Name: In vitro Demontaż kapsydów wirusa grypy A przez wirowanie gradientowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Poznaj metodę wirowania gradientowego do analizy demontażu kapsydów wirusa grypy A w warunkach imitujących środowisko endosomalne. Technika umożliwia ilościowe badanie wpływu pH na stabilność kapsydów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Yohei Yamauchi i Robercie Mancini za dostarczenie nam odczynników. Laboratorium A. H. było wspierane przez Sieci Szkolenia Początkowego Marie Curie (ITN), Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN) oraz Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (Sinergia).

1. Przygotowanie i roztworów podstawowych
<ol>
	<li>Przygotować bufor MNT (20 mM MES, 30 mM Tris i 100 mM NaCl) rozpuszczając 470 mg chlorowodorku Tris, 390 mg hydratu MES i 580 mg NaCl w 80 ml ddH2O. Dostosować bufor do pH 7,4 i doprowadzić go do końcowej objętości 100 ml za pomocą ddH2O.</li>
	<li>Przygotować trzy identyczne roztwory 500 mM buforu MES, rozpuszczając 9,76 g hydratu MES w 80 ml dH2O każdy. Dostosować odpowiednio do pH 5,8, 5,4 i 5,0, miareczkując stężonym NaOH. Doprowadzić każdy bufor do końcowej objętości 100 ml zdH2O.</li>
	<li>Przygotować dwa identyczne roztwory 500 mM buforu Tris, rozpuszczając 7,88 g chlorowodorku Tris w 80 ml dH2O każdy i dostosować pH odpowiednio do 7,4 i 6,4 przez miareczkowanie stężonym HCI. Doprowadzić bufor do końcowej objętości 100 ml zdH2O.</li>
	<li>Przygotować 50% roztwór glicerolu w dH2O i dobrze wymieszać, aż glicerol zostanie jednorodnie wymieszany. Przefiltruj roztwór przez jednostkę filtrującą Steritop (wielkość porów 0,22 μm) do szklanej butelki.</li>
	<li>Przygotować 10% roztwór NP-40 i 1 M NaCl w dH2O.</li>
	<li>Przygotuj 25x skoncentrowany inhibitor proteazy, rozpuszczając dwie tabletki w 4 ml ddH2O.</li>
</ol>
2. Przygotowanie gradientów glicerolu
<ol>
	<li>Przygotować 5 ml głównego roztworu buforu detergentu (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x skoncentrowany inhibitor proteazy) dla każdego warunku pH do badania (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 i 5,0). W tym celu zmieszać 9 ml 1 M NaCl, 6 ml 10% NP-40, 2,4 ml 25-krotnego inhibitora proteazy i 9 ml ddH20.</li>
	<li>Dla każdego warunku pH odpipetować 4,4 ml mieszanki wzorcowej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>W przypadku wartości pH powyżej 5,8 dodać do probówki 0,6 ml odpowiedniego roztworu podstawowego Tris o dostosowanym pH 500 mM do probówki. Aby uzyskać pH 5,8 i niższe, dodaj 0,6 ml odpowiedniego roztworu podstawowego MES o dostosowanym pH 500 mM.</li>
	<li>Przygotować 5 ml roztworu buforowego zawierającego 300 mM NaCl, 2x inhibitor proteazy, 60 mM Tris dostosowanych do pH 7,4 i ddH2O. Będzie on służył jako bezdetergentowy bufor gradientu sterowania.</li>
	<li>W razie potrzeby dokładnie dostosować pH roztworów do pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 i 5,0, dodając odpowiednio stężone roztwory HCI lub NaOH.</li>
	<li>Dodać 5 ml 50% glicerolu do 5 ml mieszanin buforowych zawierających detergenty i niezawierających detergentów, otrzymując sześć różnych 25% roztworów glicerolu. Sprawdź wartości pH za pomocą pasków wskaźnika pH. 
