Name: Protokół autoradiografii receptorów do miejscowej wizualizacji receptorów angiotensyny II (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Poznaj autoradiografię receptorów do lokalizacji i ilościowego oznaczania receptorów angiotensyny II w mózgu szczura. Ta metoda pozwala wizualizować dystrybucję receptorów z większą specyficznością niż inne techniki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH Grant HL-113905

Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Nova Southeastern University zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych, wydanie 8 (The National Academies Press, Waszyngton, DC, 2011).
1. Przygotowanie skrawków tkanek do autoradiografii receptorowej
<ol>
	<li>Po złożeniu w ofierze zbierz świeże tkanki mózgowe, zawiń w folię aluminiową i umieść w zamrażarce o temperaturze -20 °C tak szybko, jak to możliwe. Aby zachować prawidłowy kształt, umieść mózgi w formie mózgowej, która symuluje wnętrze czaszki, zawiń w folię aluminiową i umieść w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Po 30 minutach umieść chusteczki w zamykanej torbie do zamrażania i przenieś do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
	<ol>
		<li>Pobrać świeżo zamrożoną próbkę tkanki będącą przedmiotem zainteresowania z zamrażarki w temperaturze -80 °C i przenieść do kriostatu ustawionego na minimum -10 °C i maksymalnie -18 °C, aby uniknąć rozmrożenia.</li>
		<li>Umieścić próbkę na uchwycie tkankowym za pomocą podłoża do zatapiania na bazie glikolu i żywicy, osadzając w pożywce tylko niewielką część próbki. W przypadku mózgu mózg jest zamontowany pionowo, aby umożliwić sekcję w płaszczyźnie koronalnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść uchwyt tkanki na mikrotomie w kriostacie i mocno dokręć. Upewnij się, że lewa i prawa strona mózgu znajdują się w tych samych współrzędnych przednio-tylnych i że oś grzbietowo-brzuszna jest prostopadła do powszechnie używanych atlasów mózgu.</li>
	<li>Rozpocznij cięcie z żądaną grubością (zalecane 20 μm) i rozmroź Zamontuj sekcje na szkiełkach mikroskopowych w kierunku pionowym, aby uzyskać większą powierzchnię przestrzeni w szkiełku. Zbierz sekcje na szkiełkach w sekwencyjnych zestawach po pięć, tj. pierwszy zestaw szkiełek jest oznaczony jako 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 i 1-5 (rysunek 3).</li>
	<li>Po napełnieniu zestawu szkiełek sekcjami pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu do 1 godziny, a następnie umieść szkiełka w plastikowym pudełku na suwaki w samozamykającej się torbie do zamrażania i przechowuj w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Autoradiografia receptorowa
UWAGA: Radioaktywność. Używaj odzieży ochronnej do radzenia sobie z radioaktywnością. Utylizacja zależy od zakładu, i musi być zgodna z wytycznymi, aby prawidłowo rozkładać się (okres półtrwania 60 dni) lub być odebrany przez certyfikowaną firmę. 
<ol>
	<li>Wyjmij interesujące Cię szkiełka "-1" i "-2" z zamrażarki w temperaturze -20 °C i zamontuj w uchwytach ślizgowych (Rysunek 5). Zamontuj szkiełka "-1" razem dla leczenia "niespecyficznego", a szkiełka "-2" dla leczenia "całkowitego". "Niespecyficzne" słoiki będą zawierały 10 μM końcowych stężeń PD123319 antagonisty AT2R i losartanu antagonisty AT1R w buforze pożywki testowej (AM5) (tabela 1), "całkowite" słoiki wiążące będą zawierać tylko 10 μM PD123319 w AM5.</li>
	<li>Odwróć uchwyty szkiełka, aby umieścić szkiełka w słoikach z koplinu przed inkubacją wypełnionych 35-40 ml AM5 i odpowiednimi inhibitorami na 30 minut w temperaturze pokojowej. Kolejne serie należy rozpoczynać w kąpieli wstępnej w odstępach 4-minutowych.</li>
	<li>Natychmiast przenieść szkiełka z roztworu do inkubacji do szkiełek do inkubacji, zawierających 10 ml AM5 plus z góry określone stężenie 125I-SI-Ang II (obliczone na rysunku 4) z odpowiednimi inhibitorami, przez 60-90 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli jest wystarczająca ilość radioligandu, 10 szkiełek można umieścić (tyłem do siebie) w zmodyfikowanych uchwytach szkiełkowych i inkubować ze 125I-SI-Ang II w słoikach z Coplinu.</li>
	<li>Umieść szkiełka z powrotem w uchwytach szkiełkowych (w razie potrzeby), osusz i spłucz, delikatnie obracając przez 1-2 sekundy w 400 ml wody destylowanej w dwóch oddzielnych pojemnikach.</li>
	<li>Przenieś szkiełka sekwencyjnie do czterech słoików Coplin zawierających 35-40 ml AM5 każdy, dokładnie przez 1 minutę każdy (jak pokazano na rysunku 4).</li>
	<li>Po ostatnich 1 minutach płukania delikatnie obracaj sekcje przez 1-2 sekundy w czterech zmianach lodowatej wody destylowanej.</li>
	<li>Wysusz szkiełka chłodnym powietrzem (Uwaga: gorące powietrze ulatnia związek radioaktywny) za pomocą czterech suszarek do włosów ustawionych pod różnymi kątami na 4 minuty (Rysunek 5), aż wszystkie sekcje wyschną, a następnie połóż na ręczniku papierowym.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka z chusteczkami skierowanymi do góry na kartonie w celu nałożenia na film rentgenowski za pomocą taśmy dwustronnej.</li>
	<li>Zamontuj co najmniej jedną szkiełko wzorcowe 125 jodu na każdym kartonie (Rysunek 6). 
