Name: Identyfikacja warunków krytycznych dla barwienia immunologicznego w zarodkach mszyc grochowych: zwiększenie przepuszczalności tkanek i zmniejszenie barwienia tła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj protokół barwienia immunologicznego zarodków mszyc grochowych Acyrthosiphon pisum, który zwiększa przepuszczalność tkanek i zmniejsza tło. Ta metoda umożliwia dokładną detekcję ekspresji białek w tkankach embrionalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Chau-Ti Ting (Fly Core na Tajwanie) za dostarczenie monoklonalnego przeciwciała 4D9, Technology Commons (TechComm) z College of Life Science NTU do mikroskopii konfokalnej, Hsiao-Ling Lu za korektę manuskryptu i Chen-yo Chungowi za pomoc w filmowaniu. CC szczególnie dziękuje Charlesowi E. Cookowi za dostarczenie strategicznych sugestii i krytyczną redakcję manuskryptu. Prace te były wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii (101-2313-B-002-059-MY3 i 104-2313-B-002-022-MY3 dla GWL i CC) oraz Narodowy Uniwersytet Tajwański (NTU-CESRP 101R4602D3 dla CC; 103R4000 dla GWL).

1. Kultura mszyc
UWAGA: Laboratoryjny szczep partenogenetycznej żyworodnej mszycy grochowej A. pisum zostało pierwotnie zebrane w środkowym Tajwanie i było hodowane na roślinach żywicielskich (groch ogrodowy Pisum sativum lub bób Vicia faba) w fotoperiodze długiego dnia przez ponad 300 pokoleń (jedno pokolenie: ~10 dni).
<ol>
	<li>Kiełkowanie nasion
	<ol>
		<li>Namocz nasiona roślin żywicielskich w wodzie z kranu przez 3-5 dni w temperaturze pokojowej. Uzupełniaj świeżą wodą raz dziennie. 
		UWAGA: Alternatywnie, umieszczanie nasion roślin żywicielskich bezpośrednio w wilgotnej glebie może również wywołać kiełkowanie.</li>
		<li>Wyhoduj 10 kiełkujących nasion w małej doniczce (9 cm średnicy x 7 cm wysokości) z glebą w komorze wzrostu w fotoperiodzie 16 godzin światła / 8 godzin ciemności w temperaturze 20 °C.</li>
		<li>Około 10 dni po rozpoczęciu wzrostu przenieś mszyce na rośliny o wysokości większej niż 8 cm. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenoszenie mszyc
	<ol>
		<li>Trzymaj każdą doniczkę z roślinami w szklanej zlewce o pojemności 1 l, przenieś 8 dorosłych mszyc na rośliny za pomocą pędzla, a następnie uszczelnij zlewkę przepuszczalną dla powietrza osłoną, taką jak siatka z gazy, aby zapobiec ucieczce mszyc.</li>
		<li>Mszyce należy inkubować w komorze wzrostowej w świetle fotoperiodycznym 16 godzin światła/8 godzin ciemności w temperaturze 20 °C. Podlewaj każdą doniczkę z roślinami raz dziennie.</li>
		<li>Aby uzyskać następną generację mszyc, powtórz kroki 1.1.3-1.2.2 dziesięć dni po pierwotnym przeniesieniu mszyc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie i unieruchomienie jajników
<ol>
	<li>Świeżo przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako bufor utrwalający.</li>
	<li>Napełnij jedną studzienkę płytki punktowej PFA (około 500 μl), umieść płytkę pod mikroskopem stereoskopowym w małym powiększeniu i zanurz dorosłego mszycę w PFA w celu sekcji.</li>
	<li>Wypreparuj jajniki, przytrzymując głowę i brzuch jednym zestawem kleszczy, rozcinając naskórek grzbietowy brzucha i odciągając jajniki od jamy brzusznej.</li>
	<li>Umieścić trzy pary jajników w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml PFA w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Zdekantować bufor utrwalający za pomocą pipety transferowej (szklanej lub jednorazowej), a następnie przemyć jajniki 0,2% TritonX-100 w 1x PBS (PBST) 3 razy przez 10 minut każdy. Łagodne wstrząsanie na mieszarce/rotatorze (kąt obrotu: 60° (F60) / prędkość obrotowa: 8 obr./min) jest zalecane zarówno do utrwalania, jak i mycia.</li>
</ol>
3. Leczenie proteinazą K (PK) w celu zwiększenia przepuszczalności tkanek embrionalnych
UWAGA: Leczenie farmakokinetyczne stosuje się do zarodków od wydłużenia pasma zarodkowego (stadium 11 rozwoju). W przypadku młodszych zarodków ten krok jest opcjonalny.
<ol>
	<li>Roztwór podstawowy PK (10 mg/ml) rozcieńczyć seryjnie 1x PBS do stężenia roboczego 1 μg/ml.</li>
	<li>Jajniki inkubować z 1 μg/ml PK (około 500 μl) przez 10 minut, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Zdekantować roztwór PK, a następnie przemyć jajniki 700 μl glicyny (2 mg/ml) 3 razy przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Przemyj jajniki 0,2% PBST dwa razy po 10 minut.</li>
	<li>Ponownie unieruchomić jajniki za pomocą buforu stabilizującego przez 15 minut w temperaturze pokojowej z łagodnym potrząsaniem.</li>
	<li>Wyrzuć supernatant i przemyj jajniki 0,2% PBST dwa razy po 10 minut.</li>
</ol>
4. Inkubacja metanolu w celu tłumienia aktywności endogennej peroksydazy (POD)
UWAGA: Inkubacji metanolu nie stosuje się do zarodków poddanych barwieniu falloidyną lub epitopami przeciwciał, które są wrażliwe na metanol.
<ol>
	<li>Seryjnie odwadniać jajniki z różnym procentem metanolu w 0,2% PBST (v/v: 1:3, 1:1, 3:1) poprzez inkubację jajników przy każdym stężeniu roztworu metanolu przez 10 minut z łagodnym mieszaniem.</li>
	<li>Odwodnić jajniki 100% metanolem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z łagodnym wstrząsaniem. 
	UWAGA: Zadowalające wyniki barwienia można było jeszcze uzyskać z tkanek mszyc, które były przechowywane w 100% metanolu w temperaturze -20 °C przez jeden miesiąc.</li>
	<li>Seryjnie nawadniaj jajniki różnymi procentami metanolu w 0,2% PBST (v/v: 3:1, 1:1, 1:3) poprzez inkubację jajników przy każdym stężeniu roztworu metanolu przez 10 minut z łagodnym pomieszaniem.</li>
</ol>
5. Barwienie przeciwciał
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 10-krotny roztwór blokujący z zestawu na bazie DIG (DIG-B) do 1x, 
	UWAGA: 1x roztwór blokujący DIG-B jest bardziej skuteczny w zmniejszaniu tła barwiącego niż standardowy odczynnik blokujący składający się z 5% (v/v) normalnej surowicy koziej (NGS) i 0,5% (v/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 0,2% PBST.</li>
	<li>Inkubować jajniki z 1x roztworem blokującym DIG-B przez 2,5 do 4 godzin w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C z łagodnym wstrząsaniem. 
	UWAGA: W przypadku trzech par jajników w probówce o pojemności 1,5 ml minimalna objętość do blokowania próbki i barwienia przeciwciał wynosi 200 μl.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i zastąpić świeżym 1x roztworem blokującym DIG-B zawierającym przeciwciało pierwszorzędowe w odpowiednim stosunku rozcieńczenia. Barwienie jajników przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C z łagodnym potrząsaniem. 
	UWAGA: W opisanym tutaj eksperymencie należy zastosować następujące optymalne rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych: (1) przeciwciało ApVas1: 1:500 dla barwienia chromogenicznego, 1:50 dla barwienia immunofluorescencyjnego; (2) przeciwciało przeciwko tubulinie anty-α: 1:500; (3) Przeciwciało monoklonalne 4D9: 1:25.</li>
	<li>Przemyj jajniki 0,2% PBST 4 razy po 15 minut każdy.</li>
	<li>Inkubować jajniki z 1x roztworem blokującym DIG-B przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z łagodnym wstrząsaniem.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i zastąpić świeżym 1x roztworem blokującym DIG-B zawierającym przeciwciało drugorzędowe w odpowiednim stosunku rozcieńczenia. Barwienie jajników przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub O/N w temperaturze 4 °C z łagodnym potrząsaniem.
