Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wyizolowanie pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego we wczesnym stadium w celu ich schwytania w mikroprzepływowym systemie multipleksowym pojedynczych komórek w celu oceny ekspresji genów poszczególnych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju, takie jak to, jakie zmiany transkrypcyjne zachodzą w komórkach podczas specyfikacji i różnicowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to bezstronne podejście do ujawniania heterogeniczności, która jest maskowana w konwencjonalnych technikach populacyjnych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej techniki, będą miały trudności, ponieważ generowanie żywotnych preparatów pojedynczych komórek jest technicznie trudne, ale niezbędne do dalszej analizy. Po opanowaniu, przetwarzanie całych próbek zarodków na pojedyncze lizowane komórki na zintegrowanym chipie mikroprzepływowym można zakończyć w ciągu sześciu godzin, jeśli kroki zostaną wykonane prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby upewnić się, że tylko pojedyncze komórki są przechwytywane w urządzeniu mikroprzepływowym.

Po wyhodowaniu dorosłego danio pręgowanego typu dzikiego i transgenicznego, należy pobierać zarodki w 15-minutowych odstępach zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi zatwierdzonymi przez placówkę i instytucję. Co najmniej dwie godziny później przenieś od 100 do 300 zapłodnionych zarodków z jednego punktu czasowego na nową szalkę Petriego zawierającą świeżą wodę z jaj. I użyj cienkich kleszczy, aby ręcznie usunąć kosmówkę z każdego zarodka.

Następnie użyj szklanej pipety o szerokim otworze, aby przenieść zarodki do 2-mililitrowej probówki wirówkowej w minimalnej objętości wody jajecznej. Po przeniesieniu wszystkich zarodków zastąp wodę 1 mililitrem lodowatej wody jajecznej i zanurz probówkę w lodzie na 20 minut. Po eutanazji należy użyć szklanej pipety o szerokim otworze, aby usunąć supernatant.

I pipeta P-1000, aby dwukrotnie dodać świeżą wodę z jaj do zarodków. Po drugim umyciu zastąp wodę jajeczną 1 mililitrem buforu do usuwania żółtka i użyj pipety P-1000, aby rozcierać zarodki od ośmiu do 12 razy, aż żółtko się rozpuści i widoczne będą tylko ciała zarodków. Zebrać tkankę przez odwirowanie.

Następnie za pomocą pipety delikatnie usuń supernatant bez naruszania osadu tkankowego i ponownie zawieś komórki w 1 mililitrze świeżej wody jajecznej. Po dwukrotnym umyciu zarodków ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze odczynnika do dysocjacji komórek w temperaturze pokojowej-1. Następnie umieść probówkę na boku na 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.

Z delikatnym rozcieraniem co dwie do trzech minut, aby zapobiec zbrylaniu. Pod koniec inkubacji ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w 1 mililitrze odczynnika do dysocjacji komórek-2. Inkubować komórki poziomo w temperaturze pokojowej przez kolejne pięć do 15 minut z delikatnym rozcieraniem co dwie do trzech minut.

Co pięć minut rozcieńczyć 2 mikrolitry supernatantu w 18 mikrolitrach buforu FACS i dozować komórki w postaci kropelki na szalkę do hodowli komórkowych. Umieść szkiełko nakrywkowe na próbce i użyj mikroskopu kultur tkankowych, aby ocenić postęp trawienia przy 10- i 20-krotnym powiększeniu. Gdy preparat wydaje się być mieszanką głównie pojedynczych komórek z kilkoma małymi i dużymi skupiskami komórek oraz kilkoma w większości nienaruszonymi ciałami zarodków, odwiruj komórki i ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze zimnego buforu FACS.

Następnie zwilż sitko do komórek o grubości 40 mikronów buforem FACS. I przefiltruj komórki przez sitko do 35-milimetrowego naczynia do hodowli komórek. Po ponownym odwirowaniu komórek ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach bufora FACS i policzyć liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego.

