Name: Prosty test biologiczny do oceny czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj prosty test biologiczny do wykrywania i ilościowej oceny aktywności ligandów rodziny VEGF przy użyciu linii komórkowej WEHI-3D. Ta metoda umożliwia badanie wiązania receptorów bez specjalizowanych komórek nabłonkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SAS i MGA są wspierane przez Granty Projektowe, Granty Programowe i Stypendia Badawcze od Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych Australii (NHMRC) oraz przez fundusze z Programu Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej zapewnione przez Rząd Wiktorii w Australii. MMH jest wspierane przez Fundację Petera MacCalluma Grant.

Źródło IL-3 i przygotowanie podłoża kondycjonowanego przez WEHI-3D
Uwaga: Mysia linia komórkowa białaczki granulocytowej WEHI-3D jest hodowana w celu wytworzenia kondycjonowanej pożywki zawierającej IL-3.
<ol>
	<li>Hodowla WEHI-3D w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, 10% płodowa surowica bydlęca (FBS), 1% suplement glutaminy o przedłużonym okresie przydatności, 50 μg/ml gentamycyny. Zaszczepić 5 × 106 komórek w logarytmicznej fazie wzrostu do 50 ml świeżej pożywki hodowlanej w kolbie do hodowli tkankowej T175 cm3 i hodować przez około 7 dni lub do momentu, gdy komórki przejdą logarytmiczną fazę wzrostu przez około 24 - 48 godzin (należy unikać nadmiernej śmierci komórek w hodowli). Kondycjonowane podłoża mogą być przechowywane przez wiele lat w temperaturze -20 °C, dzięki czemu można jednorazowo produkować partie po 200-500 ml.</li>
	<li>Zdekantować płyn i komórki z kolb i wirować w temperaturze 1 000 x g przez 15 minut w celu usunięcia komórek i resztek komórkowych. Usunąć górne 90% supernatantu. Przefiltruj przez jednostkę filtrującą 0,22 μm.</li>
	<li>Podwielokrotność kondycjonowanej pożywki (CM) WEHI-3D na objętości 1 ml, 50 ml i 200 ml do przechowywania w temperaturze -20 °C lub -70 °C. Mniejsze podwielokrotności są przydatne do przygotowania testów, pośrednie objętości do wytwarzania pożywki hodowlanej do przejścia linii komórkowych zależnych od czynnika, a większe objętości do długotrwałego przechowywania. IL-3 jest stosunkowo stabilna w temperaturze 4 °C, więc rozmrożone podłoże może być przechowywane przez kilka tygodni, jeśli jest używane w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Alternatywnie, należy użyć rekombinowanej mysiej IL-3 na poziomie 50 ng/ml rozcieńczonej do pożywki hodowlanej, po przefiltrowaniu przez jednostkę filtrującą 0,22 μm.</li>
</ol>
2. Hodowla i ocena linii komórkowych VEGFR-2-EpoR-BA/F3 i kontrolnych Ba/F3
<ol>
	<li>Kontrola hodowli komórek Ba/F3 w DMEM, 10% FBS, 50 μg/ml gentamycyny lub suplementu penicyliny/streptomycyny, 1% stabilizowanej L-glutaminy i 10% WEHI-3D-CM. Pasaż komórek w rozcieńczeniach 1:15 mniej więcej co trzy dni od komórek rosnących w fazie logarytmicznej.</li>
	<li>Hodowla komórek VEGFR2-EpoR-Ba/F3 w DMEM, 10% FBS, 50 μg/ml gentamycyny, 1% stabilizowanej L-glutaminy i 10% WEHI-3D-CM oraz 1 mg/ml G418. Pasaż komórek w rozcieńczeniach 1:15 z komórek rosnących w fazie logarytmicznej. Zobacz 24, aby uzyskać więcej szczegółów na temat budowy i ekspresji receptora chimerycznego.</li>
	<li>Kontroluj zbiory komórek Ba/F3 lub VEGFR2-EpoR-Ba/F3 z kultur w środkowej fazie logarytmicznej. Delikatnie odpipetować pipetą, aby usunąć te nieprzylegające komórki z dna kolby. Przemyć trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem toniczności myszy, pH 7,3 (PBS), (10 ml, odwirować przy 750 x g przez 5 minut w celu odzyskania osadu komórkowego) w celu usunięcia pożywki zawierającej IL-3.</li>
	<li>Przemyć komórki raz DMEM i dodatkami, bez WEHI-3D-CM lub rekombinowanego IL-3, a następnie ponownie zawiesić w tym podłożu w stężeniu 7,4 ×10 4 komórek/ml (tj. 1000 komórek na 13,5 μl; 10 000 komórek na 135 μl, jak określono przez zliczenie za pomocą hemocytometru) do użycia odpowiednio w półilościowych lub ilościowych wersjach testu.</li>
	<li>Oceń komórki pod kątem żywotności przez wykluczenie błękitu trypanowego (UWAGA). Wymieszaj błękit trypanowy w PBS (0,4%) 1:1 z populacją komórek i policz co najmniej 100 komórek na hemocytometrze. Komórki, które pobierają barwnik, są uważane za martwe lub umierające. Do przeprowadzenia testu wymagana jest żywotność większa niż 98%.</li>
</ol>
3. Test półilościowy
<ol>
	<li>Dodać przemyte komórki (1,000 komórek) zawarte w 13,5 μl pożywki z niedoborem IL-3 do dołków 72-dołkowej płytki mikrodołkowej w temperaturze pokojowej. Należy uważać, aby wymieszać zawiesinę komórek podczas porcjowania, aby upewnić się, że osiadanie komórek pod wpływem grawitacji nie wpływa na stężenie komórek. Używaj dobrze skalibrowanej pipety automatycznej P20 i końcówek sterylizowanych w autoklawie.</li>
	<li>Dodać próbki testowe i kontrole do studzienek przy 10% objętości (1,5 μl, co daje końcową objętość 15 μl zawierającą 1000 komórek na studzienkę) za pomocą skalibrowanej pipety P20 lub, najlepiej, pipety P2. Należy upewnić się, że próbki są zgodne z warunkami hodowli komórek Ba/F3 pod względem pH, soli i innych substancji potencjalnie cytotoksycznych/cytostatyków. Tam, gdzie to możliwe, należy użyć kompatybilnego podłoża lub buforu (np. odpowiednio DMEM lub PBS) lub rozcieńczyć w takim pożywce lub buforze. Rozcieranie tą samą końcówką zapewni mieszanie.</li>
	<li>W przypadku próbek kontrolnych należy uwzględnić: (i) samą pożywkę niezawierającą IL-3; (ii) WEHI-3BD-CM dodany do samej pożywki w ilości 10% objętości końcowej; i/lub (iii) VEGF-A rozcieńczony do 100 ng/ml w samym pożywce, niezawierający IL-3.</li>
