską technikę rejestrowania wyładowań doprowadzających z powodu mechanicznej stymulacji lancetowatych końcówek końcówek palisadowych, unerwiających mysie, skóry uszu, mieszków włosowych.

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie szybkiej i prostej metody łączenia obrazowania żywych komórek i zapisu elektrofizjologicznego w notorycznie trudno dostępnych, wrażliwych mechanicznie zakończeniach neuronów. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące mechanosensacji. Takich jak rola pęcherzyków synaptycznych lub farmakologia potencjalnych kanałów mechanoprzetworników w całkowicie zróżnicowanych zakończeniach, in situ.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest tak prosta, a jednocześnie daje wizualny dostęp do w pełni zróżnicowanych końcówek do badań fizjologicznych. Chociaż metoda ta koncentruje się na aferencji mieszków włosowych, może również dać wgląd w inne systemy mechanosensoryczne o niższym progu, takie jak wrzeciona mięśniowe, zakończenia czuciowe Merkla i baroreceptory. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku opracowania nowych celów leków do regulacji czujników mechanicznych, w tym terapii nieprawidłowej regulacji ciśnienia krwi.

Po odcięciu głowy młodej dorosłej myszy, umieść głowę grzbietem do góry, w zagazowanym roztworze Lileya, w dolnym naczyniu o szerokości 50 centymetrów, pod stereoskopowym mirkoskopem preparacyjnym. Mniej więcej co 10 minut dokładnie spłukiwać obszar sekcji silanem gazowym. Teraz ostrożnie naciąć i oddzielić skórę u podstawy małżowiny usznej za pomocą nożyczek do łuków sprężynowych i kleszczy numer trzy.

Odsłoń unerwienie i chrząstkę zewnętrznego przewodu słuchowego. Zidentyfikuj gałęzie podziału żuchwy nerwu trójdzielnego i wielkiego nerwu usznego, gdy wyłaniają się z czaszki w szczelinie stawu żuchwowego. Te dwie gałęzie nerwowe wystają przez chrząstkę, aby unerwić wklęsłe i wypukłe aspekty skóry małżowiny usznej.

Następnie w zagajniku między szczęką a wyrostkiem sutkowatym zidentyfikuj, gdzie wychodzą gałęzie nerwu trójdzielnego. Odsłoń ich długość, delikatnie odciągając małżowinę uszną od czaszki. Po odsłonięciu w ten sposób przetnij nerwy jak najbliżej czaszki.

Następnie użyj nożyczek do łuków sprężynowych, aby usunąć małżowinę uszną z głowy. Unikaj przycinania dystalnych kikutów podzielonych nerwów i zminimalizuj ilość gęstych włosów. Przenieś małżowinę uszną do naczynia wyłożonego gumą silikonową wypełnionego zagazowanym roztworem Lileya.

Teraz otwórz zewnętrzny przewód słuchowy, dzieląc go w najwęższym miejscu. Następnie spłaszcz małżowinę uszną wklęsłą stroną do dołu i przypnij tę stronę wzdłuż brzegów za pomocą regularnie rozmieszczonych, bardzo drobnych szpilek na owady. Następnie całkowicie usuń odsłoniętą skórę grzbietową z małżowiny usznej i dolnej chrząstki poprzez rozwarstwienie za pomocą nożyczek.

Na tym etapie nie uszkadzaj przedniej części skóry. Następnie za pomocą kleszczy chwyć cienką szpilkę do owadów i delikatnie rozciągnij przecięte gałęzie podziału żuchwy, które wyłaniają się z tyłu między skórą a zewnętrzną chrząstką przewodu słuchowego. Przymocuj te gałęzie nerwowe do płytki za pomocą najdrobniejszych możliwych szpilek.

Przebijając tkankę łączną, przylegając do ich odciętych końców, a nie samych kawałków nerwów. Uzupełnij przygotowanie tkanki, usuwając większość otaczającej tkanki łącznej z okolic gałęzi nerwowych, ale nie uszkadzaj nerwów nadmiernym ciągnięciem lub przecinaniem. Aby potraktować zakończenia mechanosensoryczne mieszków włosowych za pomocą niezbędnych barwników lub leków, ostrożnie oderwij pienistą włóknistą chrząstkę podskórnej warstwy tłuszczowej wzdłuż pięciu milimetrów brzegu małżowiny usznej.

W ten sposób otwórz kwadratowe okno, odsłaniając skórę właściwą i podstawę mieszków włosowych. Użycie młodej myszy minimalizuje zrost między przednią i tylną warstwą skóry oraz trudność w usunięciu leżącej pod spodem chrząstki. Oba te czynniki zwiększają prawdopodobieństwo udanego barwienia.

