Name: Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metodę izolacji pojedynczych komórek z zarodków Danio rerio przy użyciu systemu mikrofluidycznego do analizy ekspresji genów. Technika ta ujawnia heterogeniczność komórkową ukrytą w metodach opartych na populacjach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. C. Geoffreyowi Burnsowi za rybołówstwo. Autorzy są wdzięczni UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core za zasoby umożliwiające ten projekt oraz ośrodkowi ZAC zajmującemu się opieką nad zwierzętami. L.S. jest wspierany przez grant NIH T32 HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. jest wspierany przez stypendium badawcze dla absolwentów NSF NSF-DGE-1144081. Badanie to było wspierane przez grant NIH P30DK034987 (dla UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 i Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (dla dr Qian) oraz grant HL109079 NIH R00 (dla dr Liu).

<ol><li>Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis%3A+toward+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis: toward the clinic.</a> Genome medicine. 5, (2013).</li>
<li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+genomics%3A+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Single cell genomics: advances and future perspectives.</a> PLoS genetics. 10, e1004126(2014).</li>
<li>Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).</li>
<li>Yin, H., Marshall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for single cell analysis.</a> Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).</li>
<li>Garlanda, C., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+endothelial+cells.+Specific+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).</li>
<li>Diaz-Cano, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+heterogeneity%3A+mechanisms+and+bases+for+a+reliable+application+of+molecular+marker+design%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design.</a> International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cellular+hierarchy+by+single-cell+analysis+of+the+cell+surface+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire.</a> Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Developmental cell. 18, 675-685 (2010).</li>
<li>Treutlein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+lineage+hierarchies+of+the+distal+lung+epithelium+using+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq.</a> Nature. 509, 371-375 (2014).</li>
<li>Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+early+development+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics+%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Genetics and early development of zebrafish.</a> Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).</li>
<li>Liu, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+the+study+of+early+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in the study of early cardiac development.</a> Circulation research. 110, 870-874 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA-Seq+and+microarray+in+transcriptome+profiling+of+activated+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells.</a> PloS one. 9, e78644(2014).</li>
<li>McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+non-detects+in+qPCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">On non-detects in qPCR data.</a> Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature. 3, 1101-1108 (2008).</li>
<li>Lyons, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+and+morphogenetic+defects+in+the+heart+tubes+of+murine+embryos+lacking+the+homeo+box+gene+Nkx2-5%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5.</a> Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).</li>
<li>Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+tinman+homolog+demarcates+the+heart+field+and+initiates+myocardial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation.</a> Development. 122, 3809-3816 (1996).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+TGF-beta+binding+protein+3+identifies+a+second+heart+field+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish.</a> Nature. 474, 645-648 (2011).</li>
<li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+field+origin+of+great+vessel+precursors+relies+on+nkx2.5-mediated+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis.</a> Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).</li>
<li>McCurley, A. T., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+housekeeping+genes+in+zebrafish%3A+male-female+differences+and+effects+of+tissue+type%2C+developmental+stage+and+chemical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment.</a> BMC molecular biology. 9, 102(2008).</li>
<li>Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+reference+genes+for+quantitative+real-time+RT-PCR+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biochimica+et+biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization.</a> Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+in+the+heart+field+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation in the heart field of zebrafish.</a> Development. 125, 1095-1101 (1998).</li>
<li>de Pater, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+phases+of+cardiomyocyte+differentiation+regulate+growth+of+the+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart.</a> Development. 136, 1633-1641 (2009).</li>
<li>Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cardiac+development+requires+a+conserved+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field.</a> Development. 138, 2389-2398 (2011).</li>
<li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Developmental biology. 214, 23-37 (1999).</li>
<li>Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj metoda wykorzystuje ekspresję białka fluorescencyjnego pod kontrolą promotora specyficznego dla typu komórki w celu wzbogacenia populacji komórek progenitorowych serca z zarodków danio pręgowanego do zastosowania w mikroprzepływowym systemie wychwytywania pojedynczych komórek w celu oceny ekspresji podzbioru genów sercowych w pojedynczych komórkach. Pod warunkiem, że możliwości wzbudzenia i emisji laserowej FACS są zgodne z wybranym fluoroforem (fluoroforami), metoda ta może być stosowana do dowolnej fluore...