	<li>Napełnij wszelkie niewykorzystane studzienki płytki mikrodołkowej sterylną wodą, PBS lub pożywką i umieść płytkę w nawilżonym pojemniku (z bibułką nasączoną wodą), umożliwiając wymianę gazową. Inkubować komórki w pojemnikach w wilgotnej atmosferze 10% CO2 . Test ten może być wygodnie skonfigurowany w ciągu 3 godzin przez jedną osobę, jeśli dostępne są próbki testowe i składniki pożywki.</li>
	<li>Oceniać płytki zazwyczaj po 16 godzinach inkubacji, w którym to czasie wyraźna jest różnica między próbkami dodatnimi i ujemnymi. Na rysunku 3 przedstawiono przykłady wyglądu komórek w hodowli. Analizuj płytki za pomocą standardowego mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym przy powiększeniu 40 − 100×. 
	Uwaga: Studzienki zawierające wspomagające czynniki wzrostu, takie jak IL-3 lub VEGF-A, będą zawierać komórki, które wydają się okrągłe i półprzezroczyste. Studnie bez wspomagających czynników wzrostu lub z samym podłożem będą miały zmniejszoną liczbę okrągłych komórek, a także martwe lub umierające komórki i szczątki komórkowe (np. Ryc. 3C). Ocena testu w ciągu 24−48 godzin po inkubacji jest optymalna dla czułości.</li>
</ol>
4. Ilościowy test biologiczny
<ol>
	<li>Dodać umyte komórki (10 000 komórek w 135 μl) w pożywce z niedoborem IL-3 do dołków standardowej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania w temperaturze pokojowej. Należy zachować ostrożność, aby wymieszać zawiesinę komórek podczas porcjowania, aby upewnić się, że osiadanie komórek pod wpływem grawitacji nie wpływa na stężenie komórek.</li>
	<li>Dodać próbki testowe i kontrole do studzienek przy 10% objętości (15 μl) za pomocą skalibrowanej pipety (P20). Należy upewnić się, że próbki są zgodne z warunkami hodowli komórek Ba/F3 pod względem pH, soli lub innych substancji potencjalnie cytotoksycznych/cytostatyków. Tam, gdzie to możliwe, należy użyć kompatybilnego podłoża lub buforu (np. DMEM lub PBS) lub rozcieńczyć w takim pożywce lub buforze. Filtr sterylizuje małe objętości za pomocą jednostki filtrującej z rurką wirówkową z octanu celulozy o porach 0,22 μm.</li>
	<li>Mieszaninę komórek, czynników wzrostu i/lub czynników hamujących inkubować w wilgotnej atmosferze 10% CO2 przez 48 godzin. Przeprowadzić test w wilgotnym pojemniku z bibułką nasączoną wodą i umożliwiającym wymianę gazową. Po zakończeniu okresu inkubacji ocenić test, stosując jedną z alternatywnych metod wymienionych poniżej, które są zastępczymi markerami liczby zdolnych do życia komórek w studzience.</li>
	<li>Alternatywa#1: Inkorporacja 3H-tymidyny 
	Uwaga: Ta kwantyfikacja jest przeznaczona dla formatu płytki 96-dołkowej.
	<ol>
		<li>Po inkubacji płytek do oznaczania przez 48 godzin w temperaturze 37 °C (objętość 150 μl na studzienkę), dodać 3H-tymidynę do objętości 50 μl pożywki do oznaczania (pożywka hodowlana Ba/F3 bez IL-3/WEHI-3D CM) na basenik w stężeniu 20 μCi/ml, uzyskując ostateczną dawkę 1 μCi na basenik.</li>
		<li>Inkubować płytki przez kolejne 4 godziny w temperaturze 37 °C przed pobraniem komórek za pomocą kombajnu komórkowego. Ekstrahuj pojedyncze próbki, umieszczając filtry w scyntylatorze i oznaczaj ilościowo za pomocą licznika scyntylacji cieczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywa#2: Bioluminescencyjna detekcja komórkowego ATP 
	Uwaga: To podejście wykorzystuje odczynnik monitorujący ATP, który w połączeniu z lizatem komórkowym może generować sygnał bioluminescencyjny, który odzwierciedla żywe komórki w populacji.
	<ol>
		<li>Lizuj komórki w celu ekstrakcji ATP i użyj odczynnika monitorującego ATP, aby wygenerować sygnał luminescencyjny zgodnie z instrukcjami producenta. Odczyt luminescencji za pomocą luminometru kompatybilnego z formatem płytki 96-dołkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywa#3: Enzymatyczna redukcja barwnika wskaźnikowego przez żywotne komórki 
	Uwaga: Testy na bazie resazuryny wykazują dobrą korelację z żywotnością komórek.
	<ol>
		<li>Połączyć hodowane komórki z barwnikiem na bazie rezazuryny i określić ilościowo testy za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+VEGF+and+its+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The biology of VEGF and its receptors.</a> Nat Med. 9, 669-676 (2003).</li>
<li>Achen, M. G., Stacker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor-D%3Asignalling+mechanisms%2C+biology+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance.</a> Growth Factors. 5, 283-296 (2012).</li>
<li>Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+VEGF-A+to+treat+cancer+and+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration.</a> Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).</li>
<li>Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+development+of+bevacizumab%2C+an+anti-VEGF+antibody+for+treating+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).</li>
<li>Korpelainen, E. I., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+angiogenesis+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).</li>
<li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascities+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li>
<li>Joukov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+vascular+endothelial+growth+factor%2C+VEGF-C%2C+is+a+ligand+for+the+Flt-4+%28VEGFR-3%29+and+KDR+%28VEGFR-2%29+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases.</a> EMBO J. 15, 290-298 (1996).</li>
<li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+D+%28VEGF-D%29+is+a+ligand+for+the+tyrosine+kinases+VEGF+receptor+2+%28Flk1%29+and+VEGF+receptor+3+%28Flt4%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4).</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).</li>
<li>Leppanen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+receptor+binding+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity.</a> Blood. 117, 1507-1515 (2011).</li>
