Identyfikacja warunków krytycznych dla barwienia immunologicznego w zarodkach mszyc grochowych: zwiększenie przepuszczalności tkanek i zmniejszenie barwienia tła

Ogólnym celem tego protokołu barwienia immunologicznego jest wykrycie ekspresji białka w zarodkach mszyc. Zidentyfikowano warunki krytyczne, które zwiększają przepuszczalność tkanek i zmniejszają barwienie tła, które są długotrwałymi problemami podczas barwienia tkanek embrionalnych mszyc. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona specyficzne warunki do skutecznej penetracji przeciwciał i redukcji barwienia tła, które zwykle nie jest opisane w standardowym protokole barwienia immunologicznego.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej miary, gdy badaliśmy, w jaki sposób komórki rozrodcze są określane w mszycy grochowej, różnorodnym modelu owada, do badań genomicznych i środowiskowych. Laboratoryjny szczep mszycy grochowej, a. pisum, został pierwotnie zebrany w środkowym Tajwanie i jest hodowany na roślinach żywicielskich od ponad 300 pokoleń.

Aby wykiełkować, namocz nasiona roślin żywicielskich w wodzie z kranu przez trzy do pięciu dni w temperaturze pokojowej. Uzupełniaj świeżą wodę raz dziennie. Wyhoduj dziesięć kiełkujących nasion w małej doniczce z ziemią w komorze wzrostu pod okresem fotograficznym 16 godzin światła, ośmiu godzin ciemności, w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Około 10 dni po rozpoczęciu wzrostu wysokość roślin wynosi zwykle ponad osiem centymetrów. Trzymaj każdą doniczkę z roślinami w litrowej szklanej zlewce i przenieś dorosłe mszyce na rośliny za pomocą pędzla. Następnie uszczelnij zlewkę osłoną przepuszczającą powietrze, taką jak siatka z gazy, aby zapobiec wydostawaniu się mszyc.

Wysiaduj mszyce w komorze wzrostowej pod fotoperiodem 16 godzin światła, ośmiu godzin ciemności, w temperaturze 20 stopni Celsjusza, podlewając każdą doniczkę z roślinami raz dziennie. Napełnij jedną studzienkę płytki punktowej około 500 mikrolitrami 4-procentowego paraformaldehydu. Umieść płytkę pod mikroskopem stereoskopowym w małym powiększeniu i zanurz dorosłego mszycę w paraformaldehydzie w celu sekcji.

Wypreparuj jajniki, przytrzymując głowę i brzuch jednym zestawem kleszczy, rozcinając naskórek grzbietowy brzucha i odciągając jajniki od jamy brzusznej. Następnie umieść trzy pary jajników w 1,5-mililitrowej probówce zawierającej jeden mililitr paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 20 minut, delikatnie wstrząsając mikserem. Wyrzuć bufor utrwalający szklanym zakraplaczem, a następnie przemyj jajniki PBST trzy razy przez 10 minut, delikatnie wstrząsając.

Aby leczyć jajniki, najpierw inkubuj je z proteinazą K przez 10 minut z łagodnym potrząsaniem, aby zwiększyć przepuszczalność tkanek zarodka. Po inkubacji wyrzuć roztwór proteinazy K, a następnie przemyj jajniki 700 mikrolitrami glicyny trzy razy przez pięć minut. Następnie przemyj jajniki PBST dwa razy przez 10 minut.

Ponownie utrwalić jajniki za pomocą buforu utrwalającego przez 15 minut w temperaturze pokojowej z łagodnym potrząsaniem. Aby stłumić aktywność peroksydazy engoenous, należy seryjnie odwodnić jajniki różnymi procentami metanolu w 0,2% PBST o proporcjach objętości jeden do trzech, jeden do jednego i trzy do jednego, a następnie dalej inkubować jajniki ze 100% metanolem przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z łagodnym wstrząsaniem. Następnie seryjnie nawadniaj jajniki, zgodnie z instrukcjami w protokole tekstowym.

W przypadku trzech par jajników w probówce o pojemności 1,5 mililitra minimalna objętość do blokowania próbki i barwienia przeciwciał to 200 mikrolitrów. Inkubować jajniki z 1x roztworem blokującym DIG-B przez cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Po inkubacji odrzucić supernatant i zastąpić go świeżym 1x roztworem blokującym DIG-B, zawierającym pierwszorzędowe przeciwciało w odpowiednim stosunku rozcieńczenia.

