Izolacja i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z podskórnych tkanek tłuszczowych świń

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z podskórnej białej tkanki tłuszczowej świni w celu oceny ich zdolności do różnicowania się w adipocyty, osteocyty i chondrocyty. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad otyłością. Stanowi ona przydatne narzędzie do odkrywania mechanizmów molekularnych zaangażowanych w regulację rozwoju tkanki tłuszczowej.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość pozyskania licznej populacji komórek stromalno-naczyniowych, co pozwala na szczegółową analizę biologii i różnicowania adypocytów. Znaczenie tej techniki przejawia się w badaniach nad terapią komórkami macierzystymi, ponieważ pochodzące z tkanki tłuszczowej świni komórki macierzyste wykazują wielipotencjalność w zakresie transróżnicowania do wielu linii komórkowych. Pracę należy rozpocząć od ułożenia prosięcia w pozycji brzusznej na czystym stole operacyjnym.

Wygolić całą sierść wzdłuż linii środkowej od szyi do ogona, a następnie trzykrotnie przemyć skórę grzbietową 7,5% roztworem povidonu jodowego. Po trzecim przemyciu pozostawić jod na powierzchni skóry na około 10 minut. Następnie spryskać skórę 70% etanolem.

Następnie użyj gazy nasączonej etanolem, aby przetrzeć skórę w jednym kierunku w celu usunięcia środka dezynfekującego, aż do momentu, gdy nie będzie już widoczny żaden wyraźny kolor. Następnie wykonaj nacięcie od okolicy szyi w dół w stronę nogi. Następnie, podtrzymując tłuszcz i skórę pęsetą, użyj skalpela, aby oddzielić grzbietową warstwę tłuszczu wieprzowego tkanek tłuszczowych podskórnych oraz przylegającą warstwę skóry od mięśni.

Natychmiast zanurz tkankę skóry i tłuszczu w wysterylizowanym zlewce o pojemności 200 ml zawierającej pożywkę DMEM bez surowicy w temperaturze 37°C i spryskaj zewnętrzną stronę zlewki 70% etanolem. Następnie umieść zlewkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli komórkowych, a obok zlewki połóż wysterylizowaną, trójwarstwową folię ochronną o wymiarach 40 × 30 cm. Przenieś tkankę na folię, kładąc ją stroną skóry do dołu.

Użyj pęsety i nożyczek, aby odciąć pozostałą tkankę mięśniową od tkanki tłuszczowej. Potnij tłuszcz na kwadratowe kawałki o wymiarach 7 by 7 cm, a następnie przenieś je do nowego, wysterylizowanego zlewka o pojemności 200 ml zawierającego DMEM bez surowicy w temperaturze 37 °C. Następnie umieść specjalnie dostosowany uchwyt do plastrów, wyposażony w ostrze z stali węglowej, na folii ochronnej i połóż jeden z kawałków tłuszczu na ostrzu warstwą tłuszczową do dołu.

Pokroić tłuszcz na kawałki o grubości około 1 mm, tak blisko skóry, jak to możliwe, ale nie przecinając jej. Następnie za pomocą nożyczek posiekać kawałki tkanki tłuszczowej tak drobno, jak to możliwe, i dodać je do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej przefiltrowane medium do trawienia uzupełnione kolagenazą. Inkubować kolbę z mieszaniem przez 90 minut przy 45 RPM, w inkubatorze orbitalnym w temperaturze 37 °C.

Gdy medium do trawienia przyjmie formę zawiesiny bez znaczących grudek tkanki, należy przerwać proces trawienia, dodając równą objętość medium hodowlanego DMEM F-12 z 10% FBS. Aby zebrać pochodzące z tkanki tłuszczowej świni komórki macierzyste, przefiltruj zawiesinę strawionej tkanki tłuszczowej przez pojedynczą warstwę szyfonu do sterylnej butelki serologicznej o pojemności 250 ml, używając pęsety do dociskania środka szyfonu, aby nakierować i ułatwić przepływ materiału. Odciśnij i wykręć szyfon pęsetą, aby zakończyć filtrację, a następnie rozdziel medium do czterech 50-mililitrowych stożkowych probówek wirówkowych.

Odwirować komórki naczyniowo-stromalne. Następnie zlać nadsącz, nie naruszając osadu, aby usunąć większość górnej warstwy tłuszczu zawierającej dojrzałe adipocyty. W dalszej kolejności zawiesić ponownie osad w 10 mililitrach DMEM, pipetując i delikatnie wstrząsając próbką.

Ponownie odwiruj komórki, a otrzymane osady zawieś w 10 mililitrach buforu lizującego ACK. Po siedmiu minutach w temperaturze pokojowej przerwij lizę erytrocytów, dodając do każdej probówki 10 mililitrów DMEM i delikatnie wstrząsając probówkami w celu wymieszania. Następnie ponownie odwiruj komórki.

Przemyj komórki jeszcze dwa razy 10 ml DMEM, a następnie połącz nadsączki, przeciskając je przez sitko o oczkach 100 µm do jednej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Delikatnie pipetuj zawiesinę komórkową kilka razy, aby równomiernie rozdzielić komórki, a następnie policz komórki metodą wykluczania błękitu trypanu. Na koniec wysiej świńskie komórki macierzyste pochodne z tkanki tłuszczowej z gęstością 6 × 10⁴ na cm² do odpowiednio dobranego naczynia hodowlanego w pożywce do hodowli komórkowej.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37°C i 5% CO2, aby wspomóc tworzenie monowarstwy. Morfologia świńskich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z frakcji naczyniowo-stromalnej tkanki tłuszczowej jest podobna do morfologii mysich lub ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej, z obserwowaną po 24 godzinach od wysiewu rozbudowaną morfologią przypominającą włókna. Świńskie komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej osiągają konfluencję w ciągu 72 godzin, po czym są gotowe do różnicowania w adipocyty lub inne komórki typu mezenchymalnego.

Komórki te wykazują również silny potencjał adipogenny po indukcji chemicznej, a dojrzałe adypocy można zaobserwować po dziewięciu dniach różnicowania, przy czym ponad 90% świńskich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej wykazuje różnicowanie adipogenne. Markery powierzchniowe mezenchymalnych komórek macierzystych, w tym CD 29, CD 44, CD 90 oraz MHC 1, są silnie eksponowane na świńskich komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej, podczas gdy CD 4a, CD 31, CD 45 i MHC II są ledwo wykrywalne, co dowodzi, że komórki te wykazują cechy typu mezenchymalnego bez znaczącej kontaminacji komórkami śródbłonkowej lub krwiotwórczej linii macierzystej. Ponadto zróżnicowane świńskie komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą zostać zidentyfikowane jako adypocy, osteocyty lub chondrocyty przy użyciu specyficznych barwników tkankowych, co wykazuje, że komórki pochodzące z frakcji naczyniowo-stromalnej zachowują wielopotencjalność typową dla progenitorów typu mezenchymalnego.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest stosowanie właściwej techniki aseptycznej w hodowli komórkowej oraz przeprowadzanie wszystkich etapów tak szybko, jak to możliwe, aby zmaksymalizować żywotność komórek. Po opanowaniu tej metody, przy prawidłowym wykonaniu techniki, komórki można pobrać od dwóch do trzech świń w ciągu sześciu godzin.

Ta standardowa technika utorowała drogę badaczom otyłości w dziedzinie cukrzycy do zbadania przełączników molekularnych, takich jak czynniki transkrypcyjne kontrolujące różnicowanie adipocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej świni oraz ocenę zdolności tych komórek do różnicowania się w adipocyty, osteocyty i chondrocyty.