Polega na przeniesieniu preparatu na wyłożoną silikonem podstawę komory nagraniowej. Za pomocą cienkich szpilek przeciw owadom zabezpiecz ucho wokół krawędzi, umieszczając czyste nerwy podstawy ucha w pobliżu dwóch elektrod ssących. Jedna do nagrywania, a druga do obojętnej elektrody, która dostarcza neutralny sygnał do wzmacniacza różnicowego.

W przypadku elektrody rejestrującej ostrożnie dopasuj aperturę i wewnętrzną średnicę otworu do grubości nerwu wybranego do nagrywania. Po wykonaniu tej czynności będzie to zwykle stałe dla każdej serii eksperymentów. Dobra długość nerwu musi ściśle przylegać do środka.

Aby wciągnąć nerw do elektrody, użyj delikatnego ssania z dwumililitrowej strzykawki, przymocowanej za pomocą silikonowej rurki. W elektrodzie rejestrującej upewnij się, że nerwy są proste i nie są złożone ani podwojone, delikatnie wyjmując i ponownie wkładając nerw cienką szpilką do owadów podczas ssania. Teraz zassaj otaczającą tkankę łączną lub miękką, giętką tkankę tłuszczową, aby utworzyć wodoszczelne uszczelnienie w otworze elektrody.

Uzyskanie zrównoważonej impedancji między elektrodami jest niezbędne do uzyskania wysokiej jakości i pełnego szacunku nagrania. Kluczowe znaczenie ma uzyskanie wodoszczelnego uszczelnienia wokół nerwu o wysokiej odporności. Następnie napełnij obojętną elektrodę solą fizjologiczną przez odsysanie, jeśli nie została już napełniona przez spontaniczne działanie kapilarne.

Następnie umieść identyczne srebrne przewody nagrywające w wewnętrznym otworze nagrania i obojętnych elektrodach. Na drugim końcu przewody powinny być podłączone do różnych żył dwużyłowego ekranowego. Upewnij się, że drut w elektrodzie rejestrującej styka się z solą fizjologiczną i znajduje się w pobliżu nerwu, ale bez naruszania uszczelnienia.

Umieść drut na końcu obojętnej elektrody. Następnie umieść elektrodę uziemiającą, granulkę chlorku srebra i srebra, w kąpieli. Podłącz tę elektrodę do ekranu dwużyłowego podłączonego do elektrody nagrywającej.

Wyświetl ich indywidualne sygnały na oscyloskopie, aby sprawdzić, czy poziomy szumów elektrycznych obu kanałów są podobne. Spontaniczne potencjały czynnościowe w elektrodzie rejestrującej mogą nie być widoczne, dopóki obie elektrody nie zostaną zrównoważone. Aby skorygować różnice w szumach tła, zwiększ impedancję jednego kanału, zasysając tkankę łączną tłuszczu głębiej do elektrody.

Gdy elektrody zrównoważą tła, przełącz się na zapis różnicowy i poszukaj spontanicznych potencjałów czynnościowych lub wywołaj potencjały czynnościowe, głaszcząc włoski na brzegu małżowiny usznej prętem z polerowanego ogniowo. Następnie nagraj elektroneurogram za pomocą interfejsu komputera. I przepuść neurogram przez system dźwiękowy, aby skok był słyszalny tuż powyżej wyjściowego hałasu.

Ten przekaźnik słuchowego sprzężenia zwrotnego jest bardzo przydatny podczas przeprowadzania eksperymentów. Następnie upewnij się, że unerwienie mieszków włosowych w pobliżu oczyszczonego obszaru jest nienaruszone, ręcznie stymulując włosy. Teraz złóż od jednego do dwóch milimetrów brzegu skóry ucha na poziomie okienka oczyszczonego z tłuszczu, aby odsłonić leżące pod spodem włosy.

Pozostaw wypełnioną solą fizjologiczną szczelinę między przeciwległymi warstwami skóry. Podczas uważnego słuchania delikatnie pogłaszcz szklanym prętem włoski wystające wzdłuż zagiętej krawędzi. Nie dotykaj skóry.

W razie potrzeby sprawdź oscyloskop, aby ocenić wyjście. Aby dokonać kontrolowanych zapisów potencjałów czynnościowych wywołanych bodźcem, należy użyć sondy mechanicznej z polerowanego ogniowo, dziesięciocentymetrowego szkła mikroelektrodowego borokrzemianowego, przymocowanej do ceramicznego siłownika piezoelektrycznego. Ustaw sondę tak, aby poruszała się równolegle do fałdu skórnego i dotykała włosów, a nie skóry.