	Uwaga: Wzorce kalibracyjne składają się z pasty mózgowej dokładnie zmieszanej ze 125jodem związanym ze związkiem zawierającym pierścień fenolowy, zagęszczonej przez odwirowanie w strzykawce tuberkulinowej o pojemności 1 ml, które są kriostatem pociętym na te same grubości co skrawki mózgu i rozmrożone na szkiełkach mikroskopowych. Alternatywnie można uzyskać komercyjnie wzorce kalibracyjne 125I z żywicy z tworzywa sztucznego o grubości 20 μm. Żywica z tworzywa sztucznego w tych standardach częściowo chroni folię przed promieniowaniem, tak że przy kalibracji należy uwzględnić równoważność tkankową ~40%.</li>
</ol>
3. Ekspozycja i wywołanie filmu
<ol>
	<li>Udaj się do ciemni z kasetą rentgenowską z taśmą i filmem do autoradiografii. Otwórz kasetę i umieść w niej karton ze szkiełkami (Rysunek 6).
	<ol>
		<li>Wyłącz światła i włącz światło awaryjne. Ostrożnie otwórz pudełko z filmem rentgenowskim, wyjmij jeden film i umieść film błyszczącą stroną do góry (z postrzępioną krawędzią w prawym dolnym rogu) na wierzchu szkiełek w kasecie. Ostrożnie zamknij kasetę i przekręć pręty blokujące, aby uszczelnić światło (Rysunek 6). Szkiełka należy naświetlać przez kilka dni do kilku tygodni w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W ciemni otwórz kasetę i kontynuuj proces wywoływania filmu.
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka w tacach kolejno: wywoływacz na 2 minuty, woda zawierająca 5% lodowatego kwasu octowego przez 30 sekund i utrwalacz przez 5 minut. Folie umieszcza się na tacy z bieżącą wodą na 20 minut, a następnie umieszcza w Photoflo na nie dłużej niż 10 sekund i zawiesza. 
		Uwaga: Czas naświetlania jest określany empirycznie i może obejmować wiele filmów o różnych czasach naświetlania: wystarczająco długi, aby uzyskać mierzalne sygnały z obszarów o słabym wiązaniu, ale nie tak długi, aby nasycić film obszarami o wysokim wiązaniu. Po uzyskaniu akceptowalnych ekspozycji przejdź do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Histologia
<ol>
	<li>Przygotować odczynniki do barwienia tioniny i barwienia (Tabela 2, Rysunek 7).
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka "-3" w stojaku na szkiełka i przenoś w kolejności sekwencyjnej, zaczynając od wody dejonizowanej przez 1 minutę, następnie roztworu barwienia tioniny przez 10 minut, a następnie trzykrotnie zanurz w wodzie dejonizowanej i przemyj jedno 30-sekundowe mycie w wodzie dejonizowanej.</li>
		<li>Po wodzie umieść ruszt szkiełkowy w płuczkach z etanolem w następujący sposób: 50%, 70% i 90% na 30 sekund, a następnie wykonaj dwa płukania etanolem w 100% przez 1 minutę każde. Na koniec umieść ruszt do szkiełek w ksylenie na 3 minuty, a następnie przenieś do drugiego roztworu ksylenu na 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmować po jednym szkiełku z ostatniej kąpieli ksylenowej i przykryć górną krawędź szkiełka podstawą z żywicy w podłożu montażowym rozpuszczalnika organicznego, a następnie umieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 60 mm na szkiełku. Pozostaw slajdy do wyschnięcia na ~48 godzin, a następnie zeskanuj je do komputera w skali szarości 2,400 dpi.</li>
</ol>
5. Densytometryczna analiza obrazu
<ol>
	<li>Umieść film błyszczącą stroną do dołu, z postrzępioną krawędzią w lewym dolnym rogu i zeskanuj za pomocą zastrzeżonego skanera, który jest w stanie przesyłać informacje o gęstości filmu bez żadnych zniekształceń w komputerze systemu obrazowania.</li>
	<li>Otwórz zastrzeżony system obrazowania i wykorzystaj paski kalibracyjne do ustalenia standardów kalibracji dla przyszłej analizy densytometrycznej obrazów na kliszy (rysunki 9-12).</li>
	<li>Zmierz obszary zainteresowania, ustanawiając szablon lub empirycznie przedstawiając obszary zainteresowania. Dane są zbierane i rozdzielane na podstawie folii, typu kontrolnego lub dzikiego (sekcja) i regionu. Upewnij się, że w pomiarach uwzględniono gęstość (fmol/g), obszar skanowania i całkowity obszar docelowy (Rysunek 9).
	<ol>
		<li>Dostosuj paski obszaru skanowania, upewniając się, że obszar zainteresowania mieści się między parametrami podświetlania (Rysunek 10).</li>
		<li>Eksportowanie danych do arkusza kalkulacyjnego (Tabela 4). Pomnóż gęstość razy całkowity obszar docelowy, a następnie podziel przez obszar skanowania, aby uzyskać wartość powiązania tego konkretnego obszaru. Gdy zostanie to zrobione dla wszystkich zmierzonych wartości, należy substratować ustaloną niespecyficzną wartość od całkowitej, aby uzyskać określone wiązanie. Dla tych wartości można również przeprowadzić uśrednienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Robert Speth udzielił komercyjnemu sprzedawcy licencji na stosowanie przeciwciał przeciwko receptorom angiotensyny II i otrzymuje tantiemy ze sprzedaży tych przeciwciał. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany protokół identyfikuje wizualizację "całkowitego" i "niespecyficznego" wiązania radioligandu w sąsiednich odcinkach koronalnych mózgu gryzonia, uprzednio pobranego i przechowywanego w temperaturze -80 °C i może być łatwo stosowany do praktycznie każdej tkanki, która ma anatomicznie rozwiązane podstruktury, które wykazują zróżnicowane ilości receptorów lub miejsc wiązania radioligandu. Procedury opisane w protokole są proste, a analiza ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej interpretacji wyników. Grubość 20 μm uznan...

