Identyfikacja warunków krytycznych dla barwienia immunologicznego w zarodkach mszyc grochowych: zwiększenie przepuszczalności tkanek i zmniejszenie barwienia tła

Ogólnym celem niniejszego protokołu immunobarwienia jest wykrycie ekspresji białek w embrionach mszyc. Zidentyfikowano krytyczne warunki, które zwiększają przepuszczalność tkanek i zmniejszają barwienie tła, co stanowi od dawna znane problemy podczas barwienia tkanek embrionalnych mszyc. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie specyficznych warunków dla efektywnej penetracji przeciwciał oraz redukcji barwienia tła, które zazwyczaj nie są opisane w standardowym protokole immunobarwienia.

Pomysł na zastosowanie tej miary pojawił się podczas naszych badań nad specyfikacją komórek zarodkowych u mszycy grochowej, która jest modelem owadziego wykorzystywanym w badaniach genomiki i środowiska. Laboratoryjny szczep mszycy grochowej, a. pisum, został pierwotnie zebrany w środkowej części Tajwanu i jest hodowany na roślinach żywicielskich od ponad 300 pokoleń.

Aby nasiona wykiełkowały, należy namoczyć nasiona roślin żywiciela w wodzie z kranu przez trzy do pięciu dni w temperaturze pokojowej. Raz dziennie należy wymienić wodę na świeżą. Dziesięć kiełkujących nasion należy wysiać do małej doniczki z ziemią w komorze wzrostowej, przy fotoperiodzie 16 godzin światła i ośmiu godzin ciemności, w temperaturze 20 °C.

Około 10 dni po rozpoczęciu wzrostu wysokość roślin zazwyczaj przekracza osiem centymetrów. Umieść każdą doniczkę z roślinami w zlewce szklanej o pojemności 1 litra i przenieś dorosłe mszyce na rośliny za pomocą pędzla. Następnie zamknij zlewkę przepuszczalną dla powietrza przykrywką, np. z gazy, aby zapobiec ucieczce mszyc.

Inkubuj mszyce w komorze wzrostowej przy fotoperiodzie 16 godzin światła i ośmiu godzin ciemności, w temperaturze 20 °C, podlewając każdą doniczkę z roślinami raz dziennie. Napełnij jedno wgłębienie płytki do testów około 500 µL 4% paraformaldehydu. Umieść płytkę pod stereomikroskopem przy niskim powiększeniu i zanurz dorosłą mszycę w paraformaldehydzie w celu przeprowadzenia sekcji.

Przeprowadź sekcję jajników, trzymając głowę i odwłok jedną pęsetą, rozcinając grzbietową kutykulę odwłoka i odsuwając jajniki od jamy odwłoka. Następnie utrwal trzy pary jajników w probówce o pojemności 1,5 mililitra zawierającej jeden mililitr paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 20 minut, przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku. Usuń bufor do utrwalania za pomocą pipety szklanej, a następnie przemyj jajniki PBST trzy razy po 10 minut, przy łagodnym mieszaniu.

Aby przygotować jajniki, należy najpierw inkubować je z Proteinazą K przez 10 minut przy delikatnym wstrząsaniu w celu zwiększenia przepuszczalności tkanek embrionalnych. Po inkubacji należy usunąć roztwór Proteinazy K, a następnie trzykrotnie przemyć jajniki 700 µL glicyny przez pięć minut. Następnie jajniki należy przemyć dwa razy roztworem PBST przez 10 minut.

Ponownie utrwal jajniki w buforze do utrwalania przez 15 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu. Aby zahamować endogenną aktywność peroksydazy, przeprowadź seryjne odwodnienie jajników za pomocą roztworów metanolu o różnych stężeniach w 0,2% PBST, stosując stosunki objętościowe 1:3, 1:1 oraz 3:1, a następnie inkubuj jajniki w 100% metanolu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu. Następnie przeprowadź seryjne rehydratowanie jajników zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole tekstowym.

W przypadku trzech par jajników w probówce o pojemności 1,5 ml, minimalna objętość dla blokowania próbek i barwienia przeciwciałami wynosi 200 µl. Inkubować jajniki z 1x roztworem blokującym DIG-B przez cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C, przy łagodnym wstrząsaniu. Po inkubacji usunąć nadsącz i zastąpić go świeżym 1x roztworem blokującym DIG-B, zawierającym przeciwciało pierwszorzędowe w odpowiednim stosunku rozcieńczenia.

