TRUE Gene Silencing: Badania przesiewowe małej biblioteki przewodnikowego RNA typu heptamer pod kątem potencjalnych środków terapeutycznych przeciwnowotworowych
2 czerwca 2016
Tutaj prezentujemy protokół badania przesiewowego biblioteki sgRNA typu heptamer pod kątem potencjalnych leków terapeutycznych przeciwko nowotworom krwi.
Ogólnym celem tego przesiewu jest znalezienie potencjalnych leków terapeutycznych przeciwko nowotworom krwi. Rozpocznij tę procedurę od wybrania podzbioru sekwencji heptamerów. Sekwencje mogą być losowe lub zaprojektowane tak, aby celować w konkretne RNA komórkowe. Aby celować w konkretne RNA komórkowe, użyj odpowiedniego programu komputerowego, aby znaleźć struktury spinki we włosach przypominające ramię T w docelowym RNA. Wybierz komplementarne sekwencje siedmionucleotydowe bezpośrednio poniżej spinki we włosach. Korzystając z metody fosforamidytowej na szkle z kontrolowanymi porami, czyli nośniku CPG, zsyntetyzuj każdy z wybranych heptamerów jako w pełni 2-prime O-metylowane, 5-prime i 3-prime fosforylowane RNA za pomocą syntetyzatora DNA-RNA. Pozostaw grupę ochronną DMT na terminalu 5-prime w ostatnim cyklu syntezy. Po zakończeniu ostatniego cyklu przenieś CPG z zsyntetyzowanym oligonukleotydem z kolumny do szklanej fiolki z zakrętką wyłożoną teflonem. Dodaj 1mL 29% wodorotlenku amonu i inkubuj probówkę w temperaturze 55
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół przesiewania biblioteki sgRNA typu heptamerowego, mający na celu zidentyfikowanie potencjalnych leków terapeutycznych w leczeniu nowotworów krwi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Inżynieria genetyczna
Wstęp
- Nowotwory krwi stanowią istotne wyzwanie terapeutyczne.
- Konieczne jest opracowanie nowych podejść terapeutycznych w celu poprawy wyników leczenia pacjentów.
- Biblioteki sgRNA mogą ułatwić celowaną edycję genów.
- Niniejsze badanie koncentruje się na specyficznym typie sgRNA przeznaczonym do przesiewu terapeutycznego.
Cel badania
- Opracowanie protokołu przesiewania bibliotek sgRNA.
- Identyfikacja potencjalnych kandydatów na leki w terapii nowotworów krwi.
- Pogłębienie zrozumienia edycji genów w kontekstach terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Projektowanie i synteza bibliotek sgRNA typu heptamerowego.
- Protokoły przesiewowe służące do oceny skuteczności terapeutycznej.
- Analiza wyników edycji genów.
- Walidacja potencjalnych kandydatów na leki za pomocą testów eksperymentalnych.
Główne wyniki
- Identyfikacja obiecujących sgRNA o potencjale terapeutycznym.
- Zaprezentowanie skutecznej metodologii przesiewowej.
- Wnioski dotyczące roli sgRNA w leczeniu nowotworów krwi.
- Zalecenia dotyczące dalszych badań i rozwoju.
Wnioski
- Protokół ten stanowi cenne narzędzie w procesie odkrywania leków.
- sgRNA typu heptamerowego wykazują potencjał w celowaniu w nowotwory krwi.
- Przyszłe badania powinny koncentrować się na zastosowaniach klinicznych i skuteczności.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Niniejszy protokół umożliwia systematyczny screening bibliotek sgRNA typu heptamerowego w celu zidentyfikowania terapeutycznych kandydatów kierowanych przez RNA w leczeniu nowotworów krwi, wspierając wczesną walidację celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego. Wykorzystując wyciszanie genów za pośrednictwem tRNase ZL, podejście to oferuje modality niezależną od transfekcji w celu indukowania apoptozy w komórkach złośliwych, co wpisuje się w wysiłki na etapie odkrywania nowych leków, mające na celu rozszerzenie dostępnych metod terapeutycznych poza małe cząsteczki lub przeciwciała. Skalowalny projekt biblioteki (16 384 heptamerów) umożliwia wysokoprzepustową ocenę, wyznaczając ścieżkę priorytetyzacji sgRNA o udowodnionej skuteczności w modelach szpiczaka i białaczki do dalszego rozwoju przedklinicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę celów RNA poprzez wyciszanie zależne od tRNase ZL w celu walidacji hipotez terapeutycznych w modelach nowotworów krwi.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje chemicznie modyfikowane, przenikające przez błony komórkowe sgRNA, które eliminują konieczność stosowania odczynników do transfekcji, co upraszcza przygotowanie testów w liniach komórkowych nowotworów w zawiesinie.