	UWAGA: W przypadku, gdy zmierzone pH znacznie różni się od pożądanej wartości, odpowiednie roztwory należy ponownie przygotować.</li>
	<li>Przygotować 15% roztwór glicerolu, mieszając 50% glicerolu zdH2Ow stosunku 3:7.</li>
</ol>
3. Ultrawirowanie IAV
<ol>
	<li>Dodać 3 ml 15% roztworu glicerolu do bardzo przezroczystych probówek wirówkowych (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i igły (21 G, 9 cm długości). Nie pozostawiaj kropli na wewnętrznej ściance rury, ponieważ może to zakłócić integralność gradientu. Powtórzyć tę czynność dla łącznie sześciu probówek wirówkowych, po jednej dla każdego z pięciu warunków pH do zbadania i jednej dla próbki kontrolnej.</li>
	<li>Ostrożnie umieścić 3,4 ml 25% roztworu glicerolu pod warstwą 15% glicerolu za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i długiej igły. Uważaj, aby nie mieszać dwóch warstw. Powtórz tę czynność we wszystkich sześciu warunkach, aby przeprowadzić test z odpowiednimi roztworami glicerolu o dostosowanym pH. 
	UWAGA: Pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, aby wykonać następujące kroki.</li>
	<li>Delikatnie nałożyć gradienty glicerolu na 30 μl klarowanego płynu omoczniowego zawierającego IAV (X31, H3N2) rozcieńczonego w 1 ml buforu MNT (odpowiada około 20-30 μg całkowitego białka wirusowego) dla każdego gradientu.</li>
	<li>Zrównoważ przeciwległe rurki i umieść je w wirniku ultrawirówkowym SW41. Wirować przez 150 minut, przy 55 000 x g i w temperaturze 12 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant, tj. obie warstwy glicerolu za pomocą czystej pipety Pasteura i aspiratora. Zawiesić osad w 40 μl (1x) nieredukującym buforze do próbek LDS. Ważne jest, aby kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby całkowicie rozpuścić osad. Przenieść próbkę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
</ol>
4. SDS-PAGE z frakcjami granulek i barwieniem Coomassie
<ol>
	<li>Ogrzewać wszystkie próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut. W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu ich analizy przez SDS-PAGE.</li>
	<li>Załaduj 20 μl rozpuszczonych granulek na wstępnie odlany gradient (4-12%) mini żel Bis-Tris i uruchom przez 1 godzinę przy 200 V w buforze 1x MOPS SDS running buffer.</li>
	<li>Sporządzić roztwór utrwalający z 40% metanolem i 10% lodowatym kwasem octowym w ddH2O.</li>
	<li>Inkubować żel w roztworze utrwalającym przez 1 godzinę i barwić przez noc w 15 cm naczyniu do hodowli komórkowych z wystarczającą ilością koloidalnego roztworu Coomassie, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Ważne jest, aby zamknąć naczynie, aby uniknąć odparowania roztworu barwiącego.</li>
	<li>Odbarwić żel w ddH2O. Wymieniaj ddH2O co 15-20 minut, aż tło żelu stanie się czyste. Przechowywać żel w ddH2O w temperaturze 4 °C do czasu zeskanowania w celu określenia ilościowego pasma.</li>
	<li>Zeskanuj żel w wysokiej rozdzielczości i użyj dostępnego na rynku lub dostosowanego do potrzeb klienta oprogramowania do ilościowego określania intensywności pasm białkowych. Odjąć sygnał tła z obszaru znajdującego się w pobliżu odpowiednich pasm i znormalizować te wartości do próbek kontrolnych niezawierających detergentów (przy pH 7,4).</li>
</ol>

<ol><li>Taubenberger, J. K., Kash, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+Virus+Evolution%2C+Host+Adaptation%2C+and+Pandemic+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation.</a> Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).</li>
<li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry%3A+the+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).</li>
<li>de Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+influenza+a+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS pathogens. 7 (3), e1001329(2011).</li>
<li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).</li>
<li>Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+influenza+virus+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells.</a> J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).</li>
<li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).</li>
<li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+virus+entry+via+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Dissecting virus entry via endocytosis.</a> J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).</li>
<li>Yoshimura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+Cell+Entry+Mechanism+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus.</a> Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).</li>
<li>White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-fusion+activity+of+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane-fusion activity of influenza virus.</a> Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).</li>
<li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins%3A+The+viral+matrix+protein+%28M1%29+promotes+export+and+inhibits+import%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import.</a> Cell. 67 (1), 117-130 (1991).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).</li>
<li>Chou, Y. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+Different+Influenza+Viral+RNA+Segments+in+the+Cytoplasm+before+Viral+Budding+as+Shown+by+Single-molecule+Sensitivity+FISH+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis.</a> PLoS Pathog. 9 (5), e1003358(2013).</li>