Choroby układu krążenia nadal są główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności w Stanach Zjednoczonych, powodując ponad 30% zgonów w USA w 2011 roku1. Najnowsze statystyki American Heart Association wskazują, że więcej niż jedna osoba na trzy cierpi na jeden lub więcej rodzajów chorób sercowo-naczyniowych. Badania sercowo-naczyniowe nadal czynią postępy w kierunku zrozumienia tej choroby, ale ponieważ pokolenia zaczynają się starzeć, konieczne jest kontynuowanie tych wysiłków. Układ renina-angiotensyna (RAS) odgrywa kluczową rolę w regulacji układu sercowo-naczyniowego, głównie poprzez promowanie miażdżycy, stanu zapalnego, ogólnoustrojowego zwężenia naczyń krwionośnych i aktywacji współczulnego układu nerwowego (ryc. 1)2-8.
RAS to system hormonalny, który jest aktywowany, gdy komórki przykłębuszkowe nerki wydzielają reninę do krwiobiegu w odpowiedzi na obniżone ciśnienie krwi, zwiększoną stymulację układu współczulnego lub zmniejszony przepływ sodu przez plamkę gęstą. Renina metabolizuje angiotensynogen (syntetyzowany w wątrobie) do powstania angiotensyny I (Ang I). Ang I jest następnie metabolizowany przez enzym konwertujący angiotensynę (ACE), ektoenzym po stronie światła komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, głównie w płucach i nerkach, tworząc angiotensynę II (Ang II), główny peptyd efektorowy RAS. Ang II jest zdolny do aktywacji dwóch podtypów receptorów; receptor typu 1 (AT1R) i receptor typu 2 (AT2R), które regulują pracę układu sercowo-naczyniowego, utrzymują homeostazę płynów i elektrolitów i są obecnie uważane za wpływające na funkcje poznawcze i procesy chorób neurodegeneracyjnych8,9. Doniesiono, że lokalny, specyficzny dla mózgu RAS niezależnie syntetyzuje Ang II. W mózgu białko prekursorowe angiotensynogen jest syntetyzowane w astrogleju10 przekształcane w Ang I przez enzym podobny do reniny3, prawdopodobnie proreninę związaną z receptorem proreniny11, a następnie przekształcane w Ang II przez enzym konwertujący angiotensynę, który ulega obfitej ekspresji na zewnątrzkomórkowej powierzchni neuronów w mózgu12. Ten wytwarzany wewnątrz mózgu Ang II jest agonistą receptorów mózgu AT1 i AT2, które są izolowane z przenoszonego przez krew Ang II.
Chociaż AT1R odgrywa ważną rolę fizjologiczną, jest lepiej znany ze swoich patofizjologicznych efektów w całym ciele, głównie wpływając na układ sercowo-naczyniowy i nerki (Rysunek 2). Kiedy Ang II wiąże się z AT1R, powoduje zwężenie naczyń krwionośnych; zwiększenie oporu przepływu krwi i podniesienie ciśnienia krwi. Wspomaga również syntezę i wydzielanie aldosteronu i wazopresyny, co prowadzi do zwiększonej retencji sodu i wody. Efekty te mogą również wywoływać niedokrwienne uszkodzenie mózgu i upośledzenie funkcji poznawczych i są związane z chorobą Parkinsona, chorobą Alzheimera i cukrzycą, a także niedawno zidentyfikowano wpływ na uczenie się i pamięć13-15. W RAS występuje pętla sprzężenia zwrotnego, w której AT1R na komórkach przykłębuszkowy w nerce hamuje wydzielanie reniny. Co ciekawe, AT2R ogólnie przeciwreguluje działanie AT1R, powodując między innymi rozszerzenie naczyń krwionośnych, rozrost neurytów, regenerację aksonów, antyproliferację i ochronę mózgu16-20. AT2R został również zidentyfikowany jako cel dla leków przeciwnadciśnieniowych, a ostatnio także przeciwnowotworowych21. Określenie lokalizacji i gęstości receptorów Ang II w różnych tkankach oraz wpływu różnych metod leczenia i stanów chorobowych za pomocą ilościowej densytometrycznej autoradiografii receptorów pomoże odkryć rolę, jaką RAS odgrywa w określonych chorobach.
Autoradiografia receptorów jest stosowana od ponad 30 lat jako skuteczna metoda oznaczania obecności receptorów angiotensyny II i innych składników RAS w mózgu i innych tkankach szczura, myszy, świnki morskiej, psa i człowieka w różnych warunkach eksperymentalnych22-34. Znaczenie lokalizacji receptorów Ang II w mózgu polega na tym, że można zastosować neuroanatomię funkcjonalną do działania Ang II w mózgu, np. obecność AT1R w jądrze przykomorowym podwzgórza (PVN) sugeruje funkcję Ang II w mózgu w celu stymulowania uwalniania wazopresyny, oksytocyny lub hormonu uwalniającego kortykotropinę (CRH), lub aktywacja współczulnego układu nerwowego. Tak więc leki, które blokują AT1R, mogą zmniejszać niektóre z tych efektów za pośrednictwem PVN związanych z nadmierną aktywnością RAS w mózgu. Trwające prace sugerują, że stosowanie antagonistów AT1R może zmniejszać uwalnianie CRH wywołane zespołem stresu pourazowego (PTSD) i łagodzić objawy PTSD (Hurt i wsp., przedłożone do publikacji). PVN, narząd podogonowy (SFO) i ciało migdałowate są znane z regulacji homeostazy, apetytu/pragnienia, snu, pamięci, reakcji emocjonalnych i są obszarami docelowymi tego badania demonstracyjnego. Obszary te badano poprzez pobieranie wycinków koronalnych mózgu na szkiełkach mikroskopowych i traktowanie tych skrawków specyficznymi inhibitorami wraz ze specyficznym radioligandem dla receptorów Ang II. W tym badaniu wymieniono wszystkie materiały i odczynniki wraz z sugerowanymi dostawcami, Jod-125 użyto do znakowania radioaktywnego antagonisty receptora Ang II, sarkozyny1, izoleucyny8 Ang II (SI Ang II), która następnie została oczyszczona jako mono125 I-SI Ang II przy użyciu metod HPLC, jak opisano wcześniej35. Zastosowanie tego radioligandu o wysokiej aktywności specyficznej pozwala na wizualizację obszarów o niskiej, umiarkowanej i wysokiej gęstości receptorów po ekspozycji znakowanych radioaktywnie skrawków na kliszę rentgenowską. Kalibrując film za pomocą wzorców pasty mózgowej zawierających znane ilości jodu-125, można określić ilościowo określoną ilość wiązania receptora Ang II w danym obszarze. W badaniach eksperymentalnych wiązanie receptora Ang II w mózgach osób eksperymentalnych można porównać do tego w mózgach osób z grupy kontrolnej. Może to wskazywać, czy działanie Ang II jest zmienione w odpowiedzi na chorobę genetyczną, nieprawidłowość fenotypową, stan chorobowy lub leczenie farmakologiczne. Wiedza ta może być następnie wykorzystana do opracowania terapii w leczeniu chorób związanych z rozregulowaniem RAS. Alternatywnymi technikami, które identyfikują miejsca wiązania receptorów, ale o zmniejszonej rozdzielczości anatomicznej, są testy wiązania, które wykorzystują preparaty błon tkankowych pochodzące z homogenatów tkankowych, które są inkubowane z radioligandem w zakresie stężeń w celu oceny powinowactwa wiązania radioligandu jako stałej dysocjacji (KD) i maksymalnej zdolności wiązania (Bmax) tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.
Opisany tutaj protokół można podzielić na 5 głównych elementów: Przygotowanie skrawków tkanek do autoradiografii receptorów; Autoradiografia receptorów; Ekspozycja i wywołanie filmu; Histologia; i densytometryczna analiza obrazu.