	<ol>
		<li>Stosować następujące proporcje rozcieńczenia przeciwciał drugorzędowych: (1) Do barwienia immunofluorescencyjnego: 1:500 dla koziej anty-króliczej IgG Alexa Fluor 633 lub koziej anty-mysiej IgG Alexa Fluor 488; (2) Do barwienia chromogennego: 1:200 dla biotynylowanych kozich anty-króliczych IgG. 
		UWAGA: Biotynylowane przeciwciało drugorzędowe stosuje się do interakcji z kompleksem awidyny-biotyny (ABC) w detekcji opartej na substratach (chromogennych), dzięki czemu sygnały barwienia są znacznie wzmacniane.</li>
		<li>W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego należy przeprowadzić barwienie w ciemności, ponieważ przeciwciało wtórne jest wrażliwe na światło.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmyć przeciwciało drugorzędowe 0,2% PBST 4 razy po 10 minut.</li>
</ol>
6. Barwienie jądrowe i F-aktynowe
UWAGA: Dotyczy to tylko barwienia immunofluorescencyjnego.
<ol>
	<li>Zabarwić jajniki 0,2% PBST zawierającym DAPI (2 ng/μl) i falloidynę-TRITC (100 nM) przez 2 godziny w temperaturze RT w ciemności.</li>
	<li>Przemyj jajniki 0,2% PBST 4 razy po 10 minut każdy.</li>
	<li>Inkubować jajniki z pożywką mocującą O/N w temperaturze 4 °C, lekko wstrząsając.</li>
</ol>
7. Rozwój sygnału
UWAGA: Dotyczy to tylko barwienia chromogenicznego.
<ol>
	<li>Przygotować 100 μl odczynnika kompleksu awidyny-biotyny (ABC) w celu wzmocnienia sygnałów, dodając 1 μl odczynnika A (awidyny) do 98 μl 0,2% PBST, dokładnie mieszając przez delikatne pipetowanie i dodając 1 μl odczynnika B (biotyna sprzężona z peroksydazą chrzanową), a następnie natychmiast mieszając. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, lekko wstrząsając.</li>
	<li>Jajniki (w tym oddzielone komory jajowe) inkubować w mieszaninie odczynników A i B przez 30 minut w temperaturze słonecznej, lekko wstrząsając.</li>
	<li>Zmyć mieszaninę odczynników A i B 0,2% PBST 4 razy po 10 minut.</li>
	<li>Przenieś jajniki zanurzone w PBST do studzienki na płytce punktowej za pomocą plastikowego zakraplacza.</li>
	<li>Przygotować roztwór substratu 3,3'-diaminobenzydyny (DAB): rozpuścić jedną tabletkę DAB wraz z drugą tabletką zawierającą nadtlenek mocznika w 1 ml ddH2O poprzez energiczne wirowanie przez 1 min. 
	UWAGA: DAB, wytrącający się substrat peroksydazy, jest popularnym chromogenem do barwienia immunologicznego. Po utlenieniu przez peroksydazę wytwarza brązowy i nierozpuszczalny osad. Słabe sygnały można wzmocnić, dodając chlorek niklu do roztworu substratu (stężenie końcowe 0,05-0,08</li>%).
	<li>Usunąć roztwór PBST pozostały w studzience i ponownie napełnić 100 μl roztworu substratu DAB w celu opracowania sygnału.</li>
	<li>Monitoruj intensywność sygnałów pod mikroskopem stereoskopowym przy małym powiększeniu.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcje, usuwając roztwór DAB, a następnie natychmiast ponownie napełnij 1x PBS. Powtórz pranie dwa razy.</li>
	<li>Przenieś jajniki z powrotem do probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie przemyj 1x PBS lub PBST dwa razy przez 15 minut każdy. </li>
	<li>Inkubować jajniki w pożywce mocującej na bazie glicerolu (70% glicerolu) O/N w temperaturze 4 °C, lekko wstrząsając.</li>
</ol>
8. Montaż zarodków mszyc
UWAGA: Grubość zarodków mszyc różni się w zależności od etapu rozwoju. Strategie montowania są zatem modyfikowane tak, aby pasowały do wczesnych (germaria i stadia 0-10), środkowych (stadia 11-18) i późnych zarodków (stadia 19-20), które pokazano na rysunku 2B-D. Stadium embrionalne nastąpiło po Miura i wsp. 12
<ol>
	<li>Przenieś jajniki wraz z pożywką montażową do tacki na komórkę za pomocą plastikowego zakraplacza i obserwuj próbki pod mikroskopem stereoskopowym w małym powiększeniu.</li>
	<li>Przetnij kielichy związane z bocznym jajowodem za pomocą szpilek przeciw owadom, a następnie przenieś izolowany jajnik do pustej szklanej studzienki za pomocą zakraplacza. Uzupełnić końcową objętość do 50-100 μl za pomocą podłoża mocującego.</li>
	<li>Przenieść jajnik na szkiełko za pomocą szklanego zakraplacza, a następnie wypreparować komory jajowe za pomocą szpilek na owady. 
	UWAGA: W przypadku zarodków starszych niż 6 stadium rozwoju sugeruje się oddzielenie komór jajowych; W przypadku germarii i pierwszych dwóch komór jajowych młodszych niż stadium 6 separacja jest opcjonalna.</li>
	<li>Przenieś wypreparowaną komorę na jajka na czyste szkiełko za pomocą szklanego zakraplacza.</li>
	<li>Powoli nakładaj szkiełko nakrywkowe (rozmiar: 22 x 22 mm) na wypreparowane komory germinowe lub jajowe (zawierające zarodki w stadiach 1-10 rozwoju), aby uniknąć pęcherzyków.
	<ol>
		<li>Umieścić komory jajowe (zawierające zarodki w stadium 11-18 rozwoju) na szkiełku podstawowym z jednostronnym mostkiem nakrywkowym i umieścić kolejne szkiełko nakrywkowe (o wymiarach 18 x 18 mm) na wierzchu próbki.</li>
		<li>Umieścić komory jajowe (zawierające zarodki starsze niż 19 stadium rozwoju) na szkiełku podstawowym z dwustronnym szkiełkiem nakrywkowym i umieścić kolejne szkiełko nakrywkowe (o wymiarach: 18 x 18 mm) na wierzchu próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypełnić przestrzeń pod górnym szkiełkiem nakrywkowym środkami montażowymi, aby uniknąć wysuszenia próbki.</li>
	<li>Delikatnie zwiń zarodek, przesuwając szkiełko nakrywkowe, aby uzyskać właściwą orientację do obserwacji.</li>
	<li>Uszczelnij wokół krawędzi szkiełek nakrywkowych (w tym szkiełka nakrywkowe) lakierem do paznokci.</li>
</ol>
9. Analiza obrazowa
<ol>
	<li>Fotografuj obrazy z kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC) zarodków z pełnym mocowaniem za pomocą mikroskopu złożonego wyposażonego w optykę DIC i suchą soczewkę obiektywową (10X, 20X, 40X) podłączoną do aparatu. Zainstaluj oprogramowanie do przesyłania obrazów między aparatem a komputerem, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Pozyskaj projekcje fluorescencyjnie znakowanych zarodków za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego14. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi fotografowania, układania w stosy i projekcji 3D za pomocą oprogramowania do obrazowania.
	<ol>
		<li>Odwróć szkiełko do góry nogami, znajdź zamontowaną próbkę za pomocą obiektywu 10X i zakreśl obszar próbki cienkim pisakiem na bazie oleju. 
		UWAGA: Ułatwia to identyfikację próbki podczas wyszukiwania jej za pomocą obiektywów mikroskopu konfokalnego.</li>
		<li>Dodać kroplę oleju na wierzch szkiełka nakrywkowego, którego przeciwna strona jest oznaczona zgodnie z opisem w ppkt 9.2.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znajdź płaszczyznę ogniskową przy 40-krotnym zanurzeniu w olejku, a następnie zmień na 63-krotny obiektyw zanurzeniowy w olejku. Ręcznie przesuwaj precyzyjny element regulacji ostrości w górę i w dół, aby uchwycić najlepszą płaszczyznę ogniskowej. 
	UWAGA: Do obserwacji szczegółów strukturalnych germin i wczesnych zarodków sugerujemy użycie obiektywów 40X lub tych o większym powiększeniu.</li>
	<li>Zeskanuj zarodek w różnych kanałach wzbudzenia i uzyskaj obraz z-stack. 
	UWAGA: W przypadku tkanek mszyc grochowych należy zmniejszyć grubość każdego przekroju optycznego do 1,5 μm lub mniej.</li>
</ol>