<li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF%29-like+protein+from+orf+virus+NZ2+binds+to+VEGFR2+and+neuropilin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).</li>
<li>Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snake+venom+vascular+endothelial+growth+factors+%28VEGFs%29+exhibit+potent+activity+through+their+specific+recognition+of+KDR+%28VEGF+receptor+2%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2).</a> J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).</li>
<li>Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphangiogenesis+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Lymphangiogenesis and cancer metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).</li>
<li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-D+promotes+the+metastatic+spread+of+tumor+cells+via+the+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics.</a> Nat Med. 7, 186-191 (2001).</li>
<li>Skobe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tumor+lymphangiogenesis+by+VEGF-C+promotes+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.</a> Nat Med. 7, 192-198 (2001).</li>
<li>Mandriota, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor-C-mediated+lymphangiogenesis+promotes+tumour+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis.</a> EMBO J. 20, 672-682 (2001).</li>
<li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphangiogenesis+and+lymphatic+vessel+remodelling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).</li>
<li>Karnezis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-D+promotes+tumor+metastasis+by+regulating+prostaglandins+produced+by+the+collecting+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium.</a> Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis%3A+an+organizing+principle+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).</li>
<li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+involves+proteolytic+processing+which+generates+non-covalent+homodimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers.</a> J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).</li>
<li>McColl, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+activates+the+lymphangiogenic+growth+factors+VEGF-C+and+VEGF-D%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D.</a> J Exp Med. 198, 863-868 (2003).</li>
<li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+endothelial+cells+derived+from+umbilical+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).</li>
<li>Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+by+VEGF+receptors+in+regulation+of+angiogenesis+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).</li>
<li>Pacifici, R. E., Thomason, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+tyrosine+kinase%2Fcytokine+receptors+transmit+mitogenic+signals+in+response+to+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand.</a> J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).</li>
<li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF%29+that+lacks+VEGF+receptor-2+activation+retains+the+ability+to+induce+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability.</a> J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).</li>
<li>Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VD1+neutralizing+antibody+to+vascular+endothelial+growth+factor-D%3A+binding+epitope+and+relationship+to+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding.</a> J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).</li>
<li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vascular+endothelial+growth+factors+vary+extensively+in+amino+acid+sequence%2C+receptor-binding+specificities%2C+and+the+ability+to+induce+vascular+permeability+yet+are+uniformly+active+mitogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens.</a> J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).</li>
<li>Davydova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+human+vascular+endothelial+growth+factor-D+for+structural+and+preclinical+therapeutic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies.</a> Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).</li>
<li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forms+of+mouse+vascular+endothelial+growth+factor-D+are+generated+by+RNA+splicing+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis.</a> J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).</li>
<li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specificity+of+receptor+binding+by+vascular+endothelial+growth+factor-D+is+different+in+mouse+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man.</a> J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).</li>
<li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+lymphatic+endothelial+cells+transduce+growth%2C+survival+and+migratory+signals+via+the+VEGF-C%2FD+receptor+VEGFR-3%5BTitle%5D)+AND+%22EMBOJ%22%5BJournal%5D)">Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3.</a> EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).</li>
<li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+vascular+endothelial+growth+factor-D+block+its+interactions+with+both+VEGF+receptor-2+and+VEGF+receptor-3%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3.</a> Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).</li>
<li>Bamford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+COSMIC+%28Catalogue+of+Somatic+Mutations+in+Cancer%29+database+and+website%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website.</a> Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).</li>
<li>Pleasance, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+catalogue+of+somatic+mutations+from+a+human+cancer+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome.</a> Nature. 463, 191-196 (2010).</li>
</ol>