<table><tbody><tr><td>500 ml Zlewki plastikowe</td><td>Fisher</td><td>02-591-30</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 60 mm Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>22-050-25</td><td></td></tr><tr><td>Folia do obrazowania autoradiograficznego 24 mm x 30 cm</td><td>Carestream-Biomax MR Film</td><td>891-2560</td><td></td></tr><tr><td>Bacytracyna (z Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma</td><td>B-0125</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz tektury 8 x 11</td><td>Tablica ilustracji półksiężyca #201</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Słoiki Coplin</td><td>Fisher Scientific</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>Komercyjne suszarki do włosów</td><td>Conair</td><td>Model SD6X</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe probówki hodowlane</td><td>Fisher</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (sól disodowa, dihydrat)</td> <td>USB Corporation</td><td>15-699</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>16-100-210&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Substytut receptury dla D-19 Developer</td><td>Photographers Formulary, Inc.&nbsp;</td><td>01-0036</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Fisher</td><td>A38 SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Histoprep/OCT</td><td>Fisher</td><td>SH75-125D</td><td></td></tr><tr><td>Film Fixer</td><td>Kodak</td><td>5160320</td><td></td></tr><tr><td>Photo flo</td><td>Kodak</td><td>1464502</td><td></td></tr><tr><td>Losartan</td><td>Fisher/Tocris</td><td>37-985-0</td><td></td></tr><tr><td>MCID&trade; Core 7.0</td><td>MCID</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty ślizgowe Peel-A-Way</td><td>VWR</td><td>48440-003</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PD123319</td><td>Fisher</td><td>13-615-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium Charged Slides, drobno szlifowane</td><td>Prowadnice mikroskopowe Premiere</td><td>9308W</td><td></td></tr><tr><td> 125I Ligands</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX- 248</td><td></td></tr><tr><td>125SI-Ang II&nbsp;</td><td>George Washington University</td><td>Radiojodowany przez Dr. Speth</td><td></td></tr><tr><td>Slide Mailers</td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny fosforan dwuzasadowy sodu (Na2PO4)</td><td>Fisher</td><td>RDCS0750500</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu (bezwodny)</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Tionina&nbsp;</td><td>Kaseta</td> rentgenowska Fisher <td>T409-25</td><td></td></tr><tr><td>(10 x 12)</td><td>Spectronics Corporation</td><td>Cztery kwadratowe</td><td></td></tr><tr><td>ksyleny</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół autoradiografii receptorów do miejscowej wizualizacji receptorów angiotensyny ii

