Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życiowego S. venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego

Ogólnym celem niniejszego protokołu fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej jest zapewnienie metody badania procesów biologicznych komórek, które leżą u podstaw rozwoju i różnicowania komórkowego w sporulującej bakterii nitkowatej, Streptomyces venezuelae. Opisana metoda stanowi doskonałą platformę do badania procesów biologii komórki, które są kluczowe dla cyklu życiowego Streptomyces, w tym dynamicznej lokalizacji białek, wzrostu polarnego oraz wrzecionowania podczas sporulacji. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że Streptomyces venezuelae sporuluje w środowisku ciekłym, co pozwala na hodowlę komórek w urządzeniu mikroprzepływowym i mikroskopijną obserwację pełnego cyklu życiowego.

Niniejsza metoda wykazuje ogromny potencjał Streptomyces venezuelae jako nowego systemu rozwojowego dla tego rodzaju, ponieważ umożliwia obrazowanie na żywo różnicowania się grzybni wieloośrodkowej w łańcuchy zarodników. W pierwszej kolejności należy zaszczepić 30 ml uzupełnionego podłoża wzrostowego 10 µL zarodników szczepu S.venezuela przeznaczonego do obrazowania. Aby zapewnić jednolity wzrost i sporulację komórek, należy użyć kolby z przegrodami lub kolby zawierającej sprężynę, co zapewni odpowiednie napowietrzanie.

Kultury komórkowe inkubuj przez 35 do 40 godzin w temperaturze 30 °C przy 250 RPM. Po tym czasie fragmenty grzybni oraz zarodniki powinny być widoczne w mikroskopie fazowo-kontrastowym w preparacie mokrym. Jeden mililitr kultury odwiruj w wirówce stołowej z prędkością 400 ×g przez jedną minutę, aby uzyskać osad z grzybni i większych fragmentów komórek.

Następnie przenieś około 300 µl supernatantu zawierającego zawiesinę zarodników do nowej probówki 1,5 mm i umieść ją w lodzie. Pozostałą pożywkę zachowaj do wykorzystania w późniejszym etapie. Następnie rozcieńcz zarodniki w stosunku 1:20 w uzupełnionej pożywce wzrostowej i utrzymuj rozcieńczone zarodniki w lodzie do momentu ich użycia.

Wlej pozostałą pożywkę do zlewki o pojemności 50 ml, a następnie pobierz 10 ml za pomocą strzykawki i przefiltruj ją przez sterylny filtr strzykawkowy o wielkości oczek 22 µm, aby uzyskać sterylną pożywkę. Celem jest otrzymanie zużytej, suplementowanej pożywki wzrostowej wolnej od zarodników i fragmentów grzybni. Przechowuj przefiltrowaną, zużytą, suplementowaną pożywkę wzrostową przez kilka dni w temperaturze 4 °C, jeśli planowane są dodatkowe eksperymenty w analogicznych warunkach hodowli.

Każda płyta mikroprzepływowa może być wykorzystana do maksymalnie czterech niezależnych eksperymentów. Aby uniknąć zanieczyszczenia niewykorzystanych komór przepływowych, należy upewnić się, że podczas przygotowywania eksperymentu stosowane są sterylne roztwory i warunki pracy. Rozpocznij od usunięcia roztworu transportowego z płyty mikroprzepływowej.

Następnie opłucz dołki sterylną suplementowaną pożywką wzrostową. Po opłukaniu dodaj 300 µL suplementowanej pożywki wzrostowej do wlotu do dołka pierwszego oraz 300 µL zużytej suplementowanej pożywki wzrostowej do dołków od drugiego do szóstego. Następnie nanieś 40 µL rozcieńczonych spor do dołka ósmego w kanale A i uszczelnij kolektor z płytką zgodnie z instrukcjami producenta.

Uruchom oprogramowanie sterujące mikroprzepływami i wybierz odpowiedni typ płytki. Skonfiguruj program przepływu tak, aby medium płynęło z dolków wlotowych od pierwszego do piątego pod ciśnieniem 6 psi przez dwie minuty na dołek, w celu przepłukania kanału przepływowego i komory hodowlanej. Następnie ustaw przepływ uzupełnionej pożywki wzrostowej pod ciśnieniem 6 psi do pierwszego dołka wlotowego przez sześć godzin.

Umożliwi to kiełkowanie i wzrost wegetatywny. Zaprogramuj przełączenie po sześciu godzinach na zużyte wzbogacone medium wzrostowe i doprowadź je do dołków od drugiego do piątego pod ciśnieniem 6 psi przez pozostały czas trwania eksperymentu. Komorę klimatyczną należy uprzednio rozgrzać do 30 °C.

Następnie włącz mikroskop oraz oprogramowanie sterujące mikroskopem. Zamontuj obiektyw imersyjny z wysoką aperturą numeryczną i upewnij się, że ustawiono odpowiednie filtry i lustra diagramatyczne do obrazowania w kontraście interferencyjnym (DIC), a także filtry dla fuzji białek fluorescencyjnych w kolorze żółtym i czerwonym. Nałóż kroplę oleju imersyjnego na obiektyw oraz na dno okna obrazowania na płytce mikroprzepływowej.