Steven A. Stacker i Marc M. Achen są udziałowcami Circadian Technologies Ltd., firmy rozwijającej terapie ukierunkowane na rodzinę czynników wzrostu VEGF.

Opisany tutaj test opiera się na wykorzystaniu komórek o wysokiej żywotności, które są zależne od czynników wzrostu. Komórki muszą być zatem starannie hodowane, aby upewnić się, że są zależne od czynnika i zachowują ekspresję receptora chimerycznego. Ważne jest, aby pożywka była świeżo przygotowana i nie była przechowywana przez zbyt długi okres oraz aby WEHI-3D CM był wysoce aktywny. Komórki muszą być dokładnie umyte z pożywki zawierającej IL-3 do pożywki testowej, aby upewnić się, że żadna pozostałość IL-3 nie zanieczy...

Rodzina czynników wzrostu wydzielanych białek (VEGF) wydzielanych przez czynniki wzrostu białek i ich pokrewne receptory na powierzchni komórek to ważna i zróżnicowana grupa rozpuszczalnych ligandów i receptorów osadzonych w błonie, które działają w transdukowaniu sygnałów przez błony komórkowe. Funkcjonują głównie w komórkach śródbłonka, ale także w komórkach pochodzenia nabłonkowego i komórek układu odpornościowego 1,2. Szlaki sygnałowe zaangażowane przez receptory VEGF aktywowane ligandem (VEGFR) mają kluczowe znaczenie w głównych patologiach, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem i rak, a terapie ukierunkowane na nie są często stosowane klinicznie (np. przeciwciało monoklonalne bewacyzumab, które jest skierowane przeciwko VEGF-A) 3,4.
Jedną z zawiłości rodziny VEGF jest różnorodność rozpuszczalnych ligandów obecnych w przyrodzie (białka VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF kodowane przez rodzinę wirusów parapox orf i jad węża VEGF, plus inne hamujące izoformy VEGF-A)2.
Te ligandy oddziałują z trzema członkami rodziny receptorowych kinaz tyrozynowych, a mianowicie VEGFR-1, VEGFR-2 i VEGFR-3. Receptory te ulegają zmiennej ekspresji na różnych typach komórek, ale często ulegają koekspresji na powierzchni komórek śródbłonka, które wyściełają naczynia krwionośne i limfatyczne wszystkich rozmiarów 5. VEGFR-2 może wiązać ligandy ssaków VEGF-A 6, VEGF-C 7 i VEGF-D 8,9, a także wirusa orf VEGF10 i jadu węża VEGF11. VEGFR-2 odgrywa główną rolę w napędzaniu angiogenezy (wzrostu nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń) w rozwoju embrionalnym, gojeniu się ran, nowotworach i chorobach oczu. W tych kontekstach ligandy, takie jak VEGF-A, -C i -D, wiążą i aktywują receptor na komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych12-15. Na komórkach śródbłonka limfatycznego VEGFR-2 odgrywa rolę w limfangiogenezie, tworzeniu nowych naczyń limfatycznych 16. VEGFR-2 może również sprzyjać rozszerzaniu i rozszerzaniu głównych tętnic i limf w zdrowych tkankach i chorobach 17. Pełne zrozumienie interakcji VEGFR-2:ligand jest zatem ważne dla opracowania inhibitorów do stosowania w leczeniu chorób zależnych od angiogenezy18. Podczas gdy większość izoform VEGF-A wiąże się z VEGFR-2, proteolityczne rozszczepienie VEGF-C i VEGF-D jest wymagane do uwolnienia fragmentu składającego się z domeny homologii VEGF, która wykazuje wysokie powinowactwo wiązania do VEGFR-2 19,20.
Opracowaliśmy test biologiczny do monitorowania ligandów VEGFR-2, który ma na celu obejście potrzeby pierwotnych komórek śródbłonka, które są technicznie trudne do przejścia, drogie w zakupie i hodowli (wymagają specjalistycznej pożywki) 21 i wyrażają wiele VEGFR i związanych z nimi koreceptorów 22. Heterodimeryzacja VEGFR-2 z innymi receptorami lub koreceptorami VEGF może powodować niepożądaną złożoność podczas badania binarnych interakcji receptor-ligand, oceny aktywności przypisywanej określonemu receptorowi lub oceny wpływu odczynników hamujących. 23. Test biologiczny zachowuje ruchliwość odpowiedniego receptora w błonie komórkowej i umożliwia ocenę zdolności liganda do wiązania i sieciowania regionu zewnątrzkomórkowego VEGFR-2.
Test biologiczny polega na stworzeniu chimerycznego receptora, w którym zewnątrzkomórkowy region receptora VEGF (w tym przypadku VEGFR-2) jest połączony z transbłonowymi i wewnątrzkomórkowymi regionami receptora erytropoetyny (EpoR), członka rodziny receptorów cytokin 8,24. To białko fuzyjne ulega następnie ekspresji w zależnej od czynnika linii komórkowej pro-B Ba/F3, na której stymulacja ligandem zdolnym do wiązania i sieciowania domeny zewnątrzkomórkowej receptora powoduje aktywację regionu efektora cytoplazmatycznego, który jest zdolny do przekazywania sygnału przeżycia za pośrednictwem kinaz janusowych (JAK) w celu promowania przeżycia i / lub proliferacji komórki. W przeciwieństwie do tego, ekspresja pełnej długości VEGFR-2 w tym samym typie komórki i stymulacja ligandem nie sprzyja przeżyciu i proliferacji komórek, co wskazuje, że proksymalne efektory sygnalizacyjne szlaku VEGFR-2 nie są dostępne w tym typie komórki.
Użyliśmy tego testu w różnych kontekstach, aby zbadać wiązanie nowych ligandów VEGFR-2 10,19,20,24-29. W połączeniu z testem VEGFR-3-EpoR-Ba/F3 porównaliśmy względną aktywność czynników wzrostu VEGF-C i VEGF-D pod kątem wiązania i sieciowania VEGFR-2 i VEGFR-3 30. Test został wykorzystany do scharakteryzowania hamującej aktywności neutralizujących przeciwciał monoklonalnych przeciwko VEGFR-2 lub VEGF-D, rozpuszczalnej pułapki VEGFR-2 i peptydomimetyków ukierunkowanych na rodzinę VEGF31. Test wykorzystano również do wykazania zdolności VEGF z różnych szczepów wirusa orf do wiązania i sieciowania VEGFR-2 przed testem w pierwotnych komórkach śródbłonka 10,26. Test ten jest szczególnie przydatny do szybkich badań przesiewowych mutantów VEGF, które można szybko ocenić pod kątem aktywności, zanim zostaną wprowadzone do bardziej pracochłonnych testów komórek śródbłonka 25 lub podczas oceny protokołów oczyszczania czynników wzrostu 27.
Opisany przez nas test jest łatwy do wykonania, a wersja półilościowa pozwala na szybkie oznaczenia, które czasami są wymagane podczas monitorowania produkcji lub oczyszczania czynników wzrostu, przeciwciał lub rozpuszczalnych domen receptorowych dla innych eksperymentów. Łatwość użycia testu sprawia, że jest on idealnym uzupełnieniem dalszych i bardziej kompletnych badań wykonywanych na pierwotnych komórkach śródbłonka pochodzących z krwi lub naczyniach limfatycznych z określonych tkanek lub układów narządowych.

