Name: Konwersja epigenetyczna jako bezpieczna i prosta metoda pozyskiwania komórek wydzielających insulinę z fibroblastów skóry dorosłych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Poznaj metodę konwersji epigenetycznej fibroblastów skóry w komórki wydzielające insulinę bez indukowania pluripotencji i wektorów retrowirusowych. Ta technika oferuje bezpieczne podejście do terapii komórkowej cukrzycy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Carraresi i Europejską Fundację Badań nad Cukrzycą (EFSD). Lekarz rodzinny jest wspierany przez stypendium podoktorskie Uniwersytetu w Mediolanie. Autorzy są członkami COST Action FA1201 Epiconcept: Epigenetics and Periconception environment oraz COST Action BM1308 Sharing advances on large animal models (SALAAM). TALB jest członkiem COST Action CM1406 Epigenetic Chemical Biology (EPICHEM).

Uwaga: Wszystkie opisane poniżej procedury muszą być wykonywane pod okapem z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach. Upewnij się, że wszystkie procedury hodowli są przeprowadzane na etapach kontrolowanych termostatycznie, a komórki są utrzymywane w temperaturze 37 °C przez cały czas ich obsługi.
1. Izolacja fibroblastów skóry
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór do powlekania naczyń kulturowych
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,1 g żelatyny wieprzowej w 100 ml wody (stężenie końcowe 0,1%). Sterylizuj roztwór w autoklawie.</li>
		<li>Dodać 1,5 ml sterylnej 0,1% żelatyny wieprzowej na szalki Petriego o średnicy 35 mm. Poczekaj 2 godziny na pokrycie, utrzymując je w temperaturze pokojowej. 
		Uwaga: Biopsje ludzkiej skóry są pobierane przez wycięcie w znieczuleniu miejscowym z jałowego obszaru przedniej części przedramienia i przechowywane w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) firmy Dulbecco uzupełnionej 2% antybiotykowym roztworem przeciwgrzybiczym w temperaturze +4 °C przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj biopsje nowym PBS uzupełnionym 2% roztworem antybiotykowym przeciwgrzybiczym.</li>
	<li>Umieścić biopsje na szalce Petriego o średnicy 100 mm i pokroić na około 2 mm3 fragmenty za pomocą sterylnych skalpeli.</li>
	<li>Nadmiar roztworu powlekającego należy usunąć bezpośrednio przed fragmentami poszycia.</li>
	<li>Umieść 5-6 fragmentów skóry na wstępnie pokrytej szalce Petriego o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę do hodowli fibroblastów: 77% Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy, 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% roztwór L-glutaminy i 2% antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy</li>.
	<li>Dodać kroplę pożywki z fibroblastów na każdy fragment (zwykle 100 μl na fragment) i hodować je w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Po 24 godzinach dodać 500 μl pożywki do hodowli fibroblastów na fragmenty, aby utrzymać je mokre w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę za pomocą pipety co najmniej raz na 48 godzin.</li>
	<li>Po 6 dniach inkubacji należy ostrożnie usunąć fragmenty tkanek i wyrzucić je. 
	Uwaga: Po 6 dniach fibroblasty zaczynają wyrastać z fragmentów tkanki i zaczynają tworzyć monowarstwę komórkową.</li>
	<li>Odświeżyć pożywkę, dodać 2 ml pożywki do hodowli fibroblastów i kontynuować hodowlę komórek jednowarstwowych w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Kultura fibroblastów
<ol>
	<li>Hodowla fibroblastów w temperaturze 37 °C w 5% CO2 aż do 80% konfluencji</li>
	<li>Do pasażowania odessać pożywkę do hodowli fibroblastów z naczyń do hodowli tkankowych. Umyj komórki trzykrotnie 4 ml PBS uzupełnionego 1% antybiotykowym roztworem przeciwgrzybiczym.</li>
	<li>Dodać cienką warstwę (10% objętości pożywki hodowlanej) roztworu trypsyna-EDTA (0,5 g/l trypsyny wieprzowej i 0,2 g/l EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C, aż monowarstwa komórek zacznie odrywać się od dna naczynia do hodowli tkankowej, a komórki ulegną dysocjacji.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórkową 9 częściami pożywki hodowlanej fibroblastów, aby zneutralizować działanie trypsyny. Wirowanie nie jest konieczne.</li>
