Prosty test biologiczny do oceny czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych

Ogólnym celem tego prostego, komórkowego testu biologicznego jest wykrycie, ilościowe określenie i monitorowanie aktywności członków rodziny ligin czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii naczyniowej, wirusologii, nowotworach i okulistyce, gdzie liginy z rodziny VEG-FR promieniują kluczowymi procesami w tych chorobach. Główną zaletą tego testu jest to, że umożliwia ocenę ligin z rodziny VEG-FM pod kątem ich zdolności do wiązania i sieciowania różnych receptorów bez konieczności stosowania wyspecjalizowanych komórek nabłonkowych.

Hodowla linii komórkowej wydzielającej IL3 WEHI-3D, pipetując pięć razy dziesięć do szóstych komórek w logarytmie wzrostu do czterech do dziesięciu kolb T175 zawierających 50 milimetrów świeżej pożywki hodowlanej. Inkubować przez siedem dni lub do momentu, gdy komórki przejdą logarytmiczną fazę wzrostu przez około 24 do 48 godzin. Zdekantować płyn i komórki z kolb.

I wiruj z prędkością 1,000 G przez 15 minut, aby usunąć komórki i resztki komórkowe. Następnie usuń górne 90% supernaytentu i przefiltruj go przez filtr o średnicy 0,22 mikrona. Podwielokrotność kondycjonowanej pożywki na jednomililitrowe podwielokrotności w celu przygotowania testu.

50 mililitrów podwielokrotności do przygotowania pożywki hodowlanej do przejścia linii komórkowych zależnych od czynnika i 200 mililitrów objętości do długotrwałego przechowywania w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Przechowuj mniejsze objętości w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Kontroluj hodowlę komórek BAF3 w pożywkach hodowlanych zawierających 10% pożywki kondycjonowanej WEHI-3D.

i komórki VegFR2-EPoR-BAF3 w tym samym podłożu plus jeden miligram na mililitr G418. Pasaż komórek w jednym do 15 rozcieńczeń z komórek rosnących w fazie logarytmicznej. Komórki BAF3 lub VegFR2VPoR-BAF3 do hodowli w środkowej fazie logarytmicznej.

Delikatnie pipetując w celu usunięcia komórek z dna kolby, wirować w temperaturze 750 G przez pięć minut w celu odzyskania osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach mysiego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem toniczności myszy i ponownie odwirować przy 750 Gs przez pięć minut. Powtórz pranie jeszcze dwa razy, aby usunąć podłoże zawierające IL3.

Umyj komórki raz za pomocą pożywki bez pożywki kondycjonowanej DEHI-3D. Ważne jest, aby zmyć pożywkę hodowlaną zawierającą IL3, aby upewnić się, że nie pozostaną żadne dodatkowe czynniki wzrostu, które mogą generować fałszywie dodatni wynik lub wysoką aktywność tła. Po odwirowaniu i odrzuceniu supernayten ponownie zawiesić komórki w tym samym wolnym pożywce IL3 o stężeniu 7,4 razy 10 do czwartych komórek na mililitr.

Na koniec wymieszaj równe objętości błękitu trypanowego w PBS z populacją komórek i załaduj do hemacytometru. Policz co najmniej 100 komórek. Komórki, które pobierają barwnik, są uważane za martwe lub umierające.

Bardzo ważne jest, aby komórki użyte do testu miały wysoką żywotność, aby były w stanie zareagować na warunki testu. Użyj dobrze skalibrowanej automatycznej pipety P20 i autoklawowanych końcówek, aby dodać 1 000 komórek w 13,5 mikrolitrach pożywki z niedoborem IL do dołków 72-dołkowej płytki. Należy uważać, aby wymieszać zawiesinę komórek podczas porcjowania, aby upewnić się, że osiadanie komórek przez grawitację nie wpływa na stężenie komórek.

Użyj dobrze skalibrowanej pipety P2, aby dodać 1,5 mikrolitra wolnego podłoża IL3 w trzech egzemplarzach do studzienek kontrolnych. Skomplikowane do mieszania. W ten sam sposób dodaj 10% pożywkę kondycjonowaną przez WEHI-3D i 100 nanogramów na mililitr VegFA bez kontroli IL3 do żądanych studzienek.

Na koniec dodać 1,5 mikrolitra badanych próbek w trzech egzemplarzach. Napełnij wszelkie niewykorzystane studzienki płytki mikrostudzienkowej sterylną wodą, PBS lub pożywką. Umieść nasączoną wodą bibułkę w pojemniku przepuszczającym gaz, aby stworzyć nawilżoną komorę, która umożliwia wymianę gazową.

Inkubować płytki testowe w komorach w wilgotnej atmosferze 10% dwutlenku węgla przez 16 godzin. Po 16 godzinach inkubacji przeanalizuj płytki za pomocą standardowego mikroskopu z odwróconymi fazami przy powiększeniu od 40 do 100x. W tej chwili możliwe jest rozróżnienie próbek dodatnich i ujemnych.

Studnie bez wsparcia czynników wzrostu lub z samym podłożem będą miały zmniejszoną liczbę okrągłych komórek, a także martwych lub umierających komórek i szczątków komórkowych. Natomiast komórki inkubowane z pożywką zawierającą IL3 lub liginę dla VegFR2 są duże i półprzezroczyste, a dowody na ziarnistość komórki, cytoplazmy lub szczątków komórkowych w hodowli nie są ziarniste lub są minimalne. Dodaj 10 000 przemytych komórek w 135 mikrolitrach pożywki z niedoborem IL3 do studzienek standardowej płytki 96-dołkowej.

Użyj skalibrowanej pipety P20, aby dodać 15 mikrolitrów próbek testowych i kontrolnych do studzienek. Inkubować mieszaninę czynników wzrostu komórek i/lub czynników hamujących jak poprzednio przez 48 godzin. Po zakończeniu okresu inkubacji ocenia się liczbę żywotnych komórek w studzienkach, stosując metody opisane w pisemnej części protokołu.

Poniżej przedstawiono wyniki testu, w którym test biologiczny VEGF-R2 EPoR BAF3 jest używany do ilościowego określenia aktywności trzech leżących ludzkich ligin ze swoistością dla VEGF-R2. VEGF-A165, VEGF-C oraz VEGF-D. Aktywność określono ilościowo w obecności bewacyzumabu, hamującego przeciwciała monoklonalnego przeciwko VEGF-A165 lub w obecności trastuzumabu, przeciwciała nieneutralizującego.

Dane zostały znormalizowane w porównaniu z odpowiedzią na sam VEGF-A165. Zgodnie z oczekiwaniami bewacyzumab blokował działanie VEGF-A165 w teście, ale nie miał wpływu na aktywność VEGF-C i VEGF-D. Komórki wystawione na działanie IL3 były wysoce żywotne.

Natomiast te, które nie są narażone na żaden dodatkowy czynnik wzrostu, wykazują słabą żywotność. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, że jest to szereg czynników kontrolnych w kondycjonowanych pożywkach, które należy wygenerować przed testem. Technika ta utorowała drogę do odrodzenia się biologii naczyniowej, wirusologii, raka i optologii w celu zbadania roli VEG-FM w liginach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować komórki testu biologicznego, uruchomić test biologiczny i przeprowadzić ilościowe lub półilościowe analizy aktywności liginy VEG-FM.