Name: Epigenetyczna regulacja różnicowania serca embrionalnych komórek macierzystych i tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Poznaj metodę immunoprecypitacji chromatyny do badania epigenetycznej regulacji różnicowania serca w komórkach macierzystych embrionów myszy. Technika ta pozwala analizować modyfikacje histonów w konkretnych regionach DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują agencjom finansującym, europejskiemu programowi wspólnotowemu IMI StemBANCC, Fundacji leducq (SHAPEHEART) i Agence Nationale de la Recherche (Genopath)

1. Sieciowanie DNA-białko
<ol>
	<li>Umieścić w probówkach o pojemności 15 ml pobrane komórki ES (2 x 106 komórek dla zwykłego ChIP, 2 x 105 komórek dla mikroChIP), ciała zarodkowe (EB) wygenerowane z komórek ES i embrionalnych tkanek serca wypreparowanych z zarodków myszy E9,5 (kanał przedsionkowo-komorowy, droga odpływu i komora) przy użyciu 1% formaldehydu w PBS dla komórek lub w buforze przepuszczalnym PB2 dla tkanek embrionalnych. Umieść rurki na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 60 obr./min w temperaturze pokojowej dokładnie na 10 minut.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję sieciowania poprzez dodanie glicyny do końcowego stężenia 125 mM i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 60 obr./min.</li>
</ol>
2. Liza komórek i fragmentacja chromatyny
<ol>
	<li>Dwukrotnie przemyć usieciowane komórki zawieszone w 10 ml PBS 1x lub tkanki embrionalne ponownie zawieszone w 1 ml PB2. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatanty.</li>
	<li>Dodaj inhibitory proteazy do buforu PB1 lub PB2 (2 μg/ml leupeptyny, 1 μg/ml aprotyniny i 0,1 mM PMSF) (Tabela 1). Zawiesić osad komórkowy lub tkankę embrionalną z etapu 2.1 w 1 ml odpowiednio buforu PB1 lub PB2. Pipetować w górę i w dół i ponownie zawiesić komórki lub tkanki. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 21 do homogenizacji komórek lub tkanki. Inkubować w temperaturze 4 °C (na kołu) przez 10 minut.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 300 μl odpowiednich SB (Tabela 1) uzupełnionych inhibitorami proteazy w czystej probówce (certyfikowanej wolnej od RNaz, DNaz i pirogenów), aby zapobiec degradacji DNA. Inkubować przez 15 do 30 minut na lodzie.</li>
	<li>Sonikować próbki w temperaturze 4 °C w celu ścinania chromatyny za pomocą sonikatora zgodnie z programami wymienionymi w Tabeli 2 dla każdego materiału. Dostosuj czas trwania sonikacji w zależności od następnej aplikacji (tj. PCR lub sekwencjonowania). Rozmiar ściętego DNA powinien wynosić około 500 pz dla PCR i 300 pz dla sekwencjonowania.</li>
	<li>Odwirować sonikowany lizat komórkowy przez 10 minut przy 6 000 x g w temperaturze 4 °C, przenieść supernatant (chromatynę) do czystej probówki o pojemności 1,5 ml i wyrzucić osad.</li>
	<li>Rozcieńczyć chromatynę w roztworze (bufor sklarowany B) 10 razy wodą i ocenić gęstość optyczną za pomocą 1,5 μl w nanospektrofotometrze. Stężenie białek w μg/μl obliczyć według wzoru: 1,55 x OD 280 - 0,76 x OD260.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>bufor</td>
			<td>Wykorzystanie</td>
			<td colspan="4">Kompozycja</td>
			<td>Materiałów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">A</td>
			<td rowspan="2">Przepuszczalność</td>
			<td colspan="4">PB1 : 5 mM RURY pH 8; 85 mM KCl; 0,5 % NP40</td>
			<td>cały</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">PB2 : 15 mM HEPES pH 7,6, 15 mM NaCl, 4 mM MgCl2 60 mM KCl, 0,5% TRITON X-100</td>
			<td>Tkanka embrionalna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B</td>
			<td rowspan="3"> Liza / Sonikacja</td>
			<td colspan="4">SB1: 1 % SDS; 10 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl pH 8</td>
			<td>Esc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">SB2: 50 mM HEPES-KOH pH7,9 ; 140 mM; 1mM EDTA; 0,1% deoksycholanu; 0,1 % SDS</td>
			<td>Ebs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">SB3:15 mM HEPES pH7.6, 15 mM NaCl ; 60 mM KCl, 1mM EDTA, 0.5 mM EGTA ; 1% TRITON-X100, 0,1% SDS , 0,5% laurylosarkozyna</td>
			<td>Tkanka embrionalna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z</td>
			<td>Bufor ChIP</td>
			<td colspan="4">150 mM NaCl ; 50 mM Tris-HCl pH 7,5 ; 5 mM EDTA ; 0,5 % NP40 ; 1% TRITON-X100 .</td>
			<td>cały</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>Elucja DNA/białka</td>
			<td colspan="4">D1 : 1 % SDS; 100 mM NaHCO3 
			D2: 50 mM Tris pH 7,6 /5 mM EDTA, 15 mM naziemna telewizja cyfrowa, 2% SDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>Przygotowanie kulek wiążących DNA</td>
			<td colspan="4">E : 20 % PEG 8000; 2,5 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 8; 1mM EDTA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. ChIP.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>materiał</td>
			<td>Program sonikacji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embrionalne komórki macierzyste</td>
			<td>15 cykli po 30 sekund włączenia i 30 sekund wyłączenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciała zarodkowe</td>
			<td>30 cykli po 30 sekund włączenia i 30 sekund wyłączenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tkanki embrionalne</td>
			<td>21 cykli po 30 s WŁ. i 30 sek. WYŁ.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Programy sonikacyjne.
3. Immunoprecypitacja i płukanie
<ol>
	<li>Umyj 3 razy kulki sprzężone z białkiem A buforem C. Pobrać 100 μl kulek do czystej probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 1 ml buforu C (Tabela 1). Rurka jest następnie przenoszona na magnes; Odczekaj 1 minutę i odessaj supernatant. Powtórz dwukrotnie etap prania.</li>