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

Ten protokół opisuje wzorce wiązania receptora dla angiotensyny II (Ang II) w mózgu szczura za pomocą radioligandu specyficznego dla receptorów Ang II do przeprowadzenia autoradiograficznego mapowania receptorów.
Próbki tkanek są pobierane i przechowywane w temperaturze -80 °C. Kriostat służy do koronalnego cięcia tkanki (mózgu) i rozmrażania skrawków na naładowanych szkiełkach. Skrawki tkanek montowane na szkiełku są inkubowane w 125I-SI-Ang II w celu znakowania radioizotopem receptorów Ang II. Sąsiednie szkiełka rozdziela się na dwa zestawy: "niespecyficzne wiązanie" (NSP) w obecności stężenia nasycającego receptor nieznakowanego radioaktywnie Ang II lub selektywnego antagonisty receptora Ang II podtypu AT1 Ang II (AT1R) oraz "całkowite wiązanie" bez antagonisty AT1R. W buforze inkubacyjnym występuje również stężenie nasycające antagonisty podtypu AT2 Ang II (AT2R) (PD123319, 10 μM) w celu ograniczenia wiązania 125I-SI-Ang II z podtypem AT1R. Podczas 30-minutowej inkubacji wstępnej w temperaturze ~22 °C, szkiełka NSP są poddawane działaniu 10 μM PD123319 i losartanu, podczas gdy szkiełka "całkowitego wiązania" są poddawane działaniu 10 μM PD123319. Szkiełka są następnie inkubowane z 125I-SI-Ang II w obecności PD123319 w celu "całkowitego wiązania" oraz PD123319 i losartanu dla NSP w buforze testowym, a następnie kilka "płukań" w buforze i wodzie w celu usunięcia soli i niespecyficznie związanego radioligandu. Szkiełka są suszone za pomocą suszarek, a następnie poddawane działaniu filmu autoradiograficznego za pomocą specjalistycznej folii i kasety. Film jest wywoływany, a obrazy są skanowane do komputera w celu densytometrii wizualnej i ilościowej przy użyciu zastrzeżonego systemu obrazowania i arkusza kalkulacyjnego. Dodatkowy zestaw szkiełek jest barwionowany tioniną w celu porównań histologicznych.
Zaletą korzystania z autoradiografii receptorowej jest możliwość wizualizacji receptorów Ang II in situ, w obrębie przekroju próbki tkanki, oraz anatomicznej identyfikacji obszaru tkanki poprzez porównanie go z sąsiednim histologicznym odcinkiem referencyjnym.

Przegląd szlaku metabolicznego układu renina-angiotensyna przedstawiono na Rysunku 1, a bezpośredni opis podtypów receptorów angiotensyny II (AT1R i AT2R) znajduje się na Rysunku 2. Rysunek 3 obrazuje przenoszenie koronarnych przekrojów mózgu na szkiełka przedmiotowe, które następnie poddaje się procedurze autoradiografii receptorowej z użyciem określonego stężenia 125I-SIAng II, co pokazano na Rys...