<ol><li>Blackman, R. L. Reproduction, cytogenetics and development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlackman%2C+RL+%22Aphids%3A+their+biology%2C+natural+enemies%22">Aphids: their biology, natural enemies</a>. Minks, A. K., Harrewijn, P. , Elsevier Press. Amsterdam. 163-195 (1987).</li>
<li>Davis, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclical+parthenogenesis+and+viviparity+in+aphids+as+evolutionary+novelties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties.</a> J. Exp. Zool. 318, 448-459 (2012).</li>
<li>The International Aphid Genomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> PLoS Biol. 8 (2), e1000313(2010).</li>
<li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+there+yet%3F+Tracking+the+development+of+new+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends Genet. 24 (7), 353-360 (2008).</li>
<li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apvasa+marks+germ-cell+migration+in+the+parthenogenetic+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum+%28Hemiptera%3A+Aphidoidea%29%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Apvasa marks germ-cell migration in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea)).</a> Dev. Genes Evol. 217 (4), 275-287 (2007).</li>
<li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+identification+of+gene+transcripts+in+aphids%3A+Protocols+and+evaluation+of+probe+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem%22%5BJournal%5D)">Whole-mount identification of gene transcripts in aphids: Protocols and evaluation of probe accessibility.</a> Arch. Insect Biochem. 68 (4), 186-196 (2008).</li>
<li>Chung, C. Y., Cook, C. E., Lin, G. W., Huang, T. Y., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+protocols+for+whole-mount+fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%3A+a+comprehensive+survey+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Reliable protocols for whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) in the pea aphid Acyrthosiphon pisum: a comprehensive survey and analysis.</a> Insect Sci. 21 (3), 265-277 (2014).</li>
<li>Mutti, N. S., Park, Y., Reese, J. C., Reeck, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+knockdown+of+a+salivary+transcript+leading+to+lethality+in+the+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">RNAi knockdown of a salivary transcript leading to lethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum.</a> J. Insect Sci. 6, 38(2006).</li>
<li>Jaubert-Possamai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knockdown+by+RNAi+in+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> BMC Biotechnol. 7, 63(2007).</li>
<li>Sapountzis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insight+into+the+RNA+interference+response+against+cathepsin-L+gene+in+the+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%3A+Molting+or+gut+phenotypes+specifically+induced+by+injection+or+feeding+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New insight into the RNA interference response against cathepsin-L gene in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum: Molting or gut phenotypes specifically induced by injection or feeding treatments.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 51, 20-32 (2014).</li>
<li>Braendle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origin+and+evolution+of+bacteriocytes+in+the+aphid-Buchnera+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental origin and evolution of bacteriocytes in the aphid-Buchnera symbiosis.</a> PLoS Biol. 1 (1), e21(2003).</li>
<li>Miura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+parthenogenetic+and+sexual+embryogenesis+of+the+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum+%28Hemiptera%3A+Aphidoidea%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">A comparison of parthenogenetic and sexual embryogenesis of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea).</a> J. Exp. Zool. 295 (1), 59-81 (2003).</li>
<li>Chang, C., Lee, W. C., Cook, C. E., Lin, G. W., Chang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-plasm+specification+and+germline+development+in+the+parthenogenetic+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%3A+Vasa+and+Nanos+as+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers.</a> Int. J. Dev. Biol. 50 (4), 413-421 (2006).</li>
<li>Koshy, A. A., Cabral, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+imaging+and+analysis+of+neurons+infected+in+vivo+with+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii.</a> J. Vis. Exp. (94), e52237(2014).</li>
<li>Brisson, J. A., Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%3A+an+emerging+genomic+model+system+for+ecological%2C+developmental+and+evolutionary+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The pea aphid, Acyrthosiphon pisum: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies.</a> Bioessays. 28 (7), 747-755 (2006).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Method.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Method. Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Wolff, C., Sommer, R., Schroder, R., Glaser, G., Tautz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+divergent+expression+aspects+of+the+Drosophila+segmentation+gene+hunchback+in+the+short+germ+band+embryo+of+the+flour+beetle+Tribolium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Conserved and divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium.</a> Development. 121 (12), 4227-4236 (1995).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23 (4), 345-358 (2001).</li>
<li>Lin, G. W., Cook, C. E., Miura, T., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+localization+of+ApVas1+positions+the+preformed+germ+plasm+in+the+sexual+oviparous+pea+aphid+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22Evodevo%22%5BJournal%5D)">Posterior localization of ApVas1 positions the preformed germ plasm in the sexual oviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum.</a> Evodevo. 5, 18(2014).</li>
<li>Straus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+peroxidase+by+methanol+and+by+methanol-nitroferricyanide+for+use+in+immunoperoxidase+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol-nitroferricyanide for use in immunoperoxidase procedures.</a> J. Histochem. Cytochem. 19 (11), 682-688 (1971).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zidentyfikowaliśmy optymalne warunki krytyczne dla skutecznego barwienia immunologicznego mszycy grochowej A. Pisum, wyłaniający się organizm modelowy do badań genomicznych i rozwojowych3,15. Zoptymalizowane warunki zwiększające przepuszczalność tkanek i zmniejszające barwienie tła zwiększyły intensywność i swoistość sygnałów. Różnią się one od standardowych protokołów barwienia immunologicznego w innych modelach zwierzęcych etapami tworzenia porów w błonach komórkowych i blokowania nieswois...