Większość obecnych badań nad biologią komórkową i molekularną opiera się na średnich populacjach. Jednak te tradycyjne analizy populacyjne mogą być maskowane przez ważne zdarzenia biologiczne, ponieważ mniejsze populacje mogą odgrywać główną rolę w procesach biologicznych i wynikach choroby. Zrozumienie ekspresji genów w heterogenicznych populacjach na poziomie pojedynczej komórki może prowadzić (i prowadziło) do odpowiednich spostrzeżeń biologicznych i klinicznych1,2. Niepokojące dla badań nad rozwojem embrionalnym jest to, że w większej populacji komórek komórki progenitorowe są często niedostatecznie reprezentowane, co utrudnia wykrycie subtelnych zmian w ekspresji genów, które ostatecznie inicjują decyzje dotyczące losu komórki3. Podobnie, pojedynczy typ komórki może mieć różne profile ekspresji w odpowiedzi na mikrośrodowisko4. Na przykład komórki śródbłonka rezydentne w tym samym narządzie lub w różnych narządach (np. aorcie lub nerce) wykazują znaczną niejednorodność, mimo że mają wspólne cechy morfologiczne i funkcjonalne5. Ponadto komórki rakowe zasiedlające ten sam guz mogą mieć różne profile molekularne lub mutacje na poziomie pojedynczej komórki6.
W systemach modelowych, transkryptomika w pojedynczych komórkach z powodzeniem zidentyfikowała nowe populacje komórek, scharakteryzowała stany pośrednie, które występują podczas różnicowania komórek, i ujawniła zróżnicowane reakcje komórkowe na bodźce7,8,9. Takie spostrzeżenia zostałyby zamaskowane w konwencjonalnych badaniach populacyjnych. Zarodki danio pręgowanego są niezwykle niewykorzystanym źródłem komórek macierzystych, progenitorowych i różnicujących się do badania kwestii heterogeniczności pojedynczych komórek i molekularnej regulacji tożsamości komórkowych podczas rozwoju. Ich wysoce stereotypowy rozwój ex vivo i łatwość manipulacji genetycznej sprawiają, że są one doskonałym systemem modelowym dla tego podejścia10,11. W szczególności głównym ograniczeniem w interpretacji danych dotyczących ekspresji genów w pojedynczej komórce jest to, że wiarygodna identyfikacja nowych pośrednich stanów komórkowych podczas rozwoju wymaga bardzo starannego czasu pobierania tkanek9. Jest to konieczne, aby zapewnić, że heterogeniczność między wychwyconymi komórkami reprezentuje heterogeniczność w tkance w jednym punkcie czasowym, a nie heterogeniczność ekspresji genów wynikającą z różnicowania komórek zależnego od wieku. W porównaniu z myszami, rozwój zarodka danio pręgowanego może być precyzyjnie zsynchronizowany w dużej liczbie zarodków12. Dodatkowo, dzięki dużym rozmiarom lęgu, zarodki danio pręgowanego mogą być wykorzystywane jako obfite źródło komórek macierzystych i progenitorowych.
Ten protokół opisuje metodę izolowania komórek z zarodków ryb danio pręgowanych i przechwytywania pojedynczych komórek za pomocą dostępnego na rynku zintegrowanego układu mikroprzepływowego (IFC) i systemu autoprep do analizy ekspresji genów qRT-PCR. Protokół ten można szybko przenieść do dowolnych testów multipleksowania o wysokiej przepustowości, w tym sekwencjonowania całego transkryptomu, które umożliwia bardziej kompleksową analizę heterogeniczności komórkowej13. Oferuje również kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi testami ekspresji genów. Protokół izolacji pojedynczych komórek zapewnia wysoką żywotność po FACS, co zmniejsza odsetek uszkodzonych komórek, które są włączane do dalszych zastosowań. Korzystając z IFC, przechwycone komórki mogą być bezpośrednio obserwowane w celu oceny wskaźników wychwytywania i morfologicznej oceny zdrowia komórek. Ponadto protokół ten ma szerokie zastosowanie w społeczności badawczej danio pręgowanego, wymagając jedynie oznakowanej transgenicznej linii do ryb i dostępu do technologii wychwytywania komórek mikroprzepływowych.
Jako dowód zasady, pojedyncze komórki pochodzące z komórek progenitorowych serca zostały wyizolowane i przechwycone na chipie IFC, a następnie względna obfitość markerów różnicowania serca została zmierzona za pomocą qRT-PCR. Analiza ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki pokazuje, że komórki progenitorowe serca współistnieją ze swoim różnicującym się potomstwem. Wgląd uzyskany dzięki profilowaniu pojedynczych komórek progenitorów serca może rzucić światło na niejednorodność wzorców ekspresji genów wśród komórek progenitorowych serca podczas rozwoju kręgowców, która mogła zostać zamaskowana w tradycyjnych analizach populacyjnych.