	<li>Płytki komórkowe w nowych szalkach hodowlanych (bez żelatyny) i hodowla w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 . Utrzymuj współczynnik przejścia od 1:2 do 1:4, w zależności od tempa wzrostu.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, przechodź przez nie (zwykle dwa razy w tygodniu).</li>
</ol>
3. Posiewanie fibroblastów w celu konwersji epigenetycznej
<ol>
	<li>Dodać 0,26 ml/cm2 0,1% żelatyny wieprzowej (przygotować zgodnie z opisem w ppkt 1.1) do szalek do hodowli komórkowych. Poczekaj 2 godziny na pokrycie.</li>
	<li>Nadmiar roztworu powlekającego należy usunąć na 10-30 minut przed posiewem fibroblastów.</li>
	<li>Usuń pożywkę hodowlaną fibroblastów z naczyń hodowlanych. Umyj komórki trzykrotnie PBS uzupełnionym 1% antybiotykowym roztworem przeciwgrzybiczym.</li>
	<li>Dodać cienką warstwę (10% objętości pożywki hodowlanej) roztworu trypsyna-EDTA (0,5 g/l trypsyny wieprzowej i 0,2 g/l EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C, aż monowarstwa komórek zacznie odrywać się od dna naczynia do hodowli tkankowej, a komórki ulegną dysocjacji.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórek 9 częściami pożywki hodowlanej fibroblastów, aby zneutralizować działanie trypsyny.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą komory liczącej pod mikroskopem w temperaturze pokojowej. Obliczyć wymaganą objętość pożywki hodowlanej fibroblastów do ponownego zawieszenia komórek, aby uzyskać stężenie komórek 7,8 x 104 fibroblasty/cm2. Będzie to zależało od konkretnego rodzaju używanej komory. 
	Komórki/μl = Średnia liczba komórek w małej siatce x 90 (współczynnik mnożenia) x rozcieńczenie</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek w ilości 150 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą wcześniej obliczonej objętości pożywki hodowlanej fibroblastów.</li>
	<li>Umieść komórki na 0,1% galatycznych naczyniach pokrytych żelatyną i hoduj je przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Zwiększ plastyczność komórek za pomocą środka demetylującego 5-aza-CR
<ol>
	<li>Dzień 0
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 5-aza-CR, rozpuszczając 2,44 mg 5-aza-CR w 10 ml pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Sterylizować przez filtrację. Przygotuj bulion 5-aza-CR bezpośrednio przed użyciem.</li>
		<li>Rozcieńczyć 1 μl roztworu podstawowego 5-aza-CR w 1 ml pożywki do hodowli fibroblastów (stężenie końcowe 1 μM).</li>
		<li>Aby zwiększyć plastyczność komórek, 24 godziny po posiewie komórek (podpozycja 3.8) należy usunąć pożywkę hodowlaną z wysiewanych fibroblastów i dodać 1 μM roztwór podstawowy 5-aza-CR i hodować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Przygotować świeżą pożywkę dla ludzi z pluripotencjalnym potencjałem (HP) zgodnie z opisem w Tabeli 1.</li>
		<li>Po inkubacji z 1 μM 5-aza-CR usunąć pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki PBS, aby upewnić się, że 5-aza-CR został wypłukany.</li>
		<li>Inkubować fibroblasty poddane działaniu 5-aza-CR z pożywką HP przez 3 godziny (okres rekonwalescencji) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
		<li>Po okresie rekonwalescencji usuń pożywkę, przemyj trzykrotnie PBS.</li>
		<li>Aby monitorować skuteczność leczenia 5-aza-CR, sprawdź na tym etapie obecność zmian morfologicznych (szczegółowo w sekcji Wyniki). Komórki tracą typową wydłużoną morfologię fibroblastów i uzyskują okrągły lub owalny kształt, stając się mniejszymi, z powiększonymi jądrami.</li>
		<li>Kontynuuj różnicowanie trzustki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Protokół różnicowania trzustki
<ol>
	<li>Dni 1-6
	<ol>
		<li>Przygotować podłoże podstawne trzustki zgodnie z opisem w Tabeli 2.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy aktywiny A: rozpuścić 5 μg rekombinowanego białka ludzkiego aktywiny A w 166,6 μl sterylnej wody.</li>