Mszyce to owady z rodzaju pluskwiaków o małych (1-10 mm) miękkich ciałach. Żywią się roślinami, wysysając sok z łyka z przeszywającymi aparatami gębowymi. Dodatkowo polegają na obowiązkowej endosymbiotycznej bakterii, Buchnera aphidicola, do syntezy niezbędnych aminokwasów, których brakuje w diecie z soku łyka. Mszyce mają złożoną historię życia, która obejmuje partenogenetyczne rozmnażanie żyworodne wiosną i latem, fotoperiody długodniowe oraz rozmnażanie płciowe jajorodne wywoływane przez fotoperiody dni krótkich, podczas których składają ograniczoną liczbę zimujących jaj1,2. Wiosną z jaj wylęgają się pierwsze pokolenie samic mszyc (fundatrices), po wielu rundach rozmnażania partenogenetycznego trwających do jesieni. Cykliczna partenogeneza u mszyc, w której fazy bezpłciowe i płciowe występują naprzemiennie w rocznym cyklu życiowym, została uznana za nowość ewolucyjną1,2. U partenogenetycznych mszyc żyworodnych embriogeneza zachodzi w komorach jajowych kanalików jajnikowych (jajników). Natomiast w zapłodnionych jajach rozwijają się płciowe zarodki jajorodne. Oprócz plastyczności reprodukcyjnej, mszyce mogą wykazywać międzypokoleniową polifenizm skrzydeł: w odpowiedzi na sygnały przeludnienia i zagrożenia ze strony drapieżników, bezskrzydłe bezpłciowe samice mogą żyworodnie produkować skrzydlate potomstwo do długodystansowej migracji. Publikacja sekwencji genomu mszycy grochowej Acyrthosiphon pisum – pierwszej sekwencji genomu owada podstawnokomórkowego półmetabolicznego – umożliwia dalsze badania plastyczności reprodukcyjnej, polifenizmu skrzydeł i innych cech, w tym interakcji owad-roślina, wektorowania wirusowego i symbiozy u mszyc na podstawie molekularnej3.
Oprócz zsekwencjonowanego genomu, potrzebne są narzędzia do charakteryzowania ekspresji i funkcji genów do promowania mszycy grochowej jako dojrzałego organizmu modelowego4. Opisaliśmy solidne protokoły hybrydyzacji in situ w celu wykrycia ekspresji mRNA w zarodkach mszyc5-7. Interferencja RNA (RNAi) poprzez wstrzyknięcie i karmienie dwuniciowego RNA została wykorzystana do wyciszenia genów u nimf mszyc i dorosłych osobników, ale stabilne warunki knockdownu genów w zarodkach nie zostały jeszcze zgłoszone8-10. Barwienie immunologiczne, podejście oparte na przeciwciałach, które może wykryć ekspresję białka w próbkach przed i po knockdown RNAi, przeprowadzono na zarodkach mszyc grochowych11-13. Jednak zwiększenie przepuszczalności tkanek i eliminacja barwienia tła są jak dotąd niezadowalające przy użyciu standardowych protokołów barwienia immunologicznego w bezpłciowych żyworodnych zarodkach mszycy grochowej. Na przykład stwierdziliśmy, że przenikanie przeciwciał do tkanek zmniejszyło się w zarodkach gasstrulujących (stadia 8-10) i że zarodki z morfologicznie identyfikowalnymi zawiązkami kończyn (stadia 13-14) były ledwo przepuszczalne dla przeciwciał. Ponadto uwidoczniono barwienie tła w bezpłciowych żyworodnych zarodkach mszycy grochowej barwionej przy użyciu przeciwciała przeciwko markerowi linii zarodkowej Vasa, a także przeciwko białku Engrailed/Invected ulegającemu ekspresji w segmentach zarodkowych12,13. W rzeczywistości barwienie tła było nadal wyraźnie widoczne w zarodkach barwionych samym przeciwciałem drugorzędowym.
Aby zwiększyć przepuszczalność bez naruszania integralności tkanek mszyc, starannie zwiększyliśmy stężenie proteinazy K i określiliśmy optymalne warunki do trawienia tkanek na zarodkach mszyc. Aby uniknąć niespecyficznego barwienia u mszycy grochowej, poszukiwaliśmy związków, które mogłyby skutecznie blokować zarodki i hamować aktywność endogennej peroksydazy (POD), enzymu wykorzystywanego do wzmacniania sygnałów podczas barwienia immunologicznego. Odczynnik blokujący dostarczany przez zestaw buforowy oparty na digoksygeninie (DIG), zamiast tradycyjnie stosowanej normalnej surowicy koziej (NGS) / albuminy surowicy bydlęcej (BSA), znacznie zmniejszył barwienie tła. Ponadto stwierdzono, że metanol hamuje endogenną aktywność POD skuteczniej niż nadtlenek wodoru (H2O2). Szczegółowe informacje dotyczące tych specyficznych dla mszyc warunków barwienia immunologicznego na zarodkach zostaną opisane w poniższych sekcjach.

