Protokół autoradiografii receptorów do miejscowej wizualizacji receptorów angiotensyny II

Ogólnym celem tej procedury jest anatomiczna lokalizacja i ilościowe określenie ekspresji receptora angiotensyny II w odcinkach mózgu z wykorzystaniem autoradiografii receptorów i histologicznej identyfikacji struktur mózgu. Metoda ta identyfikuje obszary mózgu, w których angiotensyna II wpływa na zachowanie, funkcje poznawcze i układ sercowo-naczyniowy, dostarczając informacji na temat rozwoju nowych terapii w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych i sercowo-naczyniowych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest ona ilościowa, jakościowa i pozwala na identyfikację funkcjonalnych receptorów dla angiotensyny II z większą swoistością niż inne metody.

Metoda ta może również charakteryzować funkcjonalność innych układów receptorów hormonalnych w całym ciele, takich jak receptory związane z narkotykami nadużywanymi. Natychmiast po zbiorach umieść tkanki mózgowe w formach mózgowych, które symulują wnętrze czaszki i zawiń formy w folię aluminiową do przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po 30 minutach przenieś chusteczki do zamykanej torby do przechowywania w zamrażarce i przechowuj torbę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Przed sekcją delikatnie usuń mózg z formy mózgowej. Aby przeciąć tkankę mózgową, przenieś badaną próbkę do kriostatu ustawionego w temperaturze od minus 10 do minus 18 stopni Celsjusza. Gdy tkanka osiągnie równowagę do nowej temperatury, użyj pożywki na bazie glikolu i żywicy, aby pionowo osadzić niewielką część próbki w mocowaniu tkankowym, aby umożliwić przekrój płaszczyzny koronalnej.

Załaduj tkankę na mikrotom i mocno dokręć mocowanie na miejscu, a następnie rozpocznij cięcie mózgu na żądaną grubość, a następnie montuj skrawki na szkiełkach mikroskopowych w orientacji pionowej, aby przyłożyć większą powierzchnię tkanki do szkiełka. Zbierz sekcje w sekwencyjnych zestawach po pięć. Po zebraniu wszystkich sekcji pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu na okres do jednej godziny.

Następnie umieść próbki w plastikowym pudełku na suwaki w samozamykającej się torbie do zamrażania do przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby oznaczyć próbki radiowo, wyjmij pierwszy i drugi slajd z każdego zestawu pięciu prowadnic i zamontuj w dostępnych na rynku lub wydrukowanych w 3D uchwytach do slajdów. Slajdy z kreską pierwszą są przeznaczone dla niespecyficznej grupy leczonej, a slajdy z kreską drugą są przeznaczone dla całej grupy leczonej.

Odwróć szkiełka w 35 do 40 mililitrach AM5 o temperaturze pokojowej wraz z odpowiednimi inhibitorami w odpowiednich słoikach Coplin do wstępnej inkubacji. Uruchamianie wielu zestawów slajdów może być przytłaczające. Dlatego niezwykle ważne jest, aby umieszczać szkiełka w słoikach do wstępnej inkubacji w czterominutowych odstępach, aby upewnić się, że na etapie suszenia nie ma zachodzenia na siebie.

Po 30 minutach przenieść szkiełka do szkiełek inkubacyjnych zawierających 10 mililitrów AM5 uzupełnionych odpowiednim stężeniem I125 SI angiotensyny II i odpowiednich inhibitorów grupy poddanej działaniu substancji przez 60 do 90 minut w temperaturze pokojowej. Określenie dokładnego stężenia 125I SI Ang II ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia porównania receptorów angiotensyny II z dnia na dzień. Pod koniec inkubacji włóż szkiełka z powrotem do uchwytów szkiełkowych, zablokuj szkiełka i delikatnie obracaj je przez jedną do dwóch sekund w dwóch oddzielnych pojemnikach po 400 mililitrów wody destylowanej.

Po drugim myciu wodą spłucz szkiełka czterema sekwencyjnymi jednominutowymi płukaniami w 30 do 40 mililitrach AM5. Po czwartym praniu delikatnie obracaj sekcje przez jedną do dwóch sekund w czterech zmianach lodowatej wody destylowanej. Następnie użyj czterech suszarek ustawionych pod różnymi kątami, aby suszyć szkiełka chłodnym powietrzem przez cztery minuty.

Gdy wszystkie sekcje wyschną, przenieś szkiełka na ręcznik papierowy. Następnie użyj taśmy dwustronnej, aby zamontować szkiełka, chusteczką do góry, na kawałku tektury na kliszę rentgenowską w odpowiednim miejscu i zawierającym co najmniej jedno szkiełko kalibracyjne jodu 125 na grupę. Aby naświetlić sekcje na kliszy, w ciemnym pomieszczeniu umieść kartonowe slajdy w kasecie rentgenowskiej z paskiem i wyłącz światła.