		<li>Hodowla fibroblastów traktowanych 5-aza-CR w 0,26 ml/cm2 podłoża podstawowego trzustki, uzupełniona 1 μl/ml roztworu podstawowego aktywiny A (patrz 5.1.2) przez 6 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 . Zmieniaj medium codziennie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dni 7-8
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy kwasu retinowego, dodając 16,6 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do 50 mg kwasu retinowego.</li>
		<li>Hodowla komórek w 0,26 ml/cm2 podłoża podstawowego trzustki uzupełniona 1 μl/ml roztworu podstawowego aktywiny A (patrz 5.1.2) i 1 μl/ml roztworu podstawowego kwasu retinowego (patrz 5.2.1) przez 2 dni w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Zmieniaj medium codziennie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dni 9-36
	<ol>
		<li>Hodowla komórek w 0,26 ml/cm2 podłoża podstawowego trzustki uzupełniona 1% (v/v) insulina-transferyna-selen (ITS), 2% (v/v) B27 i 0,1% (v/v) rekombinowany ludzki roztwór podstawowy zasady FGF (bFGF) (patrz tabela 1) w temperaturze 37 °C w 5% inkubatorze CO2 . Zmieniaj podłoże codziennie przez pierwsze 15 dni.</li>
		<li>Począwszy od 16 dnia, należy odświeżać pożywkę co drugi dzień pod mikroskopem, ponieważ tworzące się komórki zbiorcze mogą oderwać się od dna szalki hodowlanej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475, 386-389 (2011).</li>
<li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Lineage+Conversion+of+Terminally+Differentiated+Hepatocytes+to+Functional+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li>
<li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+Pig+Dermal+Fibroblast+into+Insulin+Secreting+Cells+by+a+Brief+Exposure+to+5-aza-cytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Brevini, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+Molecular+Changes+of+Human+Granulosa+Cells+Exposed+to+5-Azacytidine+and+Addressed+Toward+Muscular+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).</li>
<li>Thoma, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).</li>
<li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+J%22%5BJournal%5D)">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).</li>
<li>Plath, K., Lowry, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+reprogramming+to+the+induced+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state.</a> Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).</li>
<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+demethylation+induced+by+5-azacytidine+does+not+affect+fragile+X+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression.</a> Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).</li>
<li>Do, J. T., Scholer, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+of+embryonic+stem+cells+reprogram+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells.</a> Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).</li>
<li>Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+pluripotency+determined+and+maintained%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How is pluripotency determined and maintained?</a> Development. 134 (4), 635-646 (2007).</li>
<li>Kahan, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+precursors+and+differentiated+islet+cell+types+from+murine+embryonic+stem+cells%3A+an+in+vitro+model+to+study+islet+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation.</a> Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Niniejszy manuskrypt opisuje metodę, która umożliwia przekształcenie ludzkich fibroblastów skóry w komórki produkujące insulinę, poprzez przejściową i krótką ekspozycję na 5-aza-CR, po której następuje protokół indukcji specyficznej dla tkanki. Takie podejście pozwala na przejście od komórek związanych z mezodermą do komórek związanych z endodermą, bez wymuszonej ekspresji czynników transkrypcyjnych lub mikroRNA ani uzyskania stabilnego stanu pluripotencjalnego, który sprawia, że komórki są bardziej niestabilne i podatne...