<table><tbody><tr><td>30% persydaza wodorowa (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td>Do wybielania endogennej peroksydazy zarodków.</td></tr><tr><td>4' Dichlorowodorek 6-diamidino-2-fenylo-indolu (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Do znakowania dwuniciowego DNA. TOKSYCZNY. Nosić rękawice, dozować do małych porcji i feeze, aby zminimalizować narażenie</td></tr><tr><td>4D9 przeciwciało monoklonalne myszy przeciw zaplątaniu/inwekcji</td><td>Badania rozwojowe banku hybrydoma AB_528224</td><td></td><td>Do znakowania rozwijających się segmentów zarodka.</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne królika ApVas1</td><td>Nasze laboratorium</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>znakowania białka Vas1 specyficznego dla linii zarodkowej mszyc w zarodkach. To przeciwciało zostało wyprodukowane przez nasze laboratorium.</td></tr><tr><td>Austerlitz Szpilki do owadów</td><td>ENTOMORAVIA</td><td>N/A</td><td>Do oddzielania każdej komory jajowej od jajnika. Rozmiar 000, EMAMELOWANY.&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Do blokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał.</td></tr><tr><td>Aparat podłączony do mikroskopu złożonego</td><td>Canon</td><td>EOS 5D</td><td>Do fotografowania zarodków mszyc.</td></tr><tr><td>Kolorymetryczna taca na 8 komórek</td><td>Kartell Labware</td><td>357</td><td>Do opracowywania sygnału barwienia zarodków mszyc. Średnica 95 x 57 mm, głębokość ogniwa 2 mm.</td></tr><tr><td>Mikroskop złożony z optyką DIC Leica</td><td>Microsystems</td><td>DMR</td><td>Do fotografowania zarodka mszycy zamontowanego na szkiełkach.</td></tr><tr><td>DIG Zestaw buforowy do mycia i blokowania</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>11585762001</td><td>Do blokowania nieswoistego wiązania przeciwciał. Rozcieńczyliśmy 10x roztwór blokujący do 1x jako odczynnik blokujący.</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Ideal-tek</td><td>N/A</td><td>Do wycinania jajników z mszyc. Część producenta nr 5: 5 SA.&nbsp;</td></tr><tr><td>Szklany zakraplacz</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Do przenoszenia jajników mszyc z płytki szczelinowej do rurek. 150 mm długości całkowitej i 5 3/4" długości końcówki.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Do usuwania zarodków mszyc i montażu.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>N/A</td><td>Do blokowania aktywności enzymatycznej proteinazy K (PK).</td></tr><tr><td>Koza anty-mysia IgG sprzężona Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Do wykrywania pierwszorzędowego przeciwciała od myszy.</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG sprzężona Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Do wykrywania pierwszorzędowego przeciwciała od królika.</td></tr><tr><td>Mieszalnik Intelli</td><td>ELMI sprzęt laboratoryjny</td><td>RM-2M</td><td>Do poprawy reakcji zanikowej odczynników z jajnikami.</td></tr><tr><td>Laserowo-skaningowa mikroskopia konfokalna</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Do fotografowania zarodka mszycy zamontowanego na szkiełkach z znacznikiem florecent .</td></tr><tr><td>metanol&nbsp;</td><td>Burdick i Jackson</td><td>AH2304</td><td>Do wybielania endogennej peroksydazy zarodków.</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>10143560</td><td>Do montowania zarodków. Obrzeża szlifowane SUPERFROST, ca./env. Wymiary: 76 x 26 mm.</td></tr><tr><td>Mikroskop Okulary nakrywkowe</td><td>Marienfeld</td><td>0101030</td><td>Do mocowania zarodków na szkiełkach. Rozmiar 18 x 18 mm. Grubość nr 1 (0,13 do 0,16 mm)</td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe do mikroskopu</td><td>Marienfeld</td><td>0101050</td><td>Do mocowania zarodków na szkiełkach. Rozmiar 22 x 22 mm. Grubość nr 1 (0,13 do 0,16 mm)</td></tr> <tr><td>mysie monoklonalne przeciwciało anty-alfatubulinowe (DM1A)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32293</td><td>Do oznaczania dystrybucji alfa-tubuliny komórek.</td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Do uszczelniania szkiełek nakrywkowych na szkiełkach.</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Do blokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>VWR</td><td>MK262159</td><td>Do utrwalania jajników mszyc.</td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>Do oznaczania dystrybucji F-aktyny na zarodkach.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Jako roztwór izotoniczny dla jajników mszyc.</td></tr><tr><td>Plastikowy zakraplacz</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Do przenoszenia jajników mszyc z probówki do tacki na komórki. Rozmiar 3 ml.&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Merck</td><td>124678</td><td>Do tworzenia porów (dziurkowania) na błonie komórkowej i ułatwiania dostępu przeciwciał.</td></tr><tr><td>Płytka plamkowa Pyrex</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Do preparacji i reakcji barwnych jajników mszyc pod mikroskopem. Każda wnęka o średnicy 22 mm i&nbsp; głębokość 7 mm.</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3'-diaminobenzydyna (DAB) tabletki&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4168</td><td>Do opracowywania sygnałów substratowych. Nazywany również zestawem tabletek z substratem peroksydazy DAB.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>EZ4</td><td>Do preparowania i obserwacji jajników mszyc.</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Do tworzenia porów (dziurkowania) na błonie komórkowej.&nbsp;</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>PK-6101</td><td>Do wzmocnienia sygnału. W tym biotynylowane kozie przeciwciała anty-królicze IgG drugorzędowe, odczynniki A i B.</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe VECTASHIELD</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td>Do usuwania zarodków mszyc i montażu.</td></tr></tbody></table>

