Name: Immunomagnetyczna separacja komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 specyficznych dla Fat Depot (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj metodę immunomagnetycznej separacji komórek macierzystych Sca1 z tkanki tłuszczowej myszy. Technika ta umożliwia izolację i wzbogacenie ASC z różnych depozytów tłuszczowych do badań regeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez NIH DK095137 (do THC). Dziękujemy obecnym i byłym członkom laboratorium, którzy przyczynili się do rozwoju i udoskonalenia opisanych metod.

Oświadczenie etyczne: Komitet Uniwersytetu Michigan ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami (UCUCA) zatwierdził wszystkie metody i protokoły zgodnie z Przewodnikiem po Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Laboratoryjnych (Instytut Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi, Krajowa Rada ds. Badań). Myszy są trzymane w wiwarium Uniwersytetu Michigan i mają swobodny dostęp do pożywienia i wody oraz są utrzymywane w 12-godzinnym cyklu ciemności / światła.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Przygotuj podstawowe pożywki hodowlane z DMEM, 10% FBS, 1x P/S/G i 1x antybiotykami/lekami przeciwgrzybiczymi. Zostanie to wykorzystane do utrzymania tkanek przed trawieniem. Umieścić bulion i podwielokrotność w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować pięć mililitrów roztworu kolagenazy typu III o stężeniu 5 mg/ml rozpuszczonego w HBSS (+Ca, +Mg) dla każdego rodzaju izolowanej poduszeczki tłuszczowej, do pięciu myszy. Na przykład, izolując SQ i VIS z jednego genotypu, należy przygotować 10 ml, a w przypadku typu dzikiego i zmutowanego SQ i VIS należy zrobić 20 ml. Dostosuj pH do 7,4 i sterylny filtr. Podwielokrotność rozlać na probówki o pojemności 50 ml. Odstawić z dala od światła.</li>
	<li>Użyj 70% etanolu do dezynfekcji pola operacyjnego. Wytrzyj i przykryj niebieską podkładką. Spryskaj niebieską podkładkę odrobiną etanolu.</li>
	<li>Za pomocą igieł 22 G przymocuj chłonną podkładkę do płyty styropianowej i przytnij nożyczkami. Spryskaj podkładkę etanolem, a następnie połóż deskę na niebieskiej podkładce i przykryj inną niebieską podkładką, aż do rozpoczęcia sekcji.</li>
	<li>Napełnij dwie probówki o pojemności 50 ml etanolem i umieść na stojaku przylegającym do pola operacyjnego. Umieść nożyczki i kleszcze w etanolu.</li>
	<li>Napełnij kolejną probówkę o pojemności 50 ml PBS plus 1x anty-anti do spłukiwania etanolu z narzędzi chirurgicznych.</li>
	<li>W kapturze oznacz szalki o średnicy 60 mm dla każdego rodzaju tkanki i napełnij je pożywką hodowlaną ogrzaną do 37 °C. Umieść płytki w pobliżu pola operacyjnego.</li>
</ol>
2. Izolacja podskórnych (SQ) poduszek tłuszczowych
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez przedawkowanie izofluranu i odmy opłucnowej.</li>
	<li>Delikatnie spryskaj mysz 70% etanolem i połóż się na wznak. Przypnij łapy do piankowej tablicy za pomocą igieł 22 G.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie w skórze dolnej części brzucha. Trzymając górną część nacięcia kleszczami, weź nożyczki i oddziel skórę od otrzewnej.</li>
	<li>Po oddzieleniu skóry od otrzewnej od brzucha do klatki piersiowej, odbij skórę od otrzewnej w kierunku głowy, wykonując boczne nacięcia w skórze wzdłuż boku ciała.</li>
	<li>Odbij pozostałą skórę trzymającą tłuszcz pachwinowy z dala od ciała i przypnij do deski za pomocą igieł 22 G.</li>
	<li>Przełącz się na cienkie nożyczki i kleszcze. Chwyć pachwinową poduszeczkę tłuszczową kleszczami w miejscu początkowym w pobliżu otrzewnej i odetnij między skórą a tłuszczem pachwinowym postępującym w kierunku pachwiny, unikając zanieczyszczenia SQ skórą.</li>
	<li>Umieść nasłonecznioną pachwinową poduszkę tłuszczową w oznaczonym naczyniu o średnicy 60 mm.</li>
</ol>
3. Izolacja poduszek tłuszczowych trzewnych (VIS)
<ol>
	<li>W podobny sposób jak w kroku 2.5 rozetnij otrzewną, aby odsłonić trzewne poduszeczki tłuszczowe i jelita.</li>
	<li>Odsuń jelito w kierunku klatki piersiowej.</li>
	<li>Chwyć poduszkę tłuszczową VIS na dystalnym końcu i delikatnie pociągnij do góry. Wypreparuj poduszeczkę tłuszczową VIS, uważając, aby wykluczyć tkankę najądrza (lub macicy, jeśli używasz samic myszy).</li>
	<li>Umieść w oznaczonym naczyniu i powtórz krok 3.3 dla pozostałej podkładki VIS.</li>
</ol>
4. Trawienie kolagenazy w poduszeczkach tłuszczowych
<ol>
	<li>Przenieś szalki o średnicy 60 mm do okapu do hodowli tkankowej i odessaj pożywkę.</li>