Tutaj prezentujemy protokół opisujący lokalizację receptorów angiotensyny II typu 1 w mózgu szczura za pomocą ilościowej, densytometrycznej autoradiografii receptorów in vitro przy użyciu analogu angiotensyny II, znakowanego jodem-125.

Protokół autoradiografii receptorów do miejscowej wizualizacji receptorów angiotensyny II

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest anatomiczna lokalizacja i ilościowe określenie ekspresji receptorów angiotensyny II w przekrojach mózgu z wykorzystaniem autoradiografii receptorowej oraz histologicznej identyfikacji struktur mózgu. Metoda ta pozwala zidentyfikować obszary mózgu, w których angiotensyna II wpływa na zachowanie, funkcje poznawcze oraz układ sercowo-naczyniowy, dostarczając informacji istotnych dla opracowania nowych terapii w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych i sercowo-naczyniowych. Głównymi zaletami tej techniki są jej charakter ilościowy i jakościowy oraz możliwość identyfikacji funkcjonalnych receptorów angiotensyny II z większą swoistością niż w przypadku innych metod.Metoda ta może służyć również do charakteryzacji funkcjonalności innych układów receptorów hormonalnych w całym organizmie, takich jak receptory związane z narkotykami. Niezwłocznie po pobraniu, należy umieścić tkanki mózgowe w formach do mózgu, które symulują wnętrze czaszki, a następnie owinąć formy folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C. Po 30 minutach tkanki należy przenieść do szczelnej torby do przechowywania w zamrażarce i przechowywać torbę w temperaturze -80 °C.Przed wykonaniem skrawków ostrożnie wyjmij mózg z formy. Aby wykonać skrawki tkanki mózgowej, przenieś odpowiedni preparat do kriotomostatu ustawionego w temperaturze od -10 do -18 °C. Po wyrównaniu temperatury tkanki, użyj medium na bazie glikolu i żywicy, aby pionowo zatopić niewielką część preparatu w uchwycie do tkanek, co umożliwi wykonanie skrawków w płaszczyźnie czołowej.Umieść tkankę w mikrotomie i mocno dokręć uchwyt, następnie rozpocznij cięcie mózgu z wybraną grubością, a następnie mocuj przekroje na szkiełkach mikroskopowych w orientacji pionowej, aby zapewnić większą powierzchnię styku tkanki z szkiełkiem. Zbieraj przekroje w sekwencyjnych seriach po pięć sztuk. Po zebraniu wszystkich przekrojów pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez maksymalnie jedną godzinę.Następnie umieść próbki w plastikowym pudełku na szkiełka w samouszczelniającej torbie mrożniczej i przechowuj w temperaturze -20 °C. Aby przeprowadzić znakowanie radiacyjne preparatów, wyjmij pierwsze i drugie szkiełko z każdego zestawu pięciu i zamontuj je w dostępnych komercyjnie lub wydrukowanych w technologii 3D uchwytach do szkiełek. Szkiełka oznaczone jako -1 są przeznaczone dla grupy traktowanej nieswoiście, a szkiełka -2 dla grupy traktowanej całkowicie.Odwróć preparaty w 35 do 40 mililitrów AM5 w temperaturze pokojowej wraz z odpowiednimi inhibitorami w stosownych słoikach Coplina do preinkubacji. Przetwarzanie wielu zestawów preparatów jednocześnie może być uciążliwe. Dlatego niezwykle ważne jest umieszczanie preparatów w słoikach do preinkubacji w czterominutowych odstępach czasu, aby upewnić się, że nie dojdzie do nakładania się etapów podczas procesu suszenia.Po 30 minutach przenieś preparaty do kaset inkubacyjnych zawierających 10 ml AM5 uzupełnionego o odpowiednie stężenie I125 SI Angiotensin II oraz inhibitory dla poszczególnych grup badawczych na 60 do 90 minut w temperaturze pokojowej. Wyznaczenie dokładnego stężenia 125I SI Ang II jest kluczowe dla umożliwienia porównania receptorów angiotensyny II pomiędzy kolejnymi dniami. Po zakończeniu inkubacji przenieś preparaty z powrotem do uchwytów, zablokuj je i delikatnie zamieszaj okrężnym ruchem przez jedną do dwóch sekund w dwóch oddzielnych naczyniach zawierających 400 ml wody destylowanej.Po drugim płukaniu wodą, wypłucz preparaty na szkiełkach czterokrotnie, przez jedną minutę każdego razu, w 30 do 40 mililitrów AM5. Po czwartym płukaniu, delikatnie zamieszaj sekcje ruchem wirowym przez jedną do dwóch sekund w czterech kolejnych porcjach lodowatej wody destylowanej. Następnie użyj czterech suszarek nadmuchowych ustawionych pod różnymi kątami, aby suszyć szkiełka chłodnym powietrzem przez cztery minuty.Po wyschnięciu wszystkich sekcji przenieś preparaty na ręcznik papierowy. Następnie użyj dwustronnej taśmy, aby przymocować preparaty stroną z tkanką do góry do kawałka tektury do filmu rentgenowskiego, uwzględniając co najmniej jeden preparat kalibracyjny z jodem 125 na każdą grupę. Aby naświetlić sekcje na film, umieść tekturowe podłoże z preparatami w kasecie rentgenowskiej z zapadką w ciemni, a następnie zgaś światła.Włącz bezpieczne światło i ostrożnie otwórz pudełko z filmem rentgenowskim. Połóż jeden arkusz filmu stroną błyszczącą do góry, z