identyfikacja warunków krytycznych dla barwienia immunologicznego w zarodkach mszyc grochowych: zwiększenie przepuszczalności tkanek i zmniejszenie barwienia tła

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Mszyca grochowa Acyrthosiphon pisum, z sekwencjonowanym genomem i dużą plastycznością fenotypową, stała się nowym modelem do badań genomicznych i rozwojowych. Podobnie jak inne mszyce, A. Pisum rozmnaża się szybko poprzez partenogenetyczne rozmnażanie żyworodne, w którym zarodki rozwijają się w komorach jajowych w sposób liniowy w jajniku. Wcześniej opracowaliśmy solidną platformę do hybrydyzacji in situ metodą całego montażu, która umożliwia wykrywanie ekspresji mRNA w zarodkach mszyc. Jednak w celu analizy ekspresji białka ustalone protokoły barwienia immunologicznego jajników bezpłciowych żyworodnych mszyc nie przyniosły zadowalających wyników. W tym miejscu przedstawiamy warunki zoptymalizowane pod kątem zwiększenia przepuszczalności tkanek i zmniejszenia barwienia tła, które stanowiły problemy przy stosowaniu ustalonych podejść. Optymalizacje obejmują: (1) inkubację proteinazy K (1 μg/ml, 10 min), która okazała się niezbędna do penetracji przeciwciał w zarodkach mszyc w średnim i późnym stadium; 2) zastąpienie normalnej surowicy koziej / albuminy surowicy bydlęcej odczynnikiem blokującym dostarczanym przez zestaw buforowy na bazie digoksygeniny (DIG) oraz 3) zastosowanie metanolu zamiast nadtlenku wodoru (H2O2) do wybielania endogennej peroksydazy; co znacznie zmniejszyło przebarwienia tła w tkankach mszyc. Te krytyczne warunki zoptymalizowane pod kątem barwienia immunologicznego pozwolą na skuteczne wykrywanie produktów genowych w zarodkach A. pisum i inne mszyce.

W niniejszym badaniu przeprowadziliśmy immunobarwienie całych embrionów mszycy grochowej bezpłciowej (Rysunek 1A). Samice te produkują potomstwo w sposób partenogenetyczny i żyworodny. Embriony samic rozwijają się w komorach jajowych cewek jajników (owariolach) (Rysunek 1B oraz Rysunek 2A). Przed badaniem mikroskopowym celem barwienia są wypreparowane owariole; jednak do obserwacji embrionów pod mikroskopem wymagana jest separacja komór j...

Przedstawiono protokół barwienia immunologicznego na zarodkach mszyc, w którym omówiono krytyczne warunki zmniejszania barwienia tła i zwiększania przepuszczalności tkanek. Warunki te zostały specjalnie opracowane do skutecznego wykrywania ekspresji białek w tkankach embrionalnych mszyc.

