Wytwarzanie i eksploatacja urządzeń akustyczno-przepływowych wspomagających masowe akustyczne fale stojące do bezosłonowego ogniskowania cząstek

Ogólnym celem tej metody wykonania jest stworzenie wszechstronnego i wytrzymałego urządzenia akustofluidycznego do bezkontaktowego manipulowania koloidalnymi cząstkami o rozmiarach mikronowych przy użyciu objętościowych fal akustycznych stojących. Naszym celem jest zaprezentowanie prostego podejścia poprzez pokazanie, jak wykonać narzędzia akustofluidyczne wspierające objętościowe fale akustyczne stojące przy użyciu standardowego sprzętu i procedur, w nadziei na zwiększenie dostępności tej użytecznej technologii. Główną zaletą akustofluidyki jest fakt, że oferuje ona prosty sposób na szybkie ogniskowanie lub rozdzielanie mikroskopijnych obiektów, co ma szerokie zastosowanie w cytometrii na chipie oraz sortowaniu komórek.

Technologia ta oferuje możliwość rozmieszczania cząstek przy różnych szybkościach przepływu w sposób delikatny i selektywny, a wszystko to na wygodnej, zminiaturyzowanej platformie. W pomieszczeniu typu clean room umieść czysty, sześciocalowy, jednostronnie polerowany wafel krzemowy na powlekaczu wirówkowym stroną polerowaną do góry. Nanieś pozytywny fotorezyst bezpośrednio na środek wafla, ostrożnie wlewając go, aż fotorezyst pokryje większą część powierzchni.

Następnie zakręć próbkę, aby uzyskać równomierną warstwę fotorezystu. Po zakończeniu procesu zwolnij podciśnienie w uchwycie i za pomocą pęsety do wafli wyjmij wafelek. Następnie umieść wafelek na płycie grzejnej i przeprowadź wstępne wygrzewanie (soft bake) przez czas określony przez dostawcę fotorezystu.

Podczas wygrzewania fotorezystu, umieść maskę fotolitograficzną, taką jak ta pokazana tutaj, w uchwycie urządzenia do wyrównywania masek. Następnie umieść podłoże krzemowe i naświetl je światłem UV dawką energii określoną przez dostawcę fotorezystu. Następnie wyjmij naświetlone podłoże z uchwytu i umieść je w roztworze odpowiedniego wywoływacza.

Po zakończeniu procesu wyjmij wafle z wywoływacza, opłucz go jednostajnym strumieniem wody dejonizowanej i osusz azotem. Umieść wafle z fotomaską w komorze urządzenia do głębokiego trawienia jonowego (DRIE) i wytraw kanały fluidyczne w waflu do pożądanej głębokości, stosując standardowe procedury trawienia. Po zakończeniu procesu trawienia wyjmij próbkę z komory i umieść ją w dużym zlewce zawierającej roztwór do usuwania fotorezystu.

Należy upewnić się, że podłoże krzemowe jest zanurzone w roztworze i pozostawić je do namaczania przez jedną godzinę w temperaturze 65 °C. Następnie należy wyjąć podłoże z zlewki i przepłukać je naprzemiennie strumieniami acetonu i alkoholu izopropylowego. Na koniec podłoże należy wysuszyć azotem.

W dobrze wentylowanej dygestorii dopuszczonej do pracy z kwasami, przygotuj roztwór Piranha w dużym, czystym zlewce, dodając 30% nadtlenku wodoru do kwasu siarkowego w stosunku jeden do trzech. Zanurz płytkę trawioną jonowo w roztworze Piranha wytrawioną stroną do góry i pozostaw ją na pięć minut. Następnie wyjmij płytkę i dokładnie wypłucz ją wodą dejonizowaną.

Ponownie zanurz płytkę w roztworze Piranha na dodatkowe dwie minuty, a następnie ponownie wypłucz ją obfite ilością wody dejonizowanej. W oddzielnym, dobrze wentylowanym dygestorium przeznaczonym do pracy z rozpuszczalnikami, przemyj płytkę jednostajnym strumieniem acetonu, a następnie jednostajnym strumieniem metanolu, po czym osusz ją gazem azotowym. Za pomocą rylca narysuj proste linie na płytce wokół obwodu układu mikrofluidycznego w taki sposób, aby był on mniejszy niż wymiary prostokątnego fragmentu szkła z nawierconymi otworami.

Ostrożnie przełam płytkę wzdłuż wytrawionych linii. Przepłucz segment krzemowy pod stałym strumieniem acetonu, a następnie pod stałym strumieniem metanolu. Następnie umieść płytkę na płycie grzewczej w temperaturze 95 °C przez dwie minuty do wyschnięcia.

Następnie ostrożnie nałóż czyste szkło na segment silikonowy tak, aby wytrawione elementy były skierowane do góry. Upewnij się, że otwory są odpowiednio wyrównane. Następnie ostrożnie obróć segmenty, dbając o zachowanie osiowości otworów.

Przymocuj oba segmenty za pomocą dwustronnej taśmy przewodzącej w taki sposób, aby połowa taśmy mocowała pionowe krawędzie segmentu silikonowego, a druga połowa mocowała wystające szkło. Następnie ponownie odwróć segmenty tak, aby segment szklany znajdował się na górze. Umieść segmenty na stalowej płycie na płycie grzejnej w temperaturze 450 stopni Celsjusza.