<table><tbody><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0,4% roztwór w PBS stosuje się 1:1 z zawiesinami komórkowymi do pomiaru żywych komórek. Hazard-może powodować raka</td></tr><tr><td>G418 Siarczan (Genetycyna)</td><td>Invivogen</td><td>ant-gn-5</td><td>Środek do selekcji transfekowanych komórek eukariotycznych. Zagrożenie - może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu.</td></tr><tr><td>3H-Thymidine</td><td>PerkinElmer</td><td>NET-027</td><td>Ten radioaktywny nukleozyd jest wbudowywany w chromosomalne DNA podczas mitozy. Zestaw</td></tr><tr><td>Vialight Plus Hazard-radiation Lonza</td><td></td><td>LT07-221</td><td>Bioluminescencyjne wykrywanie komórkowego ATP w celu ilościowego określenia żywotności, przy użyciu odczynnika do monitorowania ATP</td></tr><tr><td>Odczynnik do żywotności komórek Prestoblue</td><td>Invitrogen</td><td>A13261</td><td>Wskaźnik żywotności komórek na bazie resazuryny. Zmienia kolor na czerwony w środowisku redukującym komórkę</td></tr><tr><td>Nunc Minitray z powierzchnią Nunclon Delta (72 dołki)</td><td>Thermo Scientific</td><td>136528</td><td>Mała płytka do mikromiareczkowania</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli tkankowych</td><td>Falcon, Corning Inc.</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>DMEM (1X)</td><td>Gibco</td><td>11965-92</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>&nbsp; 10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Kombajn komórkowy</td><td>Tomtec Nauki przyrodnicze</td><td></td><td>Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Kombajn komórkowy</td></tr><tr><td>Licznik scyntylacji cieczy</td><td>LKB Wallac</td><td>1205</td><td>LKB Wallac 1205 Betaplate Licznik scyntylacyjny</td></tr><tr><td>UniFilter-96 GF/B</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005177</td><td>Biała 96-dołkowa mikropłytka Barex z filtrem GF / B 1 i mikro; m wielkość porów</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,22 um Jednostka filtrująca probówkę wirówkową z octanu celulozy 0,22 um</td><td>Costar, Corning Inc.</td><td>8160</td><td>Filtry probówkowe wirówkowe mają 0,22 &mikro; Jednostka filtrująca zawierająca membranę CA o m porach w 500 &mikro; l pojemność polipropylenowej mikrowirówki.</td></tr><tr><td>Czytnik fluorescencyjny</td><td>BioTek</td><td></td><td>BioTek Synergy 4 Hybrydowy czytnik mikropłytek&nbsp;</td></tr></tbody></table>

prosty test biologiczny do oceny czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