<li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+incoming+influenza+virus+nucleocapsids+into+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus.</a> Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).</li>
<li>Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+M1+protein+and+low+pH+on+nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins.</a> Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-Controlled+Two-Step+Uncoating+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus.</a> Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).</li>
<li>Stauffer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+priming+by+acidic+pH+and+high+K%2B+is+required+for+efficient+uncoating+of+influenza+A+virus+cores+after+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration.</a> Journal of Virology. , (2014).</li>
<li>Zhirnov, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+of+matrix+protein+M1%2FM+from+virions+occurs+at+different+pH+for+orthomyxo-+and+paramyxoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses.</a> Virology. 176 (1), 274-279 (1990).</li>
<li>Banerjee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+uses+the+aggresome+processing+machinery+for+host+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry.</a> Science. 346 (6208), 473-477 (2014).</li>
<li>Huotari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cullin-3+regulates+late+endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cullin-3 regulates late endosome maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).</li>
<li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylase+8+Is+Required+for+Centrosome+Cohesion+and+Influenza+A+Virus+Entry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002316(2011).</li>
<li>Bachmayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Solubilization+of+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+from+Influenza+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses.</a> Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).</li>
<li>Reginster, M., Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Characterization+of+Influenza+Virus+Cores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores.</a> Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).</li>
<li>Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+Investigation+on+the+Fine+Structure+of+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus.</a> Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).</li>
<li>Schulze, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+influenza+virus%3A+II.+A+model+based+on+the+morphology+and+composition+of+subviral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles.</a> Virology. 47 (1), 181-196 (1972).</li>
<li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li>
<li>Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+virus+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of virus uncoating.</a> Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).</li>
<li>Yamauchi, Y., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+entry+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Virus entry at a glance.</a> Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+Influenza+C+Viruses%2C+Distinct+from+That+of+Influenza+A+and+B+Viruses+Requires+Neutral-Alkaline+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH.</a> Virology. 200 (1), 284-291 (1994).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kapsydy wirusowe są metastabilnymi kompleksami makromolekularnymi. Podczas gdy składanie wirionów wymaga enkapsydacji i kondensacji genomu wirusa, rozpoczęcie kolejnej rundy infekcji zależy od demontażu tej zwartej struktury kapsydu. Wirusy ewoluowały, aby wykorzystywać różne mechanizmy komórkowe do kontrolowania cyklu powlekania-odsłaniania, w tym receptory komórkowe, białka opiekuńcze, enzymy proteolityczne, siły fizyczne dostarczane przez białka motoryczne lub helikazy, a także pH i przełączniki jonowe26,27...

Wirus grypy A (IAV) jest wirusem otoczkowym i należy do rodziny Orthomyxoviridae. Jego geny są zakodowane w segmentowanym, jednoniciowym genomie RNA o ujemnym sensie. U ludzi IAV powoduje infekcje dróg oddechowych, które występują w sezonowych epidemiach i mogą prowadzić do globalnych pandemii1. Po związaniu się z resztami kwasu sjalowego na powierzchni komórki gospodarza2, IAV jest internalizowany przez endocytozę zależną od klatryny i szlaki niezależne od klatryny3-8. Środowisko kwaśne (pH < 5,5) w wakuolach endocytarnych wywołuje poważną zmianę konformacyjną w hemaglutyninie (HA) glikoproteiny kolca IAV, co powoduje fuzję wirusa i późnej błony endosomalnej9. Gdy kapsyd IAV (określany również jako "rdzeń" wirusa) ucieknie z późnych endosomów (LE), jest on odsłaniany w cytozolu, a następnie transportowany przez rybonukleoproteiny wirusa (vRNP) do jądra - miejsca replikacji i transkrypcji wirusa10-13. Przed kwasową aktywacją kwasu hialuronowego wirus doświadcza stopniowego spadku pH w układzie endocytarnym, co przygotowuje rdzeń do jego późniejszego rozkładu14-16. W tym etapie "torowania" kanały jonowe M2 w błonie wirusowej pośredniczą w napływie protonów i K+10,14,16. Zmiana stężenia jonów we wnętrzu wirusa zaburza interakcje budowane przez białko macierzy wirusa M1 i osiem wiązek vRNP oraz ułatwia odwarstwianie się IAV w cytoplazmie po fuzji błonowej10,14-17.