Następnie ostrożnie połóż drugą stalową płytę o masie co najmniej pięciu kilogramów bezpośrednio na wierzchu zmontowanych segmentów szklanych i krzemowych. Płyta ta nie powinna stykać się z segmentem krzemowym ani z taśmą przewodzącą. Używając zasilacza wysokiego napięcia, podłącz przewód fazowy do stalowej płyty znajdującej się na wierzchu zmontowanych segmentów szklanych i krzemowych, a przewód uziemiający do dolnej stalowej płyty.

Ustaw napięcie na płycie grzejnej znajdującej się poniżej na 1 000 V. Sprawdź przyłożone napięcie za pomocą multimetru, dociskając jedną sondę do dolnej płyty, a drugą sondę do górnej płyty. Po dwóch godzinach wyłącz płytę grzejną oraz zasilacz DC i zdejmij urządzenie z metalowych płyt.

Zeskrob powierzchnię szkła żyletką, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia powstałe w wyniku wiązania anodowego, a następnie oczyść powierzchnię szkła acetonem. Następnie przygotuj arkusz polidimetylosiloksanu o grubości około 5 mm, wycinając z niego kilka małych kwadratowych płytek o wymiarach około 10 mm na 10 mm. Użyj 3-mm wycinaka do biopsji, aby wyciąć jeden otwór w centrum każdej płytki.

Następnie przyklej płytki bezpośrednio nad otworami na podłożu szklanym, używając żywicy epoksydowej. Przylutuj dwa przewody do dwóch obszarów przewodzących na przetworniku. Ostrożnie przyklej przetwornik z tytanianu cyrkonianu ołowiu do segmentu krzemowego na tylnej stronie urządzenia, centrując go pod mikrokanałem.

Na koniec należy przełożyć rurkę silikonową przez otwory w płytkach z polidimetylosiloksanu i nałożyć dodatkowy klej wokół płytek oraz rurki, aby je unieruchomić. Urządzenie należy stabilnie zamontować na stole mikroskopu, tak aby mikrokanał znajdował się bezpośrednio pod obiektywem. Należy zadbać o to, by przetwornik nie stykał się ze stołem.

Następnie podłącz rurki silikonowe z wylotów urządzenia do strzykawek zamocowanych w pompach strzykawkowych. Umieść rurkę silikonową prowadzącą do wlotu urządzenia w fiolce zawierającej zawiesinę kulek polistyrenowych lub badanych komórek. Następnie umieść fiolkę z próbką na mieszadle magnetycznym, aby stale ją mieszać w celu zapewnienia utrzymania stałego stężenia przez cały czas trwania eksperymentu.

Podłącz przetwornik do wyjścia wzmacniacza mocy połączonego szeregowo z generatorem funkcji. Zaprogramuj ustawienia w generatorze funkcji i monitoruj sygnał wyjściowy na oscyloskopie. Następnie włącz generator funkcji oraz wzmacniacz mocy, aby rozpocząć aktywację przetwornika.

Następnie włącz mikroskop i upewnij się, że kanał mikrofluidyczny jest wyraźnie w ostrości. Włącz również pompę strzykawkową, aby wprowadzić próbkę do urządzenia. Przez cały czas trwania eksperymentu monitoruj obiekty przepływające przez urządzenie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

W tym przypadku użyto pompy strzykawkowej do wprowadzenia do komory mikrofluidycznej zawiesiny zielonych fluorescencyjnych kulek polistyrenowych z prędkością 100 µL/min. Po aktywacji przetwornika z tytanianu cyrkonianu ołowiu i nastrojeniu go do częstotliwości 2,366 MHz, w poprzek szerokości tego mikrokanału, która wynosi 313 µm, powstaje fali stojącej o długości połowy fali. Powoduje to skupienie strumienia kulek wzdłuż węzła ciśnienia.

Kiedy czerwone fluorescencyjne cząsteczki silikonu, charakteryzujące się ujemnym współczynnikiem kontrastu akustycznego, zostały wstrzyknięte do urządzenia, skoncentrowały się wzdłuż węzłów ciśnienia. Zdolność tego systemu do ogniskowania cząsteczek zależy zarówno od szybkości przepływu, jak i przyłożonego napięcia. Wraz ze wzrostem przepływu rozkład cząsteczek w mikrokanale ulega rozszerzeniu.

Zwiększenie przyłożonych napięć powoduje również zwiększenie stopnia ogniskowania cząstek. Po uruchomieniu urządzenie to może być wykorzystywane do manipulowania cząstkami i komórkami w różnych bioanalizach i eksperymentach opartych na mikrofluidyce, które wymagają precyzyjnej kontroli przestrzennej lub czasowej. Należy pamiętać, aby nie spieszyć się i zachować ostrożność na każdym etapie, ponieważ pośpiech może doprowadzić do powstania niedoskonałości w gotowym urządzeniu.

Po ukończeniu procesu wykonania urządzenie można wykorzystywać wielokrotnie, pod warunkiem odpowiedniej pielęgnacji oraz czyszczenia między poszczególnymi użyciami przy pomocy właściwych detergentów i buforów płuczących. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak wykonać urządzenie akustofluidyczne zbudowane z krzemu i szkła, wspierające stojące fale akustyczne w całej objętości. Prosimy pamiętać, że pracują Państwo z silnymi odczynnikami chemicznymi, takimi jak mieszanina Piranha, które mogą być niezwykle niebezpieczne w przypadku niewłaściwego obchodzenia się z nimi.

Należy zachować należytą ostrożność podczas obchodzenia się z tymi cieczami, aby zapewnić bezpieczną praktykę chemiczną podczas wszystkich prac związanych z wytwarzaniem.