Ostrożnie zamocuj szczelne urządzenie mikrofluidyczne na stoliku mikroskopu odwróconego i zabezpiecz je w odpowiedniej pozycji. Skorzystaj z wbudowanych znaczników położenia, aby ustawić ostrość w oknie obrazowania komory hodowli mikrofluidycznej. Ustaw ostrość na najbardziej lewej części pierwszej komory przepływowej oznaczonej literą A, a następnie przesuń stolik do pułapki rozmiaru pięć, odpowiadającej wysokości pułapki 7 micrometers.

W oprogramowaniu mikroprzepływowym ustaw system tak, aby załadował komórki z otworu wlotowego nr osiem pod ciśnieniem 4 psi przez 15 sekund. Po zakończeniu procesu sprawdź gęstość komórek w komorze hodowlanej, przesuwając stolik wzdłuż okna obrazowania. Jeśli nie uwięziono żadnych zarodników, powtórz etap ładowania komórek lub alternatywnie zwiększ ciśnienie i/lub czas ładowania, aż do osiągnięcia pożądanej gęstości od 1 do 10 zarodników na okno obrazowania.

Należy zadbać o to, aby nie przeładować komory hodowlanej. Następnie w oprogramowaniu sterującym należy uruchomić wcześniej przygotowany program przepływu i pozwolić płytce mikrofluidycznej na wyrównanie temperatury przez jedną godzinę na stoliku mikroskopu przed rozpoczęciem akwizycji obrazów. W oprogramowaniu sterującym mikroskopem należy skonfigurować wielowymiarową akwizycję, aby wykonać wiele obrazów w wielu pozycjach stolika w czasie, określając najpierw katalog do automatycznego zapisywania plików obrazów.

Następnie przejdź do ustawień oświetlenia i wprowadź wcześniej określone optymalne parametry oświetlenia dla każdego konkretnego konstruktu. Następnie skonfiguruj serię czasową, aby rejestrować obrazy co 40 minut przez 24 godziny. W celu wyznaczenia pozycji stolika i ustawienia autofokusu, przeskanuj komorę hodowlaną i zapisz pozycje stolika dla każdego interesującego obszaru obrazowania.

Upewnij się, że pozycje pojedynczego etapu są oddalone od siebie na tyle, aby zminimalizować fotoblaknięcie i fototoksyczność. Po zweryfikowaniu współrzędnych Z wybranych pozycji stołu, aktywuj sprzętowy autofokus. Następnie uruchom eksperyment time-lapse w oprogramowaniu sterującym mikroskopem.

Zatrzymaj akwizycję obrazów po 24 do 30 godzinach lub w momencie, gdy strzępki w obszarze zainteresowania zróżnicują się w zarodniki. Następnie zatrzymaj program przepływu w oprogramowaniu i zdemontuj urządzenie mikroprzepływowe. Przygotuj używaną płytkę mikroprzepływową do krótkotrwałego przechowywania, usuwając resztki pożywki z dołków wlotowych, dołka na odpady oraz dołka do ładowania komórek.

Następnie wypełnij użyte studzienki w rzędzie A oraz studzienki w nieużywanych rzędach sterylnym PBS. Na koniec szczelnie zamknij płytkę folią Parafilm, aby zapobiec wysychaniu. Płytkę należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pomyślne obrazowanie żywych komórek w całym cyklu życiowym S.venezuela pozwala na uzyskanie ciągłej serii czasowej, obejmującej kluczowe etapy rozwojowe: kiełkowanie, wzrost wegetatywny oraz sporulację. Podczas kiełkowania lub wzrostu wegetatywnego DivIVA-mCherry gromadzi się wyłącznie na rosnących wierzchołkach strzępek lub znakuje nowo powstające punkty rozgałęzień strzępek. Z kolei FtsZ-YPet tworzy pojedyncze struktury pierścieniowate w nieregularnych odstępach w rosnącej grzybni.

Struktury te stanowią rusztowanie dla syntezy niekonstrukcyjnych wegetacyjnych ścian poprzecznych, co prowadzi do powstania połączonych komór hyfalnych. W hyfach sporulujących wzorzec lokalizacji FtsZ-YPet zmienia się drastycznie. Najpierw helikalne filamenty FtsZ-YPet przemieszczają się wzdłuż strzępki, a następnie, w gwałtownym, niemal synchronicznym zdarzeniu, helisy te zlewają się w drabinę regularnie rozmieszczonych pierścieni FtsZ-YPet.

W końcu w obrazach z kontrastu interferencyjnego (DIC) stają się widoczne przegrody sporulacyjne, a ostatecznie uwalniane są nowe przącznice. Technika ta stanowi solidny protokół do obrazowania żywych komórek w pełnym cyklu życiowym Streptomyces. System mikroprzepływowy jest łatwy w obsłudze.

Zapewnia ona elastyczność eksperymentalną i umożliwia długoterminowe monitorowanie. Ten układ doświadczalny stanowi również doskonały punkt wyjścia do badania konkretnych zdarzeń rozwojowych w odpowiedzi na zmieniające się warunki hodowlane lub wykorzystania barwników fluorescencyjnych do monitorowania syntezy peptydoglikanu lub wizualizacji organizacji chromosomów.