<table><tbody><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Do usuwania kosmówki z zarodków</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek 2 ml</td><td>GeneMate</td><td>C-3261-1</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 40 um</td><td>Biobasic</td><td>SP104151</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Naczynie hodowlane</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Probówki FACS zwieńczone sitkiem 35 μm</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>P1000 i końcówkami</td><td>Rainin</td><td>17005089</td><td></td></tr><tr><td>P20 oraz końcówkami</td> Protokół <td></td><td></td> producenta chipów IFC Rainin 17005091 <td></td></tr><tr><td>Fluidigm</td><td>100-6117</td><td>Wersja 100-6117 E1 został użyty w reprezentatywnym eksperymencie</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta szklana pastuer o szerokim otworze</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>Do przenoszenie zarodków</td></tr><tr><td>Dorosły danio pręgowany typu dzikiego</td><td></td><td></td> Nie dotyczy <td>Użyliśmy linii AB</td></tr><tr><td>Dorosły transgeniczny danio pręgowany</td><td>Nie</td><td></td> dotyczy <td>Użyliśmy Tg(nkx2.5:ZsYellow)</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Odczynniki do dysocjacji komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Podwójnie destylowana woda</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FisherScientific</td><td>S271-3</td><td>zrobić zapas w wodzie i użyć do odtłuszczania żółtka</td></tr><tr><td>bufor KCl</td><td>Sigma</td><td>Aldrich P5405</td><td>zrobić zapas w wodzie i użyć do buforu do usuwania żółtek</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>zrobić zapas w wodzie i użyć do buforu do usuwania żółtka</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>FisherScientific</td><td>03-600-511</td><td>Inaktywacja termiczna; każda marka FBS powinna być w porządku</td></tr><tr><td>Odczynnik do dysocjacji komórek 1 -TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Odczynnik do dysocjacji komórek 2 - FACSmax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>Store -20; rozmrozić na lodzie; przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej</td></tr><tr><td>Pronase (opcjonalnie)</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>L/D Dye - Sytox Blue</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td>Każda żywa/martwa plama nadająca się do cytometrii przepływowej będzie działać</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa </td><td>Company</strong</td><td>>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Odczynniki do stosowania na płytkach IFC i sondy</td> specyficzne dla qRT-PCRGene'a <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sondy będą się różnić w zależności od eksperymentu</td>TaqMan Probe ef1a Life Technologies Dr03432748_m1 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan gata4</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03443262_g1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan nk2-5</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03074126_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan myl7</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03105700_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan vmhc</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03431136_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sonda TaqMan isl1</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03425734_m1</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>wymienione w protokole</td><td></td><td></td><td></td>producenta IFC</tr><tr><td>Zestaw odczynników C1</td><td>Fluidigm</td><td>100-5319</td><td>Odczynniki do ładowania komórek na płytkę IFC</td></tr><tr><td>Ambion Single Cell-to-CTTM</td><td>Life Technologies</td><td>4458237</td><td>Odczynniki do etapów odwrotnej transkrypcji i wstępnej amplifikacji</td></tr><tr><td>Biologia molekularna Jakość wody</td><td>Corning</td><td>46-000CM</td><td></td></tr><tr><td>C1 IFC dla PreAmp (5-10 um)</td><td>Fluidigm</td><td>100-5757</td><td>Płyta IFC do małych komórek</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maszyna C1 AutoPrep</td><td>Fluidigm</td><td>100-5477</td><td>Do płyty IFC użyj</td></tr><tr><td>hemocytometru&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Do liczenia komórek i oceny wielkości komórek</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> preparacyjny <td>Do usuwania zarodków z kosmówki</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> do <td>hodowli tkankowych Do oceny trawienia pojedynczych komórek</td></tr><tr><td>Maszyna</td><td></td><td></td> FACS <td>Do izolowania komórek będących przedmiotem zainteresowania</td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Danio rerio (Danio rerio) jest potężnym organizmem modelowym do badania rozwoju kręgowców. Chociaż wiele aspektów rozwoju embrionalnego danio pręgowanego zostało opisanych na poziomie morfologicznym, niewiele wiadomo na temat molekularnych podstaw zmian komórkowych, które zachodzą wraz z rozwojem organizmu. Dzięki niedawnym postępom w dziedzinie mikrofluidyki i technologii multipleksowania, możliwe jest obecnie scharakteryzowanie ekspresji genów w pojedynczych komórkach. Pozwala to na badanie niejednorodności między poszczególnymi komórkami określonych populacji komórek w celu identyfikacji i klasyfikacji podtypów komórek, scharakteryzowania stanów pośrednich zachodzących podczas różnicowania komórek oraz zbadania zróżnicowanych odpowiedzi komórkowych na bodźce. W badaniu tym opisano protokół izolacji żywotnych, pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego do wysokoprzepustowych testów multipleksowych. Metodę tę można szybko zastosować do dowolnego typu komórek embrionalnych danio pręgowanego z markerami fluorescencyjnymi. Rozszerzenie tej metody może być również stosowane w połączeniu z technologiami sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, aby w pełni scharakteryzować transkryptom pojedynczych komórek. Jako dowód zasady, oceniono względną obfitość markerów różnicowania serca w izolowanych, pojedynczych komórkach pochodzących z komórek progenitorowych serca nkx2,5 dodatnich. Oceniając ekspresję genów na poziomie pojedynczej komórki i w jednym punkcie czasowym, dane wspierają model, w którym komórki progenitorowe serca współistnieją z różnicującym się potomstwem. Opisana tutaj metoda i przepływ pracy mają szerokie zastosowanie w społeczności badawczej danio pręgowanego, wymagając jedynie oznakowanej linii do transgenicznych ryb i dostępu do technologii mikrofluidycznych.