	<li>Zmiel poduszeczki tłuszczowe zakrzywionymi nożyczkami, a następnie dodaj do roztworu kolagenazy. Pamiętaj, aby opłukać nożyczki i kleszcze między typami tkanek etanolem i PBS.</li>
	<li>Wstrząsać z prędkością 300 obr./min i w temperaturze 37 ºC przez 10-20 minut, aż tkanki zostaną strawione. Dopuszczalne jest, jeśli niektóre fragmenty SQ są nadal widoczne. Kwestia ta zostanie rozwiązana w późniejszym kroku.</li>
	<li>Dodać 25 ml pożywki hodowlanej do roztworu kolagenazy, aby zatrzymać leczenie kolagenazą, a następnie 10 razy pipetować w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aby rozproszyć strawione tkanki.</li>
	<li>Odcedź komórki za pomocą sitka o wielkości 100 μm. Wirować przez 10 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Ostrożnie zdekantować pożywkę, aby nie naruszyć osadu i dodać 5 ml sterylnej wody do osadu i delikatnie pipetą, aby zawiesić komórki. Odczekaj 2 minuty na lizę erytrocytów.</li>
	<li>Dodaj 25 ml pożywki z 10% FBS i przecedź komórki przez nowe sitko do komórek o średnicy 100 μm.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut przy 300 x g. Zdekantować pożywkę i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru za pomocą błękitu trypanowego 1:1.</li>
	<li>Płytka 1 x 10 6 komórek w jednym dołku na płytce 6-dołkowej.</li>
</ol>
5. Magnetyczna separacja komórek
<ol>
	<li>Po około 4 do 6 godzinach adhezji komórek należy dwukrotnie przepłukać komórki HBSS (-Ca, -Mg). Dysocjuj przylegające komórki za pomocą 0,05% trypsyny. Rozcieńczyć zawiesinę komórek trypsyny w 1 ml buforu separacyjnego i wirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g.</li>
	<li>Aspirowany supernatant. Zawieś komórki w buforze 500 μl. Usunąć podwielokrotność 10 μl i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Wiruj komórki przez 5 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Całkowicie odessać supernatant. Zawieś komórki w buforze 90 μl. Dodać 10 μl przeciwciała pierwszorzędowego anty-Sca1-FITC. Dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki 1 ml buforu i odwirować komórki przez 5 minut przy 300 x g. Całkowicie usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawieś komórki w buforze o objętości 80 μl. Dodaj 20 μl mikrogranulek anty-FITC. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki 1 ml buforu i odwirować komórki przez 5 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze o pojemności 500 μl.</li>
	<li>Umieścić kolumnę w uchwycie magnetycznym i przepłukać kolumnę buforem o pojemności 500 μl.</li>
	<li>Dodaj zawieszenie komórki do kolumny. Podczas pipetowania należy unikać pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Zebrać nieznakowane komórki Sca1 i przemyć kolumnę 3 razy buforem o pojemności 500 μl. Nowy bufor należy dodawać tylko wtedy, gdy zbiornik jest pusty. Podczas pipetowania należy unikać pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę z uchwytu magnetycznego i umieść w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu do kolumny i wymyć Sca1+, przepychając dostarczony tłok przez zbiornik kolumny.</li>
	<li>Odwirowywać frakcje komórkowe przez 5 minut przy 300 x g. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Usunąć 10 μl podwielokrotności z oznakowanych i nieznakowanych frakcji i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Umieść każdą frakcję komórkową w 1 dołku na płytce 6-dołkowej.</li>
</ol>
6. Weryfikacja immunomagnetycznej separacji ACSo wysokim poziomie Sca1 za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przepłucz komórki dwukrotnie HBSS (-Ca, -Mg) i dysocjuj komórki za pomocą 0,05% trypsyny.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej i policzyć za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Otrzymać >106 komórek w 1 ml pożywki hodowlanej i odwirować przy 300 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i powtórzyć krok 6.3 jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml 2% surowicy koziej + 2% BSA i blokować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usuń roztwór blokujący.</li>
	<li>Dodaj szczurzą IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 μg, 1:400) lub anty-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 μg, 1:400) w 100 μl PBS z 2% surowicą kozią i 2% BSA + PBS w temperaturze 4 °C przez 30 min w ciemności.</li>
	<li>Dodaj 1 ml zimnego PBS do komórek. Wirować 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i powtórzyć krok 6.9 jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS. Przepuścić zawiesiny komórek przez sitko do komórek o wielkości 100 μm w celu przygotowania do analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

