Jednoczesne wykrywanie aktywacji c-FOS z mezolimbicznych i mezokortykalnych miejsc nagrody dopaminy po naiwnym spożyciu cukru i tłuszczu u szczurów

Ogólnym celem tego eksperymentalnego protokołu jest ustalenie, czy VTA i jego główne strefy projekcji mezotelencefatycznej DA będą wykazywać koordynacyjną i jednoczesną aktywację c-Fos po nowym spożyciu roztworów oleju kukurydzianego, glukozy, fruktozy lub sacharyny. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak motywacja, i określić, czy wiele miejsc w mózgu jest aktywowanych w skoordynowany sposób w odpowiedzi na przyjemne bodźce. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy w sobie uznane testy behawioralne, techniki aktywacji komórkowej i analizy statystyczne.

Aby ustawić aparaturę, użyj skalibrowanej probówki wirówkowej z korkiem złodziejskim oraz metalowej rurki do łykania pod kątem 45 stopni, aby zapewnić dokładny pomiar roztworu przedstawionego szczurowi. Przymocuj go do klatki domowej za pomocą napiętej metalowej sprężyny, aby zapewnić widoczność kalibracji. Na trzy do pięciu dni przed treningiem ogranicz racje pokarmowe dla szczura, aby zmniejszyć jego masę ciała do 85% pierwotnej wagi, aby zwiększyć motywację do spożycia roztworu.

W międzyczasie podawaj zwierzęciu 10 mililitrów roztworu przedtreningowego z 0,2% sacharyną przez cztery dni, w ciągu jednej godzinnej sesji, aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo, że szczur pobierze próbkę kolejnego roztworu testowego z krótkim opóźnieniem. Zważ probówkę przed i po każdej sesji, aby uzyskać pomiar spożycia. Następnie, piątego dnia, przeprowadź test wstępny na podgrupach otrzymujących jedno z sześciu roztworów.

Upewnij się, że roztwór próbki szczurów z krótkim opóźnieniem i wyklucz uczestników z badania, jeśli ten wymóg nie jest spełniony. Aby przygotować tkankę, po złożeniu zwierzęcia w ofierze, szybko usuń mózg z czaszki. Użyj rongeurs, aby ostrożnie rozbić i usunąć kość z mózgu, zaczynając od tyłu do przodu.

Pracuj w obszarze poniżej móżdżku i upewnij się, że rongeurs znajdują się między kością a pia mater opony mózgowej. Po usunięciu górnej i bocznej części czaszki użyj małej szpatułki, aby podnieść mózg z podstawy i przeciąć nerwy czaszkowe małymi nożyczkami. Następnie utrwal mózg w 4% roztworze paraformaldehydu przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia umieść mózg w roztworze sacharozy o temperaturze pokojowej, aż osiądzie na dnie pojemnika. Następnie usuń opuszkę węchową. Następnie usuń móżdżek i most.

Następnie zamontuj mózg koronalnie, z częścią ogonową przymocowaną do stopnia mikrotomu i przetnij odcinki koronalne 40 mirometrów. W tej procedurze należy potraktować skrawki pięcioma mililitrami 5% normalnej surowicy koziej i 0,2% Triton x-100 w PBS przez jedną godzinę. Następnie inkubować traktowane sekcje z pierwszorzędowym przeciwciałem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 36 godzin w studzienkach zawierających jeden mililitr PBS.

Po 36 godzinach przepłukać sekcje trzykrotnie pięcioma mililitrami PBS przez 10 minut za każdym razem. Następnie inkubować skrawki z przeciwciałem wtórnym w temperaturze pokojowej przez dwie godziny w studzienkach zawierających jeden mililitr PBS. Następnie przepłucz sekcje trzy razy w pięciu mililitrach PBS przez 10 minut za każdym razem.

Następnie inkubuj wypłukane skrawki przez dwie godziny w dostępnej w handlu mieszaninie peroksydazy chrzanowej Avidin. Po dwóch godzinach przepłucz skrawki trzy razy w pięciu mililitrach PBS, za każdym razem przez dziesięć minut. Następnie reaguj skrawki z DAB w obecności nadtlenku wodoru przez pięć do dziesięciu minut.

Następnie dwukrotnie znakuj skrawki VTA, inkubując je z przeciwciałem przeciwko hydroksylazie tyrozynowej w pięciu mililitrach PBS, przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przepłucz skrawki trzy razy w pięciu mililitrach PBS, za każdym razem przez dziesięć minut. Następnie inkubować skrawki z przeciwciałem drugorzędowym w pięciu mililitrach PBS w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Po dwóch godzinach przepłucz skrawki trzy razy w pięciu mililitrach PBS, za każdym razem przez dziesięć minut. Aby uwidocznić przeciwciało za pomocą drugorzędowego kompleksu peroksydazy przeciwciał, należy je reagować z kombinacją DAB i 0,3% roztworu siarczanu niklu przez pięć do dziesięciu minut. Policz komórki, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania.

Przejdź do paska menu, kliknij Pozyskiwanie, a następnie Obraz na żywo. Następnie ustaw ostrość na interesującym Cię obszarze i kliknij ekran, aby ustalić punkt odniesienia. Następnie przejdź do paska narzędzi siatki i kliknij Wyświetl siatkę i Użyj etykiet siatki.

Nakreśl obszar zainteresowania za pomocą wcześniej określonego śladu. Następnie policz wszystkie komórki w każdym obszarze zainteresowania i wybierz Plus na pasku bocznym po lewej stronie, aby zarejestrować liczbę komórek c-Fos. Rozważmy komórkę dodatnią dla c-Fos, gdy zaobserwowano zdefiniowany ciemnoczerwony okrąg.

Powtórz ten proces dla każdej lokalizacji i upewnij się, że wiarygodność dwóch niedoinformowanych oceniających między oceniającymi dla każdej sekcji w każdym regionie zainteresowania zawsze przekracza 0,8. Następnie policz neurony c-Fos dodatnie w interesujących Cię regionach. Określ, czy immunoreaktywność c-Fos jest obecna w komórkach TH-dodatnich i TH-ujemnych w VTA.

Obraz ten pokazuje, że spożycie tłuszczu lub cukru w różny sposób zwiększa aktywację c-Fos w całym ciele migdałowatym, a także w podobszarach ciała migdałowatego podstawno-bocznego i centralno-korowo-przyśrodkowego. Na tym zdjęciu zaobserwowano rzeczywistą aktywację c-Fos ciała migdałowatego u zwierząt narażonych na spożycie oleju kukurydzianego, glukozy, a także fruktozy. Aktywację C-Fos w VTA obserwowano również u zwierząt narażonych na olej kukurydziany i wodę.

Czarne strzałki wskazują reprezentatywne, podwójnie oznaczone, dodatnie komórki TH c-Fos, podczas gdy szare strzałki wskazują reprezentatywne komórki tylko c-Fos. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przestrzeganiu precyzyjnej metodologii, przechowywania i liczenia.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.