	<li>Inkubować przeciwciało podniesione przeciwko zmodyfikowanym histonom lub czynnikowi transkrypcyjnemu (stężenia wymienione w tabeli 3) z 20 μl przemytych sprzężonych kulek białka A i 1 ml buforu C uzupełnionego inhibitorami proteazy w czystej probówce o pojemności 1,5 ml. Umieścić próbki w rotatorze z prędkością 40 obr./min na co najmniej 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć kompleksy przeciwciało-kulki 3 razy 1 ml buforu C (manipulacja opisana w ppkt 3.1).</li>
	<li>Przygotować 2 probówki, jedną zawierającą 150 μg chromatyny i kompleksów przeciwciało-kulki, a drugą probówkę zawierającą 150 μg chromatyny i 20 μl przemytych kulek; Dodać 1 ml buforu C uzupełnionego inhibitorami proteazy do każdej probówki i inkubować próbki na obracającym się kole z prędkością 40 obr./min przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Stężenie chromatyny musi wynosić co najmniej 300 μg w celu immunoprecypitacji czynnika transkrypcyjnego lub sekwencyjnego ChIP.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>norma</td>
			<td> Stężenie (ng/μl)</td>
			<td>Objętość (μl)</td>
			<td>Całkowite stężenie DNA (ng)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZA</td>
			<td>Wersja 10.0</td>
			<td>1</td>
			<td>Wersja 10.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W</td>
			<td>Godzina 5.00</td>
			<td>1</td>
			<td>Godzina 5.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z</td>
			<td>Godzina 2,50</td>
			<td>1</td>
			<td>Godzina 2,50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>Wydanie orzeczenia 1,25</td>
			<td>1</td>
			<td>Wydanie orzeczenia 1,25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>0,625</td> pkt.
			<td>1</td>
			<td>0,625</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Z</td>
			<td>0,3125</td> pkt.
			<td>1</td>
			<td>0,3125</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Z</td>
			<td>0,156</td> pkt.
			<td>1</td>
			<td>0,156</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td>0,0</td>
			<td>1</td>
			<td>0,0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3. Stężenia wzorcowe.
4. Elucja DNA, odwrócenie usieciowania i trawienie proteinazy K
<ol>
	<li>Umieść próbki w stojaku magnetycznym. Odzyskać supernatant zawierający niezwiązaną chromatynę przeciwciała. 
	UWAGA: Na tym etapie próbki można szybko zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Chromatyna może być stosowana w innych testach immunoprecypitacyjnych z innymi przeciwciałami. Przemyć każdą próbkę 3 razy 1 ml buforu C (manipulacja opisana powyżej).</li>
	<li>Eluować białko związane z przeciwciałami, dodając 150 μl buforu D1 lub D2, jeżeli konieczne jest wykonanie sekwencyjnego ChIP (tabela 1), do przemytych materiałów ChIP i inkubować próbki przez 20 minut w temperaturze 50 °C w bloku grzewczym.</li>
	<li>Wyjmij probówki z bloku grzewczego i umieść próbki w stojaku magnetycznym, odzyskaj supernatant w czystej probówce o pojemności 1,5 ml (certyfikowanej wolnej od RNaz, DNaz i pirogenów) i wyrzuć kulki.</li>
	<li>Użyć supernatantu do sekwencyjnego ChIP, dodając 1 do 3 μg drugiego przeciwciała w 2 objętościach buforu C lub odwrotnego sieciowania przez dodanie 5 M NaCl w celu uzyskania końcowego stężenia 200 mM.</li>
	<li>Przygotować próbkę wejściową chromatyny w czystej probówce o pojemności 1,5 ml (z certyfikatem wolnym od RNaz, DNaz i pirogenów), pobierając taką samą ilość chromatyny jak w próbce IP (150 μg) w końcowej objętości 150 μl wody (woda wolna od RNazy). Dodać 5M NaCl do końcowego stężenia 200 mM. Próbki inkubować przez noc w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Następnego dnia należy usunąć próbki z bloku grzewczego, dodać 250 mM EDTA w celu uzyskania końcowego stężenia 12,5 mM i proteinazy K w celu uzyskania końcowego stężenia 250 μg/ml w materiale ChIP i trawić w temperaturze 55 °C przez 2 godziny w bloku grzewczym.</li>
</ol>
5. Izolacja DNA za pomocą koralików wiążących DNA
<ol>
	<li>Przygotowanie koralików
	<ol>
		<li>Zacznij przynosić koraliki do temperatury pokojowej przez co najmniej 30 minut, bardzo dokładnie wymieszaj koraliki. Kulki osiadają, więc pipetowanie działa szybko. Przenieś 1 ml kulek do czystej probówki o pojemności 1,5 ml (z certyfikatem wolnym od RNaz, DNaz i pirogenów).</li>
		<li>Ustaw na magnesie, odczekaj 2 - 3 minuty, aż roztwór się sklaruje, wyrzuć supernatant. Zdjąć z magnesu, dodać 1 ml 0,5 M EDTA i wymieszać przez krótkie wirowanie.</li>
		<li>Powtórzyć krok 5.1.2 dwa razy i odrzucić supernatant na końcu.</li>
		<li>Zdejmij z magnesu, dodaj 1 ml buforu E i powoli ponownie zawieś kulki. Przenieś całą mieszaninę (kulki w buforze E) do 50 ml buforu E. Umieść na shakerze i pozwól mu powoli mieszać się w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Zbadać kulki wiążące DNA zgodnie z protokołem oczyszczania opisanym poniżej, stosując 3 warunki doświadczalne: 50 μl kulek/50 μl DNA (1 objętość/1 objętość), 100 μl kulek/50 μl DNA (2 objętości/1 objętość) i 125 μl kulek/50 μl DNA (2,5 objętości/1 objętość). Pozwól migrować oczyszczonemu DNA na 1,5% żelu agarozowym, aby sprawdzić rozmiar fragmentów (ryc. 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie DNA
	<ol>
		<li>Do każdej próbki DNA (około 170 μl) dodać 425 μl (2,5 objętości) kulek magnetycznych wiążących DNA. Zawiesić powoli, pipetując w górę i w dół (około 10 razy) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Umieścić na magnesie na 5 minut, następnie odessać supernatant i wyrzucić (na magnes).</li>
		<li>Dodaj 600 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówki na magnesie, odczekaj 1 minutę, odessaj supernatant i wyrzuć, a następnie powtórz poprzedni krok jeszcze raz.</li>
		<li>Szybko zakręć, przez 5 sekund (mikrofuge), umieść rurkę na magnesie i usuń ostatnie krople etanolu. Pozostaw do wyschnięcia na 1 minutę w temperaturze pokojowej</li>