<ol><li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pericellular+collagenase+directs+the+3-dimensional+development+of+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue.</a> Cell. 125 (3), 577-591 (2006).</li>
<li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+link+between+obesity+and+MMP14-dependent+adipogenic+collagen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover.</a> Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).</li>
<li>Chun, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peri-adipocyte+ECM+remodeling+in+obesity+and+adipose+tissue+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis.</a> Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).</li>
<li>Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+adipose+tissue+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and adipose tissue dysfunction.</a> Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).</li>
<li>Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Science. 241, 58-62 (1988).</li>
<li>Welm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sca-1%28pos%29+cells+in+the+mouse+mammary+gland+represent+an+enriched+progenitor+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population.</a> Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).</li>
<li>Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origin+of+fat%3A+tracking+obesity+to+its+source%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental origin of fat: tracking obesity to its source.</a> Cell. 131 (2), 242-256 (2007).</li>
<li>Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+fat+progenitor+cells+reside+in+the+adipose+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature.</a> Science. 322, 583-586 (2008).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1%28high%29+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).</li>
<li>Chun, T. H., Inoue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+adipocyte+differentiation+and+peri-adipocyte+collagen+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover.</a> Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ready-to-use%2C+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li>
<li>Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ly-6A+%28Sca-1%29+GFP+Transgene+is+Expressed+in+all+Adult+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).</li>
<li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).</li>
<li>Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+depot-specific+activation+of+adipocyte+precursor+cells+at+the+onset+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).</li>
<li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis%3B+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Specific+Cell-Surface+Markers+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Subcutaneous+and+Visceral+Fat+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym artykule demonstrujemy izolację i immunomagnetyczną separację komórek mysich ASC z różnych poduszek tłuszczowych oraz ich zastosowanie w eksperymentach in vitro . Przedstawiona metoda jest skuteczna w szybkiej izolacji dużej liczby Sca1-dodatnich ASC, co jest korzystne w porównaniu z technicznie skomplikowaną i kosztowną izolacją ASCs za pośrednictwem FACS9,14. W przeciwieństwie do FACS, immunomagnetyczna separacja komórek nie pozwala na użycie wielu antygenów do identyfikacji docelowej p...