Bezpośrednia i ilościowa analiza etapu primingu została utrudniona przez fakt, że endosomy są trudno dostępne eksperymentalnie. Co więcej, proces wejścia jest wysoce niesynchroniczny. Ponadto testy punktu końcowego, takie jak qRT-PCR uwolnionego wirusowego RNA lub pomiary zakaźności, nie dają szczegółowego obrazu stanu biochemicznego kapsydu wirusa na żadnym etapie wprowadzenia. Podczas gdy zaburzenia endosomów przez siRNA lub leczenie farmakologiczne znacząco przyczyniły się do zrozumienia wejścia IAV18-20, dostrojenie jest trudne i podatne na niespecyficzne skutki uboczne w ściśle kontrolowanym programie dojrzewania endosomów.
Aby uniknąć tych problemów, dostosowaliśmy wcześniej opracowany protokół in vitro oparty na wykorzystaniu wirowania w gradiacji prędkości17. W przeciwieństwie do innych prób 21,22,23,24, które w większości opierały się na kombinacjach rozszczepienia proteolitycznego i obróbki detergentem, a następnie analizie EM, podejście to umożliwiło łatwo wymierny wynik. Wirowanie przez różne warstwy gradientu pozwala na wystawienie cząstek sedymentacyjnych na działanie zmieniających się warunków i reagowanie z nimi w kontrolowany sposób. W przedstawionym protokole IAV pochodzący z oczyszczonego płynu omoczniowego lub oczyszczonych cząstek wirusa jest sedymentowany do dwuwarstwowego gradientu glicerolu, w którym dolna warstwa zawiera niejonowy detergent NP-40 (ryc. 1). Gdy wirus dostaje się do drugiej, zawierającej detergent warstwy, wirusowa otoczka lipidowa i glikoproteiny otoczki są delikatnie rozpuszczane i pozostawiane. Rdzeń, złożony z ośmiu wiązek vRNP i otoczony warstwą matrycy, osadza się jako stabilna struktura we frakcji osadów. Białka rdzenia wirusa, takie jak nukleoproteina (NP) związana z M1 i vRNP, można zidentyfikować w osadzie za pomocą barwienia SDS-PAGE i Coomassie. W szczególności, wykorzystanie dostępnych na rynku żeli gradientowych i barwienie bardzo czułym koloidalnym Coomassie25, umożliwia wysoką precyzję i wykrywanie nawet niewielkich ilości białek związanych z rdzeniem wirusa.
To stanowi podstawę do testowania, czy różne warunki, takie jak pH, stężenie soli i przypuszczalne czynniki niepowlekania, mają wpływ na zachowanie sedymentacji składników rdzenia i stabilność rdzenia. W tym celu tylko dolna, zawierająca detergent warstwa w gradieniu glicerolu jest modyfikowana poprzez wprowadzenie czynnika lub warunku będącego przedmiotem zainteresowania. Technika ta okazała się szczególnie cenna w badaniu wpływu różnych wartości pH i stężeń soli na integralność rdzeniaIAV 16. Można monitorować pośrednie etapy odwarstwiania IAV, w tym dysocjację warstwy matrycy przy lekko kwaśnym pH (<6,5), a następnie dysocjację vRNP przy pH 5,5 i niższym16,17 (ryc. 1). Ten ostatni etap został dodatkowo wzmocniony przez obecność wysokiego stężenia K+ w warstwie glicerolu, odzwierciedlającego późne środowisko endocytarne16. W ten sposób, gdy wirus i rdzeń sedymentowały przez gradient, doświadczyły zmieniającego się środowiska, które naśladuje warunki panujące w endosomach. Rezultatem był stopniowy demontaż rdzenia wirusa in vitro, uzupełniający wyniki uzyskane z testów biologii komórki.