		<li>Eluuj DNA, dodając 20 μl wody wolnej od RNazy DNazy. Zdjąć próbkę z magnesu i przekręcić ją wirowo.</li>
		<li>Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić próbki na magnesie. Odessać eluowane DNA do nowej probówki (certyfikowanej wolnej od RNaz, DNaz i pirogenów).</li>
		<li>Uruchom DNA z frakcji wejściowej na 1,5% żelu agarozowym, aby sprawdzić rozmiar fragmentów DNA (ryc. 1B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja DNA za pomocą przyrządu do wykrywania fluorescencji
<ol>
	<li>Seryjnie rozcieńczyć w wodzie 1 μg DNA (drabinka 1 kb), aby uzyskać w sumie 7 rozcieńczeń plus punkt no-DNA (rozcieńczenia zebrane w tabeli 3).</li>
	<li>Przygotować roztwór barwnika PCR Green I, wystarczający dla wszystkich próbek (oczyszczone DNA i wzorcowe rozcieńczenia A-H): rozcieńczyć 10 000x zielony barwnik w 1x buforze TE.</li>
	<li>Dodać 1 μl każdej próbki DNA (oczyszczone DNA i wzorcowe rozcieńczenia A-H) do 10 μl 1x zielonej mieszanki barwników w kapilarnych kuwetach do odczytu we fluorymetrze przy długości fali 488 nm. Do testu bez DNA należy użyć 1 μl buforu 1x TE.</li>
	<li>Zbuduj krzywą kalibracyjną za pomocą oprogramowania graficznego i określ względne stężenia w zakresie próbek DNA w ng/μl. DNA jest następnie gotowe do PCR lub do tworzenia bibliotek sekwencjonowania.</li>
</ol>
7. PCR
<ol>
	<li>Wybór podkładów
	<ol>
		<li>Zaprojektuj interesujące startery do badania interesujących regionów genomu. Zaprojektuj startery do amplifikacji regionów wzmacniających geny za pomocą przeglądarki genomu UCSC. Wzmacniacze są dalej przewidywane przy użyciu danych H3K4me1 lub p300 ChIP-seq9 dostępnych w zbiorze danych GEO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metoda PCR
	<ol>
		<li>Uruchom reakcje PCR przez 45 cykli (8 s 95 °C, 8 s 60 °C, 8 s 72 °C) przy użyciu termocyklera PCR w czasie rzeczywistym w 25 μl mieszanki zielonego barwnika, 2 ng DNA i 0,5 μl mieszaniny starterów (20 μM roztworu podstawowego)10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wzbogacenia
	<ol>
		<li>Obliczać Bezwzględne wzbogacenie przy założeniu, że co najwyżej 1% nukleosomów było immunoprecypitowanych11.</li>
		<li>Rozważ, że genom jest wzbogacony, jeśli próbki IP o mocy 10 ng wykazują większe wzbogacenie w porównaniu z 0,1 ng wejściowego DNA.</li>
		<li>Wyraź wyniki jako wzrost fałdowania wzbogacenia w niewzbogaconym regionie po normalizacji do danych wejściowych i dostosowaniu do niespecyficznej próbki kontrolnej.</li>
		<li>Rozważ, że wejściowy DNA należy rozcieńczyć o 100 (współczynnik rozcieńczenia lub DF).</li>
		<li>Znormalizuj dane wejściowe, używając następującego równania 2-ΔCt x 100%, gdzie -ΔCt = Ct[IP] - Ct[Wejście x DF].</li>
		<li>Dostosuj kontrolę, stosując następujące równanie (ΔCt[IP]-ΔCt[NS]), gdzie NS jest próbką niespecyficzną (brak przeciwciała IP lub IgG IP).</li>
		<li>Obliczyć wzbogacenie próbki w fałdowanie jako 2-ΔΔCt. Plik zawierający wszystkie kroki obliczeń wraz ze wzorami, do których można wprowadzić tylko każdą próbkę PCR, ułatwi analizę wyników.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li>
<li>Chen, T., Dent, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifiers+and+remodellers%3A+regulators+of+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation.</a> Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).</li>
<li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li>
<li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).</li>
<li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gel+retardation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li>
<li>Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cardiac+development%3A+a+view+from+stem+cells+to+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).</li>
<li>Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+bivalent+epigenetic+marks+in+two+human+embryonic+stem+cell+lines+reveals+a+different+cardiogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential.</a> Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).</li>
<li>Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44, 148-156 (2012).</li>
<li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162, 948-959 (2015).</li>
<li>Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cohesin-OCT4+complex+mediates+Sox+enhancers+to+prime+an+early+embryonic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage.</a> Nat Commun. 6, 6749(2015).</li>
<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q2ChIP%2C+a+quick+and+quantitative+chromatin+immunoprecipitation+assay%2C+unravels+epigenetic+dynamics+of+developmentally+regulated+genes+in+human+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells.</a> Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).</li>
<li>Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 315-326 (2006).</li>
<li>Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151, 206-220 (2012).</li>
<li>Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fate+and+cellular+maturity+encoded+in+human+regulatory+DNA+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes.</a> Cell. 154, 888-903 (2013).</li>
<li>Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nat Commun. 6, 6033(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Epigenetyka stała się ważną dziedziną badań w biologii rozwoju. W jaki sposób program genetyczny jest aktywowany w komórkach embrionalnych, aby umożliwić komórkom uzyskanie określonej tożsamości w linii embrionalnej, od dawna było kluczowym pytaniem dla biologów rozwojowych.
ChIP jest szeroko stosowany w ciągu ostatnich lat i łączony z sekwencjonowaniem DNA po poprawie rozdzielczości sekwencjonowania. Stało się to potężną techniką pozwalającą na badanie w sposób zależny od całego genomu epigen...

