Name: Jednoczesne wykrywanie aktywacji c-FOS z mezolimbicznych i mezokortykalnych miejsc nagrody dopaminy po naiwnym spożyciu cukru i tłuszczu u szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj metodę immunohistochemiczną do wykrywania aktywacji c-fos w szlaku dopaminergicznym u szczurów po spożyciu cukru i tłuszczu. Technika ta łączy behawioralne testy motywacji z analizą aktywacji komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla Diany Icaza-Culaki, Cristal Sampson i Theologia Karagiorgis za ich ciężką pracę nad tym projektem.

Niniejsze protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt, potwierdzając, że wszystkie badane osobniki oraz procedury są zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i korzystania ze zwierząt laboratoryjnych.
1. Badani
<ol>
	<li>Nabyć i/lub wyhodować samce szczurów Sprague-Dawley (260 - 30 g).</li>
	<li>Utrzymywać szczury indywidualnie w klatkach z drucianej siatki. Stosować 12-godzinny cykl światła i ciemności, zapewniając dostęp do paszy dla szczurów i wody ad libitum.</li>
	<li>Losowo przydzielić odpowiednią wielkość próby (np. n ≈ 6 - 8) do grup.</li>
</ol>
2. Aparatura testowa i procedury przyjęcia
<ol>
	<li>Użyć kalibrowanych probówek wirówkowych z gumowymi korkami i metalną rurką ssącą pod kątem 45°, aby zapewnić dokładny pomiar (± 0,1 ml) podawanych roztworów. Przymocować je do klatek macierzystych za pomocą napiętej metalowej sprężyny, aby umożliwić widoczność skali kalibracyjnej.</li>
	<li>Ograniczyć racje żywieniowe szczurów (~ 15 g/dobę), aby zredukować ich masę ciała do 85% masy początkowej w celu zwiększenia motywacji do spożywania roztworów. Uwaga: redukcja masy ciała powinna trwać od 3 do 5 dni.</li>
	<li>Podawać roztwory wstępne (10 ml) 0,2% sacharyny przez cztery dni w ramach jednejgodzinnych sesji, aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo, że szczury będą próbować kolejnych roztworów testowych z krótkim (poniżej 1 min) czasem latencji.</li>
	<li>Potwierdzić przepływ przez probówkę wirówkową, wylewając kilka kropel.</li>
	<li>Ważić probówki przed i po każdej sesji, aby uzyskać pomiar spożycia.</li>
	<li>Piątego dnia przeprowadzić test spożycia w podgrupach otrzymujących jeden z sześciu roztworów (10 ml, 1 h): a) wodę, b) 0,2% sacharynę o nowym smaku (0,05% aromat wiśniowy), c) 8% fruktozę, d) 8% glukozę, e) 3,5% olej kukurydziany zawieszony w 0,3% gumie ksantanowej oraz f) 0,3% gumie ksantanowej.</li>
	<li>Upewnić się, że roztwory składników odżywczych są izokaloryczne; w związku z tym stężenie 3,5% oleju kukurydzianego jest izokaloryczne względem 8% roztworów cukrów.</li>
	<li>Upewnić się, że szczury próbują roztworów z krótkim czasem latencji (poniżej 1 min). Jeśli ten warunek nie zostanie spełniony, należy wykluczyć zwierzę z badania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie tkanki
<ol>
	<li>Zanurz każde zwierzę w narkozie poprzez doszpikowe wstrzyknięcie pentobarbitalu 90 min po początkowej ekspozycji na każdy roztwór testowy. Potwierdź, że zwierzęta są prawidłowo znieczulone, wykazując brak reakcji na odruchy, takie jak wycofanie łapy po uciśnięciu, mruganie po bezpośrednim nacisku na rogówkę lub potrząsanie głową po głębokiej stymulacji małżowiny usznej.</li>
	<li>Przeprowadź perfuzję transkardialną każdego zwierzęcia zgodnie z wcześniejszym opisem69.
	<ol>
		<li>Zanurz szczury w narkozie za pomocą przedawkowania pentobarbanu sodu (65 mg/kg), usuń klatkę piersiową i odsłoń klatkę piersiową, aby uzyskać swobodny dostęp do serca69.</li>
		<li>Wprowadź igłę do wierzchołka lewej komory serca i przetnij żyłę główną. Podaj roztwór buforu fosforanowego (PBS, ~ 180 ml), a następnie buforowany fosforanowy utrwalacz zawierający 4% paraformaldehydu (~ 180 ml).</li>
		<li>Upewnij się, że perfuzja zwierzęcia przebiega prawidłowo, sprawdzając, czy płyn wydostaje się z innych jam, takich jak nos, jama ustna i okolice genitalne. Uwaga: Prawidłowe utrwalenie paraformaldehydem będzie temu towarzyszyć silne ruchy mięśni. Jeśli tak się nie stanie, skoryguj położenie igły aż do wystąpienia tej reakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szybko wyjmij mózg z czaszki, odcinając futro i skórę od kości. Użyj kleszczy kostnych (rongeurs), aby roztrzaskać i usunąć kość z mózgu, przesuwając się od tyłu do przodu. Pracuj początkowo w obszarze poniżej i za móżdżkiem, upewniając się, że kleszcze znajdują się między kością a oponą miękką. Po usunięciu górnej i bocznych części czaszki użyj małej szpatułki, aby unieść mózg z podstawy, i przetnij nerwy czaszkowe małymi nożyczkami. Zachowaj ostrożność, aby nie uszkodzić mózgu podczas próby usunięcia kości.</li>
	<li>Utrwal mózgi w 4% roztworze paraformaldehydu przez noc w temperaturze 4 °C. Przełóż mózgi do roztworu 30% sacharozy i 70% PBS w temperaturze pokojowej, aż opadną na dno pojemnika.</li>
	<li>Zablokuj mózg
	<ol>
		<li>Usuń przednią część mózgu, wykonując cięcie poprzeczne zaopasznocznio względem opłazki węchowej.</li>
		<li>Usuń tylną część mózgu, wykonując cięcie poprzeczne na poziomie móżdżku i mostu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamocuj mózg w płaszczyźnie wieńcowej, ustalając tylną część na stoliku mikrotomu ślizgowego, i wykonaj cięcia wieńcowe (40 µm) przez mPFC (+2,86 – +2,20 mm rostralnie względem bregmy), jądro i otoczkę NAC oraz grzbietowy prążek (+1,76 – +1,60 mm rostralnie względem bregmy), AMY (-2,12 – -2,92 mm kaudalnie względem bregmy) oraz VTA (-5,20 – -5,60 mm kaudalnie względem bregmy). W celu orientacji skorzystaj z atlasu mózgu szczura70.</li>
	<li>Zbierz swobodnie pływające przekroje do poszczególnych studzienek płytki 24-dołkowej wypełnionej PBS do późniejszej analizy immunohistochemicznej71. Użyj Parafilmu do uszczelnienia płytki, aby zapobiec odparowaniu PBS z pojemnika i wysychaniu tkanki mózgowej. Przechowuj tkankę mózgu w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Procedury c-fos (Adaptacja z 71)
<ol>
	<li>Każdy przekrój inkubować przez 1 h w 5 ml 5% normalnego surowicy koziej i 0,2% Triton x-100 w PBS.</li>
	<li>Przetraktowane przekroje inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi (królicze anty-c-fos, 1:5 0) przez 36 h w temperaturze 4 °C w dołkach zawierających 1 ml PBS.</li>
	<li>Przekroje płukać 3x w PBS (5 ml), po 10 min każde płukanie.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi (biotynylizowane kozie anty-królicze; 1:20) przez 2 h w temperaturze pokojowej w dołkach zawierających 1 ml PBS.</li>
	<li>Każdy przekrój płukać 3x w PBS (5 ml), po 10 min każde płukanie.</li>
	<li>Wypłukane przekroje inkubować przez 2 h w dostępnej handlowo mieszaninie awidyny i peroksydazy chrzanowej z zestawu składającego się z Awidyny DH (10 µl) i biotynylizowanej peroksydazy chrzanowej H (10 µl) w 5 ml PBS.</li>
	<li>Ponownie płukać przekroje 3x w PBS (5 ml), po 10 min każde płukanie.</li>
	<li>Poddać przekroje reakcji z 0,05% diaminobenzydyną (DAB) w obecności 0,0015% H2O2 przez 5–10 min, zależnie od reaktywności tkanki, w dołkach zawierających 5 ml roztworu DAB.</li>
	<li>Przeprowadzić podwójne znakowanie przekrojów VTA. Inkubować je z przeciwciałem przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH) (królicze anty-szczurze TH, 1:2 0) w PBS (5 ml) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przekroje płukać 3x w PBS (5 ml), po 10 min każde płukanie.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi (biotynylizowane kozie anty-królicze; 1:200) w PBS (5 ml) przez 2 h w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przekroje płukać 3x w PBS (5 ml), po 10 min każde płukanie.</li>
	<li>Wizualizować przeciwciała, stosując kompleks przeciwciała drugorzędowego z peroksydazą. Poddać reakcji z kombinacją 0,05% DAB i 0,3% roztworu siarczanu niklu przez 5–10 min, zależnie od reakcji tkanki, w dołkach zawierających 5 ml roztworu DAB/NiCl.</li>
	<li>Upewnić się, że roztwór DAB ma mleczno-jasnozielony kolor w wyniku reakcji z 0,3% siarczanem niklu. Jeśli roztwór będzie zbyt zielony, reakcja będzie zbyt ciemna.</li>
	<li>Zamontować wszystkie przekroje na szkiełkach powlekanych żelatyną. Pozostawić do wyschnięcia na noc, a następnie przykryć szkiełkami dekrywacyjnymi, stosując kilka kropli roztworu na bazie toluenu (TBS).</li>
	<li>Oznaczyć szkiełka kodem w taki sposób, aby warunki eksperymentalne były nieznane obserwatorom.</li>
</ol>
5. Określanie liczby komórek immunoreaktywnych dla c-fos
<ol>
	<li>Wyznacz pary bezstronnych obserwatorów do policzenia neuronów Fos-dodatnich w następujących obszarach zainteresowania (ROI): przedlimbicznym mPFC, podlimbicznym mPFC, rdzeniu NAC, powłoce NAC, jądrach bocznych AMY, centralno-korowo-przyśrodkowej AMY, grzbietowym prążkowiu oraz VTA. Określ, czy immunoreaktywność c-Fos występowała w komórkach TH+ i TH- w VTA. Rycina 1 przedstawia zrzut ekranu obrazu NAC z mikroskopu.</li>
</ol>
<img alt="Schemat anatomiczny mózgu przedstawiający oznakowane jądro NAC (rdzeń i otoczkę); obejmuje komorę boczną oraz spoidło przednie." src="/files/ftp_upload/53897/53897fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Reprezentatywny przekrój jądra półleżącego (NAC) z zaznaczonymi obszarami zainteresowania ograniczonymi siatką, która służy do zliczania białka c-fos. Skorupa jądra półleżącego (NAC) znajduje się przyśrodkowo i brzusznie w stosunku do rdzenia jądra półleżącego (NAC). Rdzeń NAC otacza komisurę przednią (Anterior Comm.). Widoczny jest brzuszny zasięg komory bocznej (Lateral Vent.). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53897/53897fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="2">
	<li>Przeanalizuj co najmniej trzy reprezentatywne przekroje dla każdego obszaru wspólnego dla wszystkich zwierząt we wszystkich warunkach testowych.</li>
	<li>Użyj oprogramowania i mikroskopu optycznego, aby przeanalizować cały region dla każdego ROI poprzez obrysowanie jego konturu (Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Dla danego obszaru otwórz aplikację, kliknij rozwijane menu akwizycji i wybierz „Live Image”. Ustaw ostrość na ROI i kliknij ekran, aby ustanowić punkt odniesienia. Następnie obrysuj wybrany obszar mózgu, korzystając z siatki jako prowadnicy. Po zakończeniu obrysowywania policz komórki (kroki 5.3.1.1 - 5.3.1.3).
		<ol>
			<li>Dwukrotnie kliknij ikonę oprogramowania. W pasku menu wybierz „Acquisition”, a następnie „Live Image”. Ustaw ostrość na ROI i kliknij ekran, aby ustanowić punkt odniesienia.</li>
			<li>W pasku narzędzi siatki kliknij „Display Grid” oraz „Use grid labels”. Obrysuj ROI zgodnie z wcześniej ustalonym konturem.</li>
			<li>Policz wszystkie komórki w każdym obszarze ROI, wybierając znak „+” w lewym pasku bocznym, aby prowadzić licznik komórek c-fos. Klikaj pojedynczo w każdą komórkę, aby zarejestrować liczbę. Komórkę uznaje się za pozytywną pod kątem c-fos, gdy widoczny jest wyraźny ciemnoczerwony okrąg (Rysunek 1).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powtórz ten proces dla każdego obszaru.</li>
		<li>Zapisz wyniki w notatniku laboratoryjnym oraz w komputerze do późniejszej analizy. W pasku menu wybierz „File”, a następnie „Save Data File”, aby zapisać obrys i liczbę komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upewnij się, że niezależna zgodność oceniających (wykorzystując korelację wyników zliczeń) dwóch niepoinformowanych obserwatorów dla każdego przekroju w każdym ROI zawsze przekracza 0,8.</li>
</ol>
6. Statystyka
<ol>
	<li>Oceń bazowe spożycie sacharyny w ciągu pierwszych czterech dni, stosując jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami w celu porównania spożycia sacharyny w dniach 1, 2, 3 i 469.</li>
	<li>Porównaj spożycie sacharyny (dzień 4) ze spożyciem testowym (dzień 5) w sześciu grupach, stosując dwuczynnikową analizę ANOVA dla bloków randomizowanych69.</li>
	<li>Zastosuj test Tukeya (p &lt; 0,05), aby określić poszczególne istotne statystycznie efekty69.</li>
	<li>Określ niezawodność międzyoceniającą, a następnie wykorzystaj wyniki wspólnego obserwatora.</li>
	<li>Oblicz średnią liczbę komórek c-fos dla trzech reprezentatywnych przekrojów dla każdego obszaru69.
	<ol>
		<li>Przeprowadź jednoczynnikową analizę ANOVA aktywacji c-fos indukowanej spożyciem sześciu roztworów (3,5% oleju kukurydzianego, 8% glukozy, 8% fruktozy, 0,2% aromatyzowanej sacharyny, kontroli z gumą ksantanową oraz wody) dla przyobwodowej mPFC69.</li>
		<li>Powtórz równoległe analizy dla sześciu grup w odniesieniu do podobwodowej mPFC, jądra NAC, powłoki NAC, bocznej części AMY, centralno-koro-medialnej części AMY, VTA oraz grzbietowego prążkowia. Zastosuj test Tukeya (p &lt; 0,05), aby wykryć poszczególne istotne statystycznie efekty69.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Porównaj spożycie oleju kukurydzianego zarówno ze spożyciem wody, jak i spożyciem środka zawieszającego, gumy ksantanowej. Porównaj spożycie fruktozy i glukozy zarówno ze spożyciem wody, jak i spożyciem słodzika bezkalorycznego, sacharyny.</li>
	<li>Ustal, czy zaobserwowano istotne zależności między spożyciem roztworów a aktywacją c-fos w każdym z obszarów, stosując korelację r Bonferroniego (p &lt; 0,05).
	<ol>
		<li>Systematycznie porównaj liczbę komórek c-fos w przyobwodowej i podobwodowej korze przedczołowej dla każdego zwierzęcia w grupie 3,5% oleju kukurydzianego.</li>
		<li>Powtórz systematyczne równoległe analizy dla każdej pary z sześciu obszarów (VTA, grzbietowe prążkowie, podobwodowa mPFC, przyobwodowa mPFC, jądro NAC, powłoka NAC, boczna część AMY, centralno-koro-medialna część AMY) dla 3,5% oleju kukurydzianego.</li>
		<li>Powtórz systematyczne równoległe analizy tych sześciu obszarów dla pozostałych pięciu eksperymentalnych warunków spożycia (8% glukozy, 8% fruktozy, 0,2% aromatyzowanej sacharyny, kontroli z gumą ksantanową oraz wody).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykorzystaj fakt, że te same zwierzęta w obrębie jednej grupy roztworu były oceniane we wszystkich obszarach, określając istotne zależności między aktywacją c-fos w różnych roztworach oraz w obrębie każdego roztworu, stosując korelację r Bonferroniego (p &lt; 0,05).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Celem badania było ustalenie, czy źródło (VTA) i cele projekcji przodomózgowia (NAC, AMY, mPFC) neuronów związanych z nagrodą DA były jednocześnie aktywowane po nowym spożyciu tłuszczu i cukru u szczurów przy użyciu techniki komórkowej c-fos. Niniejsze badanie jest szczegółowym opisem protokołów badania opublikowanego wcześniej69. Postawiono hipotezę, że VTA, jego główne strefy projekcyjne do przedlimbicznego i podlimbicznego mPFC, rdzeń i powłoka NAC oraz podstawno-boczny i centralno-korowo-przyśrodkowy AMY, ...

Dopamina w mózgu (DA) została zaangażowana w centralne reakcje na spożycie smacznych cukrów poprzez proponowane hedoniczne1,2, związane z wysiłkiem3 i oparte na nawykumechanizmy działania 4,5. Pierwotny szlak DA zaangażowany w te efekty wywodzi się z brzusznego obszaru nakrywki (VTA) i rzutuje na rdzeń i powłokę jądra półleżącego (NAC), ciało migdałowate podstawno-boczne i środkowo-korowo-przyśrodkowe (AMY) oraz przedlimbiczną i podlimbiczną przyśrodkową korę przedczołową (mPFC) (patrz przeglądy6,7). VTA jest związana ze spożyciem sacharozy8,9, a uwalnianie DA obserwuje się po spożyciu cukru w NAC10-15, AMY16,17 i mPFC18-20. Spożycie tłuszczu stymuluje również uwalnianie DANAC 21, a inna bogata w DA strefa projekcji do prążkowia grzbietowego (ogoniastego-skorupy) jest również związana z karmieniem za pośrednictwem DA22,23. Kelley24-27 zasugerował, że te liczne strefy projekcyjne tego systemu, w którym pośredniczy DA, tworzą zintegrowaną i interaktywną rozproszoną sieć mózgową poprzez rozległe i intymne wzajemne połączenia.
Oprócz zdolności antagonistów receptorów DA D1 i D2 do zmniejszania spożycia cukrów35-37 i tłuszczów38-40, sygnalizacja DA jest również zaangażowana w pośredniczenie w zdolności cukrów i tłuszczów do wytwarzania uwarunkowanych preferencji smakowych (CFP)41-46. Mikroiniekcja antagonisty receptora DA D1 do NAC, AMY lub mPFC47-49 eliminuje nabywanie CFP wywołanego przez glukozę w żołądku. Podczas gdy mikrowstrzyknięcia antagonistów receptora DA D1 lub D2 do mPFC eliminują nabywanie fruktozy-CFP50, nabywanie i ekspresja fruktozy-CFP są w różny sposób blokowane przez antagonistów DA w NAC i AMY51,52.
Technika c-fos53,54 została wykorzystana do zbadania aktywacji neuronalnej wywołanej przez smaczne spożycie i aktywację neuronalną. Termin "aktywacja c-fos" będzie używany w całym manuskrypcie i jest operacyjnie zdefiniowany przez zwiększoną transkrypcję c-Fos podczas depolaryzacji neuronów. Przyjmowanie sacharozy zwiększało immunoreaktywność podobną do fos (FLI) w centralnym jądrze AMY, VTA, a także w powłoce, ale nie w rdzeniu NAC55-57. Podczas gdy spożycie sacharozy u szczurów karmiących pozorami znacznie zwiększyło FLI w AMY i NAC, ale nie w VTA58, dożołądkowe wlewy sacharozy lub glukozy znacznie zwiększyły FLI w NAC oraz jądrach centralnych i podstawno-bocznych AMY59,60. Wielokrotne dodawanie sacharozy do zaplanowanego dostępu do karmy zwiększało FLI w mPFC, a także w powłoce NAC i rdzeniu61. Paradygmat obniżania stężenia sacharozy ujawnił, że największy wzrost FLI wystąpił w podstawno-bocznym AMY i NAC, ale nie w VTA62. Po kondycjonowaniu, wygaśnięcie naturalnych zachowań nagrody związanych z cukrem zwiększyło FLI w podstawno-bocznym AMY i NAC63. Co więcej, połączenie dostępności cukru z tonem spowodowało, że ton następnie zwiększył poziom FLI w podstawno-bocznym AMY64. Spożycie dużej ilości tłuszczu zwiększyło również FLI w miejscach NAC i mPFC65-67.
Większość wcześniej cytowanych badań dotyczyła wpływu cukru i tłuszczu na aktywację c-fos w pojedynczych miejscach, które nie dostarczają informacji na temat identyfikacji rozproszonych sieci mózgowych związanych z nagrodą24-27. Co więcej, wiele badań nie określiło również względnego wkładu podobszarów NAC (rdzeń i powłoka), AMY (podstawno-boczny i centralno-korowo-przyśrodkowy) oraz mPFC (przedlimbiczny i infralimbiczny), które mogłyby być potencjalnie zbadane przez przewagę doskonałej rozdzielczości przestrzennej, pojedynczej komórki w mapowaniu c-Fos68. Nasze laboratorium69 niedawno wykorzystało aktywację c-fos i jednocześnie zmierzyło zmiany w szlaku VTA DA i jego strefach projekcji (NAC, AMY i mPFC) po spożyciu nowych tłuszczów i cukrów u szczurów. W niniejszym badaniu opisano kroki proceduralne i metodologiczne mające na celu jednoczesną analizę, czy ostre narażenie na sześć różnych roztworów (olej kukurydziany, glukoza, fruktoza, sacharyna, woda i kontrola emulsji tłuszczowej) w różny sposób aktywowałoby FLI w podobszarach NAC, AMY, mPFC, a także w prążkowiu grzbietowym. To jednoczesne wykrycie różnic pozwoliło potwierdzić znaczący wpływ na FLI w każdym miejscu i określić, czy zmiany w jednym konkretnym miejscu korelują ze zmianami w powiązanych miejscach, zapewniając w ten sposób wsparcie dla rozproszonej sieci mózgowej24-27. Procedury te sprawdzały, czy VTA, mPFC przedlimbiczny i podlimbiczny, rdzeń i powłoka NAC oraz podstawno-boczny i centralno-korowo-przyśrodkowy AMY), a także prążkowie grzbietowe będą wykazywać skoordynowaną i jednoczesną aktywację FLI po doustnym, bezwarunkowym spożyciu roztworów glukozy (8%), fruktozy (8%), oleju kukurydzianego (3,5%) i sacharyny (0,2%).

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley szczury</td><td>Charles River Laboratories</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>Klatki z siatki drucianej</td><td>Produkty laboratoryjne, Seaford, DE</td><td>Stojak</td><td></td>na 30 klatek</tr><tr><td>Rat Chow</td><td>PMI Nutrition International</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>Taut Metal Spring</td><td>Lab Products, Seaford, DE</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Waga do ważenia szczurów</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe Nalgene</td><td>Produkty laboratoryjne, Seaford, DE</td><td>10-0501</td><td></td></tr><tr><td>Gumowy korek</td><td>Produkty laboratoryjne, Seaford, DE</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Metal Sippers</td><td>Lab Products, Seaford, DE</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>sacharyny</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>82385-42-0</td><td></td></tr><tr><td>Kool-Aid, wiśnia</td><td>Kool-Aid</td><td>Komercyjny</td><td></td></tr><tr><td>Kool-Aid, winogrono</td><td>Kool-Aid</td><td>Komercyjna</td><td></td></tr><tr><td>fruktoza</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>Mazzola</td><td>Komercyjna</td><td></td></tr><tr><td>guma ksantanowa</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>11138-66-2</td><td></td></tr><tr><td>Przesuwny mikrotom</td><td>Microm International</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida Camera</td><td>MBF Bioscience</td><td>Aplikacja</td><td></td>oprogramowania</tr><tr><td>Szkiełka powlekane żelatyną</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>Złote nylonowe szczotki</td><td>Loew-Cornell&nbsp;</td><td>2037</td><td></td></tr><tr><td>Naturalne sobole do włosów&nbsp;</td><td>Loew-Cornell&nbsp;</td><td>2022</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Butelki Pyrex 1 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>1395-1L</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka tkankowa (sitko do tkanek)</td><td>Pipety Fisher Scientific</td><td>7200214</td><td></td></tr><tr><td>Eagle&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>E10 dla 1-10&#956; l</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Eagle&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>E100 dla 20-100&#956; l</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Eagle&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>E200 dla 50-200&#956; l</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Eagle&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>E1000 dla 100-1000&#956; l</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Eagle&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>E5000 dla 1000-5000&#956; l&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalne końcówki .1-10 &#956; l</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>500192</td><td></td></tr><tr><td>końcówki uniwersalne 5-200 i #956; l</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>500194</td><td></td></tr><tr><td>końcówki uniwersalne 500-5,000 &#956; l</td><td>World Precision Instruments</td><td>500198</td><td></td></tr><tr><td>Blade Vibroslice 100</td><td>World Precision Instruments</td><td>BLADE</td><td></td></tr><tr><td>DPX Medium montażowe&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa&nbsp;</td><td>13510</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Biologix Research Co.</td><td>10-0501</td><td></td></tr><tr><td>Pudełka na slajdy</td><td>Biologix Research Co.</td><td>41-6100</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna&nbsp;</td><td>Korporacja Madell&nbsp; &nbsp;</td><td>Łodzie wagowe ZD-9556</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipety jednorazowe 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-5AM</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator Software</td><td>Micro Bright Field</td><td>Software aplikacja</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td><silne>odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde granulowany</td><td>Fisher Scientific</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Monozasadowy Monozasadowy Sodowy Pfhatowy</td><td>Fisher</td><td>Scientific S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu Difazowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wodór Nadtlenek&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>H324-500</td><td></td></tr><tr><td>SafeClear II&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-044-192</td><td></td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Wektor</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany anty-króliczy IgG (H + L)</td> <td>Vector</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>ABC Zestaw ABC Peroksydaza Standardowy</td><td>wektor</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-cFos (Ab-5) Królik</td><td>EMD chem/Cal Biochem</td><td>PC38</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>SigmaAldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>3,3' tetrachlorowodorek diaminobenzydyny&nbsp;</td><td>SigmaAldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>SigmaAldrich</td><td>5881</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne przeciwciało TH</td><td>EMD Milipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Euthosol</td><td>Virbac AH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

jednoczesne wykrywanie aktywacji c-fos z mezolimbicznych i mezokortykalnych miejsc nagrody dopaminy po naiwnym spożyciu cukru i tłuszczu u szczurów

Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats

To badanie wykorzystuje komórkową aktywację c-fos do oceny wpływu nowego spożycia tłuszczu i cukru na szlaki dopaminy (DA) w mózgu u szczurów. Spożycie cukrów i tłuszczów jest zapośredniczone przez ich wrodzoną atrakcyjność, a także wyuczone preferencje. Dopamina w mózgu, zwłaszcza projekcje mezolimbiczne i mezokorowe z brzusznego obszaru nakrywki (VTA), jest zaangażowana w obie te niewyuczone i wyuczone reakcje. Zaproponowano koncepcję rozproszonych sieci mózgowych, w których oddziałuje na siebie kilka miejsc i systemów przekaźnik/peptyd, aby pośredniczyć w przyjmowaniu smacznego pokarmu, ale istnieją ograniczone dowody empirycznie wykazujące takie działania. W ten sposób spożycie cukru wywołuje uwalnianie DA i zwiększa immunoreaktywność podobną do c-fos (FLI) z poszczególnych stref projekcji VTA DA, w tym jądra półleżącego (NAC), ciała migdałowatego (AMY) i przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC), a także prążkowia grzbietowego. Co więcej, centralne podawanie selektywnych antagonistów receptora DA do tych miejsc w różny sposób zmniejsza nabywanie i ekspresję uwarunkowanych preferencji smakowych wywoływanych przez cukry lub tłuszcze. Jednym z podejść do określenia, czy te miejsca oddziaływały na siebie jako rozproszona sieć mózgowa w odpowiedzi na spożycie cukru lub tłuszczu, byłaby jednoczesna ocena, czy VTA i jego główne strefy projekcji mezotelencefalicznego DA (przedlimbiczne i podlimbiczne mPFC, rdzeń i powłoka NAc, podstawno-boczne i centralno-korowo-przyśrodkowe AMY), a także prążkowie grzbietowe wykazywałyby skoordynowaną i jednoczesną aktywację FLI po podaniu doustnym, Bezwarunkowe spożycie roztworów oleju kukurydzianego (3,5%), glukozy (8%), fruktozy (8%) i sacharyny (0,2%). Podejście to jest udanym pierwszym krokiem w kierunku określenia wykonalności jednoczesnego wykorzystania komórkowej aktywacji c-fos w odpowiednich miejscach w mózgu do badania uczenia się związanego z nagrodą w spożywaniu smacznego pokarmu u gryzoni.

Wszystkie reprezentatywne wyniki opisane poniżej zostały opublikowane wcześniej69 i są tutaj przedstawione ponownie, aby wesprzeć „dowód koncepcji” wskazujący na skuteczność tej techniki.
Spożycie roztworów 
W ciągu pierwszych czterech dni u wszystkich zwierząt zaobserwowano istotne różnice w bazowym spożyciu sacharyny (F(3,108) = 57.27, p &lt; 0.01), przy czym spożycie (Dzień 1: 1.3 (± 0.2) ml; Dz...

Celem tego badania jest zidentyfikowanie rozproszonych sieci mózgowych związanych z nagrodą poprzez nakreślenie niezawodnej techniki immunohistologicznej wykorzystującej komórkową aktywację c-fos do pomiaru jednoczesnych zmian w szlakach dopaminy i miejscach końcowych po nowym spożyciu tłuszczu i cukru u szczurów.

Jednoczesne wykrywanie aktywacji c-FOS z mezolimbicznych i mezokortykalnych miejsc nagrody dopaminy po naiwnym spożyciu cukru i tłuszczu u szczurów

This study uses cellular c-fos activation to assess effects of novel ingestion of fat and sugar on brain dopamine (DA) pathways in rats. Intakes of sugars ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu eksperymentalnego jest określenie, czy VTA oraz jego główne obszary projekcji DA do mezotelencefalonu wykazują skoordynowaną i jednoczesną aktywację c-Fos po pierwszym spożyciu roztworów oleju kukurydzianego, glukozy, fruktozy lub sacharyny. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neurobiologii, takie jak kwestie motywacji, oraz pozwolić zidentyfikować, czy wiele obszarów mózgu jest aktywowanych w sposób skoordynowany w odpowiedzi na bodźce smakowe. Główną zaletą tej techniki jest połączenie uznanych testów behawioralnych, technik aktywacji komórkowej oraz analiz statystycznych.Aby przygotować aparat, należy użyć skalowanej probówki wirówkowej z gumowym korkiem oraz metalnej rurki ssącej ustawionej pod kątem 45 stopni, co zapewni dokładny pomiar ilości roztworu podanego szczurowi. Mocujemy ją do klatki domowej za pomocą napiętej metalowej sprężyny, tak aby zachować widoczność skali. Od trzech do pięciu dni przed rozpoczęciem treningu należy ograniczyć racje żywnościowe szczura, aby zredukować jego masę ciała do 85% masy początkowej w celu zwiększenia motywacji do spożycia roztworu.W międzyczasie, przez cztery dni, w trakcie jednej godzinnej sesji, podawaj zwierzęciu 10 mililitrów roztworu wstępnego zawierającego 0,2% sacharyny, aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo, że szczur pobierze kolejny roztwór testowy z krótką latencją. Waż próbówkę przed i po każdej sesji, aby uzyskać pomiar spożycia. Następnie, piątego dnia, przeprowadź test spożycia w podgrupach otrzymujących jeden z sześciu roztworów.Należy upewnić się, że szczury wykazują krótką latencję w roztworze próbnym i wykluczyć osobniki z badania, jeśli ten wymóg nie zostanie spełniony. Aby przygotować tkankę, po uśmierceniu zwierzęcia należy szybko wyciąć mózg z czaszki. Za pomocą kleszczyków do kostni ostrożnie rozłupać i usunąć kość z mózgu, przesuwając się od tyłu do przodu.Pracuj w obszarze poniżej móżdżku, upewniając się, że kleszczyki kostne znajdują się pomiędzy kością a miękką oponą mózgową. Po usunięciu górnej i bocznych części czaszki, użyj małej szpatułki, aby unieść mózg z jego podstawy, a następnie przetnij nerwy czaszkowe małymi nożyczkami. Następnie utrwal mózg w 4% roztworze paraformaldehydu przez noc w temperaturze 4 °C.Następnego dnia umieść mózg w roztworze sacharozy w temperaturze pokojowej, aż opadnie on na dno pojemnika. Następnie usuń opuszki węchowe. W dalszej kolejności usuń móżdżek oraz most.Następnie zamocuj mózg w płaszczyźnie czołowej, z częścią ogonową przymocowaną do stolika mikrotomu, i wykonaj przekroje czołowe o grubości 40 µm. W tej procedurze poddaj przekroje działaniu pięciu ml 5% surowicy koziej i 0,2% Triton x-100 w PBS przez jedną godzinę. Następnie inkubuj przygotowane przekroje z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 °C przez 36 godzin, w dołkach zawierających jeden ml PBS.Po 36 godzinach wypłucz preparaty trzykrotnie w 5 ml PBS, przez 10 minut przy każdym płukaniu. Następnie inkubuj preparaty z przeciwciałem wtórnym w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, w dołkach zawierających 1 ml PBS. Po tym czasie wypłucz preparaty trzykrotnie w 5 ml PBS, przez 10 minut przy każdym płukaniu.Następnie inkubuj wypłukane przekroje przez dwie godziny w dostępnej komercyjnie mieszaninie awidyny z peroksydazą chrzanową. Po dwóch godzinach wypłucz przekroje trzykrotnie w 5 mL PBS, przez dziesięć minut za każdym razem. Następnie poddaj przekroje reakcji z DAB w obecności nadtlenku wodoru przez pięć do dziesięciu minut.Następnie należy przeprowadzić podwójne znakowanie przekrojów VTA poprzez inkubację z przeciwciałem przeciwko hydroksylazie tyrozynowej w 5 ml PBS przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia przekroje należy wypłukać trzykrotnie w 5 ml PBS, po 10 minut za każdym razem. Następnie należy inkubować przekroje z przeciwciałem wtórnym w 5 ml PBS w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Po dwóch godzinach przemyj skrawki trzykrotnie w 5 ml PBS, przez dziesięć minut przy każdym płukaniu. Aby zwizualizować przeciwciało przy użyciu kompleksu peroksydazy przeciwciała wtórnego, poddaj je reakcji z mieszaniną DAB i 0,3% roztworem siarczanu niklu przez pięć do dziesięciu minut. Policz komórki, dwukrotnie klikając ikonę oprogramowania.Przejdź do paska menu, kliknij Akwizycja, a następnie Obraz na żywo. Po tym ustaw ostrość w obszarze zainteresowania i kliknij ekran, aby ustanowić punkt odniesienia. Następnie przejdź do paska narzędzi siatki i kliknij Wyświetl siatkę oraz Użyj etykiet siatki.Obrysuj obszar zainteresowania za pomocą wcześniej zdefiniowanego śladu. Następnie policz wszystkie komórki w każdym obszarze zainteresowania i wybierz opcję Plus w lewym pasku bocznym, aby zarejestrować liczbę komórek c-Fos. Komórkę uznaje się za pozytywną w kierunku c-Fos, gdy widoczny jest wyraźny, ciemnoczerwony krąg.Powtórz ten proces dla każdego miejsca i upewnij się, że niezawodność między sędziami (inter-rater reliability) dwóch niepoinformowanych oceniających dla każdej sekcji w każdym obszarze zainteresowania zawsze przekracza 0,8. Następnie policz neurony dodatnie pod kątem c-Fos w obszarach zainteresowania. Określ, czy immunoreaktywność c-Fos występuje w komórkach dodatnich i ujemnych pod kątem TH w VTA.Na tym obrazie widać, że spożycie tłuszczu lub cukru w różny sposób zwiększa aktywację c-Fos w całym ciele migdałowatym, a także w jego podobszarach: boczno-podstawnym oraz centralno-korowo-przyśrodkowym. Na obrazie zaobserwowano rzeczywistą aktywację c-Fos w ciele migdałowatym u zwierząt poddanych podaży oleju kukurydzianego, glukozy oraz fruktozy. Aktywację c-Fos w VTA zaobserwowano również u zwierząt poddanych podaży oleju kukurydzianego i wody.Czarne strzałki wskazują reprezentatywne, podwójnie znakowane komórki dodatnie pod kątem TH i c-Fos, natomiast szare strzałki wskazują reprezentatywne komórki dodatnie tylko pod kątem c-Fos. Po opanowaniu techniki, przy zachowaniu odpowiedniej staranności, można ją przeprowadzić w ciągu trzech do czterech tygodni. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest przestrzeganie precyzyjnej metodologii, zasad przechowywania oraz zasad zliczania.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

simultaneous-detection-c-fos-activation-from-mesolimbic-mesocortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Reagowanie na sygnały powiązane z pokarmem lub lekiem nasila się w czasie okresu abstynencji, co może wiązać się ze zwiększoną podatnością na zachowania nawrotowe. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy procedurę oceny tej „inkubacji głodu” (ang. incubation of craving) u szczurów, które podawały sobie samodzielnie sacharozę.

Ogólna metoda oceny inkubacji głodu sacharozy u szczurów

W niniejszym raporcie przedstawiamy w pełni zautomatyzowany i wysoce wszechstronny system umożliwiający jednoczesne badanie wielu zachowań poznawczych oraz rejestrację aktywności neuronów u gryzoni.

W pełni zautomatyzowany i wysoce wszechstronny system do badania wielorakich funkcji poznawczych i rejestracji aktywności neuronalnej u gryzoni

Gwałtowne wahania dopaminy zewnątrzkomórkowej (DA) pośredniczą zarówno w przetwarzaniu nagrody, jak i w motywowanym zachowaniu u ssaków. Manuskrypt ten opisuje połączone zastosowanie szybkiej woltamperometrii cyklicznej (FSCV) i doustnej dawki degustacyjnej w celu określenia, w jaki sposób degustatory zmieniają szybkie uwalnianie dopaminy u obudzonych, swobodnie poruszających się szczurów.

Badanie szybkiej dynamiki dopaminy za pomocą cyklicznej woltamperometrii Fast Scan podczas doustnej dawki degustacyjnej u obudzonych szczurów

Gryzonie są odpowiednim modelem do badania molekularnych substratów zachowania i złożonych zaburzeń psychicznych. Mikroiniekcja mózgu u obudzonych gryzoni może być wykorzystana do wyjaśnienia substratów chorobowych. Przedstawiono skuteczną i konfigurowalną metodę mikroiniekcji mózgu, a także wykonanie paradygmatu instrumentalnego, który określa ilościowo motywację.

Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania

Tutaj prezentujemy protokół Fluorescencji Aktywowanego Sortowania Komórek (FACS) do badania molekularnych zmian w zespołach neuronalnych wyrażających Fos zarówno ze świeżej, jak i mrożonej tkanki mózgowej. Zastosowanie zamrożonej tkanki pozwala na izolację FACS wielu obszarów mózgu podczas wielu sesji, aby zmaksymalizować wykorzystanie cennych zwierząt osobistych.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i analiza ekspresji genów neuronów eksprymujących fos ze świeżej i mrożonej tkanki mózgowej szczura

Reaktywność wskazówek jest rozumiana jako wrażliwość na sygnały związane z doświadczeniami związanymi z zażywaniem narkotyków, które przyczyniają się do głodu i nawrotów u abstynentów. Reaktywność sygnału jest modelowana u szczurów poprzez pomiar orientacji uwagi na sygnały związane z narkotykami, co skutkuje zachowaniem podejścia apetytywnego w teście reaktywności sygnału po samodzielnym podaniu i wymuszonej abstynencji.

Protokół pomiaru reaktywności sygnałów w szczurzym modelu zaburzeń związanych z używaniem kokainy

Ten artykuł szczegółowo opisuje wykorzystanie nagrań amperometrycznych o stałym potencjale przy użyciu elektrod z włókna węglowego i technologii biosensorów enzymatycznych do pomiaru uwalniania dopaminy i glutaminianu z wysoką rozdzielczością czasową podczas naturalnego zachowania nagradzającego u samicy chomika.

Pomiar in vivo zmian w neuroprzekaźnikach zewnątrzkomórkowych podczas naturalnie nagradzających zachowań u samic chomików syryjskich

Tutaj opisany jest protokół preferencji miejsca uwarunkowanego morfiną (CPP) do pomiaru inkubacji głodu u szczurów.

Protokół warunkowej preferencji miejsca do pomiaru inkubacji łaknienia u szczurów

Celem tego protokołu jest bezpośrednie manipulowanie receptorami brzusznego obszaru nakrywki w celu zbadania ich udziału w subsekundowym uwalnianiu dopaminy.

Skojarzona infuzja i stymulacja z woltamperometrią cykliczną Fast-Scan (CIS-FSCV) w celu oceny regulacji dopaminy fazowej przez receptory brzusznego obszaru nakrywki

Komunikacja jelitowo-mózgowa, ułatwiana przez nerw błędny, jest kluczowa dla komunikacji między układem hormonalnym przewodu pokarmowego a mózgiem. Jednak to, czy dożołądkowe wstrzyknięcie glukozy może zmienić aktywność kory mózgowej, nadal nie jest zrozumiałe. W tym miejscu oferujemy kompleksowy protokół obserwacji zmian w aktywności kory mózgowej po wstrzyknięciu glukozy do dwunastnicy.

Analiza komunikacji neuronalnej jelitowo-mózgowej w czasie rzeczywistym: dynamika wapnia w całej korze mózgowej w odpowiedzi na stymulację glukozy w jelitach

Poznaj metodę immunohistochemiczną do wykrywania aktywacji c-fos w szlaku dopaminergicznym u szczurów po spożyciu cukru i tłuszczu. Technika ta łączy behawioralne testy motywacji z analizą aktywacji komórkowej.

Jednoczesne wykrywanie aktywacji c-FOS z mezolimbicznych i mezokortykalnych miejsc nagrody dopaminy po naiwnym spożyciu cukru i tłuszczu u szczurów (Wideo) | JoVE Journal

Jednoczesne wykrywanie aktywacji c-FOS z mezolimbicznych i mezokortykalnych miejsc nagrody dopaminy po naiwnym spożyciu cukru i tłuszczu u szczurów

Przeglądaj więcej filmów