Podstawowym celem medycyny regeneracyjnej jest generowanie nowych, funkcjonalnych komórek, które mogą być używane do naprawy lub wymiany uszkodzonych, zdegenerowanych tkanek. Przekształcanie łatwo dostępnych dorosłych komórek w nowe, poprzez przekształcanie ich z jednego typu komórek w inny, jest szczególnie atrakcyjnym podejściem, zwłaszcza gdy wymagana populacja komórek nie jest obfita lub trudno dostępna. Jednak dorosłe komórki są niezwykle stabilne. Swój zróżnicowany stan osiągają poprzez stopniowe ograniczanie swoich możliwości, a gdy osiągną dojrzałą specjalizację terminalną, stabilnie ją utrzymują 1.
W ostatnich latach opracowano szereg protokołów, które umożliwiają przeprogramowanie komórki somatycznej (iPS) na pluripotencję osiągniętą poprzez wymuszoną ekspresję zestawu czynników transkrypcyjnych 2,3. Alternatywnie, konwersję komórek można uzyskać przez bezpośrednią transdyferencjację linii, wprowadzając pojedynczy 4 lub kombinację czynników transkrypcyjnych 5-7. Strategia ta nie obejmuje przejścia przez stan niezróżnicowany, ale wymaga wysokiej ekspresji określonych czynników transkrypcyjnych 8.
Niedawno opracowaliśmy protokół konwersji oparty na krótkiej ekspozycji dorosłych komórek na demetylujące właściwości analogu cytydyny 5-azacytydyny (5-aza-CR), dobrze scharakteryzowanego inhibitora metylotransferazy DNA. Bezpośrednio po etapie demetylacji następuje specyficzny protokół różnicowania 9-11, który pozwala uzyskać wymagany fenotyp końcowy. Metoda ta jest w stanie przekształcić dojrzałe, zróżnicowane komórki w komórki o innej linii i ma istotną zaletę, ponieważ pozwala uniknąć zarówno stosowania wektorów wirusowych, jak i transfekcji jakichkolwiek egzogennych czynników transkrypcyjnych. Unika się również nabycia stabilnego stanu pluripotencjalnego i związanej z tym zwiększonej podatności na niestabilność komórki.
Szczegółowy protokół, który pozwala na konwersję fibroblastów skóry dorosłego człowieka w pełni funkcjonalne komórki wydzielające insulinę, jest przedstawiony tutaj. Warto jednak zauważyć, że technika ta została zastosowana do różnych typów komórek i przyniosła pozytywne wyniki, jeśli chodzi o kierowanie komórek w kierunku różnych szlaków różnicowania. Co więcej, konwersja epigenetyczna została z powodzeniem zastosowana u ludzi i świń z gatunku 9-13, a także u psów (przedłożony manuskrypt), co sugeruje szeroką skuteczność i solidność tego podejścia.