Serce jest pierwszym organem, który się formuje i staje się funkcjonalny w zarodku. Serce jest zbudowane z wielu linii komórkowych, które powstają z pierwszego i drugiego embrionalnego pola serca1. Od etapu blastocysty po zapłodnieniu aż do ukształtowania serca, komórki embrionalne muszą zatem podejmować wiele decyzji dotyczących losu komórki. Transkrypcja genów jest regulowana w sposób zależny od czasu i przestrzeni i jest kluczowym procesem biologicznym, który leży u podstaw decyzji o losie komórki podczas rozwoju embrionalnego. W takim procesie pośredniczą specyficzne czynniki transkrypcyjne, które wiążą regiony regulatorowe w genomie, w tym wzmacniacze i promotory genów konstytutywnych serca. DNA jest owinięte wokół histonów, które są poddawane modyfikacjom, takim jak acetylacja, metylacja, ubikwitynylacja i/lub fosforylacja. Modyfikacja histonów prowadzi do stłumionej, aktywowanej lub opanowanej transkrypcji genu w zależności od tego, która reszta lizyny histonu jest modyfikowana2.
Test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) został stworzony wiele lat temu3 i jest obecnie najszerzej stosowaną technologią do identyfikacji celów zmodyfikowanych histonów lub czynników transkrypcyjnych4. Po immunoprecypitacji histonów lub czynników transkrypcyjnych, związane DNA może być amplifikowane przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) lub sekwencjonowane. ChIP technicznie pokonał bardziej wymagające testy opóźniania żelu5. Jednak ChIP nie oznacza bezpośredniego wiązania czynnika transkrypcyjnego z DNA, co jest zaletą testu opóźniającego działanie żelu. Z drugiej strony, ChIP w połączeniu z sekwencjonowaniem DNA otworzyło nową perspektywę regulacji genów obejmującą cały genom.
Komórki ES (komórki ES) rekapitulują w ciałach embrionalnych (tj. agregatach komórkowych) lub w hodowli 2D wczesne etapyrozwoju serca 6 i dostarczają w zasadzie wystarczająco dużo materiału dla ChIP. Co więcej, ludzkie komórki ES reprezentują ludzki model komórkowy kardiogenezy, chociaż ich potencjał kardiogenny zależy od ich sygnatury epigenetycznej7. Na późniejszych etapach rozwoju tkanki embrionalne myszy pozwalają na badanie określonych krajobrazów epigenetycznych wymaganych do określenia tożsamości komórki. Jednak genom jest transkrybowany w sposób specyficzny dla czasu i typu komórki8. Epigenetyczna regulacja transkrypcji genów musi być badana w zlokalizowanych regionach. W niniejszym artykule opisujemy protokoły ChIP, sekwencyjne ChIP, po których następuje PCR lub sekwencjonowanie przy użyciu komórek ES, ciał zarodkowych i regionów embrionalnych specyficznych dla serca. Protokoły te pozwalają na zbadanie epigenetycznej regulacji transkrypcji genów serca.