Antygen komórek macierzystych 1 (Sca1 lub Ly6A/E) został po raz pierwszy zidentyfikowany jako marker powierzchni komórki wyrażany przez hematopoetyczne i mezenchymalne komórki macierzyste5,6. Frakcja naczyniowa zrębu (SVF) tkanki tłuszczowej uzyskana z magazynów tłuszczu myszy to niejednorodna populacja komórek składająca się z fibroblastów, makrofagów, komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, komórek neuronalnych i komórek progenitorowych adipocytów7. Komórki progenitorowe adipocytów lub komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) to komórki nieobciążone lipidami, które znajdują się w bogatej w kolagen okołonaczyniowej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)8. Około 50% SVF składa się z ASC, które są scharakteryzowane jako lineage-ujemne (Lin-) i CD29+: CD34+: Sca1+ 9. Większość z tych komórek to Sca1+: CD24- progenitory adipocytów, które są zdolne do różnicowania adipocytów in vitro; jednak tylko frakcja komórek (0,08% SVF) stanowi Sca1+: komórki CD24+, które są w pełni zdolne do proliferacji i różnicowania się w adipocyty w warunkach in vivo 9. Pomimo potencjalnego zastrzeżenia dotyczącego stosowania Sca1 + SVF bez rozróżniania komórek CD24 + od komórek CD24-, izolowanie Sca1 + ASC z magazynów tłuszczu za pomocą immunomagnetycznej separacji komórek jest skutecznym i praktycznym podejściem do określenia autonomicznego fenotypu komórek progenitorowych pierwotnych adipocytów.
W dziedzinie otyłości i cukrzycy, zwłóknienie tkanek i stan zapalny odgrywają kluczową rolę w rozwoju i utrzymaniu cukrzycy typu 23. Ostatnio Tokunaga i wsp. wykazały, że komórkio wysokim poziomie Sca1 wyizolowane z pachwinowych (lub podskórnych, SQ) i okołogoadalnych (lub trzewnych, VIS) magazynów tłuszczu C57BL6 / J wykazują różne sygnatury genów i przebudowę ECM in vitro10. MMP14 (MT1-MMP), prototypowy członek rodziny metaloproteinaz macierzy błonowych (MMP), pośredniczy w rozwoju białej tkanki tłuszczowej (WAT) poprzez swoją aktywność kolagenolityczną1.
Przykłady eksperymentów, które mogą być przeprowadzone na komórkach wyizolowanych i wzbogaconych za pomocą następującego protokołu, obejmują hodowlę trójwymiarową, badania różnicowania, testy degradacji kolagenu i sekwencjonowanie RNA10,11. Testy degradacji należy przeprowadzać z kolagenem ekstrahowanym kwasem, aby zapewnić zachowanie telopeptydu11,12. Poniższy protokół zademonstruje metody izolowania pierwotnych komórek zrębu naczyniowego z różnych magazynów tłuszczu i wzbogacania komórek progenitorowych adipocytów za pomocą immunomagnetycznej separacji komórek. Ważność sortowania komórek zostanie oceniona za pomocą cytometrii przepływowej i przy użyciu myszy Sca1-GFP, które wyrażają GFP w komórkach Sca1 +, napędzanych przez promotor Sca1 13.