<table><tbody><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td>PBS; do przemywania komórek i przygotowywania roztworu</td></tr><tr><td>Antybiotyk Przeciwgrzybiczy roztwór</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>Składnik fibroblastów, pożywki HP i trzustkowej</td></tr><tr><td>100 mm szalka Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td>Do izolacji fibroblastów</td></tr><tr><td>Żelatyna wieprzowa</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>Do powlekania naczyń</td></tr><tr><td>Woda</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>Do przygotowania roztworu</td></tr><tr><td>35 mm szalki Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>83.39</td><td>Do izolacji fibroblastów</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, pirogronian</td><td>Technologie życia</td><td>41966052</td><td>Do pożywki do hodowli fibroblastów</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td> Life <td>Technologies</td><td>10500064</td><td>FBS; Składnik pożywki Fibroblast i HP</td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Składnik fibroblastów, pożywek HP i trzustki</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>do dysocjacji fibroblastów</td></tr><tr><td>KOVA GLASSTIC SLIDE 10 Z SIATKAMI</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>Zliczanie komórek</td></tr><tr><td>5-azacytydyna</td><td>Sigma</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR, do komórki przyrostowej plastyczność w fibroblastach</td></tr><tr><td>Szynka F-10 Nutrient Mix</td><td>Life Technologies</td><td>31550031</td><td>Dla HP medium</td></tr><tr><td>DMEM, o niskiej glukozie, pirogronianie</td><td>Technologie życia</td><td>31885023</td><td>Dla HP medium</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>Składnik pożywki HP</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Technologie Solution</td><td>Life 11140035</td><td></td><td>Składnik pożywki HP i trzustkowej</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>Składnik pożywki HP i trzustkowej Pożywki podstawowej</td></tr><tr><td>Guanozyna</td><td>Sigma</td><td>G6264</td><td>Mieszanka nukleozydów składnik podstawowy pożywki HP</td></tr><tr><td>Adenozyna</td><td></td><td>Sigma A4036</td><td>Mieszanka nukleozydów składnik podstawowy podłoża HP</td></tr><tr><td>Cytydyna</td><td>Sigma</td><td>C4654</td><td>Mieszanka nukleozydów składnik podłoża HP</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td>Mieszanka nukleozydowa składnik podstawowy HP medium</td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma</td><td>T1895</td><td>Mieszanka nukleozydów składnik podstawowy HP medium</td></tr><tr><td>Millex-GS 0,22 &micro; m</td><td>Milipory</td><td>SLGS033SB</td><td>Do sterylizacji roztworu</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) Rekombinowane Białka Ludzkie</td><td>Technologie Życia PHG0261</td><td></td><td>bFGF; Składnik HP i trzustki</td></tr><tr><td>Podłoże Surowicy bydlęcej Albumina</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td>BSA; Składnik podłoża podstawowego trzustki</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320074</td><td>Dla podłoża podstawowego trzustki</td></tr><tr><td>B-27 Suplement Minus Witamina A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>Składnik podłoża trzustkowego</td></tr><tr><td>N-2 Suplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>Składnik podłoża podstawowego trzustki</td></tr><tr><td>Rekombinowane technologie życia białka ludzkiego Activina A</td><td></td><td>PHG9014</td><td>Dla podłoża trzustkowego</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Dla podłoża trzustkowego</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>DMSO; do przygotowania bulionu kwasu retinowego</td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen</td><td>Life Technologies</td><td>41400045</td><td>ITS; dla trzustki Końcowe podłoże</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-wimentynowe&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab8069</td><td>Do analiz immunocytochemicznych. Rozcieńczenie robocze 1:100</td></tr><tr><td>4&,6-dichlorowodorek dimidyno-2-fenyloindolu</td><td>Sigma</td><td>32670</td><td>DAPI. Do analiz immunocytochemicznych. Rozcieńczenie robocze&nbsp; 1 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>5-metylocytydyna</td><td>Eurogentec</td><td>MMS-900P-B</td><td>Do analiz immunocytochemicznych. Rozcieńczenie robocze 1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało peptydowe anty-C&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab14181</td><td>Do analiz immunocytochemicznych. Rozcieńczenie robocze 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PDX1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab47267</td><td>Do analiz immunocytochemicznych. Rozcieńczenie robocze 1:500</td></tr><tr><td>Mercodia Insulina ELISA</td><td>Mercodia</td><td>10-1113-10</td><td>Do wykrywania uwalniania insuliny</td></tr></tbody></table>