Następnie rozcieńczyć próbkę do 5 razy 10 do 6 komórek na mililitr. I zarezerwuj od 10 do 20% komórek do niebarwionej kontroli. Resztę komórek zabarwić fluorescencyjnym żywym/martwym barwnikiem dyskryminacyjnym

Następnie zwilż 35-mikronową rurkę FACS z sitkiem komórkowym 20 mikrolitrami buforu FACS i dodaj komórki do sitka, zbierając je grawitacyjnie. Korzystając z ilustrowanej strategii bramkowania, posortuj pojedyncze żywe komórki wyrażające marker fluorescencyjny. Weryfikacja bramkowania za pomocą komórek z podwójnymi etykietami.

Sortuj od 2 000 do 4 000 komórek z populacji będącej przedmiotem zainteresowania na 5 mikrolitrów zimnego buforu FACS w probówce mikrowirówkowej na lodzie. Następnie przenieś 1 mikrolitr posortowanych komórek do nowej probówki FACS ze 100 mikrolitrami buforu sortującego FACS i rozcieńczeniem 1 do 1 000 żywej/martwej plamy. I uruchom próbkę komórki za pomocą bramek sortujących, aby ocenić żywotność po sortowaniu.

Następnie załaduj 1 mikrolitr komórek rozcieńczonych w 9 mikrolitrach buforu FACS na hemocytometr, aby określić stężenie komórek i średnią średnicę. Teraz wybierz zintegrowany obwód mikroprzepływowy lub chip IFC o rozmiarze odpowiednim do średniej średnicy komórki próbki i zalej fluidykę zgodnie z instrukcjami producenta. Załaduj ogniwa na płytkę zgodnie z instrukcjami producenta i załaduj płytkę do kompatybilnej maszyny do fluidyzacji.

Następnie uruchom odpowiedni skrypt ładowania komórek dla układu IFC, aby wepchnąć komórki na tory przechwytywania. Aby potwierdzić, że komórki są umieszczone w miejscach schwytania, zamontuj płytkę na mikroskopie wyposażonym w adapter płytki i uzyskaj obrazy jasnego pola i fluorescencji każdego miejsca schwytania w 10-krotnym powiększeniu. Komórki mogą być następnie przetworzone w celu dalszej oceny ekspresji docelowych genów za pomocą QRT-PCR.

Na etapie 18-somitowym mikroskopia fluorescencyjna może być wykorzystana do weryfikacji ekspresji ZsYellow w zarodkach. Po posortowaniu uzyskuje się komórki o różnych średnicach. Płyta IFC może być używana do przechwytywania komórek o interesującej nas średnicy.

Na przykład w tym eksperymencie komórki o średnicy od pięciu do 10 mikrometrów. Zgodnie z oczekiwaniami, posortowane i przechwycone komórki z zarodków 18 godzin po zapłodnieniu wykazywały ekspresję markera fluorescencyjnego ZsYellow. W tym przypadku QRT-PCR wykorzystano do oceny względnej ekspresji określonych genów będących przedmiotem zainteresowania w 40 pojedynczych komórkach z miejsc wychwytywania komórek na płytce IFC.

Ponieważ zakres wartości progowych cyklu dla genu porządkowego był zbyt szeroki, aby można było porównać ekspresję genów między próbkami, a wiele wartości progowych cyklu przekroczyło 30, wartości zostały zwizualizowane jako mapa cieplna. Porównując różne próbki, w tym eksperymencie zaobserwowano znaczną niejednorodność w ekspresji genów. Z komórkami sklasyfikowanymi jako typy od 1 do 5 na podstawie ich wzorca ekspresji genów.

Po opanowaniu, przetwarzanie całych próbek zarodków na pojedyncze lizowane komórki na zintegrowanym chipie mikroprzepływowym można zakończyć w ciągu sześciu godzin, jeśli kroki zostaną wykonane prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że tylko pojedyncze komórki są przechwytywane na chipie mikroprzepływowym. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak wysokoprzepustowe sekwencjonowanie pojedynczych komórek, aby w pełni scharakteryzować transkryptomy pojedynczych komórek.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią rozwojową do badania heterogeniczności komórkowej we wcześnie rozwijających się zarodkach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować pojedyncze komórki z zarodków danio pręgowanego, chwytać pojedyncze komórki w systemie multipleksowym jednokomórkowym o podstawie mikroprzepływowej i oceniać ekspresję genów poszczególnych komórek.