poszarpaną krawędzią w prawym dolnym rogu, na slajdach w kasecie. Następnie ostrożnie zamknij kasetę, przekręcając rygle blokujące w celu uszczelnienia przed światłem, i przechowuj kasetę w temperaturze minus 20 stopni celsius.Po odpowiednim czasie ekspozycji przenieś film do roztworu wywoływacza na dwie minuty, następnie na 30 sekund do kąpieli przerywającej (podwójnie destylowana woda z kwasem octowym), a potem na pięć minut do roztworu utrwalacza. Płucz film w kuwecie z bieżącą wodą przez 20 minut. Przenieś go do surfaktantu na około 10 sekund i powieś film do wyschnięcia.W celu przeprowadzenia analizy histologicznej przekrojów tkanki mózgowej, rozmrozić trzy przekroje w kasecie do slajdów. Następnie przemyć przekroje wodą dejonizowaną przez jedną minutę, po czym inkubować przez 10 minut w roztworze barwiącym z tioniną i trzykrotnie zanurzyć w pojemniku z wodą dejonizowaną. Zanurzyć slajdy na dodatkowe 30 sekund w celu przemycia wodą dejonizowaną.Następnie przemyj preparaty w kolejnych kąpielach z etanolu, zgodnie z instrukcją. Po ostatnim płukaniu w 100% etanolu, przemyj preparaty w dwóch naczyniach z ksylenem przez kolejno trzy i pięć minut. Po zakończeniu drugiego płukania w ksylenie, pokryj górną krawędź każdego preparatu z osobna medium montażowym na bazie żywicy i rozpuszczalnika nieorganicznego.Przymocuj szkiełka przykrywcze o wymiarach 24 by 60 milimetrów do szkiełek przedmiotowych i pozostaw je do wyschnięcia na 48 godzin. Następnie zdigitalizuj szkiełka i filmy do komputera w skali szarości z rozdzielczością 2400 DPI. W celu analizy filmu metodą densytometrii, po skanowaniu, empirycznie wyznacz obszary zainteresowania na każdym filmie.Jest to obraz w pseudokolorach wygenerowany po otwarciu zeskanowanej kliszy w programie do analizy obrazu. W pomiarach uwzględnij gęstość, obszar skanowania oraz całkowity obszar celu. Dostosuj paski obszaru skanowania, aby upewnić się, że każdy obszar zainteresowania mieści się w parametrach wyróżnienia.Następnie należy wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego, aby określić wiązanie specyficzne dla każdej próbki. Jednostki standardu kalibracyjnego do kwantyfikacji są określane na podstawie daty wykonania analizy. Po zeskanowaniu filmów wartości kalibracyjne są wykorzystywane do wygenerowania krzywej na podstawie różnych stężeń standardów jodu 125 dla tego konkretnego filmu.Wartości kalibracyjne i standardowe zapisuje się w trzech powtórzeniach w celu zapewnienia dokładności. Rozróżnienie między wiązaniem nieswoistym a grupami całkowitymi, a także etykiety tkanek, ustala się poprzez przypisanie każdego zestawu danych do odpowiednich podgrup. Wyższą wartość progową należy ustawić, dostosowując parametry od koloru czerwonego do czarnego, natomiast niższą wartość progową należy ustawić blisko zera, aby umożliwić dokładniejszy pomiar całego przeskanowanego obszaru zainteresowania.Na przykład, tutaj końcowe zmierzone obszary jądra przykomorowego podwzgórza w grupach wiązania całkowitego i niespecyficznego porównano z przekrojem barwionym tioniną w celu potwierdzenia anatomicznego. Wiązanie niespecyficzne to ilość radioliganda związanego z receptorami innymi niż receptory angiotensyny w obecności nasycającego stężenia nieradiacyjnego ligandu receptora angiotensyny I, natomiast wiązanie całkowite to ilość radioliganda związanego wykluczając obecność nieradiacyjnego ligandu receptora angiotensyny I. Wartości wiązania niespecyficznego można następnie odjąć od wartości wiązania całkowitego, aby uzyskać wartości wiązania specyficznego dla receptorów angiotensyny I.Po opanowaniu techniki etap autoradiografii receptorowej można przeprowadzić w około cztery godziny, natomiast wywoływanie klisz zajmuje około 30 minut na jedną kliszę. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest śledzenie czasu, aby upewnić się, że wszystkie preparaty są inkubowane, płukane i suszone przez dokładnie ten sam czas. Po zakończeniu tej procedury można przeprowadzić dodatkowe badania morfologii mózgu w celu oceny zmian w wielkości obszarów wykazujących ekspresję receptora angiotensyny II.Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się farmakologią receptorów do określenia, w jaki sposób różne obszary mózgu są oddziaływane przez rozmaite neurohormony, neuroprzekaźniki i leki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak pomyślnie przeprowadzić badanie autoradiografii receptorowej, przygotować preparaty barwione histologicznie oraz ocenić autoradiogramy w celu lokalizacji receptorów w konkretnych obszarach mózgu. Należy pamiętać, że praca z substancjami promieniotwórczymi może być niebezpieczna, dlatego zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak odpowiednie osłony, zabezpieczenia, monitorowanie ekspozycji oraz właściwa utylizacja, aby uniknąć skażenia promieniotwórczego.