Umieść go około pół do jednego milimetra nad powierzchnią skóry. Następnie ręcznie zweryfikuj stymulację, nasłuchując wyjścia audio, gdy sonda się porusza. Teraz skonfiguruj oprogramowanie, aby sterować mechaniczną stymulacją małego obszaru włosów.

Na przykład zaprogramuj trzysekundowe symulacje przy sinusoidach pięciu herców co dziesięć sekund. Wymaga to przemieszczenia sondy w zakresie od 200 do 2 000 mikronów. Następnie kontynuuj wielokrotną automatyczną stymulację, aby sprawdzić spójność zarejestrowanych reakcji w nerwach.

Powtarzalne wyniki powinny być osiągalne. Gdy wyniki są spójne, zmniejsz częstotliwość powtarzania do co 30 sekund. Dalsze instrukcje znajdują się w protokole tekstowym.

Aby zbadać właściwości kanałów mechanosensorycznych i oznaczyć zakończenia mechanosensoryczne wokół mieszków włosowych, dodaj dziesięć mikromolowych FM1-43 do roztworu i pozostaw na 60 minut. Kontynuując stymulację włosów za pomocą sondy oscylacyjnej. Barwnik ten blokuje potencjalne kanały przetwornikowe i neurony czuciowe w hodowli i komórkach rzęsatych ślimaka.

Nie blokuje jednak wypalania w dojrzałych mieszkach włosowych in situ. Oznakowanie końcówek pokazuje, że barwnik uzyskuje dostęp do końcówek, które nadal reagują na stymulację mechaniczną podczas ekspozycji na barwnik. Elektroneurogramy wykonane przy użyciu opisanego protokołu zazwyczaj wykazywały ciągłą aktywność potencjału czynnościowego nawet przy braku stymulacji manualnej, w tym potencjały czynnościowe o największej wielkości.

Spontaniczna aktywność występowała przy około 10-20 skokach na sekundę, nie wykazując żadnej struktury ani oznak toniczności. Autokorelacja dla przedziałów między okresami stymulacji była zawsze dość płaska. Podczas pięciohercowej i 500-mikronowej mechanicznej stymulacji łodyg włosa całkowita wydajność zwykle wzrastała do około 50 skoków na sekundę.

Konstrukcja histogramów cykli wykazała silne porywanie odpowiedzi, z czterema do dziesięciu skokami na cykl sinusoidalny. Było to oczywiście dość powtarzalne, faza przebiegu, w której odpowiedzi były zablokowane, zależała od miejsca, w którym wibrująca sonda stykała się z włosem i kierunku jej ruchu w tym punkcie. Następnie zbadano farmakologię kanału zakończenia nerwu w mieszkach włosowych.

Kanały nadal reagowały nawet po wystawieniu na działanie FM1-43, który może blokować niektóre kanały mechanosensoryczne, takie jak te w neuronach czuciowych w hodowli lub komórkach rzęsatych ślimaka ex vivo. Po opanowaniu tej techniki aż do rozpoczęcia rejestracji elektroneurogramów, można to zrobić w ciągu 60 do 90 minut. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby rozwinąć skurcz elektryczny o wysokiej rezystancji w elektrodach, a w przypadku łączenia z wizualizacją mieszków włosowych użyć małych myszy w celu poprawy penetracji barwnika i przejrzystości optycznej.

Pomysł na tę metodę zaczerpnęliśmy z pomysłu pierwotnie opracowanego przez bliskiego kolegę, a obecnie emerytowanego profesora, Clarke'a Slatera i jego magistranta Nakula Kaina, kiedy powiedzieliśmy im o możliwej roli pęcherzyków synaptycznych w mechanosensacji wrzeciona mięśniowego oraz o potrzebie lepszej metody ich wizualizacji za pomocą FM1-43. Postępując zgodnie z tą procedurą, można zastosować takie metody, jak farmakologia i znakowanie barwników życiowych, aby odpowiedzieć na takie pytania, jak to, jakie są kanały mechanoprzetwornika i zróżnicowane zakończenia in situ oraz czy stymulacja mechaniczna może modulować wychwyt i uwalnianie barwnika poprzez regulację recyklingu pęcherzyków synaptycznych. Nie zapominaj, że FM1-43 nie został oceniony pod kątem toksyczności i powinien być traktowany tak, jakby był niebezpieczny.