<table><tbody><tr><td>Typ 3 Kolagenaza</td><td>Worthington Biochemiczna</td><td>LS004182</td><td>Trawienie tkankowe</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Pożywka hodowlana o wysokiej zawartości glukozy</td></tr><tr><td>Pióro/Paciorkowiec/Glutamina (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Podłoże antybiotykowe</td></tr><tr><td>Anty-anty (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Pożywka przeciwgrzybicza</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7,4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Sitko komórkowe</td><td>BD Bioscience</td><td>352360</td><td>100-&mu; m Sitko komórkowe</td></tr><tr><td>Płytki 60 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>Duże</td></tr><tr><td>nożyczki</td><td>FST</td><td>14091-11</td><td>Drobna, zakrzywiona końcówka</td></tr><tr><td>Kleszcze duże</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze drobne</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igły 25G 5/8"</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Igły 22G 1,5"</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Kolumny</td> separacyjne BD Falcon <td>352098</td><td></td></tr><tr><td>MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw mikrokulek anty-Sca1 (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anty-Sca1 1&ordm; Mikrokulki Ab i anty-FITC 2&ordm; </td></tr><tr><td>Bufor biegowy Ab AutoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Separator MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Niebieskie podkładki chux</td><td>Fisher</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki chłonne</td><td>Fisher</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>Płyta styropianowa</td><td></td><td></td><td>Stosować z probówek o pojemności 50 ml</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Dowolny sprzedawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczur IgG2a Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr><tr><td>Szczur IgG2a anty-mysi Sca1 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr><tr><td>Szczur IgG2a R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>R2a04</td><td></td></tr><tr><td>Szczur IgG2a anty-mysz F4/80 R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>Rura okrągłodenna</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (&ndash; Ca, &ndash; Mg)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca, +Mg)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Do roztworu kolagenazy</td></tr><tr><td>Kolagen typu I (2,7 mg/ml w 37 mm kwasie octowym</td><td>Przygotuj w domu12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0,34 N NaOH</td><td>Przygotuj we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kwas karboksylowy, ester sukcynimidylowy, mieszane izomery</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0,89 M NaHCO3&nbsp; </td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

immunomagnetyczna separacja komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (asc) sca1 specyficznych dla fat depot

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

Izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) jest ważną metodą w dziedzinie biologii tkanki tłuszczowej, adipogenezy i przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). In vivo, bogate w ECM środowisko składające się z kolagenów fibrylarnych zapewnia strukturalne wsparcie dla tkanki tłuszczowej podczas progresji i regresji otyłości. Fizjologiczna przebudowa ECM, w której pośredniczą metaloproteinazy macierzy (MMP), odgrywa główną rolę w regulacji wielkości i funkcji tkanki tłuszczowej1,2. Utrata fizjologicznej kolagenolitycznej remodelingu ECM może prowadzić do nadmiernej akumulacji kolagenu (zwłóknienie tkanek), infiltracji makrofagów, a ostatecznie do utraty homeostazy metabolicznej, w tym insulinooporności3,4. Gdy w modelach mysich ukierunkowanych na gen obserwuje się zmianę fenotypową tkanki tłuszczowej, wyizolowanie pierwotnych ASC z magazynów tłuszczu do badań in vitro jest skutecznym podejściem do określenia roli określonego genu w regulacji funkcji ASC. Poniżej definiujemy immunomagnetyczną separację ASCo wysokim poziomie Sca1.

Wzbogacanie ASCs Sca1high z różnych poduszek tłuszczowych.
Komórki z gleby naczyniowej wyizolowane z tkanki tłuszczowej podskórnej (SQ) wykazują wydłużony kształt przypominający fibroblasty, niezależnie od poziomu ekspresji Sca1 (Rycina 1A). Z kolei komórki Sca1high i Sca1low z tkanki tłuszczowej trzewnej (VIS, pochodne eWAT) wykazują wyraźną różnicę w kształcie komórek. Podobnie...

Prezentujemy techniki wymagane do wyizolowania zrębowej frakcji naczyniowej (SVF) z mysich pachwinowych (podskórnych) i okołogonadalnych (trzewnych) magazynów tkanki tłuszczowej w celu oceny ich ekspresji genów i aktywności kolagenolitycznej. Metoda ta obejmuje wzbogacanie komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 za pomocą immunomagnetycznej separacji komórek.