<table><tbody><tr><td>Formaldehyd&nbsp;</td><td>Stabilizacja komórek Sigma</td><td>F8775</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>Ogranicznik sieciowania</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fluka</td><td>10820</td><td>Inhibitor proteaz</td></tr><tr><td>Hemisulfate leupeptyny</td><td>Sigma</td><td>L2882</td><td>Inhibitor proteaz</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Inhibitor proteaz</td></tr><tr><td>Białko A kulki magnetyczne&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>10001D</td><td>Immunoprecypitacja</td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne SPRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>15002-01</td><td>Oczyszczanie DNA</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Technologie życiowe</td><td>25530-015</td><td>Trawienie białek&nbsp;</td></tr><tr><td>Norma DNA BR&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Q32850</td><td>Zakres kalibracji&nbsp;</td></tr><tr><td>Syber zielone</td><td>Sondy molekularne</td><td>S-11484</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>Bufor TE&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>PBX 1x</td><td>Life technologies</td><td>14190-094</td><td>Mycie</td></tr><tr><td>wody wolnej od RNaz DNazy</td><td>Technologie życia</td><td>10977-035</td> Rurka do <td>rozcieńczania</td></tr><tr><td>Axygen</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td>ChIP purifiction</td></tr><tr><td>Przeciwciało&nbsp; </silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Referencyjny</silny></td><td><silny>ChIP koncentracja</silny></td></tr><tr><td>H3K27ac</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td>3 &mikro; g dla ESC i EBs, 1 i mikro; g dla tkanek</td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410194 (pAb-194-050)</td><td>3 &mikro; g dla ESC i EBs, 1 i mikro; g dla tkanek</td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410058 (pAb-058-050)</td><td>3 &mikro; g dla ESC i EBs, 1 i mikro; g dla tkanek</td></tr><tr><td>H3K9me2</td><td>Diagenode</td><td>C15410060 (pAb-060-050)</td><td>3 &mikro; g dla ESC i EBs, 1 i mikro; g dla tkanek</td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410030 (pAb-030-050)</td><td>3 &mikro; g dla ESC i EBs, 1 i mikro; g dla tkanek</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410069 (pAb-069-050)</td><td>3 &mikro; g dla ESC i EBs, 1 i mikro; g jak tkanki</td></tr></tbody></table>