Analiza receptorowych kinaz tyrozynowych i ich oddziałujących ligandów zaangażowanych w biologię naczyniową jest często trudna ze względu na konstytutywną ekspresję rodzin pokrewnych receptorów, szeroki zakres pokrewnych ligandów i trudność w radzeniu sobie z pierwotnymi kulturami wyspecjalizowanych komórek śródbłonka. W tym miejscu opisujemy test biologiczny do wykrywania ligandów receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego-2 (VEGFR-2), kluczowego przetwornika sygnałów promujących angiogenezę i limfangiogenezę. CDNA kodujące fuzję zewnątrzkomórkowego (wiążącego ligand) regionu VEGFR-2 z regionami transbłonowymi i cytoplazmatycznymi receptora erytropoetyny (EpoR) ulega ekspresji w zależnej od czynnika linii komórkowej Ba / F3. Ta linia komórkowa rozwija się w obecności interleukiny-3 (IL-3), a wycofanie tego czynnika powoduje śmierć komórek w ciągu 24 godzin. Ekspresja fuzji receptora VEGFR-2 / EpoR zapewnia alternatywny mechanizm sprzyjający przetrwaniu i potencjalnej proliferacji stabilnie transfekowanych komórek Ba / F3 w obecności liganda zdolnego do wiązania i sieciowania zewnątrzkomórkowej części białka fuzyjnego (tj. takiego, który może sieciować region zewnątrzkomórkowy VEGFR-2). Test można przeprowadzić na dwa sposoby: podejście półilościowe, w którym małe objętości liganda i komórek pozwalają na szybki wynik w ciągu 24 godzin, oraz podejście ilościowe obejmujące zastępcze markery liczby żywych komórek. Test jest stosunkowo łatwy do przeprowadzenia, jest wysoce wrażliwy na znane ligandy VEGFR-2 i może pomieścić zewnątrzkomórkowe inhibitory sygnalizacji VEGFR-2, takie jak przeciwciała monoklonalne przeciwko receptorowi lub ligandom oraz rozpuszczalne pułapki ligandów.

W tej sekcji przedstawiamy wyniki eksperymentu demonstrującego kluczowe cechy bioanalizy VEGFR-2-EpoR-Ba/F3 (zasady analizy przedstawiono na Rysunku 1). Inne opublikowane badania wykazują szersze zastosowania tej metody w odniesieniu do alternatywnych ligandów VEGFR-2, mutantów cząsteczek VEGF oraz inhibicyjnych przeciwciał monoklonalnych 8,10,19,24-30.
Przedstawione tutaj dane reprezentują test, w kt...

Opisujemy prosty test biologiczny oparty na komórkach do wykrywania, ilościowego określania i monitorowania aktywności członków rodziny ligandów czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Test wykorzystuje receptory chimeryczne ulegające ekspresji w linii komórkowej zależnej od czynnika, aby zapewnić półilościową lub ilościową ocenę wiązania receptora i sieciowania przez ligand.