Barwić jajniki przez cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie potrząsając. Po umyciu jajników zgodnie z opisem w protokole tekstowym, odrzucić supernatant i zastąpić go świeżym 1x roztworem blokującym DIG-B zawierającym przeciwciało drugorzędowe w odpowiednim stosunku rozcieńczenia i zabarwić jajniki jak poprzednio. W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego należy przeprowadzić barwienie w ciemności, ponieważ przeciwciało wtórne jest wrażliwe na światło.

Grubość zarodków mszyc różni się w zależności od etapu rozwoju. Strategie montowania są zatem modyfikowane tak, aby pasowały do wczesnych, średnich i późnych zarodków. Przenieś jajniki wraz z podłożem montażowym do tacki na komórki z plastikowym zakraplaczem i obserwuj próbki pod mikroskopem stereoskopowym w małym powiększeniu.

Przetnij modzele związane z bocznym jajowódem za pomocą szpilek przeciw owadom, a następnie przenieś izolowany jajnik do pustej szklanej studzienki za pomocą zakraplacza. Uzupełnić końcową objętość do objętości od 50 do 100 mikrolitrów za pomocą podłoża mocującego. Następnie przenieść jajnik na szkiełko za pomocą szklanego zakraplacza.

Wypreparuj komory jajowe za pomocą szpilek przeciw owadom. W przypadku zarodków starszych niż szósty etap rozwoju sugeruje się oddzielenie komór jajowych. W przypadku germarii i pierwszych dwóch komór jajowych separacja jest opcjonalna.

Przenieś wypreparowaną komorę na jajka na czyste szkiełko za pomocą szklanego zakraplacza. W przypadku zarodków na etapach od pierwszego do 10 rozwoju, powoli umieść szkiełko nakrywkowe na wypreparowanych komorach germin lub jaj, aby uniknąć pęcherzyków. Alternatywnie, w przypadku zarodków w stadium od 11 do 18 rozwoju, zamontuj komory jajowe na szkiełku podstawowym z jednostronnym mostkiem nakrywkowym i umieść kolejny szkiełko nakrywkowe na próbce.

W przypadku zarodków starszych niż 19 stadium rozwoju, zamontuj komory jajowe na szkiełku z dwustronnym mostkiem nakrywkowym i umieść kolejny szkiełko nakrywkowe na próbce. Następnie wypełnij przestrzeń pod górnym szkiełkiem nakrywkowym nośnikiem montażowym, aby uniknąć wysuszenia próbki. Delikatnie zwiń górne szkiełko nakrywkowe, aby uzyskać właściwą orientację do obserwacji.

Na koniec uszczelnij krawędź szkiełek nakrywkowych, w tym szkiełek nakrywkowych mostka, lakierem do paznokci przed wykonaniem analizy obrazu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pokazana tutaj jest para jajników wypreparowanych od dorosłej kobiety. Jajnik składa się z jednego zarodka, jednego do dwóch miejsc O oraz pięciu do siedmiu zarodków, z których wszystkie są umieszczone w komorach jajowych w sposób linii montażowej.

Po utrwaleniu paraformaldehydu zdecydowanie zaleca się trawienie jajników w roztworze proteinazy K w stężeniu jednego mikrograma na mililitr przez 10 minut. Wyniki barwienia pokazują, że intensywność sygnału jest znacznie zwiększona w zarodkach trawionych przez poteinazę K. Inkubacja zarodków w roztworze blokującym z zestawu buforowego na bazie DIG zmniejsza większe zabarwienie tła niż w przypadku zarodków w normalnej surowicy koziej i albuminie surowicy bydlęcej.

Endogenna aktywność peroksydazy może również powodować wysokie zabarwienie tła. Badania te pokazują, że zanurzenie zarodków mszyc w metanolu może znacznie skuteczniej hamować aktywność peroksydazy niż leczenie zarodków nadtlenkiem wodoru. Warunki krytyczne ujawnione w tym badaniu mogą być stosowane do wykrywania sygnałów zarówno w komórkach rozrodczych, jak i somatycznych.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić skuteczne barwienie immunologiczne na zarodkach mszyc, w tym zwiększenie intensywności sygnału i zmniejszenie barwienia tła. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o delikatnym manipulowaniu każdym zarodkiem, aby uzyskać dobry kształt zarodków.

Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem i DAPI może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak rękawiczki. Po tej procedurze można przeprowadzić inne środki, takie jak hybrydyzacja in situ, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy RNA messanger jest zlokalizowany wraz z produktem białkowym w komórkach embrionalnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii środowiskowej owadów, takie jak sposób określania komórek rozrodczych i jak komórki jajowe są determinowane w różnych fazach rozrodczych u mszyc.