Immunomagnetyczna separacja komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 specyficznych dla Fat Depot

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych wykazujących ekspresję Sca1 z różnych podskórnych zapasów tłuszczu myszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki zastosowaniu sortowania komórek opartego na koralikach immunomagnetycznych można skutecznie wzbogacić populację komórek macierzystych pochodzenia tłuszczowego z różnych depotów tłuszczowych na potrzeby dalszych eksperymentów. Zazwyczaj badacze rozpoczynający pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ siła i czas trwania trawienia tkanki kolagenazą muszą zostać zoptymalizowane, aby uzyskać odpowiednią liczbę komórek do sortowania.Aby wyizolować tkankę tłuszczową podskórną, należy umieścić mysz w pozycji grzbietowej na piankowej desce sekcyjnej i spryskać zwierzę 70% ethanol. Po przymocowaniu łap do deski, należy wykonać niewielkie nacięcie skóry w dolnej części brzucha. Następnie, chwytając górną krawędź nacięcia pęsetą, należy za pomocą nożyczek oddzielić skórę i otrzewną od brzucha aż do klatki piersiowej.Wykonując nacięcia poprzeczne skóry wzdłuż boku ciała, odchyl skórę od otrzewnej w kierunku głowy. Następnie odsun pozostałą skórę, odciągając tłuszcz pachwinowy od ciała, i za pomocą igieł o rozmiarze 22 G przypnij skórę do podkładki. W kolejnym kroku, używając pęsety, chwyć jedną poduszkę tłuszczu pachwinowego u jej nasady w pobliżu otrzewnej, a następnie za pomocą drobnych nożyczek przecinaj tkankę między skórą a tłuszczem pachwinowym, przesuwając się w stronę pachwiny, unikając zanieczyszczenia podskórnej poduszki tłuszczowej skórą.Następnie wyizolowaną podskórną tkankę tłuszczową z pachwiny umieść w opisanej jako SQ szalce o średnicy 60 mm zawierającej pożywkę hodowlaną o temperaturze 37 °C, a następnie w ten sam sposób pobierz tkankę tłuszczową z pachwiny z drugiej strony ciała zwierzęcia. Aby wyizolować trzewną tkankę tłuszczową, przetnij otrzewną, aby odsłonić trzewną tkankę tłuszczową i jelita. Następnie odsuń jelita w stronę klatki piersiowej.Chwyć podskórną tkankę tłuszczową za jej dystalny koniec, delikatnie pociągnij tkankę tłuszczową do góry i wypreparuj ją, uważając, aby nie dołączyć tkanki najądrza. Następnie umieść tkankę tłuszczową w 60 mm szalce oznakowanej jako VIS, zawierającej pożywkę hodowlaną o temperaturze 37 °C. Po zebraniu wszystkich fragmentów tkanki tłuszczowej przenieś szalki do komory z laminarnym przepływem powietrza i odessij pożywkę.Za pomocą zakrzywionych nożyczek rozdrobnij poduszeczki tłuszczowe. Następnie przenieś kawałki tłuszczu do poszczególnych probówek o pojemności 50 ml zawierających świeżo przygotowaną kolagenazę. Następnie inkubuj probówki wstrząsając je przy 300 RPM w temperaturze 37 °C przez 10 do 20 minut, aż tkanki zostaną strawione.Niektóre fragmenty tkanki podskórnej poduszki tłuszczowej mogą być nadal widoczne. Do roztworu kolagenazy należy dodać 20 ml pożywki hodowlanej, aby zatrzymać proces trawienia, a następnie za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml 10 razy aspirować i wydmuchiwać zawiesinę tkankową, aby całkowicie rozdzielić strawione tkanki. Komórki należy przefiltrować przez sita komórkowe o oczkach 100 µm, a następnie poddać tkanki wirowaniu.Następnie ostrożnie odlej pożywkę, dbając o to, aby nie naruszyć osadów, i delikatnie resuspenduj obie grupy komórek w pięciu mililitrach sterylnej wody. Odczekaj dwie minuty do czasu lizy erytrocytów. Następnie zatrzymaj reakcję w każdej probówce, dodając 25 mililitrów pożywki uzupełnionej o FBS.Przefiltruj obie populacje adipocytów przez nowe sitka komórkowe o oczkach 100 µm, ponownie je odwiruj, a następnie resuspenduj osady w 1–3 mL pożywki. Po zliczeniu komórek metodą wykluczania błękitu trypanu, wysiej oddzielnie 1×10⁶ komórek z tkanki tłuszczowej podskórnej oraz komórek z tkanki tłuszczowej trzewnej do poszczególnych studzienek 6-dołkowej płytki hodowlanej. Po trypsynizacji komórek rozcieńcz trypsynę 1 mL buforu separacyjnego, a następnie odwiruj płytki hodowlane.Komórki zawieszamy w 500 µL buforu separacyjnego na probówkę i ponownie wirujemy. Następnie komórki resuspendujemy w 90 µL buforu separacyjnego na probówkę i dodajemy do zawiesiny komórkowej 10 µL przeciwciała pierwszorzędowego anty-Sca1 FITC. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze 4 °C w ciemności komórki przemywamy 1 ml buforu separacyjnego na probówkę.Po wirowaniu komórki resuspensuje się w 80 µL buforu separacyjnego na każdą zawiesinę komórkową. Następnie do każdej studni dodaje się 20 µL mikrokulek Anti-FITC, a płytki inkubuje w temperaturze 4 °C, w ciemności, przez 15 minut. Po zakończeniu inkubacji komórki przemywa się w 1 mL buforu separacyjnego, a następnie resuspensuje w 500 µL świeżego buforu na probówkę.Następnie umieść kolumnę w uchwycie magnetycznym i przepłucz ją 500 µL buforu separacyjnego. Przenieś komórki z hodowli tkankowej podskórnej tkanki tłuszczowej na kolumnę, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza, a nieoznakowane komórki Sca1 ujemne zbierz do 15 ml probówki stożkowej. Po przejściu wszystkich komórek przemyj kolumnę trzykrotnie 500 µL buforu separacyjnego.Następnie przenieś kolumnę z magnesu do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów i przepuść jeden mililitr świeżego buforu separacyjnego przez kolumnę, aby eluować komórki Sca1 dodatnie. Na koniec odwirowuj obie frakcje komórek Sca1 dodatnich i ujemnych, a otrzymane osady resuspenduj w jednym mililitrze pożywki hodowlanej. Następnie policz liczbę komórek w każdej frakcji i wysiej je do oddzielnych studni nowej sześciostudzienkowej płytki hodowlanej.Komórki zrębowe naczyń izolowane z tkanki tłuszczowej podskórnej wykazują fibroblastopodobny, wydłużony kształt niezależnie od poziomu ekspresji Sca1. Podobnie jak komórki Sca1 high pochodzące z tkanki tłuszczowej podskórnej pachwinowej, komórki Sca1 high pochodzące z tkanki tłuszczowej trzewnej nadjądrzowej wykazują wydłużony, fibroblastopodobny kształt. Natomiast komórki VIS Sca1 low wykazują kształt nabłonkowy.Komórki o wysokiej ekspresji Sca1 wyizolowane z myszy Sca1-GFP są łatwo identyfikowalne jako komórki GFP-dodatnie w hodowli tkankowej. Rzeczywiście, podczas oceny tych komórek metodą cytometrii przepływowej potwierdzono, że większość komórek GFP-dodatnich wykazuje ekspresję białek Sca1 na powierzchni komórkowej, co wykryto za pomocą przeciwciała anty-Sca1. W połączeniu z analizami RT-PCR można wykazać różnicową ekspresję kolagenolitycznych metaloproteinaz macierzy pomiędzy komórkami macierzystymi pochodzenia tłuszczowego o wysokiej ekspresji Sca1 pochodzącymi z tkanki tłuszczowej pachwinowej i nadjajowodowej.Ponadto, gdy żele kolagenu typu I znakowane fluoresceiną są wykorzystywane do oceny aktywności degradacji pericelularnej, obserwuje się wyraźnie zwiększoną aktywność przebudowy kolagenu pośredniczoną przez trzewne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej o wysokiej ekspresji Sca1. Po opanowaniu techniki izolacja komórek z tkanki tłuszczowej może zostać ukończona w ciągu dwóch godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby dbać o czystość i organizację pola operacyjnego, co zapewni wydajną izolację tkanki tłuszczowej.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak test degradacji kolagenu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące przebudowy tkanki pośredniczonej przez komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie otyłości i biologii macierzy do badania roli komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w przebudowie i funkcjonowaniu tkanki tłuszczowej u myszy i ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak pozyskiwać i wzbogacać pierwotne komórki Sca1-dodatnie z depotów tkanki tłuszczowej.