W celu przeprowadzenia dowodu koncepcji oceniono ekspresję genów, aby zbadać dynamikę różnicowania podczas rozwoju serca. U danio pręgowanego progenitory serca wywodzą się z mezodermalnej populacji komórek, które migrują do przedniej części mezodermy płyty bocznej, gdzie łączą się, tworząc liniową rurkę serca. Przed fuzją progenitory serca zaczynają eksponować czynnik transkrypcyjny nkx2.5 (NK2 homeobox 5), który uważa się za najwcześniejszy specyficzny marker progenitorów serca<...

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest izolacja pojedynczych komórek z embrionów rybki zebrafish we wczesnej fazie rozwoju w celu ich przechwycenia w mikrofluidycznym systemie multipleksowym do analizy pojedynczych komórek, aby ocenić ekspresję genów w poszczególnych komórkach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii rozwoju, takie jak to, jakim zmianom transkrypcyjnym podlegają komórki podczas specyfikacji i różnicowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona bezstronne podejście pozwalające na ujawnienie heterogeniczności, która jest maskowana w konwencjonalnych technikach opartych na analizie populacyjnej.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą techniką napotykają trudności, ponieważ przygotowanie żywotnych preparatów pojedynczych komórek jest wymagające technicznie, lecz niezbędne dla dalszych analiz. Po opanowaniu tej metody, przetwarzanie próbek całych embrionów do postaci pojedynczych lizowanych komórek na zintegrowanym chipie mikrofluidycznym może zostać ukończone w ciągu sześciu godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania poszczególnych etapów. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o upewnieniu się, że na urządzeniu mikrofluidycznym uwięzione zostały wyłącznie pojedyncze komórki.Po skrzyżowaniu dorosłych dzikich i transgenicznych daniorzek, należy zbierać embriony w odstępach 15-minutowych, zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi zatwierdzonymi przez placówkę i instytucję. Po co najmniej dwóch godzinach należy przenieść od 100 do 300 zapłodnionych embrionów z jednego punktu czasowego do nowej szalki Petriego zawierającej świeżą wodę do jaj. Następnie, używając precyzyjnej pęsety, należy ręcznie usunąć chorion z każdego embrionu.Następnie, za pomocą szklanej pipety o szerokim wlocie, przenieść zarodki do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml w minimalnej objętości wody do jaj (egg water). Po przeniesieniu wszystkich zarodków, zastąpić wodę 1 ml lodowatej wody do jaj i pozostawić probówkę w lodzie na 20 minut. Po eutanazji usunąć nadlew za pomocą szklanej pipety o szerokim wlocie.Oraz pipetę P-1000 do dwukrotnego dodania świeżej wody z jaj do embrionów. Po drugim przemyciu zastąp wodę z jaj 1 mililitrem buforu do usuwania żółtka i użyj pipety P-1000, aby trituryć embriony od 8 do 12 razy, aż żółtko zostanie rozpuszczone i widoczne będą tylko ciała embrionów. Zbierz tkankę poprzez wirowanie.Następnie za pomocą pipety ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając osadu tkankowego, a komórki ponownie zawieś w 1 mililitrze świeżej wody z jaj. Po dwukrotnym ponownym przemyciu embrionów, zawieś osad w 1 mililitrze odczynnika do dysocjacji komórek-1 (cell dissociation reagent-1) o temperaturze pokojowej. Następnie połóż probówkę poziomo i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Przy delikatnym triturowaniu co dwie do trzech minut w celu zapobiegania tworzeniu się grudek. Po zakończeniu inkubacji ponownie odwirować komórki i resuspender osad w 1 mililitrze odczynnika do dysocjacji komórek-2 (cell dissociation reagent-2). Inkubować komórki w pozycji poziomej w temperaturze pokojowej przez kolejne pięć do 15 minut, delikatnie triturując co dwie do trzech minut.Co pięć minut rozcieńczaj 2 µL supernatantu w 18 µL buforu FACS i nanieś komórki w formie kropli na szalkę do hodowli komórkowych. Połóż szkiełko nakrywkę na próbce i użyj mikroskopu do hodowli tkanek, aby ocenić postęp trawienia przy powiększeniu 10x i 20x. Gdy preparat będzie wyglądał na mieszaninę głównie pojedynczych komórek z kilkoma małymi i dużymi skupiskami komórkowymi oraz niewielką liczbą w większości nienaruszonych ciał embrionów, odwiruj komórki i resuspenderuj osad w 1 mL zimnego buforu FACS.Następnie zwilżyć sito do komórek