Epigenetyczna regulacja różnicowania serca embrionalnych komórek macierzystych i tkanek

Ogólnym celem zastosowania tych metod immunoprecypitacji chromatyny w różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych lub embrionalnych tkankach serca jest odkrycie epigenetycznej regulacji rozwoju serca. Ponieważ precyzyjne dostrajanie transkrypcji genów podczas embrionalnego rozwoju serca jest regulowane przez komponenty epigenetyczne, immunoprecypitacja chromatyny stanowi odpowiednie podejście do zrozumienia tego procesu.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość specyficznego ukierunkowania na konkretny locus i analizy znaczników epigenetycznych znajdujących się na tym fragmencie DNA. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat regulacji epigenetycznej rozwoju serca. Może być ona również zastosowana w odniesieniu do innych narządów lub dowolnych typów komórek.

To jest Imen. Jest ona doktorantką w laboratorium i to ona przeprowadzi dzisiejszy eksperyment. Niniejsza procedura wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste (ES).

Ciałka embrionalne wytworzone z komórek ES oraz embrionalne tkanki serca wypreparowane z zarodków myszy w stadium E9.5. Utwierdzić komórki i tkanki. W przypadku komórek zastosować 1% formaldehyd w PBS, a w przypadku tkanek embrionalnych bufor permeabilizujący PB2.

Umieść probówki na wytrząsarce orbitalnej przy prędkości 60 RPM w temperaturze pokojowej dokładnie przez 10 minut. Przerwij reakcję sieciowania, dodając glicynę do stężenia końcowego 125 millimolar, a następnie inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej przy prędkości 60 RPM. Aby rozpocząć tę procedurę, resuspenduj osad w 10 mililitrach PBS.

Następnie tkanki embrionalne umieszczono w 1 ml PB2. Wirowano przy 1000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Nadlewkę odlano i dodano odpowiedni bufor w celu przeprowadzenia drugiego przemycia.

Do buforów PB1 i PB2 schłodzonych na lodzie należy dodać inhibitory proteaz. Do osadu komórkowego dodać jeden mililitr buforu PB1 uzupełnionego o inhibitory proteaz i resuspendować komórki, pipetując zawiesinę w górę i w dół. W ten sam sposób resuspendować tkanki embrionalne w jednym mililitrze buforu PB2 uzupełnionego o inhibitory proteaz.

Następnie należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 21G, aby zhomogenizować komórki lub tkanki. Zawiesinę komórkową przenieś do czystej probówki o pojemności 1,5 ml. Zhomogenizowane komórki i tkanki inkubuj w temperaturze 4 °C przez 10 minut.

Odwiruj z prędkością 3000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Odlej nadsącz i resuspenduj każdy osad w 300 µl odpowiedniego buforu do sonikacji, uzupełnionego o inhibitory proteaz. Przenieś zawiesinę komórkową do certyfikowanej probówki wolnej od RNaz, DNaz i pirogenów, aby zapobiec degradacji DNA, i inkubuj przez 15 do 30 minut w lodzie.

Aby przeprowadzić fragmentację chromatyny, poddaj próbki sonikacji w temperaturze 4 °C, stosując odpowiedni program sonikacji dla każdego materiału. Dostosuj czas trwania sonikacji w zależności od tego, czy DNA zostanie wykorzystane do PCR czy do sekwencjonowania. Następnie odwiruj sonikowane lizaty komórkowe przez 10 minut.

Przenieś nadsącz zawierający chromatynę w roztworze z każdej próbki do czystej probówki 1,5 ml, a osad odrzuć. Pobierz 1,5 µl z każdej próbki i rozcieńcz 1:10 wodą. Zmierz gęstość optyczną wszystkich próbek w nanospektrofotometrze, aby określić stężenie białka.

Przed przeprowadzeniem immunoprecypitacji chromatyny należy przygotować koraliki sprzężone z białkiem A, przemywając je zgodnie z opisem w treści protokołu. W czystej probówce o pojemności 1,5 ml połączyć przeciwciało skierowane przeciwko zmodyfikowanym histonom lub czynnikom transkrypcyjnym, 20 µL przemytych koralików sprzężonych z białkiem A oraz 1 ml buforu C uzupełnionego o inhibitory proteaz. Próbki inkubować na rotatorze przy 40 RPM przez co najmniej dwie godziny w temperaturze 4 °C.

Kompleksy kulek z przeciwciałami przemyć trzykrotnie jednym mililitrem buforu C, zgodnie z opisem w treści protokołu. Przygotować dwie probówki: jedną zawierającą 150 mikrogramów chromatyny i kompleksów kulek z przeciwciałami, a drugą zawierającą 150 mikrogramów chromatyny i 20 mikrolitrów przemytych kulek. Do każdej probówki dodać jeden mililitr buforu C uzupełnionego o inhibitory proteaz, a następnie inkubować próbki na rotatorze przy 40 RPM przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po zakończeniu nocnej immunoprecypitacji umieść próbki w statywie magnetycznym i odzyskaj nadsącz zawierający nieprzypisaną chromatynę przeciwciał. Eluuj białko związane z przeciwciałami, dodając 150 µL buforu D1 do przemytych materiałów. Inkubuj próbki przez 20 minut w temperaturze 50 °C w bloku grzewczym.