Identyfikacja warunków krytycznych dla barwienia immunologicznego w zarodkach mszyc grochowych: zwiększenie przepuszczalności tkanek i zmniejszenie barwienia tła

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu immunobarwienia jest wykrycie ekspresji białek w embrionach mszyc. Zidentyfikowano krytyczne warunki, które zwiększają przepuszczalność tkanek i zmniejszają barwienie tła, co stanowi od dawna znane problemy podczas barwienia tkanek embrionalnych mszyc. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie specyficznych warunków dla efektywnej penetracji przeciwciał oraz redukcji barwienia tła, które zazwyczaj nie są opisane w standardowym protokole immunobarwienia.Pomysł na zastosowanie tej miary pojawił się podczas naszych badań nad specyfikacją komórek zarodkowych u mszycy grochowej, która jest modelem owadziego wykorzystywanym w badaniach genomiki i środowiska. Laboratoryjny szczep mszycy grochowej, a. pisum, został pierwotnie zebrany w środkowej części Tajwanu i jest hodowany na roślinach żywicielskich od ponad 300 pokoleń.Aby nasiona wykiełkowały, należy namoczyć nasiona roślin żywiciela w wodzie z kranu przez trzy do pięciu dni w temperaturze pokojowej. Raz dziennie należy wymienić wodę na świeżą. Dziesięć kiełkujących nasion należy wysiać do małej doniczki z ziemią w komorze wzrostowej, przy fotoperiodzie 16 godzin światła i ośmiu godzin ciemności, w temperaturze 20 °C.Około 10 dni po rozpoczęciu wzrostu wysokość roślin zazwyczaj przekracza osiem centymetrów. Umieść każdą doniczkę z roślinami w zlewce szklanej o pojemności 1 litra i przenieś dorosłe mszyce na rośliny za pomocą pędzla. Następnie zamknij zlewkę przepuszczalną dla powietrza przykrywką, np. z gazy, aby zapobiec ucieczce mszyc.Inkubuj mszyce w komorze wzrostowej przy fotoperiodzie 16 godzin światła i ośmiu godzin ciemności, w temperaturze 20 °C, podlewając każdą doniczkę z roślinami raz dziennie. Napełnij jedno wgłębienie płytki do testów około 500 µL 4% paraformaldehydu. Umieść płytkę pod stereomikroskopem przy niskim powiększeniu i zanurz dorosłą mszycę w paraformaldehydzie w celu przeprowadzenia sekcji.Przeprowadź sekcję jajników, trzymając głowę i odwłok jedną pęsetą, rozcinając grzbietową kutykulę odwłoka i odsuwając jajniki od jamy odwłoka. Następnie utrwal trzy pary jajników w probówce o pojemności 1,5 mililitra zawierającej jeden mililitr paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 20 minut, przy łagodnym mieszaniu na mieszalniku. Usuń bufor do utrwalania za pomocą pipety szklanej, a następnie przemyj jajniki PBST trzy razy po 10 minut, przy łagodnym mieszaniu.Aby przygotować jajniki, należy najpierw inkubować je z Proteinazą K przez 10 minut przy delikatnym wstrząsaniu w celu zwiększenia przepuszczalności tkanek embrionalnych. Po inkubacji należy usunąć roztwór Proteinazy K, a następnie trzykrotnie przemyć jajniki 700 µL glicyny przez pięć minut. Następnie jajniki należy przemyć dwa razy roztworem PBST przez 10 minut.Ponownie utrwal jajniki w buforze do utrwalania przez 15 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu. Aby zahamować endogenną aktywność peroksydazy, przeprowadź seryjne odwodnienie jajników za pomocą roztworów metanolu o różnych stężeniach w 0,2% PBST, stosując stosunki objętościowe 1:3, 1:1 oraz 3:1, a następnie inkubuj jajniki w 100% metanolu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu. Następnie przeprowadź seryjne rehydratowanie jajników zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole tekstowym.W przypadku trzech par jajników w probówce o pojemności 1,5 ml, minimalna objętość dla blokowania próbek i barwienia przeciwciałami wynosi 200 µl. Inkubować jajniki z 1x roztworem blokującym DIG-B przez cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C, przy łagodnym wstrząsaniu. Po inkubacji usunąć nadsącz i zastąpić go świeżym 1x roztworem blokującym DIG-B, zawierającym przeciwciało pierwszorzędowe w odpowiednim stosunku rozcieńczenia.Barwić jajniki przez cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C przy łagodnym wstrząsaniu. Po przemyciu jajników zgodnie z opisem w protokole tekstowym, odlać nadsącz i zastąpić go świeżym 1x roztworem blokującym DIG-B zawierającym przeciwciało wtórne w odpowiednim stosunku rozcieńczenia, a następnie barwić jajniki w ten sam sposób co wcześniej. W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego, proces barwienia należy przeprowadzać w ciemności, ponieważ przeciwciało wtórne jest światłoczułe.Grubość embrionów mszyc różni się w zależności od stadium rozwoju. Strategie montowania są zatem modyfikowane tak, aby były odpowiednie dla embrionów we wczesnej, środkowej i późnej fazie rozwoju. Przenieś jajniki wraz z medium montującym do kuwety z plastikowej pipety i obserwuj próbki pod stereomikroskopem przy małym powiększeniu.Odetnij kalusy związane z bocznym jajowodem za pomocą szpilek entomologicznych, a następnie za pomocą pipety transferuj wyizolowany owariol do pustego wgłębienia szkiełka szkiełka przedmiotowego. Uzupełnij końcową objętość do poziomu od 50 do 100 µl przy użyciu medium montażowego. Następnie przenieś owariol na szkiełko za pomocą szklanej pipety.Rozdziel komory jajowe za pomocą szpilek entomologicznych. W przypadku embrionów starszych niż szósty stopień rozwoju zaleca się oddzielenie komór jajowych. W przypadku germariów i dwóch pierwszych komór jajowych oddzielenie jest opcjonalne.Przenieś wypreparowaną komorę jajeczną na czysty szkiełko za pomocą szklanego zakraplacza. W przypadku embrionów w stadiach rozwoju od 1 do 10, powoli nałóż szkiełko nakrywkowe na wypreparowane germaria lub komory jajeczne, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Alternatywnie, dla embrionów w stadiach rozwoju od 11 do 18, zamocuj komory jajeczne na szkiełku, stosując mostek z jednostronnego szkiełka nakrywkowego, a następnie nałóż kolejne szkiełko nakrywkowe na górę próbki.W przypadku embrionów na etapie rozwoju powyżej stadium 19, zamocuj komory jajowe na szkiełku przedmiotowym za pomocą mostka z dwustronnym szkiełkiem nakrywkowym, a następnie nałóż drugie szkiełko nakrywkowe na górę próbki. Następnie wypełnij przestrzeń pod górnym szkiełkiem nakrywkowym medium montującym, aby zapobiec wysychaniu próbki. Delikatnie przesuń górne szkiełko nakrywkowe, aby uzyskać odpowiednią orientację do obserwacji.Na koniec, przed przystąpieniem do analizy obrazów, uszczelnij krawędzie szkiełek podstawowych, w tym szkiełek nad mostkami, za pomocą laku do paznokci, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawiono tutaj parę jajników wypreparowanych z dorosłej samicy. Ovariola składa się z jednego germarium, jednego do dwóch miejsc O (O-sites) oraz od pięciu do siedmiu embrionów, które są rozmieszczone w komorach jajowych w układzie taśmowym.Po utrwaleniu paraformaldehydem wysoce zalecane jest trawienie jajników w roztworze Proteinazy K o stężeniu 1 µg/mL przez 10 minut. Wyniki barwienia wskazują, że intensywność sygnału jest znacznie większa w embrionach trawionych Proteinazą K. Inkubacja embrionów w roztworze blokującym z zestawu buforów opartych na DIG redukuje tło silniej niż w przypadku embrionów w normalnym surowicy koziej i albuminie surowiczej bydlęcej.Endogenna aktywność peroksydazy może również prowadzić do wysokiego tła barwienia. Badania te wykazują, że zanurzenie embrionów mszyc w metanolu pozwala na znacznie skuteczniejsze zahamowanie aktywności peroksydazy niż traktowanie embrionów nadtlenkiem wodoru. Krytyczne warunki opisane w niniejszym badaniu mogą zostać zastosowane do detekcji sygnału zarówno w komórkach płciowych, jak i somatycznych.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu dwóch dni. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat prawidłowego przeprowadzania immunobarwienia embrionów mszyc, w tym sposobów zwiększania intensywności sygnału oraz redukcji barwienia tła. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby delikatnie manipulować każdym embrionem, aby zachować jego właściwy kształt.Należy pamiętać, że praca z paraformaldehydem i DAPI może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak używanie rękawiczek. Po zakończeniu tej procedury można przeprowadzić inne analizy, np. hybrydyzację in situ, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy mRNA znajduje się w tych samych komórkach embrionalnych co jego produkt białkowy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii środowiskowej owadów, np. dotyczące sposobu specyfikacji komórek rozrodczych oraz determinacji komórek jajowych w różnych fazach reprodukcyjnych mszyc.

