Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życiowego S. venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego

Ogólnym celem tego fluorescencyjnego protokołu mikroskopii poklatkowej jest zapewnienie metody badania biologicznych procesów komórkowych, które leżą u podstaw rozwoju i różnicowania komórkowego w zarodnikującej bakterii nitkowatej Streptomyces venezuelae. Metoda opisu stanowi doskonałą platformę do badania procesów biologicznych komórek, które mają kluczowe znaczenie dla cyklu życiowego Streptomyces, w tym dynamicznej lokalizacji białek, spolaryzowanego wzrostu i septacji zarodnikowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że zarodniki Streptomyces venezuelae znajdują się w płynie, co pozwala nam hodować komórki w urządzeniu mikroprzepływowym i mikroskopowo monitorować cały cykl życia.

Metoda ta pokazuje ogromny potencjał Streptomyces venezuelae jako nowego systemu rozwojowego dla rodzaju, ponieważ pozwala na obrazowanie żywych komórek różnicowania się wieloośrodkowej grzybni w łańcuchy zarodników. Na początek zaszczep 30 mililitrów uzupełnionej pożywki wzrostowej 10 mikrolitrami zarodników ze szczepu S.venezuela, który ma być zobrazowany. W celu zapewnienia stałego wzrostu i zarodnikowania komórek należy użyć kolby z przegrodą lub kolby zawierającej sprężynę, aby umożliwić wystarczające napowietrzenie.

Hoduj komórki przez 35 do 40 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 250 obr./min. Kiedy będziesz gotowy, powinieneś być w stanie zobaczyć fragmenty grzybni i zarodniki za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym montowanym na cieczy. Odwirować jeden mililitr kultury w wirówce stołowej przy 400 razy G przez jedną minutę, aby granulować grzybnię i większe fragmenty komórek.

Następnie przenieść około 300 mikrolitrów supernatantu zawierającego zawiesinę zarodników do nowej probówki o średnicy 1,5 milimetra i umieścić probówkę na lodzie. Zachowaj pozostałą pożywkę hodowlaną do wykorzystania w późniejszym etapie. Następnie rozcieńczyć zarodniki od 1 do 20 w uzupełnionej pożywce wzrostowej i trzymać rozcieńczone zarodniki na lodzie, aż będą potrzebne.

Wlej pozostałą pożywkę hodowlaną do 50-mililitrowej zlewki, a następnie nabierz 10 mililitrów za pomocą strzykawki i użyj sterylnego filtra strzykawkowego o średnicy 22 mikrometrów, aby przefiltrować, wysterylizować pozostałą pożywkę hodowlaną. Aby uzyskać zużytą uzupełnioną pożywkę wzrostową, która jest wolna od zarodników i fragmentów grzybni. Utrzymuj przefiltrowaną zużytą dopełnioną pożywkę wzrostową przez kilka dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jeśli mają być przeprowadzone dodatkowe eksperymenty przy użyciu podobnych warunków wzrostu.

Każda płytka mikroprzepływowa może być wykorzystana do maksymalnie czterech niezależnych eksperymentów. Aby uniknąć zanieczyszczenia nieużywanych komór przepływowych, upewnij się, że używasz sterylnych roztworów i warunków pracy podczas ustawiania eksperymentu. Zacznij od usunięcia roztworu transportowego z płytki mikroprzepływowej.

Następnie przepłucz studzienki sterylnym uzupełnionym podłożem wzrostowym. Po wypłukaniu dodaj 300 mikrolitrów uzupełnionej pożywki wzrostowej do wlotu pierwszej studzienki i 300 mikrolitrów zużytej uzupełnionej pożywki wzrostowej do studzienek od drugiej do szóstej. Następnie załaduj 40 mikrolitrów rozcieńczonych zarodników do dołka ósemki pasa A i uszczelnij kolektor do płytki zgodnie z instrukcjami producenta.

Uruchom oprogramowanie sterujące mikroprzepływem i wybierz odpowiedni typ płytki. Ustaw program przepływu, aby przepływać medium ze studzienek wlotowych od pierwszej do piątej przy sześciu psi przez dwie minuty na studzienkę, aby zalać kanał przepływowy i komorę hodowlaną. Następnie niech przepływa uzupełnioną pożywkę wzrostową o ciśnieniu sześciu psi do studzienki wlotowej przez sześć godzin.

Umożliwi to kiełkowanie i wzrost wegetatywny. Niech program przełączy się po sześciu godzinach na zużytą uzupełnioną pożywkę wzrostową i przelej go do studzienek od dwóch do pięciu przy sześciu psi na pozostałą część eksperymentu. Wcześniej podgrzej komorę środowiskową do 30 stopni Celsjusza.

Następnie włącz mikroskop i oprogramowanie sterujące mikroskopem. Umieść na miejscu obiektyw immersyjny z olejkiem o dużej aperturze numerycznej i upewnij się, że odpowiednie filtry i lustra schematyczne ustawione do uzyskiwania obrazów kontrastu interferencyjnego różnicowego, wraz z obrazami fuzji białek żółtego fluorescencyjnego i czerwonego fluorescencyjnego, są na swoim miejscu. Umieść kroplę olejku immersyjnego w obiektywie i na dole okienka obrazowania na płytce mikroprzepływowej.