Po 20 minutach wyjmij próbki z bloku grzewczego i umieść je w statywie magnetycznym. Odzyskaj nadsącz do czystej probówki 1,5 ml, a kuleczki wyrzuć. Aby odwrócić wiązania krzyżowe, dodaj do nadsączu NaCl 5 M, aby uzyskać stężenie końcowe 200 mM.

Przygotować próbkę wejściową chromatyny w czystej probówce o pojemności 1,5 ml. Należy użyć takiej samej ilości chromatyny, jak w próbce do immunoprecypitacji, w końcowej objętości 150 µL wody wolnej od RNaz i DNaz oraz NaCl o stężeniu 5 M do stężenia końcowego 200 mM. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 65 °C.

Następnego dnia wyjmij próbki z bloku grzejnego. Dodaj EDTA do stężenia końcowego 12.5 mM oraz Proteinazę K do stężenia końcowego 250 µg/mL i inkubuj w celu trawienia w temperaturze 55 °C przez dwie godziny. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania kulek.

W pierwszej kolejności doprowadzić kuleczki do temperatury pokojowej, pozostawiając je na co najmniej 30 minut. Następnie bardzo dokładnie wymieszać kuleczki w wirówce typu vortex i szybko odpipetować 1 mL kuleczek do czystej probówki o pojemności 1,5 mL. Umieścić probówkę z kuleczkami na magnesie na dwie do trzech minut, aż roztwór stanie się klarowny, a następnie odrzucić nadsącz.

Wyjmij probówkę z magnesu. Dodaj 1 mL 0,5 M EDTA i wymieszaj, krótko wirując w wstrząsarzu typu vortex. Przemyj kuleczki dwukrotnie w ten sposób, a po ostatnim przemyciu odlej nadsącz.

Wyjmij probówkę z magnesu. Dodaj jeden mililitr buforu E i powoli resuspenduj kuleczki. Przenieś całą mieszaninę do 50 mililitrów buforu E. Umieść na wytrząsarce i mieszaj powoli w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Następnie należy przetestować koraliki do wiązania DNA, używając drabinki DNA 1 KB oraz trzech różnych stosunków objętości koralików do objętości DNA. Ustalono, że stosunek 2,5/1 jest najskuteczniejszy w wiązaniu DNA. Aby wykorzystać koraliki do oczyszczania DNA, należy dodać 425 µL lub 2,5 objętości koralików do każdej próbki DNA i powoli resuspender, pipetując w górę i w dół około 10 razy.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Umieścić na magnesie na pięć minut. Następnie odessać i odrzucić nadsącz.

Przemyć dwukrotnie świeżo przygotowanym 80% etanolem, dodając 600 µL do każdej probówki. Odczekać jedną minutę, a następnie odessać i odrzucić nadsącz. Krótko odwirować probówki.

Umieść probówki na magnesie. Usuń ostatnie krople etanolu i pozostaw do wyschnięcia na jedną minutę w temperaturze pokojowej. Zdejmij próbkę z magnesu i eluuj DNA, dodając 20 µL wody wolnej od DNazy i RNazy. Wymieszaj w wortexie.

Elektroforeza w żelu agarozowym wykazała wielkości fragmentów DNA uzyskanych po odwróceniu sieciowania całego sonikowanego DNA wyekstrahowanego z komórek ES myszy, ciał embrionoidalnych oraz embrionalnej tkanki serca. Eksperyment immunoprecypitacji chromatyny został zaprojektowany w celu zbadania regulacji epigenetycznej genów przejścia epitelialno-mezenchymalnego w komórkach typu dzikiego lub zmutowanych genetycznie, podczas gdy komórki ES różnicują się w kierunku losu komórek mezo-dermalnych. Wiązanie zmodyfikowanych histonów monitorowano za pomocą PCR promotorów lub enhancerów genów E-Cadherin i Twist.

Sekwencyjna immunoprecypitacja chromatyny została przeprowadzona na chromatynie wyizolowanej z czterech linii ludzkich komórek ES z użyciem przeciwciał przeciwko markerowi aktywacji chromatyny, a następnie przeciwciał przeciwko markerowi represji. Markery te ulegają modyfikacji w odpowiedzi na działanie morfogenów, jednak ich stan jest zmienny w zależności od linii ludzkich komórek ES. Prawdopodobnie wynika to z różnic w blastocystach, z których zostały one wyprowadzone.

Immunoprecypitację chromatyny można zastosować również do chromatyny wyekstrahowanej ze specyficznych obszarów embrionalnego serca. Rysunek ten przedstawia regiony genomowe genów serca Nkx2.5 i TBx5 wzbogacone w zmodyfikowaną histonę oraz jeden region genomowy specyficznego dla rozrusznika geny Shox2, który nie jest wzbogacony ani nie ulega ekspresji w komorze. Po opanowaniu techniki, w przypadku prawidłowego wykonania, procedura ta zajmuje trzy godziny.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przed rozpoczęciem protokołu IP ocenić efektywność sonikacji. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak Eth-ek-se-ek, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. poprzez badanie stanu chromatyny (otwartego lub zamkniętego) lub monitorowanie rozmieszczenia nukleosomów. Po opracowaniu technika ta otworzyła przed badaczami w dziedzinie epigenetyki drogę do eksploracji regulacji epigenetycznej decyzji o losach komórek w dowolnym typie komórki lub organie embrionalnym.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzać analizy immunoprecypitacji chromatyny.