Przedstawiona tutaj metoda umożliwiła szybką i wysoce powtarzalną analizę IAV (X31 i A/WSN/33) oraz IBV (B/Lee/40) wywołaną kwaśnym pH i wzrostem K+16,17, a także demontaż rdzeni paramyksowirusa po ekspozycji na zasadowe pH17. Niewykluczone, że podejście to można dostosować do innych wirusów otoczkowych, aby uzyskać wgląd w właściwości biochemiczne struktury kapsydu wirusa i rozkładu kapsydu podczas wnikania do komórki.

<table><tbody><tr><td>cOmplete&trade;, Tabletki inhibitora proteazy bez EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11873580001</td><td>Roztwór podstawowy można przechowywać w temperaturze od 2 do 8 stopni; C przez 1 do 2 tygodni</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Merck Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol bezwodny BioChemica</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Merck Millipore</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Igła do wstrzykiwań długich (21&nbsp; G, 9 cm, skośny lub koniec)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrat MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td>Teraz dostępny w sprzedaży jako IGEPAL&reg; CA-630</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini żele, 10&nbsp; studzienki, 1,0 mm</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek NuPAGE LDS (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do biegania NuPAGE MOPS SDS (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Paski wskaźnikowe pH, pH 4,0-7,0</td><td>Merck Millipore</td><td>109542</td><td></td></tr><tr><td>QC Koloidalna plama Coomassie</td><td>BIO RAD</td><td>1610803</td><td></td></tr><tr><td>sodu chlorek</td><td>Merck Millipore</td><td>106406</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Merck Millipore</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca Steritop</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti, zestaw wirników ultrawirówek</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenny, Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe, 13.2&nbsp; ml, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tris chlorowodorek&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td></td></tr><tr><td>X31 Wirus grypy A (H3N2), wyhodowany w jajach, klarowany płyn omoczniowy</td><td>Virapur</td><td></td><td>Świeżo rozmrożony na 4 & stopni; Z</td></tr></tbody></table>

in vitro demontaż kapsydów wirusa grypy a przez wirowanie gradientowe

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Procesy molekularne wywołane kwasem ściśle kontrolują wnikanie do komórek wielu wirusów, które dostają się przez system endocytarny. W przypadku wirusa grypy A (IAV) fuzja wirusa z błoną endosomalną, a następnie demontaż kapsydu wirusa, zwany odwarstwieniem, jest regulowany warunkami jonowymi wewnątrz pęcherzyków endocytarnych. Wczesne etapy cyklu życiowego wirusa są trudne do zbadania, ponieważ nie można uzyskać bezpośredniego dostępu do endosomów eksperymentalnie, co stwarza potrzebę podejścia in vitro. W tym miejscu opisano metodę opartą na wirowaniu w gradiencie prędkości oczyszczonych wirionów za pomocą dwuwarstwowego gradientu glicerolu, który umożliwia analizę rdzenia IAV i jego stabilności. Gradient zawiera niejonowy detergent (NP-40) w dolnej warstwie, który usuwa błonę wirusową przez solubilizację, gdy wirus osadza się w kierunku dna. Przy neutralnym pH rdzenie wirusów są granulowane jako stabilne struktury. Główne składniki rdzenia, białko macierzy (M1) i rybonukleoproteiny wirusa (vRNP), można wyraźnie zidentyfikować we frakcji osadu za pomocą SDS-PAGE. Obniżenie pH do 6,0 lub mniej w dolnej warstwie selektywnie usuwa M1 z osadu, a następnie uwalnia vRNP w bardziej kwaśnych warunkach. Prążki białek wirusowych na żelach barwionych Coomassie można poddać kwantyfikacji densytometrycznej w celu monitorowania pośrednich stanów rozkładu IAV. Oprócz pH można ocenić inne czynniki wpływające na stabilność rdzenia wirusa, takie jak stężenie soli i przypuszczalne czynniki powodujące powstawanie powłok wirusowych, po prostu odpowiednio modyfikując warstwę glicerolu zawierającą detergent. Reasumując, prezentowana technika pozwala na wysoce powtarzalną i ilościową analizę odsłaniania wirusa in vitro. Może być stosowany do innych wirusów otoczkowych, które przechodzą złożone procesy odwarstwiania.