identification-critical-conditions-for-immunostaining-pea-aphid

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie zaprezentowano immunohistochemię w preparatach całych (whole mount immunohistochemistry), czyli metodę pozwalającą na wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji antygenu w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Jane Dodd i Toma Jessella.

Metoda barwienia przeciwciałami całych preparatów u kurczaka

Zarodek Xenopus laevis nadal jest wyjątkowo przydatny w badaniach nad wczesnym rozwojem, ze względu na jego duży rozmiar i łatwość manipulacji.   Przewidziano uproszczony protokół hybrydyzacji całego montażu in situ, który można wykorzystać do identyfikacji określonych narządów w tym modelowym systemie.

Zrozumienie wczesnej organogenezy przy użyciu uproszczonego protokołu hybrydyzacji in situ u Xenopus

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Wprowadzenie małych cząsteczek do rozwijającego się zarodka Drosophila daje ogromne możliwości do charakteryzowania aktywności biologicznej nowych związków, leków i toksyn, a także do badania podstawowych ścieżek rozwojowych. Opisane tu metody nakreślają kroki, które pokonują naturalne bariery dla tego podejścia, rozszerzając użyteczność modelu zarodka Drosophila.

Metoda przenikania zarodków Drosophila do oznaczania aktywności drobnocząsteczkowej

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Gruczoł międzynerkowy u danio pręgowanego jest teleosteańskim odpowiednikiem nadnerczy ssaków. Protokół ten przedstawia, jak przeprowadzić test aktywności enzymatycznej dehydrogenazy 3-β-hydroksysteroidowej (izomerazy Δ5-4; 3β-Hsd), który wykrywa zróżnicowane komórki steroidogenne u rozwijającego się danio pręgowanego.

Wizualizacja steroidogennej tkanki międzynerkowej i jej mikrośrodowiska naczyniowego u danio pręgowanego

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Ten protokół umożliwia wizualizację ekspresji genów u embrionalnych ryb jaskiniowych Astyanax. Podejście to zostało opracowane w celu maksymalizacji sygnału ekspresji genów, przy jednoczesnej minimalizacji niespecyficznego barwienia tła.

Wholemount Hybrydyzacja in situ dla zarodków Astyanax

Protokoły te określają, jak scharakteryzować organizację i funkcję zakrywającą złączeń przegrody plisowanej u nabłonka embrionalnego kontrolnego oraz mutacyjnego nabłonka embrionalnego Drosophila.

Eksperymenty immunobarwienia i penetracji barwnika w celu określenia białek styku przegrody w nabłonku embrionalnym Drosophila

Poznaj protokół barwienia immunologicznego zarodków mszyc grochowych Acyrthosiphon pisum, który zwiększa przepuszczalność tkanek i zmniejsza tło. Ta metoda umożliwia dokładną detekcję ekspresji białek w tkankach embrionalnych.

Identyfikacja warunków krytycznych dla barwienia immunologicznego w zarodkach mszyc grochowych: zwiększenie przepuszczalności tkanek i zmniejszenie barwienia tła (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja warunków krytycznych dla barwienia immunologicznego w zarodkach mszyc grochowych: zwiększenie przepuszczalności tkanek i zmniejszenie barwienia tła

Przeglądaj więcej filmów