immunomagnetic-separation-fat-depot-specific-sca1high-adipose-derived

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych pochodzących z grzebienia nerwowego (ADSC) z mysiej tkanki tłuszczowej łuku okołoaortalnego. Po wyizolowaniu NCADSC są wykrywane, sortowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, a następnie hodowane na płytce, co sprzyja proliferacji komórek.

Izolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy okołoortowej

W 2001 roku naukowcy z UCLA opisali izolację populacji dorosłych komórek macierzystych, określanych jako komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC. W tym artykule przedstawiono izolację ASC z lipoaspiratów przy użyciu ręcznego, enzymatycznego protokołu trawienia z użyciem kolagenazy.

Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów

Niejednorodność transkrypcyjna w ludzkich komórkach zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej może być zdefiniowana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą markerów powierzchni komórki i genów osteogennych.  Opisujemy protokół wykorzystujący cytometrię przepływową do izolacji subpopulacji komórek o zwiększonym potencjale osteogennym, który może być wykorzystany do poprawy rekonstrukcji szkieletu twarzoczaszki.

Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Ten protokół zapewnia bezenzymatyczną metodę izolowania mezenchymalnych komórek macierzystych z próbek abdominoplastyki i lipoaspiratu przy użyciu metody eksplantatu. Brak ostrych enzymów lub etapów wirowania zapewnia klinicznie istotne komórki macierzyste, które można wykorzystać do badań in vitro lub przenieść z powrotem do kliniki.

Bezenzymatyczna metoda izolacji i namnażania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Prezentujemy prostą metodę izolowania wysoce żywotnych komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z najądrzy myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodologię izolacji ADSC, co skutkuje ogromną wydajnością komórkową z zyskiem czasu w porównaniu z literaturą. Badanie to dostarcza również prostej metody uzyskiwania stosunkowo dużej liczby żywotnych komórek po długotrwałej krioprezerwacji.

Technika otrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i charakterystyka frakcji naczyniowej zrębu w długoterminowej kriokonserwacji

Produkty ksenogeniczne (chemiczne lub pochodzenia zwierzęcego) wprowadzone do etapów przygotowania/manipulacji terapii komórkowej są związane ze zwiększonym ryzykiem reaktywności immunologicznej i transmisji patogennej u pacjentów gospodarza. W tym artykule opisano całkowicie wolną od ksenogenów metodę izolacji i ekspansji in vitro ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.

Izolacja i hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej za pomocą innowacyjnej metody wolnej od ksenogenu w terapii u ludzi

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

Ten protokół opisuje wszystkie procedury, od hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i pobierania supernatantu po ekstrakcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą ultrawirowania.

Oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Przedstawiamy tutaj standardową metodę efektywnej izolacji komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu i adipocytów, charakteryzującą się skróceniem czasu przetwarzania o &gt;90%, wysoką żywotnością komórek oraz szeroką kompatybilnością.

Efektywna izolacja komórek macierzystych i adipocytów pochodzących z tłuszczu z tkanki tłuszczowej wieprzi

Poznaj metodę immunomagnetycznej separacji komórek macierzystych Sca1 z tkanki tłuszczowej myszy. Technika ta umożliwia izolację i wzbogacenie ASC z różnych depozytów tłuszczowych do badań regeneracyjnych.

Immunomagnetyczna separacja komórek macierzystych owysokiej zawartości tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 specyficznych dla Fat Depot (Wideo) | JoVE Journal

Immunomagnetyczna separacja komórek macierzystych o^{wysokiej zawartości} tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 specyficznych dla Fat Depot

Przeglądaj więcej filmów