o rozmiarze oczek 40 µm buforem FACS. Przefiltrować komórki przez sito do naczynia hodowlano-kulturowego o średnicy 35 mm. Po ponownym odwirowaniu komórek, resuspender osad w 100 µL buforu FACS i policzyć liczbę żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanu.Następnie rozcieńcz próbkę do stężenia 5 × 10⁶ komórek na mililitr. Odstaw 10 do 20% komórek jako kontrolę niebarwioną. Pozostałe komórki zabarw fluorescencyjnym barwnikiem do dyskryminacji komórek żywych i martwych.Następnie nawilżamy probówkę FACS z wbudowanym sitkiem do komórek o rozmiarze 35 µm za pomocą 20 µl buforu FACS, a następnie przenosimy komórki na sitko, pozwalając im przefiltrować się grawitacyjnie. Korzystając z przedstawionej strategii bramkowania, należy wyizolować pojedyncze żywe komórki wykazujące ekspresję markera fluorescencyjnego. Weryfikację bramkowania przeprowadzono przy użyciu komórek podwójnie znakowanych.Posortuj od 2 000 do 4 000 komórek z populacji docelowej do probówki mikrotubkowej z 5 µL zimnego buforu FACS, utrzymując ją na lodzie. Następnie przenieś 1 µL posortowanych komórek do nowej probówki FACS zawierającej 100 µL buforu do sortowania FACS oraz barwnik live/dead w rozcieńczeniu 1:1 000. Następnie poddaj próbkę komórek analizie, korzystając z bram sortowania, aby ocenić przeżywalność po sortowaniu.Następnie nanieś 1 µL komórek rozcieńczonych w 9 µL buforu FACS na komorę licznikową, aby określić stężenie komórek oraz ich średnią średnicę. Wybierz zintegrowany układ mikroprzepływowy, czyli chip IFC, o rozmiarze odpowiednim dla średniej średnicy komórek w próbce, a następnie przygotuj układ płynowy zgodnie z instrukcjami producenta. Nanieś komórki na płytkę zgodnie z instrukcjami producenta i wprowadź płytkę do kompatybilnego urządzenia do obsługi płynów.Następnie należy uruchomić odpowiedni skrypt ładowania komórek dla chipa IFC, aby wprowadzić komórki do kanałów przechwytujących. Aby potwierdzić, że komórki osiadły w miejscach przechwytu, należy zamocować płytkę na mikroskopie wyposażonym w adapter do płytek i wykonać obrazy w jasnym polu oraz obrazy fluorescencyjne każdego miejsca przechwytu przy powiększeniu 10x. Następnie komórki mogą zostać poddane dalszej analizie ekspresji genu docelowego za pomocą qRT-PCR.Na etapie 18 somytów można zastosować mikroskopię fluorescencyjną w celu weryfikacji ekspresji ZsYellow w embrionach. Po sortowaniu otrzymuje się komórki o różnych średnicach. Do wychwytywania komórek o interesującej nas średnicy można wykorzystać płytkę IFC.Na przykład w tym doświadczeniu komórki miały średnicę od 5 do 10 µm. Zgodnie z oczekiwaniami, posortowane i przechwycone komórki z embrionów 18 godzin po zapłodnieniu wykazywały ekspresję fluorescencyjnego markera ZsYellow. W tym przypadku zastosowano metodę QRT-PCR w celu oceny względnej ekspresji specyficznych genów zainteresowania w 40 pojedynczych komórkach z miejsc przechwytywania komórek na płytce IFC.Ponieważ zakres wartości progu cyklu dla genu referencyjnego był zbyt szeroki, aby porównać ekspresję genów między próbkami, a wiele wartości progu cyklu przekraczało 30, wartości te przedstawiono w formie mapy ciepła. Porównanie próbek wykazało w tym eksperymencie znaczną heterogeniczność ekspresji genów, przy czym komórki sklasyfikowano jako typy od 1 do 5 na podstawie wzorca ekspresji genów.Po opanowaniu techniki, przetwarzanie całych próbek zarodków do pojedynczych lizowanych komórek na zintegrowanym chipie mikroprzepływowym może zostać ukończone w ciągu sześciu godzin, pod warunkiem właściwego wykonania poszczególnych kroków. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że na chipie mikroprzepływowym wychwytywane są wyłącznie pojedyncze komórki. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak wysokoprzepustowe sekwencjonowanie pojedynczych komórek, aby w pełni scharakteryzować transkryptomy pojedynczych komórek.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biologii rozwoju do eksploracji heterogeniczności komórkowej w embrionach na wczesnym etapie rozwoju. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak izolować pojedyncze komórki z embrionów ryb zebrafish, wychwytywać pojedyncze komórki w mikrofluidycznym systemie multipleksowym do analizy pojedynczych komórek oraz oceniać ekspresję genów poszczególnych komórek.