Włącz bezpieczne światło i ostrożnie otwórz pudełko z kliszą rentgenowską. Umieść jedną folię błyszczącą stroną do góry z postrzępioną krawędzią w prawym dolnym rogu na górze szkiełek w kasecie. Następnie ostrożnie zamknij kasetę ze skręconymi prętami blokującymi, aby uszczelnić światło i przechowuj kasetę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Po odpowiednim okresie naświetlania przenieść film do roztworu wywoływacza na dwie minuty, a następnie 30 sekund w kąpieli zatrzymującej, dwukrotnie destylowanej wodzie z kwasem octowym, a następnie pięć minut w roztworze utrwalającym. Umyj folię na tacy z bieżącą wodą przez 20 minut. Przenieś go do środka powierzchniowego na około 10 sekund i powieś folię do wyschnięcia.

W celu analizy histologicznej skrawków tkanki mózgowej rozmrozić trzy sekcje kreski w stojaku na szkiełka. Następnie umyj skrawki w wodzie dejonizowanej przez jedną minutę, a następnie 10-minutową inkubację w roztworze barwienia tioniny i trzykrotnie zanurz w jednym pojemniku na wodę dejonizowaną. Zanurz szkiełka, aby uzyskać dodatkowe 30-sekundowe mycie wodą dejonizowaną.

Następnie umyj szkiełka w sekwencyjnych płukaniach etanolem, jak wskazano. Po ostatnim myciu 100% etanolem myj szkiełka w dwóch pojemnikach z ksylenem przez trzy i pięć minut kolejno. Pod koniec drugiego płukania ksylenem przykryj górną krawędź szkiełka po szkiełku na bazie żywicy, medium mocującym rozpuszczalnik nieorganiczny

Zamontuj szkiełka nakrywkowe o wymiarach 24 na 60 milimetrów na szkiełkach i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 48 godzin. Następnie zeskanuj slajdy i film do komputera w skali szarości 2400 DPI. Aby przeanalizować film za pomocą densytometrii, po zeskanowaniu empirycznie nakreśl obszary zainteresowania na każdym filmie.

Jest to pseudokolorowy obraz generowany po otwarciu zeskanowanego filmu w programie do analizy obrazu. Uwzględnij gęstość, obszar skanowania i całkowity obszar docelowy w pomiarach. Dostosuj paski obszaru skanowania, aby upewnić się, że każdy obszar zainteresowania mieści się między parametrami podświetlania.

Następnie wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, aby określić konkretne wiązanie występujące dla każdej próbki. Wzorcowe jednostki kalibracji do oznaczania ilościowego określa się na podstawie daty wykonania testu. Po zeskanowaniu folii, wartości kalibracji są wykorzystywane do wygenerowania krzywej opartej na różnych stężeniach wzorców jodu 125 dla tej konkretnej folii.

Kalibracja i wartości standardowe są rejestrowane w trzech egzemplarzach w celu zapewnienia dokładności. Rozróżnienie między wiązaniem niespecyficznym a grupami całkowitymi, a także etykietami tkanek ustala się poprzez przypisanie każdego zestawu danych do odpowiednich podgrup. Wyższą wartość progową należy ustawić, dostosowując parametry od czerwonego do czarnego, podczas gdy dolna wartość progowa powinna być ustawiona blisko zera, aby umożliwić dokładniejszy pomiar całego skanowanego obszaru zainteresowania.

Na przykład tutaj końcowe zmierzone obszary jądra przykomorowego podwzgórza w całkowitej i niespecyficznej grupie wiązania są porównywane z wycinkiem wybarwionym tioniną w celu potwierdzenia anatomicznego. Wiązanie niespecyficzne to ilość radioligandu związanego z receptorami nieangiotensyny w obecności stężenia nasycającego nieradioaktywnego liganda receptora angiotensyny I, podczas gdy całkowite wiązanie to ilość radioligandu związanego przy braku nieradioaktywnego liganda receptora angiotensyny I. Niespecyficzne wartości wiązania można następnie odjąć od całkowitych wartości wiązania, aby uzyskać określone wartości wiązania dla receptorów angiotensyny I.

Po opanowaniu, etap autoradiografii receptorowej można ukończyć w około cztery godziny, podczas gdy etap wywoływania filmu trwa około 30 minut na film. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby śledzić czas, aby upewnić się, że wszystkie szkiełka są inkubowane, płukane i suszone dokładnie przez ten sam czas. Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkowe badania morfologii mózgu w celu oceny zmian w wielkości regionów wykazujących ekspresję receptora angiotensyny II.

Technika ta utorowała drogę naukowcom badającym farmakologię receptorów w celu określenia, w jaki sposób różne neurohormony, neuroprzekaźniki i leki wpływają na różne regiony mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie przeprowadzić test autoradiograficzny receptora, histologicznie barwione szkiełka i ocenić autoradiogramy pod kątem lokalizacji receptorów w określonych regionach mózgu. Pamiętaj, że praca z radioaktywnością może być niebezpieczna i zawsze należy podjąć środki ostrożności, takie jak odpowiednie osłanianie, ograniczanie, monitorowanie narażenia i usuwanie, aby uniknąć skażenia radioaktywnego.