Prosty test biologiczny do oceny czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Ogólnym celem tego prostego bioanalizy opartej na komórkach jest wykrywanie, kwantyfikacja i monitorowanie aktywności ligandów z rodziny czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Metoda ta pozwala na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii naczyniowej, wirusologii, onkologii i okulistyki, gdzie ligandy z rodziny VEG-FR regulują kluczowe procesy w przebiegu tych chorób. Główną zaletą tego testu jest możliwość oceny ligandów z rodziny VEG-FM pod kątem ich zdolności do wiązania i sieciowania różnych receptorów bez konieczności wykorzystania wyspecjalizowanych komórek nabłonkowych.Hodowlę linii komórkowej WEHI-3D wydzielającej IL3 prowadzić poprzez pipetowanie 5 × 10⁶ komórek w fazie logarytmicznego wzrostu do od czterech do dziesięciu kolb T175 zawierających 50 ml świeżej pożywki hodowlanej. Inkubować przez siedem dni lub do momentu, aż komórki przekroczą fazę logarytmicznego wzrostu o około 24 do 48 godzin. Odlać ciecz wraz z komórkami z kolb.Następnie wirować przy 1 000 G przez 15 minut w celu usunięcia komórek i szczątków komórkowych. Następnie pobrać górne 90% supernatantu i przefiltrować go przez jednostkę filtrującą o rozmiarze porów 0,22 mikrona. Podzielić warunkową pożywkę na aliquoty po 1 ml do przygotowania analizy.Aliquoty o objętości 50 ml do sporządzania pożywki do pasażowania linii komórkowych zależnych od czynników oraz objętości 200 ml do długotrwałego przechowywania w temperaturze 20 °C. Mniejsze objętości przechowywać w temperaturze 20 °C. Hodować kontrolne komórki BAF3 w pożywce zawierającej 10% medium warunkującego WEHI-3D.oraz komórki VegFR2-EPoR-BAF3 w tym samym medium z dodatkiem 1 mg/mL G418. Przesiewać komórki w rozcieńczeniach od 1:10 do 1:15 z komórek rosnących w fazie logarytmicznej. Zebrać kontrolne komórki BAF3 lub VegFR2VPoR-BAF3 z kultur znajdujących się w środkowej fazie logarytmicznej.Za pomocą delikatnego pipetowania należy usunąć komórki z dna kolby, a następnie wirować z prędkością 750 Gs przez pięć minut w celu uzyskania osadu komórkowego. Osad należy zawiesić ponownie w 10 ml fosforanowego buforu solnego o toniczności mysiej i ponownie wirować przy 750 Gs przez pięć minut. Procedurę płukania należy powtórzyć jeszcze dwukrotnie, aby usunąć pożywkę zawierającą IL3.Przemyj komórki raz, używając pożywki bez medium warunkującego DEHI-3D. Ważne jest usunięcie pożywki hodowlanej zawierającej IL3, aby upewnić się, że nie pozostały żadne dodatkowe czynniki wzrostu, które mogłyby spowodować wynik fałszywie dodatni lub wysoką aktywność tła. Po odwirowaniu i odlaniu supernatantu, ponownie zawieś komórki w tej samej pożywce wolnej od IL3 w stężeniu 7,4 × 10⁴ komórek na mililitr.Na koniec wymieszać w równych objętościach błękit trypanu w PBS z populacją komórek i nanieść do hemacytometru. Policzyć co najmniej 100 komórek. Komórki, które przyjęły barwnik, uznaje się za martwe lub obumierające.Kluczowe jest, aby komórki wykorzystywane w teście wykazywały wysoką żywotność, co zapewni ich zdolność do reakcji na warunki pomiarowe. Używając dobrze skalibrowanej automatycznej pipety P20 oraz autoklawowanych końcówek, nanieś 1 000 komórek w 13,5 µL pożywki pozbawionej IL do dołków płytki 72-dołkowej. Należy pamiętać o mieszaniu zawiesiny komórkowej podczas aliquotowania, aby zapobiec sedymentacji komórek pod wpływem grawitacji, co mogłoby wpłynąć na stężenie komórek.Używając odpowiednio skalibrowanej pipety P2, nanieś 1,5 µL pożywki wolnej od IL3 w trzech powtórzeniach do studni kontrolnych. Delikatnie wymieszaj. W ten sam sposób dodaj 10% warunkowej pożywki WEHI-3D oraz kontrolę z 100 ng/mL VegFA bez IL3 do odpowiednich studni.Na koniec dodaj 1,5 µL próbek testowych w trzech powtórzeniach. Wypełnij niewykorzystane dołki płytki mikrotitracyjnej sterylną wodą, PBS lub pożywką. Umieść nasączony wodą papier tkankowy w przepuszczalnym dla gazów pojemniku, aby stworzyć wilgotną komorę umożliwiającą wymianę gazową.Inkubuj płytki testowe w komorach w nawilżonej atmosferze z dodatkiem 10% dwutlenku węgla przez 16 godzin. Po 16 godzinach inkubacji przeanalizuj płytki przy użyciu standardowego odwróconego mikroskopu fazowego przy powiększeniu od 40 do 100x. Na tym etapie możliwe jest rozróżnienie próbek pozytywnych i negatywnych.Dołeczki pozbawione czynników wzrostu lub zawierające samo medium będą charakteryzować się zmniejszoną liczbą okrągłych komórek, a także obecnością komórek martwych lub obumierających oraz detrytusu komórkowego. Z kolei komórki inkubowane w medium zawierającym IL3 lub ligand dla VegFR2 są duże i półprzezroczyste, a w cytoplazmie komórek lub w kulturze nie stwierdza się lub stwierdza minimalną obecność ziarnistości bądź detrytusu komórkowego. Do dołeczków standardowej płytki 96-dołkowej należy dodać 10 000 przemytych komórek w 135 µL medium pozbawionego IL3.Za pomocą skalibrowanej pipety P20 nanieś 15 µL próbek testowych i kontroli do dołków. Inkubuj mieszaninę komórek, czynników wzrostu i/lub inhibitorów przez 48 godzin w sposób opisany wcześniej. Po zakończeniu okresu inkubacji oceń liczbę żywych komórek w dołkach, stosując metody przedstawione w pisemnej części protokołu.Przedstawione tutaj są wyniki analizy, w której bioanaliza VEGF-R2 EPoR BAF3 została wykorzystana do ilościowego określenia aktywności trzech rekombinowanych ludzkich ligandów o specyficzności względem VEGF-R2: VEGF-A165, VEGF-C oraz VEGF-D. Aktywność określono ilościowo w obecności bevacizumabu, inhibitorowego przeciwciała monoklonalnego przeciwko VEGF-A165, lub w obecności trastuzumabu, przeciwciała nieneutralizującego.Dane zostały znormalizowane względem odpowiedzi na sam VEGF-A165. Zgodnie z oczekiwaniami bevacizumab zablokował efekt VEGF-A165 w teście, lecz nie wpłynął na aktywność VEGF-C i VEGF-D. Komórki poddane działaniu IL3 wykazały wysoką żywotność.Podczas gdy komórki nieeksponowane na dodatkowy czynnik wzrostu wykazują niską żywotność. Przystępując do tej procedury, należy pamiętać, że w pożywkach kondycjonowanych istnieje szereg czynników kontrolnych, które muszą zostać przygotowane przed przeprowadzeniem analizy. Technika ta utorowała drogę do odrodzenia badań w biologii naczyniowej, wirusologii, onkologii i okulistyce w celu zbadania roli VEG-FM w ligandach.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować komórki do bioanalizy, przeprowadzić samą bioanalizę oraz wykonać analizy ilościowe lub półilościowe aktywności ligniny VEG-FM.