epigenetyczna regulacja różnicowania serca embrionalnych komórek macierzystych i tkanek

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specyficzna transkrypcja genów jest kluczowym procesem biologicznym, który leży u podstaw decyzji o losie komórki podczas rozwoju embrionalnego. W procesie biologicznym pośredniczą czynniki transkrypcyjne, które wiążą genomowe regiony regulatorowe, w tym wzmacniacze i promotory genów konstytutywnych serca. DNA jest owinięte wokół histonów, które są poddawane modyfikacjom chemicznym. Modyfikacje histonów prowadzą dalej do stłumionej, aktywowanej lub opanowanej transkrypcji genów, przynosząc w ten sposób kolejny poziom precyzyjnej regulacji transkrypcji genów. Embrionalne komórki macierzyste (komórki ES) rekapitulują w ciałach embrionalnych (tj. agregatach komórkowych) lub w hodowli 2D wczesne etapy rozwoju serca. Dostarczają one w zasadzie wystarczającej ilości materiału do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), technologii szeroko stosowanej do identyfikacji regionów regulatorowych genów. Co więcej, ludzkie komórki ES reprezentują ludzki model komórkowy kardiogenezy. Na późniejszych etapach rozwoju tkanki embrionalne myszy pozwalają na badanie określonych krajobrazów epigenetycznych wymaganych do określenia tożsamości komórki. W niniejszym artykule opisujemy protokoły ChIP, sekwencyjnego ChIP, po którym następuje PCR lub sekwencjonowanie ChIP przy użyciu komórek ES, ciał zarodkowych i regionów embrionalnych specyficznych dla serca. Protokoły te pozwalają na zbadanie epigenetycznej regulacji transkrypcji genów serca.