isolation-and-characterization-of-single-cells-from-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Ten protokół przedstawia podejście do analizy całego transkryptomu z zarodków danio pręgowanego, larw lub posortowanych komórek. Obejmuje izolację RNA, analizę szlaku danych RNASeq oraz walidację zmian ekspresji genów opartą na qRT-PCR.

Przygotowanie próbki i analiza danych dotyczących ekspresji genów opartych na RNASeq od danio pręgowanego

Danio pręgowany był ostatnio używany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA podczas rozwoju. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania zarodków danio pręgowanego do profilowania czasu replikacji. Protokół ten można łatwo dostosować do badania czasu replikacji u mutantów, poszczególnych typów komórek, modeli chorób i innych gatunków.

Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

Przedstawiamy protokół izolowania neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Po wyizolowaniu RNA jest ekstrahowane z tych komórek w celu analizy ich profilu ekspresji genów. Protokół ten pozwala na zbieranie wysokiej jakości RNA do przeprowadzania dalszych analiz, takich jak qPCR i transkryptomika.

Izolacja i ekstrakcja RNA neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego

Przedstawiamy skuteczny i łatwy w użyciu protokół do przygotowania pierwotnych hodowli komórkowych zarodków danio pręgowanego do transfekcji i obrazowania żywych komórek, a także protokół do przygotowania pierwotnych komórek z mózgu dorosłego danio pręgowanego.

Hodowla i transfekcja komórek pierwotnych danio pręgowanego

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Obecny protokół opisuje ostrą izolację żywotnych komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłego, młodocianego, larwalnego i embrionalnego danio pręgowanego (Danio rerio), nadającego się do badań elektrofizjologicznych.

Izolacja komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłych, młodocianych, larwalnych i embrionalnych danio pręgowanego do badań elektrofizjologicznych

Tutaj opisujemy metodę izolacji jelit od larw danio pręgowanego po 5 dniach od zapłodnienia, do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki.

Izolacja jelit od larw danio pręgowanego do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

Poznaj metodę izolacji pojedynczych komórek z zarodków Danio rerio przy użyciu systemu mikrofluidycznego do analizy ekspresji genów. Technika ta ujawnia heterogeniczność komórkową ukrytą w metodach opartych na populacjach.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów