Immunomagnetyczna separacja komórek macierzystych o^{wysokiej zawartości} tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 specyficznych dla Fat Depot

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie mezenchymalnych komórek macierzystych Sca1 dodatnich z różnych poduszek tłuszczowych myszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki zastosowaniu sortowania komórek na bazie kulek immunomagnetycznych, komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej z różnych magazynów tłuszczu mogą być skutecznie wzbogacane do kolejnych eksperymentów. Ogólnie rzecz biorąc, badacze nowi w tej metodzie będą mieli trudności, ponieważ siła i czas trwania trawienia tkanek za pośrednictwem kolagenazy powinny być zoptymalizowane, aby uzyskać odpowiednią liczbę komórek do sortowania.

Aby wyizolować podskórne poduszeczki tłuszczowe, zacznij od umieszczenia myszy na piankowej desce preparacyjnej w pozycji leżącej na plecach i spryskania zwierzęcia 70% etanolem. Po przymocowaniu łap do deski wykonaj małe nacięcie w skórze dolnej części brzucha. Następnie, chwytając wierzchołek nacięcia kleszczami, użyj nożyczek, aby oddzielić skórę i otrzewną od brzucha do klatki piersiowej.

Wykonywanie bocznych nacięć w skórze, wzdłuż boku ciała, odbija skórę od otrzewnej w kierunku głowy. Następnie odciągnij pozostałą skórę, trzymając tłuszcz pachwinowy z dala od ciała i użyj igieł o rozmiarze 22, aby przypiąć skórę do deski. Następnie użyj kleszczy, aby chwycić jedną pachwinową poduszkę tłuszczową u jej początku w pobliżu otrzewnej i użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć między skórą a tłuszczem pachwinowym, postępując w kierunku pachwiny i unikając zanieczyszczenia podskórnej poduszeczki tłuszczowej skórą.

Następnie umieść izolowaną pachwinową poduszeczkę tłuszczową w 60-milimetrowym naczyniu z oznaczeniem SQ, zawierającym pożywkę hodowlaną o temperaturze 37 stopni Celsjusza i w ten sam sposób zbierz pachwinową poduszkę tłuszczową z drugiej strony zwierzęcia. Aby wyizolować trzewne poduszeczki tłuszczowe, przetnij otrzewną, aby odsłonić trzewne poduszeczki tłuszczowe i jelita. Następnie przesuń jelito na bok, w kierunku klatki piersiowej.

Chwytając trzewną poduszeczkę tłuszczową na dystalnym końcu, delikatnie pociągnij za tkankę tłuszczową i wypreparuj ją, uważając, aby wykluczyć tkankę najądrza. Następnie umieść poduszeczkę tłuszczową w 60-milimetrowym naczyniu z oznaczeniem VIS zawierającym pożywkę hodowlaną o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zebraniu wszystkich poduszek tłuszczowych przenieś szalki do okapu do hodowli tkankowych i odessaj pożywkę.

Użyj zakrzywionych nożyczek, aby zmielić opuszki. Następnie dodaj kawałki tłuszczu do pojedynczych 50-mililitrowych probówek zawierających świeżo przygotowaną kolagenazę. Następnie potrząsaj probówkami z prędkością 300 obr./min i 37 stopni Celsjusza przez 10 do 20 minut, aż tkanki zostaną strawione.

Niektóre fragmenty podskórnej tkanki poduszeczki tłuszczowej mogą być nadal widoczne. Dodaj 20 mililitrów pożywki hodowlanej do roztworu kolagenazy, aby zatrzymać trawienie, i użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej do odessania i dozowania zawiesiny tkankowej 10 razy, aby całkowicie zdysocjować strawione tkanki. Przefiltruj komórki przez sitka o średnicy 100 mikronów i odwiruj tkanki.

Następnie ostrożnie zdekantować pożywkę, uważając, aby nie naruszyć granulek, i delikatnie ponownie zawiesić obie grupy komórek w pięciu mililitrach sterylnej wody. Poczekaj dwie minuty, aż erytrocyty zostaną zrandomizowane. Następnie zatrzymaj reakcję w każdej probówce za pomocą 25 mililitrów pożywki uzupełnionej FBS.

Przefiltruj obie populacje adipocytów przez nowe sitka do komórek o wielkości 100 mikronów, ponownie je odwiruj, a następnie ponownie zawieś granulki w jednym do trzech mililitrów pożywki. Po zliczeniu przez wykluczenie błękitu trypanowego, oddzielnie rozłożyć płytki jeden razy dziesięć do szóstych podskórnych komórek poduszeczki tłuszczowej i komórek trzewnych do indywidualnych dołków sześciodołkowej płytki do hodowli komórek. Po trypsynizacji komórek rozcieńczyć trypsynę jednym mililitrem buforu separacyjnego, a następnie odwirować płytki hodowlane.

Zawieszamy komórki w 500 mikrolitrach na probówkę buforu separacyjnego i ponownie odwirowujemy komórki. Teraz ponownie zawieś komórki w 90 mikrolitrach na probówkę buforu separacyjnego i wymieszaj 10 mikrolitrów pierwotnego przeciwciała anty-Sca1 FITC z zawiesiną komórki. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności umyć komórki jednym mililitrem buforu separacyjnego na probówkę.

Po wirowaniu komórki są ponownie zawieszane w 80 mikrolitrach buforu separacyjnego na zawiesinę komórki. Następnie wymieszaj 20 mikrolitrów mikrogranulek anty-FITC z każdym dołkiem i umieść płytki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chronione przed światłem przez 15 minut. Pod koniec inkubacji umyć komórki w jednym mililitrze buforu separacyjnego i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach świeżego buforu na probówkę.

Teraz umieść kolumnę w uchwycie magnetycznym i przepłucz kolumnę 500 mikrolitrami buforu separatonowego. Przenieś komórki z podskórnej hodowli tkanki tłuszczowej do kolumny, uważając, aby uniknąć pęcherzyków, i zbierz nieznakowane komórki ujemne Sca1 w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Gdy wszystkie komórki przejdą, przemyć kolumnę trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu separacyjnego.

Następnie przenieś kolumnę z magnesu do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i zanurz jeden mililitr świeżego buforu separacyjnego przez kolumnę, aby wymyć komórki dodatnie Sca1. Na koniec odwiruj zarówno dodatnie, jak i ujemne frakcje komórek Sca1 i ponownie zawieś granulki w jednym mililitrze pożywki hodowlanej. Następnie policz liczbę komórek w każdej frakcji i umieść frakcje w indywidualnych studzienkach nowej sześciodołkowej płytki do hodowli komórek.

Komórki zrębu naczyniowego wyizolowane z podskórnej tkanki tłuszczowej wykazują podobny do fibroblastów, rozciągnięty kształt komórek, niezależnie od poziomu ekspresji Sca1. Podobnie jak podskórne komórki wysokie Sca1 pochodzące z pachwinowego tłuszczu, wysokie komórki Sca1 pochodzące z tłuszczu trzewnego najądrza wykazują rozciągnięty kształt komórek przypominający fibroblasty. Natomiast niskie komórki VIS Sca1 wykazują kształt nabłonka.

Komórki o wysokim poziomie Sca1 wyizolowane z izolowanych myszy Sca1-GFP można łatwo zidentyfikować jako komórki GFP dodatnie w hodowli tkankowej. Rzeczywiście, gdy komórki te są oceniane za pomocą cytometrii przepływowej, potwierdzono, że większość komórek GFP dodatnich wykazuje ekspresję białek Sca1 na powierzchni komórek, co wykryto za pomocą przeciwciała anty-Sca1. W połączeniu z analizami PCR w czasie rzeczywistym można wykazać różnicową ekspresję metaloproteinaz macierzy kolagenolitycznej między komórkami macierzystymi Sca1 o wysokiej zawartości tkanki tłuszczowej pochodzącymi z pachwinowych i najądrzy.

Ponadto, gdy znakowane fluoresceiną żele kolagenowe typu I są używane do oceny aktywności degradacji okołokomórkowej, obserwuje się znacznie zwiększoną aktywność przebudowy kolagenu, w której pośredniczą trzewne komórki macierzyste Sca1 o wysokiej zawartości tłuszczu. Po opanowaniu izolacja komórek poduszeczki tłuszczowej może zostać zakończona w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o utrzymaniu czystego i zorganizowanego pola operacyjnego, aby zapewnić skuteczną izolację poduszeczki tłuszczowej.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak test degradacji kolagenu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące przebudowy tkanek za pośrednictwem komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się otyłością i biologią macierzy do zbadania roli komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w przebudowie i funkcjonowaniu tkanki tłuszczowej u myszy i ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pozyskiwać i wzbogacać pierwotne komórki Sca1-dodatnie z magazynów tkanki tłuszczowej.