konwersja epigenetyczna jako bezpieczna i prosta metoda pozyskiwania komórek wydzielających insulinę z fibroblastów skóry dorosłych

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Medycyna regeneracyjna wymaga nowych, w pełni funkcjonalnych komórek, które są dostarczane pacjentom w celu naprawy zdegenerowanych lub uszkodzonych tkanek. Gdy takie komórki nie są łatwo dostępne, można je uzyskać przy użyciu różnych podejść, które obejmują między innymi przeprogramowanie i transdyferencjację, z zaletami i ograniczeniami specyficznymi dla różnych technik. W tym artykule opisano nową strategię przekształcania dorosłego dojrzałego fibroblastu w komórkę wydzielającą insulinę, arbitralnie określaną jako komórki przekształcone epigenetycznie (EpiCC). Metoda została opracowana w oparciu o coraz lepsze zrozumienie mechanizmów kontrolujących epigenetyczną regulację losu i różnicowania komórek. W szczególności pierwszy etap wykorzystuje modyfikator epigenetyczny, a mianowicie 5-aza-cytydynę, aby wprowadzić dorosłe komórki w stan "wysoce permisywny". Następnie wykorzystuje to krótkie i odwracalne okno plastyczności epigenetycznej, aby ponownie skierować komórki w stronę innej linii. Podejście to określa się mianem "epigenetycznej konwersji komórek". Jest to prosty i solidny sposób na uzyskanie wydajnego, kontrolowanego i stabilnego komórkowego przełącznika międzyliniowego. Ponieważ protokół nie obejmuje stosowania żadnej transfekcji genów, jest wolny od wektorów wirusowych i nie obejmuje stabilnego stanu pluripotencjalnego, jest bardzo obiecujący dla zastosowań w medycynie translacyjnej.

Ustanowienie hodowli pierwotnej z biopsji skóry 
Biopsaty skóry pocięto na małe fragmenty i umieszczono w naczyniach uprawnych uprzednio pokrytych żelatyną. Po 6 dniach fibroblasty zaczęły wyrastać z fragmentów tkanki, tworząc monowarstwę komórkową (Rycina 1A). Komórki miały typowy wydłużony kształt i, zgodnie z oczekiwaniami, wykazywały jednolitnią pozytywność immunologiczną w kierunku specyficznego markera fibroblastów – wimentyny (Vim, Rycina 1B).</...

Tutaj prezentowana jest nowa metoda, która pozwala na przekształcenie dorosłych fibroblastów skóry w komórki wydzielające insulinę. Technika ta opiera się na konwersji epigenetycznej, nie wiąże się z użyciem wektorów retrowirusowych ani nabyciem stabilnego stanu pluripotencjalnego. Jest zatem bardzo obiecujący w zastosowaniach medycyny translacyjnej.

Konwersja epigenetyczna jako bezpieczna i prosta metoda pozyskiwania komórek wydzielających insulinę z fibroblastów skóry dorosłych

