Prosty test biologiczny do oceny czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych

Ogólnym celem tego prostego bioanalizy opartej na komórkach jest wykrywanie, kwantyfikacja i monitorowanie aktywności ligandów z rodziny czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Metoda ta pozwala na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii naczyniowej, wirusologii, onkologii i okulistyki, gdzie ligandy z rodziny VEG-FR regulują kluczowe procesy w przebiegu tych chorób. Główną zaletą tego testu jest możliwość oceny ligandów z rodziny VEG-FM pod kątem ich zdolności do wiązania i sieciowania różnych receptorów bez konieczności wykorzystania wyspecjalizowanych komórek nabłonkowych.

Hodowlę linii komórkowej WEHI-3D wydzielającej IL3 prowadzić poprzez pipetowanie 5 × 10⁶ komórek w fazie logarytmicznego wzrostu do od czterech do dziesięciu kolb T175 zawierających 50 ml świeżej pożywki hodowlanej. Inkubować przez siedem dni lub do momentu, aż komórki przekroczą fazę logarytmicznego wzrostu o około 24 do 48 godzin. Odlać ciecz wraz z komórkami z kolb.

Następnie wirować przy 1 000 G przez 15 minut w celu usunięcia komórek i szczątków komórkowych. Następnie pobrać górne 90% supernatantu i przefiltrować go przez jednostkę filtrującą o rozmiarze porów 0,22 mikrona. Podzielić warunkową pożywkę na aliquoty po 1 ml do przygotowania analizy.

Aliquoty o objętości 50 ml do sporządzania pożywki do pasażowania linii komórkowych zależnych od czynników oraz objętości 200 ml do długotrwałego przechowywania w temperaturze 20 °C. Mniejsze objętości przechowywać w temperaturze 20 °C. Hodować kontrolne komórki BAF3 w pożywce zawierającej 10% medium warunkującego WEHI-3D.

oraz komórki VegFR2-EPoR-BAF3 w tym samym medium z dodatkiem 1 mg/mL G418. Przesiewać komórki w rozcieńczeniach od 1:10 do 1:15 z komórek rosnących w fazie logarytmicznej. Zebrać kontrolne komórki BAF3 lub VegFR2VPoR-BAF3 z kultur znajdujących się w środkowej fazie logarytmicznej.

Za pomocą delikatnego pipetowania należy usunąć komórki z dna kolby, a następnie wirować z prędkością 750 Gs przez pięć minut w celu uzyskania osadu komórkowego. Osad należy zawiesić ponownie w 10 ml fosforanowego buforu solnego o toniczności mysiej i ponownie wirować przy 750 Gs przez pięć minut. Procedurę płukania należy powtórzyć jeszcze dwukrotnie, aby usunąć pożywkę zawierającą IL3.

Przemyj komórki raz, używając pożywki bez medium warunkującego DEHI-3D. Ważne jest usunięcie pożywki hodowlanej zawierającej IL3, aby upewnić się, że nie pozostały żadne dodatkowe czynniki wzrostu, które mogłyby spowodować wynik fałszywie dodatni lub wysoką aktywność tła. Po odwirowaniu i odlaniu supernatantu, ponownie zawieś komórki w tej samej pożywce wolnej od IL3 w stężeniu 7,4 × 10⁴ komórek na mililitr.

Na koniec wymieszać w równych objętościach błękit trypanu w PBS z populacją komórek i nanieść do hemacytometru. Policzyć co najmniej 100 komórek. Komórki, które przyjęły barwnik, uznaje się za martwe lub obumierające.

Kluczowe jest, aby komórki wykorzystywane w teście wykazywały wysoką żywotność, co zapewni ich zdolność do reakcji na warunki pomiarowe. Używając dobrze skalibrowanej automatycznej pipety P20 oraz autoklawowanych końcówek, nanieś 1 000 komórek w 13,5 µL pożywki pozbawionej IL do dołków płytki 72-dołkowej. Należy pamiętać o mieszaniu zawiesiny komórkowej podczas aliquotowania, aby zapobiec sedymentacji komórek pod wpływem grawitacji, co mogłoby wpłynąć na stężenie komórek.