- Wartość prognostyczna: Identyfikuje sgRNA indukujące apoptozę, dostarczając funkcjonalnych wyników powiązanych z zaangażowaniem celu i efektem fenotypowym.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Wspiera przygotowanie standaryzowanych testów żywotności i apoptozy z wykorzystaniem cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia wpływu sgRNA na przeżywalność komórek.
- Skalowalność: Zaprojektowany do przesiewu dużych bibliotek sgRNA (np. 16 384 heptamerów), co umożliwia systematyczne mapowanie zależności struktura-aktywność.
- Powtarzalność: Wykorzystuje syntetyczne, w pełni 2'-O-metylowane, 5'- i 3'-fosforylowane sgRNA, aby zapewnić spójność serii i zmniejszyć zmienność wyników przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Koncentruje się na ludzkich liniach komórkowych szpiczaka i białaczki, zapewniając system w kontekście chorobowym do walidacji celów w nowotworach hematologicznych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Łączy aktywność sgRNA z indukcją apoptozy, oferując wgląd w mechanizm działania przed optymalizacją wiodących kandydatów.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera przejście od identyfikacji trafień do dalszej oceny skutecznych sgRNA przy użyciu ortogonalnych metod walidacji, takich jak cytometria przepłyewowa.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając testowanie hipotez dotyczących celów terapeutycznych oraz identyfikację wiodących związków w terapii nowotworów krwi poprzez generowanie funkcjonalnie zwalidowanych trafień sgRNA, które mogą stanowić podstawę do dalszych prac w zakresie chemii medycznej lub projektowania terapeutyków kwasów nukleinowych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia walidację celu poprzez przesiewanie fenotypowe bibliotek sgRNA w odpowiednich modelach nowotworowych, wyjaśniając cele RNA związane z apoptozą.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych danych dotyczących żywotności i apoptozy w celu wsparcia standaryzacji testu i wyboru trafień w formatach wysokoprzepustowych.
- Analityka: Generuje funkcjonalne odczyty (utrata żywotności, indukcja apoptozy), które umożliwiają porównanie aktywności sgRNA i priorytetyzację kandydatów.
- Badania translacyjne: Łączy wstępne trafienia z przesiewania z dalszą oceną mechanistyczną w modelach przedklinicznych z wykorzystaniem testów apoptozy i cytometrii przepływowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy reużywalną platformę do przesiewania terapeutyków opartych na kwasach nukleinowych w wielu typach nowotworów i klasach celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Dostarcza wglądu w mechanizmy apoptozy celowanej w RNA, zmniejszając niejednoznaczność w walidacji celów dla terapii nowotworów krwi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje proces syntezy i przesiewania sgRNA, zwiększając powtarzalność oraz współpracę międzyzespołową.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wczesną identyfikację sgRNA indukujących apoptozę, co ogranicza inwestycje w niefunkcjonalne kandydaty.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację trafień sgRNA z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ich skuteczności w modelach białaczki i szpiczaka mieloma, wspierając efektywną alokację zasobów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu syntezy RNA z wykorzystaniem chemii fosforamidytowej oraz oczyszczania modyfikowanych oligonukleotydów metodą HPLC.
- Zależność od dostępu do syntezatorów DNA-RNA i nośników z kontrolowanego szkła porowatego (CPG) do produkcji sgRNA.
- Konieczność zastosowania ustandaryzowanych protokołów hodowli komórkowej oraz testów żywotności/apoptozy w wszystkich zespołach przesiewowych.
- Wymagana adaptacja do różnych modeli nowotworów poza szpiczakiem i białaczką w celu oceny szerszej możliwości zastosowania.
- Ograniczenie wynikające z konieczności przesiewania dużych bibliotek w celu zidentyfikowania trafień, ponieważ w badaniu pilotażowym aktywność wykazało jedynie ok. 20/156 sgRNA.