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest konwersja fibroblastów w komórki wydzielające insulinę bez indukowania pluripotencji i bez użycia wektorów retrowirusowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, a w szczególności w terapii komórkowej cukrzycy. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania zmiany fenotypu bez indukowania stabilnego stanu pluripotencji w konwertowanych komórkach oraz bez zastosowania wektorów retrowirusowych.Procedurę zaprezentuje Georgia Pennarossa, pracownik postdoktorski w naszym laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać 1,5 milliliters sterylnej 0,1% żelatyny wieprzowej do 35-milimetrowych szalek Petriego i pozostawić do pokrycia na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie biopsje ludzkiej skóry należy przemyć PBS uzupełnionym o 2% roztwór antybiotyk-antymykotyk.Następnie umieść biopsje w 100-milimetrowej szalce Petriego i podziel je za pomocą sterylnych skalpeli na fragmenty o wielkości około dwóch milimetrów sześciennych. Potem przenieś od pięciu do sześciu fragmentów skóry do uprzednio pokrytej szalce Petriego o średnicy 35 mm. Dodaj kroplę pożywki do fibroblastów na każdy fragment i inkubuj je w temperaturze 37°C w atmosferze 5% dwutlenku węgla.Po sześciu dniach inkubacji ostrożnie usunąć fragmenty tkanki. Fibroblasty powinny zacząć wyrastać z fragmentów tkanki i tworzyć monowarstwę komórkową. W tej procedurze hodować fibroblasty w temperaturze 37 °C w 5% dwutlenku węgla aż do osiągnięcia 80% konfluencji.Następnie wysiej komórki do nowych naczyń hodowlanych. Hoduj je w temperaturze 37 °C w 5% CO2, utrzymując stosunek pasażowania od 1:2 do 1:4, w zależności od szybkości wzrostu. Następnie dodaj 0,1% żelatyny wieprzowej do naczyń z hodowlą komórkową i pozostaw do pokrycia powierzchni przez dwie godziny.Nadmiar roztworu do powlekania należy usunąć od 10 do 30 minut przed wysianiem fibroblastów. Następnie należy usunąć pożywkę do hodowli fibroblastów z naczyń hodowlanych. Komórki należy przemyć trzykrotnie buforem PBS uzupełnionym o 1% roztwór antybiotyków i przeciwgrzybiczy.Następnie należy dodać cienką warstwę roztworu Trypsyny-EDTA. Inkubować w temperaturze 37°C, aż monowarstwa komórek zacznie odrywać się od dna naczynia do hodowli tkanek, a komórki ulegną dysocjacji. Po tym czasie zawiesinę komórkową należy rozcieńczyć dziewięciokrotnością objętości pożywki do hodowli fibroblastów, aby zneutralizować działanie trypsyny.Następnie należy policzyć komórki za pomocą komory licznikowej pod mikroskopem w temperaturze pokojowej. Oblicz objętość pożywki do hodowli fibroblastów niezbędną do ponownego zawieszenia komórek i uzyskania stężenia 7,8 × 10⁴ fibroblastów na centymetr kwadratowy. Następnie odwiruj zawiesinę komórkową z prędkością 150 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie usunąć nadsącz i zawiesić komórki w obliczonej objętości pożywki do hodowli fibroblastów. Potem wysiać komórki na naczynia uprzednio pokryte 0,1% żelatyną i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. W dniu zerowym, bezpośrednio przed użyciem, przygotować roztwór zapasowy 5-aza-CR, rozpuszczając 2,44 mg 5-aza-CR w 10 ml pożywki DMEM z wysoką zawartością glukozy.Sterylizować poprzez filtrację. Następnie jeden mikrolitr roztworu stokowego 5-aza-CR rozcieńczyć w jednym mililitrze pożywki do hodowli fibroblastów. Aby zwiększyć plastyczność komórek, 24 godziny po wysianiu komórek usunąć pożywkę z wysianych fibroblastów.Dodaj stężenie końcowe 1 µM roztworu zapasowego 5-aza-CR i inkubuj przez 18 godzin w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Pierwszego dnia przygotuj świeże podłoże HP. Po inkubacji z 1 µM 5-aza-CR usuń podłoże i przemyj komórki trzykrotnie podłożem HP, aby upewnić się, że 5-aza-CR zostało całkowicie wypłukane.Następnie inkubować fibroblasty traktowane 5-aza-CR w medium HP przez trzy godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide. Aby monitorować efektywność traktowania 5-aza-CR, należy sprawdzić, czy wystąpiły jakiekolwiek zmiany morfologiczne. Komórki powinny utracić typową wydłużoną morfologię fibroblastów i przyjąć mniejszy kształt okrągły lub owalny z powiększonymi jądrami.Od pierwszego do szóstego dnia należy przygotować pancreatic Basal Medium oraz roztwór zapasowy Activin A. Następnie fibroblasty traktowane 5-aza-CR należy hodować w pancreatic Basal Medium uzupełnionym o roztwór zapasowy Activin A przez sześć dni w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide, codziennie wymieniając medium. Od siódmego do ósmego dnia należy przygotować roztwór zapasowy kwasu retinowego, dodając 16,6 ml DMSO do 50 mg kwasu retinowego.Hoduj komórki w podstawowym medium trzustkowym (pancreatic Basal Medium) uzupełnionym roztworem stokowym aktywiny A oraz roztworem stokowym kwasu retinowego przez dwa dni w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% dwutlenku węgla, wymieniając medium codziennie. Od dziewiątego do trzydziestego szóstego dnia hoduj komórki w podstawowym medium trzustkowym uzupełnionym roztworami stokowymi ITS, B27 i BFGS; wymieniaj medium codziennie przez pierwsze 15 dni, a od szesnastego dnia odświeżaj medium co drugi dzień. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% dwutlenku węgla.Rysunek ten przedstawia zmiany morfologiczne zachodzące podczas różnicowania endokrynnego trzustki. Po siedmiu dniach indukcji ludzkie komórki stopniowo organizują się w klastry. W odpowiedzi na dodanie kwasu retinowego reorganizują się one w wzór siateczkowy i gromadzą w wyraźnych agregatach.Formacje te rozwijają się w czasie, rekrutując komórki i tworząc powiększone kolonie 3D. Ostatecznie kolonie przekształcają się w struktury sferyczne, które mają tendencję do odrywania się i swobodnego unoszenia w pożywce hodowlanej, co przypomina typowe wyspy trzustkowe in vitro. Po 36 dniach indukcji trzustkowej globalne poziomy metylacji DNA w ludzkich komórkach konwertowanych epigenetycznie powróciły do wartości obserwowanych w nieleczonych fibroblastach.Współlokalizacja PDX1 z CPEP jest obserwowana pod koniec okresu konwersji, podczas gdy te endokrynne markery trzustkowe są całkowicie nieobecne w niepoddanych działaniu czynników fibroblastach. Wykres ten przedstawia ilość wydzielonej insuliny z komórek poddanych konwersji epigenetycznej w odpowiedzi na ekspozycję na 20 millimolar D-glukozy oraz 20 millimolar L-glukozy. Po opanowaniu techniki, prawidłowo przeprowadzona procedura trwa 38 dni.Po opracowaniu, niniejsze badanie utorowało drogę badaczom z zakresu medycyny regeneracyjnej do eksploracji terapii komórkowej cukrzycy u ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przekształcić fibroblasty w komórki wydzielające insulinę bez indukowania pluripotencji oraz bez użycia wektorów retrowirusowych.