receptor-autoradiography-protocol-for-localized-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metody optymalizacji detekcji immunofluorescencyjnej receptora estrogenowego α (ERα) w skrawkach tętnic oponowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego.

Obrazowanie receptorów estrogenowych $\alpha$ w tętniczkach oplątwowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego

Bioortogonalna cykloaddycja Dielsa-Aldera została wykorzystana do stworzenia skutecznej i modułowej, pretargetowanej strategii obrazowania PET dla raka. W niniejszym protokole etapy tej metodologii są opisane w kontekście systemu modelowego wykorzystującego przeciwciało ukierunkowane na raka jelita grubego huA33 i radioligand znakowany 64Cu.

Wykorzystanie bioortogonalnej cykloaddycji Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania PET

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Ten manuskrypt opisuje zastosowanie transgenicznych myszy reporterowych i różnych dróg podawania barwników fluorescencyjnych w nadciśnieniu wywołanym angiotensyną II za pomocą przyżyciowej mikroskopii wideo naczyń krwionośnych do oceny aktywacji komórek odpornościowych i ich zdolności do zwijania się i przylegania do śródbłonka.

Wizualizacja wałowania i adhezji leukocytów u myszy z infuzją angiotensyny II: techniki i pułapki

Integrynaα vβ3 jest rodzajem białka adhezyjnego, które ulega silnej ekspresji na aktywowanych komórkach śródbłonka przechodzących angiogenezę. W związku z tym ocena integralności integryny jest bardzo interesująca w onkologii. W tym miejscu przedstawiamy metodę otrzymywania 68radiopeptydów znakowanych Ga oraz metodę oceny jej skuteczności biologicznej.

Przygotowanie peptydu argininowo-glicynowego asparaginianu (RGD) znakowanego 68Ga do angiogenezy

Metoda autoradiografii jest rutynowo stosowana do badania wiązania radioligandów z sekcjami tkanek w celu określenia jakościowej lub ilościowej farmakologii.

Autoradiografia jako prosta i skuteczna metoda wizualizacji i charakterystyki celów farmakologicznych

Profilowanie proteomiczne białek azotowanych tyrozyną było trudną techniką ze względu na niską obfitość modyfikacji 3-nitrotyrozyny. W tym miejscu opisano nowatorskie podejście do wzbogacania i profilowania nitropeptydów przy użyciu angiotensyny II jako modelu. Metoda ta może zostać rozszerzona na inne systemy in vitro lub in vivo.

Profilowanie i identyfikacja nitropeptydów zilustrowane angiotensyną II

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię pomiaru izolewukleryn w tkankach metodą immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała ScFv D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną. Modele nadciśnienia zarówno u myszy, jak i u ludzi są wykorzystywane do wyjaśnienia krok po kroku procedur i podstawowych zasad związanych z pomiarem izolewuklesyny w próbkach tkanek.

Bezpośrednie wykrywanie izolewuglandyn w tkankach przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11 scFv i immunofluorescencji

W niniejszym artykule omawiamy metodologię oraz kwestie istotne dla zatwierdzonego przez FDA protokołu leczenia depresji z wykorzystaniem urządzenia Neuronetics NeuroStar TMS.

Urządzenie NeuroStar TMS: Przeprowadzanie zatwierdzonego przez FDA protokołu leczenia depresji

Odtwarzanie wideo jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach nad zachowaniem zwierząt. Stworzyliśmy i oceniliśmy program, który umożliwia interaktywne odtwarzanie trójwymiarowych animacji komputerowych w oparciu o zestaw reguł, w odpowiedzi na automatycznie gromadzone w czasie rzeczywistym dane dotyczące zachowania obiektu badań.

Zautomatyzowane interaktywne odtwarzanie wideo w badaniach nad komunikacją zwierząt

Poznaj autoradiografię receptorów do lokalizacji i ilościowego oznaczania receptorów angiotensyny II w mózgu szczura. Ta metoda pozwala wizualizować dystrybucję receptorów z większą specyficznością niż inne techniki.

Protokół autoradiografii receptorów do miejscowej wizualizacji receptorów angiotensyny II

Przeglądaj więcej filmów