a-simple-bioassay-for-evaluation-vascular-endothelial-growth

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Normalna unaczyniona tkanka ssaka dorosłego, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie była poddana interwencji chirurgicznej, jest wykorzystywana do badania: (i) inicjacji i rozwoju angiogenezy po podaniu środków testowych do jamy otrzewnej; oraz (ii) modyfikacji angiogenezy po systemowym podaniu wybranych środków testowych.

Test angiogenezy w krezoni szczura

Test tworzenia probówek jest szybką, mierzalną metodą pomiaru angiogenezy in vitro. Komórki śródbłonka łączy się z kondycjonowanymi pożywkami i plateruje ekstraktem z błony podstawnej. Tworzenie się rurki następuje w ciągu kilku godzin, a nowo utworzone kanaliki można łatwo określić ilościowo.

Test tworzenia komórek śródbłonka do badania angiogenezy in vitro

Opisujemy test czopa matrigelowego, aby zilustrować potencjał angiogenny puli czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe za pomocą dwóch uzupełniających się metod obrazowania, ultradźwięków i endomikroskopii. Matrigel, żel naśladujący macierz zewnątrzkomórkową (ECM), jest wykorzystywany do wprowadzenia gospodarza (myszy) z czynnikami angiogennymi wydzielanymi do kondycjonowanego podłoża (CM).

Monitorowanie funkcjonalności i morfologii układu krwionośnego rekrutowanego przez czynniki wydzielane przez szybko rosnące komórki nowotworowe

Ten manuskrypt opisuje test tworzenia rurki w celu ilościowego określenia wpływu danego związku lub stanu na angiogenezę za pomocą tworzenia komórek śródbłonka w kontrolowanym środowisku.

Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu

Śródbłonek naczyniowy ściśle kontroluje rekrutację leukocytów. Niewystarczające wynaczynienie leukocytów przyczynia się do chorób zapalnych u ludzi. Dlatego poszukiwanie nowych elementów regulacyjnych aktywacji śródbłonka jest niezbędne do projektowania ulepszonych terapii zaburzeń zapalnych. W tym miejscu opisujemy kompleksową metodologię charakteryzującą nowe regulatory śródbłonka, które mogą modyfikować transport leukocytów podczas stanu zapalnego.

Testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną

Tutaj prezentujemy nowatorskie zastosowanie testu pierścienia aortalnego, w którym wstępnie znakowane komórki mezenchymalne są hodowane wspólnie z sieciami śródbłonka pochodzącymi z aorty szczura. Ta nowatorska metoda umożliwia wizualizację naprowadzania i integracji mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) z sieciami śródbłonka, ilościowe określenie właściwości sieci oraz ocenę immunofenotypów MSC i ekspresji genów.

Test kohodowli pierścienia aortalnego: wygodne narzędzie do oceny potencjału angiogennego mezenchymalnych komórek zrębu in vitro

Ten artykuł przedstawia kompleksową procedurę oceny in vitro, czy klasyczna angiogeneza nowotworów występuje w naczyniakach zarodkowych (HBs) i jaka jest jej rola w HBs. Wyniki podkreślają złożoność neowaskularyzacji HB i sugerują, że ta powszechna forma angiogenezy jest jedynie mechanizmem uzupełniającym w neowaskularyzacji HB.

Kompleksowa procedura oceny wydajności in vitro przypuszczalnego neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru przecieku naczyniowego wywołanego śródskórnym podawaniem środków zwiększających przepuszczalność do skóry myszy. Technika ta może być wykorzystana do określenia zdolności cząsteczek do promowania lub hamowania przecieku naczyniowego lub do badania mechanizmów molekularnych regulujących przepuszczalność naczyń.

Ocena czynników indukujących nadprzepuszczalność naczyń krwionośnych w skórze za pomocą testu Milesa

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Poznaj prosty test biologiczny do wykrywania i ilościowej oceny aktywności ligandów rodziny VEGF przy użyciu linii komórkowej WEHI-3D. Ta metoda umożliwia badanie wiązania receptorów bez specjalizowanych komórek nabłonkowych.

Prosty test biologiczny do oceny czynników wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych

Przeglądaj więcej filmów