epigenetic-conversion-as-safe-simple-method-to-obtain-insulin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Bezpośrednie przeprogramowanie neuronów generuje neurony, które utrzymują wiek początkowej komórki somatycznej. W tym miejscu opisujemy pojedynczą metodę opartą na wektorach do generowania indukowanych neuronów z fibroblastów skóry uzyskanych od dorosłych dawców ludzkich.

Proste generowanie wysokowydajnej kultury indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system bezpośredniego przeprogramowania melanocytów oraz wysoce wydajny, skoncentrowany system pakowania wirusów, który zapewnia płynne bezpośrednie przeprogramowanie.

Bezpośrednie przeprogramowanie mysich fibroblastów w melanocyty

Różnicowanie komórek macierzystych w komórki wysp trzustkowych stanowi alternatywne rozwiązanie dla konwencjonalnego leczenia cukrzycy i modelowania chorób. Opisujemy szczegółowy protokół hodowli komórek macierzystych, który łączy komercyjny zestaw różnicujący z wcześniej zwalidowaną metodą, aby pomóc w wytwarzaniu wysp trzustkowych wydzielających insulinę pochodzących z komórek macierzystych w naczyniu.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę konwersji epigenetycznej fibroblastów skóry w komórki wydzielające insulinę bez indukowania pluripotencji i wektorów retrowirusowych. Ta technika oferuje bezpieczne podejście do terapii komórkowej cukrzycy.

Konwersja epigenetyczna jako bezpieczna i prosta metoda pozyskiwania komórek wydzielających insulinę z fibroblastów skóry dorosłych (Wideo) | JoVE Journal

Konwersja epigenetyczna jako bezpieczna i prosta metoda pozyskiwania komórek wydzielających insulinę z fibroblastów skóry dorosłych

Przeglądaj więcej filmów