Używając odpowiednio skalibrowanej pipety P2, nanieś 1,5 µL pożywki wolnej od IL3 w trzech powtórzeniach do studni kontrolnych. Delikatnie wymieszaj. W ten sam sposób dodaj 10% warunkowej pożywki WEHI-3D oraz kontrolę z 100 ng/mL VegFA bez IL3 do odpowiednich studni.

Na koniec dodaj 1,5 µL próbek testowych w trzech powtórzeniach. Wypełnij niewykorzystane dołki płytki mikrotitracyjnej sterylną wodą, PBS lub pożywką. Umieść nasączony wodą papier tkankowy w przepuszczalnym dla gazów pojemniku, aby stworzyć wilgotną komorę umożliwiającą wymianę gazową.

Inkubuj płytki testowe w komorach w nawilżonej atmosferze z dodatkiem 10% dwutlenku węgla przez 16 godzin. Po 16 godzinach inkubacji przeanalizuj płytki przy użyciu standardowego odwróconego mikroskopu fazowego przy powiększeniu od 40 do 100x. Na tym etapie możliwe jest rozróżnienie próbek pozytywnych i negatywnych.

Dołeczki pozbawione czynników wzrostu lub zawierające samo medium będą charakteryzować się zmniejszoną liczbą okrągłych komórek, a także obecnością komórek martwych lub obumierających oraz detrytusu komórkowego. Z kolei komórki inkubowane w medium zawierającym IL3 lub ligand dla VegFR2 są duże i półprzezroczyste, a w cytoplazmie komórek lub w kulturze nie stwierdza się lub stwierdza minimalną obecność ziarnistości bądź detrytusu komórkowego. Do dołeczków standardowej płytki 96-dołkowej należy dodać 10 000 przemytych komórek w 135 µL medium pozbawionego IL3.

Za pomocą skalibrowanej pipety P20 nanieś 15 µL próbek testowych i kontroli do dołków. Inkubuj mieszaninę komórek, czynników wzrostu i/lub inhibitorów przez 48 godzin w sposób opisany wcześniej. Po zakończeniu okresu inkubacji oceń liczbę żywych komórek w dołkach, stosując metody przedstawione w pisemnej części protokołu.

Przedstawione tutaj są wyniki analizy, w której bioanaliza VEGF-R2 EPoR BAF3 została wykorzystana do ilościowego określenia aktywności trzech rekombinowanych ludzkich ligandów o specyficzności względem VEGF-R2: VEGF-A165, VEGF-C oraz VEGF-D. Aktywność określono ilościowo w obecności bevacizumabu, inhibitorowego przeciwciała monoklonalnego przeciwko VEGF-A165, lub w obecności trastuzumabu, przeciwciała nieneutralizującego.

Dane zostały znormalizowane względem odpowiedzi na sam VEGF-A165. Zgodnie z oczekiwaniami bevacizumab zablokował efekt VEGF-A165 w teście, lecz nie wpłynął na aktywność VEGF-C i VEGF-D. Komórki poddane działaniu IL3 wykazały wysoką żywotność.

Podczas gdy komórki nieeksponowane na dodatkowy czynnik wzrostu wykazują niską żywotność. Przystępując do tej procedury, należy pamiętać, że w pożywkach kondycjonowanych istnieje szereg czynników kontrolnych, które muszą zostać przygotowane przed przeprowadzeniem analizy. Technika ta utorowała drogę do odrodzenia badań w biologii naczyniowej, wirusologii, onkologii i okulistyce w celu zbadania roli VEG-FM w ligandach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować komórki do bioanalizy, przeprowadzić samą bioanalizę oraz wykonać analizy ilościowe lub półilościowe aktywności ligniny VEG-FM.