Barwić jajniki przez cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C przy łagodnym wstrząsaniu. Po przemyciu jajników zgodnie z opisem w protokole tekstowym, odlać nadsącz i zastąpić go świeżym 1x roztworem blokującym DIG-B zawierającym przeciwciało wtórne w odpowiednim stosunku rozcieńczenia, a następnie barwić jajniki w ten sam sposób co wcześniej. W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego, proces barwienia należy przeprowadzać w ciemności, ponieważ przeciwciało wtórne jest światłoczułe.

Grubość embrionów mszyc różni się w zależności od stadium rozwoju. Strategie montowania są zatem modyfikowane tak, aby były odpowiednie dla embrionów we wczesnej, środkowej i późnej fazie rozwoju. Przenieś jajniki wraz z medium montującym do kuwety z plastikowej pipety i obserwuj próbki pod stereomikroskopem przy małym powiększeniu.

Odetnij kalusy związane z bocznym jajowodem za pomocą szpilek entomologicznych, a następnie za pomocą pipety transferuj wyizolowany owariol do pustego wgłębienia szkiełka szkiełka przedmiotowego. Uzupełnij końcową objętość do poziomu od 50 do 100 µl przy użyciu medium montażowego. Następnie przenieś owariol na szkiełko za pomocą szklanej pipety.

Rozdziel komory jajowe za pomocą szpilek entomologicznych. W przypadku embrionów starszych niż szósty stopień rozwoju zaleca się oddzielenie komór jajowych. W przypadku germariów i dwóch pierwszych komór jajowych oddzielenie jest opcjonalne.

Przenieś wypreparowaną komorę jajeczną na czysty szkiełko za pomocą szklanego zakraplacza. W przypadku embrionów w stadiach rozwoju od 1 do 10, powoli nałóż szkiełko nakrywkowe na wypreparowane germaria lub komory jajeczne, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Alternatywnie, dla embrionów w stadiach rozwoju od 11 do 18, zamocuj komory jajeczne na szkiełku, stosując mostek z jednostronnego szkiełka nakrywkowego, a następnie nałóż kolejne szkiełko nakrywkowe na górę próbki.

W przypadku embrionów na etapie rozwoju powyżej stadium 19, zamocuj komory jajowe na szkiełku przedmiotowym za pomocą mostka z dwustronnym szkiełkiem nakrywkowym, a następnie nałóż drugie szkiełko nakrywkowe na górę próbki. Następnie wypełnij przestrzeń pod górnym szkiełkiem nakrywkowym medium montującym, aby zapobiec wysychaniu próbki. Delikatnie przesuń górne szkiełko nakrywkowe, aby uzyskać odpowiednią orientację do obserwacji.

Na koniec, przed przystąpieniem do analizy obrazów, uszczelnij krawędzie szkiełek podstawowych, w tym szkiełek nad mostkami, za pomocą laku do paznokci, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawiono tutaj parę jajników wypreparowanych z dorosłej samicy. Ovariola składa się z jednego germarium, jednego do dwóch miejsc O (O-sites) oraz od pięciu do siedmiu embrionów, które są rozmieszczone w komorach jajowych w układzie taśmowym.

Po utrwaleniu paraformaldehydem wysoce zalecane jest trawienie jajników w roztworze Proteinazy K o stężeniu 1 µg/mL przez 10 minut. Wyniki barwienia wskazują, że intensywność sygnału jest znacznie większa w embrionach trawionych Proteinazą K. Inkubacja embrionów w roztworze blokującym z zestawu buforów opartych na DIG redukuje tło silniej niż w przypadku embrionów w normalnym surowicy koziej i albuminie surowiczej bydlęcej.

Endogenna aktywność peroksydazy może również prowadzić do wysokiego tła barwienia. Badania te wykazują, że zanurzenie embrionów mszyc w metanolu pozwala na znacznie skuteczniejsze zahamowanie aktywności peroksydazy niż traktowanie embrionów nadtlenkiem wodoru. Krytyczne warunki opisane w niniejszym badaniu mogą zostać zastosowane do detekcji sygnału zarówno w komórkach płciowych, jak i somatycznych.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu dwóch dni. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat prawidłowego przeprowadzania immunobarwienia embrionów mszyc, w tym sposobów zwiększania intensywności sygnału oraz redukcji barwienia tła. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby delikatnie manipulować każdym embrionem, aby zachować jego właściwy kształt.

Należy pamiętać, że praca z paraformaldehydem i DAPI może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak używanie rękawiczek. Po zakończeniu tej procedury można przeprowadzić inne analizy, np. hybrydyzację in situ, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy mRNA znajduje się w tych samych komórkach embrionalnych co jego produkt białkowy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii środowiskowej owadów, np. dotyczące sposobu specyfikacji komórek rozrodczych oraz determinacji komórek jajowych w różnych fazach reprodukcyjnych mszyc.