Konwersja epigenetyczna jako bezpieczna i prosta metoda pozyskiwania komórek wydzielających insulinę z fibroblastów skóry dorosłych

Ogólnym celem tej procedury jest przekształcenie fibroblastów w komórki wydzielające insulinę bez indukowania pluripotencji lub stosowania wektorów retrożyciowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, a w szczególności w terapii komórkowej cukrzycy. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy uzyskać przełącznik w fenotypie bez indukowania stabilnego stanu pluripotencjalnego w komórkach konwertujących i bez wektorów retrowirusowych.

Procedurę zademonstruje Georgia Pennarossa, adiunkt w naszym laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 1,5 mililitra sterylnej 0,1% żelatyny wieprzowej do 35-milimetrowych szalek Petriego i pozostaw do powlekania przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie umyj biopsje ludzkiej skóry PBS uzupełnionym 2% roztworem antybiotykowym przeciwgrzybiczym.

Następnie umieść biopsje na 100-milimetrowej szalce Petriego i pokrój je na około dwa milimetry sześcienne za pomocą sterylnych skalpeli. Następnie umieść pięć do sześciu fragmentów skóry na wstępnie pokrytej 35-milimetrowej szalce Petriego. Dodaj kroplę pożywki fibroblastowej na każdy fragment i hoduj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.

Po sześciu dniach inkubacji należy ostrożnie wyrzucić fragmenty tkanki. Fibroblasty powinny zacząć wyrastać z fragmentów tkanki i zacząć tworzyć monowarstwę komórkową. W tej procedurze hoduj fibroblasty w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla aż do 80% konfluencji.

Następnie umieść komórki w nowych szalkach hodowlanych. Hoduj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla i utrzymuj stosunek pasażu między jednym do dwóch i od jednego do czterech, w zależności od tempa wzrostu. Następnie dodaj 0,1% żelatyny wieprzowej do naczyń z kultur komórkowych i pozostaw do panierowania przez dwie godziny.

Usuń nadmiar roztworu powlekającego 10 do 30 minut przed posiewem fibroblastów. Następnie usuń pożywkę do hodowli fibroblastów z naczyń hodowlanych. Umyj komórki trzykrotnie PBS uzupełnionym 1% roztworem antybiotyku przeciwgrzybiczego.

Następnie dodaj cienką warstwę roztworu trypsyny-EDTA. Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż monowarstwa komórki zacznie odłączać się od dna naczynia do hodowli tkankowej, a komórki ulegną dysocjacji. Następnie rozcieńczyć zawiesinę komórkową dziewięcioma częściami pożywki hodowlanej fibroblastów, aby zneutralizować działanie trypsyny.

Następnie policz komórki za pomocą komory liczącej pod mikroskopem w temperaturze pokojowej. Obliczyć objętość pożywki hodowlanej fibroblastów wymaganą do ponownego zawieszenia komórek i uzyskania stężenia komórek 7,8 razy 10 do 4. fibroblastu na centymetr kwadratowy. Następnie odwirować zawiesinę komórkową o masie 150 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń supernatant i ponownie zawiesij komórki za pomocą obliczonej objętości pożywki hodowlanej fibroblastów. Następnie ułóż komórki na 0,1% galawikach pokrytych żelatyną i hoduj je przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. W dniu zero, bezpośrednio przed użyciem, przygotuj roztwór podstawowy 5-aza-CR, rozpuszczając 2,44 miligrama 5-aza-CR w 10 mililitrach pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy.

Wysterylizuj go przez filtrację. Następnie rozcieńczyć jeden mikrolitr roztworu podstawowego 5-aza-CR w jednym mililitrze pożywki do hodowli fibroblastów. Aby zwiększyć plastyczność komórek, 24 godziny po posiewie komórek usuń pożywkę hodowlaną z wysianych fibroblastów.

Dodać jeden mikromolowy roztwór podstawowy 5-aza-CR i hodować przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Pierwszego dnia przygotuj świeżą pożywkę HP. Po inkubacji z jednym mikromolowym 5-aza-CR usunąć pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki pożywką HP, aby upewnić się, że 5-aza-CR został wypłukany.

Następnie inkuaguj fibroblasty potraktowane 5-aza-CR pożywką HP przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Aby monitorować skuteczność leczenia 5-aza-CR, należy sprawdzić, czy nie ma żadnych zmian morfologicznych. Komórki powinny stracić typową wydłużoną morfologię fibroblastów i uzyskać mniejszy okrągły lub owalny kształt z powiększonymi jądrami.

W dniach od pierwszego do szóstego przygotuj roztwór podstawowy dla trzustki i roztwór podstawowy aktywiny A. Następnie hoduj fibroblasty traktowane 5-aza-CR w podłożu podstawowym trzustki uzupełnionym roztworem podstawowym Activin A przez sześć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla i zmieniaj pożywkę codziennie. W dniach od siódmego do ósmego przygotuj roztwór podstawowy kwasu retinowego, dodając 16,6 mililitra DMSO do 50 miligramów kwasu retinowego.

Hoduj komórki w pożywce podstawowej trzustki uzupełnionej roztworem podstawowym Activin A i roztworem podstawowym kwasu retinowego przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla i zmieniaj pożywkę codziennie. W dniach od dziewiątego do 36 hoduj komórki i podłoże podstawowe trzustki uzupełnione roztworem podstawowym ITS, B27 i BFGS i zmieniaj pożywkę codziennie przez pierwsze 15 dni i odświeżaj pożywkę co drugi dzień od 16 dnia. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.

Rysunek ten przedstawia zmiany morfologiczne zachodzące podczas różnicowania endokrynologicznego trzustki. Po siedmiu dniach indukcji komórki ludzkie stopniowo organizują się w skupiska. W odpowiedzi na dodanie kwasu retinowego przegrupowują się w siatkowaty wzór i grupują się w rozróżnialne agregaty.

Formacje te rozwijają się z czasem, rekrutując komórki i agregując powiększone kolonie 3D. Wreszcie kolonie stają się kulistymi strukturami, które mają tendencję do odrywania się i swobodnego przepływu w pożywce hodowlanej, przypominając typowe wyspy trzustkowe in vitro. Po 36 dniach indukcji trzustki globalne poziomy metylacji DNA ludzkich komórek przeobrażonych epigenetycznie powróciły do wartości obserwowanych w nieleczonych fibroblastach.

Kolokację PDX1 z CPEP obserwuje się pod koniec okresu konwersji, podczas gdy te endokrynne markery trzustkowe są całkowicie nieobecne w nieleczonych fibroblastach. Ten wykres pokazuje ilość uwalnianej insuliny z komórek przekształconych epigenetycznie w odpowiedzi na 20-milimolową ekspozycję na D-glukozę i 20-milimolową L-glukozę. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 38 dni, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Po jego opracowaniu, badania te utorowały drogę naukowcom z dziedziny medycyny regeneracyjnej do zbadania terapii komórkowej cukrzycy u ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przekształcić fibroblasty w komórki wydzielające insulinę bez wywoływania pluripotencji lub używania wektorów retrowirusowych.