Ostrożnie zamontuj szczelne urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu odwróconego i zabezpiecz je na miejscu. Użyj osadzonych znaczników pozycji, aby ustawić ostrość okna obrazowania komory hodowli mikroprzepływowej. Skoncentruj się na skrajnej lewej części pierwszej komory przepływowej oznaczonej A, a następnie przesuń stolik do rozmiaru pułapki piątej, odpowiadającego wysokości pułapki wynoszącej 7 mikrometrów.

W oprogramowaniu mikroprzepływowym ustaw system tak, aby ładował komórki z ósmej studni wlotowej przy czterech psi przez 15 sekund. Po uruchomieniu procesu sprawdź gęstość komórek w komorze hodowlanej, przesuwając stolik po oknie obrazowania. Jeśli żadne zarodniki nie zostały uwięzione, powtórz etap ładowania komórek lub alternatywnie zwiększ ciśnienie ładowania i/lub czas, aż zostanie osiągnięta pożądana gęstość komórek od jednego do 10 zarodników na okno obrazowania.

Uważaj, aby nie przeciążyć komory hodowlanej. Następnie uruchom przygotowany wcześniej program przepływu w oprogramowaniu sterującym i pozwól płytce mikroprzepływowej na zrównoważenie ciepła przez godzinę na etapie mikroskopu przed rozpoczęciem akwizycji obrazu. W oprogramowaniu sterującym mikroskopem skonfiguruj wielowymiarową akwizycję, aby z czasem wykonać wiele obrazów w wielu pozycjach etapu, najpierw określając katalog do automatycznego zapisywania plików obrazów.

Następnie przejdź do ustawień oświetlenia i wprowadź z góry określone optymalne ustawienia oświetlenia dla każdej konkretnej konstrukcji. Następnie skonfiguruj szereg czasowy, aby pobierać obrazy co 40 minut przez 24 godziny. Aby określić pozycje stolika i ustawić autofokus, zeskanuj komorę hodowlaną i zapisz pozycje stolika dla każdej pozycji obrazowania, która Cię interesuje.

Upewnij się, że pozycje jednostopniowe są umieszczone wystarczająco daleko od siebie, aby zminimalizować wybielanie fotograficzne i fototoksyczność. Po zweryfikowaniu współrzędnych Z wybranych pozycji stolika aktywuj sprzętowy autofokus. Następnie rozpocznij eksperyment poklatkowy w oprogramowaniu sterującym mikroskopem.

Przerwij akwizycję obrazu po 24 do 30 godzinach lub gdy strzępki w obszarze zainteresowania zróżnicują się w zarodniki. Następnie zatrzymaj program przepływu w oprogramowaniu i zdemontuj urządzenie mikroprzepływowe. Przygotuj zużytą płytkę mikroprzepływową do krótkotrwałego przechowywania, usuwając pozostałą pożywkę ze studzienek wlotowych, studzienki odpływowej i studzienki załadowczej komórki.

Następnie wypełnij używane studzienki na pasie A i studzienki nieużywanych pasów sterylnym PBS. Na koniec uszczelnij płytkę folią gruszkową, aby zapobiec jej wysychaniu. I przechowuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Udane obrazowanie żywych komórek w całym cyklu życiowym S. venezuela daje ciągły szereg czasowy, w tym kluczowe etapy rozwoju: kiełkowanie, wzrost wegetatywny i zarodnikowanie. Podczas kiełkowania lub wzrostu wegetatywnego DivIVA-mCherry gromadzi się wyłącznie na rosnących końcach hypnału lub zaznacza nowo tworzące się punkty rozgałęzień strzępek. W przeciwieństwie do tego, FtsZ-YPet tworzy pojedyncze struktury przypominające pierścienie w nieregularnych odstępach czasu w rosnącej grzybni.

Struktury te stanowią rusztowanie do syntezy niekonstruktywnych wegetatywnych ścian krzyżowych, prowadzących do tworzenia połączonych ze sobą przedziałów strzępkowych. W strzępkach zarodnikujących wzorzec lokalizacji FtsZ-YPet zmienia się dramatycznie. Najpierw spiralne włókna FtsZ-YPet przewracają się wzdłuż strzępki, a następnie w nagłym, prawie synchronicznym zdarzeniu, helisy te łączą się w drabinę regularnie rozmieszczonych pierścieni FtsZ-YPet.

Wreszcie, przegrody zarodnikowe stają się dostrzegalne na obrazach kontrastu interferencji różnicowej i ostatecznie uwalniane są nowe zarodniki. Technika ta zapewnia solidny protokół do wykonywania obrazowania żywych komórek w całym cyklu życia Streptomyces. System mikroprzepływowy jest łatwy w użyciu.

Oferuje elastyczność eksperymentalną i pozwala na długoterminowe monitorowanie Ten eksperymentalny zestaw stanowi również doskonały punkt wyjścia do badania określonych zdarzeń rozwojowych w odpowiedzi na zmieniające się warunki kulturowe lub zastosowanie barwników fluorescencyjnych do monitorowania syntezy peptydoglikanu lub wizualizacji organizacji chromosomów.