Rysunek 1A przedstawia w pierwszej kolejności przygotowanie kulek wiążących DNA oraz kontrolę jakości z wykorzystaniem DNA o różnych rozmiarach (drabina 1 kb). Aby oczyścić fragmenty DNA o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej, do jednej objętości próbki dodano odpowiednio jedną, dwie i 2,5 objętości kulek (1 do 3).
Rysunki 1 B,C,D przedstawiają typowe przykłady żeli DNA z całkowitego sonikowan...

Precyzyjna regulacja transkrypcji genów leży u podstaw decyzji o losie komórki embrionalnej. W niniejszym artykule opisujemy testy immunoprecypitacji chromatyny stosowane do badania epigenetycznej regulacji zarówno różnicowania komórek macierzystych w sercu, jak i rozwoju serca zarodków myszy.

Epigenetyczna regulacja różnicowania serca embrionalnych komórek macierzystych i tkanek

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Ogólnym celem zastosowania tych metod immunoprecypitacji chromatyny w różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych lub embrionalnych tkankach serca jest odkrycie epigenetycznej regulacji rozwoju serca. Ponieważ precyzyjne dostrajanie transkrypcji genów podczas embrionalnego rozwoju serca jest regulowane przez komponenty epigenetyczne, immunoprecypitacja chromatyny stanowi odpowiednie podejście do zrozumienia tego procesu.Główną zaletą tej techniki jest możliwość specyficznego ukierunkowania na konkretny locus i analizy znaczników epigenetycznych znajdujących się na tym fragmencie DNA. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat regulacji epigenetycznej rozwoju serca. Może być ona również zastosowana w odniesieniu do innych narządów lub dowolnych typów komórek.To jest Imen. Jest ona doktorantką w laboratorium i to ona przeprowadzi dzisiejszy eksperyment. Niniejsza procedura wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste (ES).Ciałka embrionalne wytworzone z komórek ES oraz embrionalne tkanki serca wypreparowane z zarodków myszy w stadium E9.5. Utwierdzić komórki i tkanki. W przypadku komórek zastosować 1% formaldehyd w PBS, a w przypadku tkanek embrionalnych bufor permeabilizu

epigenetic-regulation-cardiac-differentiation-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy zastosowanie testu opartego na komórkach ES myszy w celu zidentyfikowania krytycznych okien czasowych aktywacji sygnałów Wnt/β-catenin i BMP podczas indukcji kardiogennej. Metoda ta stanowi standaryzowaną platformę, która pozwala na wiarygodne ilościowe określenie wydajności kardiogennej i może być stosowana do badania innych linii komórkowych.

Zmodyfikowany test oparty na mysich embrionalnych komórkach macierzystych do ilościowego określania wydajności indukcji kardiogennej

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

W tym protokole zostanie zilustrowane pochodzenie komórek progenitorowych serca zarówno z mysich, jak i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Główną strategią w tym protokole jest wzbogacenie komórek progenitorowych serca za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluorescencyjnych reporterów zmodyfikowanych w embrionalnych liniach komórek macierzystych.

Wyprowadzenie komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych

Generowanie kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych in vitro umożliwia dostęp do dużych ilości tkanki serca in vitro dla nauk podstawowych i zastosowań klinicznych.  Protokół ten wykorzystuje czynnik przedsionkowy Grem2 zarówno do zwiększenia liczby uzyskanych kardiomiocytów, jak i do wytworzenia kardiomiocytów o fenotypie przedsionkowym.

Różnicowanie kardiomiocytów przedsionkowych od pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą antagonisty BMP Grem2

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół generowania i kwantyfikacji różnych przeprogramowanych podtypów serca przy użyciu retrowirusowego dostarczania Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 za pośrednictwem retrowirusa.

Ocena podtypów kardiomiocytów po przeprogramowaniu fibroblastów embrionalnych myszy za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Tutaj opisujemy skalowalną metodę, wykorzystującą prostą kombinację Activiny A i nadekspresji Id1 za pośrednictwem lentiwirusa, do generowania pierwszych komórek progenitorowych serca podobnych do pola serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Generacja pierwszych sercopodobnych progenitorów serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę immunoprecypitacji chromatyny do badania epigenetycznej regulacji różnicowania serca w komórkach macierzystych embrionów myszy. Technika ta pozwala analizować modyfikacje histonów w konkretnych regionach DNA.

Epigenetyczna regulacja różnicowania serca embrionalnych komórek macierzystych i tkanek

Przeglądaj więcej filmów