Jak już omówiono, inicjacja w endosomach jest niezbędna, aby rdzeń IAV stał się zdolny do odszycia. Protonowanie rdzenia osłabia oddziaływanie między M1 a vRNP (składającymi się z wirusowego RNA, NP oraz kompleksu polimerazy PB1/PB2/PA). Proces ten rozpoczyna się, gdy wnikający wirus zostaje wystawiony na pH 6.5 (lub niższe) w wczesnych endosomach (EE) i trwa do momentu fuzji wirusa przy pH około 5.0 w LE.
Aby naśladować spadek ...

Demontaż rdzeni wirusa grypy A podczas wnikania wirusa do komórek gospodarza jest procesem wieloetapowym. Opisujemy metodę in vitro do analizy wczesnych etapów odsłaniania się wirusa. W tym podejściu wirowanie w gradionym tempie służy do biochemicznej analizy etapów, które inicjują odwarstwianie w określonych warunkach.

In vitro Demontaż kapsydów wirusa grypy A przez wirowanie gradientowe

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Ogólnym celem tej wirowania w gradiencie gęstości metodą prędkości sedymentacji jest analiza kapsydów wirusa grypy A w warunkach naśladujących środowisko endocytarne, z którym wirusy zetknij się podczas wnikania do komórki. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób kapsydy wirusa grypy A ulegają rozpadowi podczas wnikania do komórki, np. w kwestii specyficznego wpływu lekko kwaśnego pH na stabilność kapsydu. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ilościową analizę procesu odnowienia wirusa grypy A w określonych warunkach eksperymentalnych.Poza dostarczeniem wiedzy na temat tego, jak inicjowany jest proces odwirusowienia wirusa grypy A, metodę tę można zastosować również do badania innych wirusów otoczkowych o podobnych mechanizmach odwirusowania. Procedurę zaprezentuje Firat Nebloglu, były student z mojego laboratorium. Po przygotowaniu buforów i odczynników zapasowych zgodnie z protokołem tekstowym, dla każdego badanego poziomu pH należy przygotować mieszaninę główną (master mix) buforu detergentowego, mieszając 9 ml 1 M NaCl, 6 ml 10% NP40, 2,4 ml 25X zapasu inhibitora proteaz oraz 9 ml wody dwukrotnie destylowanej.Następnie dla każdego z warunków pH pipetuj 4,4 mililitra mieszaniny głównej (master mix) do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. Dla wartości pH powyżej 5,8 dodaj do probówki 0,6 mililitra odpowiedniego roztworu stokowego Tris 500 milliMolar o dostosowanym pH. Dla wartości pH 5,8 i niższych dodaj 0,6 mililitra odpowiedniego roztworu stokowego MES 500 milliMolar o dostosowanym pH.Przygotować pięć mililitrów roztworu buforowego zawierającego 300 mM chlorku sodu, 2X inhibitor proteaz, 60 mM Tris, z pH dostosowanym do 7,4, oraz wodę dwukrotnie destylowaną. Będzie on służył jako bufor gradientowy kontrolny bez detergentu. Następnie dodać pięć mililitrów 50% zapasu glicerolu do pięciu mililitrów mieszanin buforowych z detergentem i bez detergentu, otrzymując sześć różnych 25% roztworów glicerolu.Użyj pasków wskaźnikowych pH, aby zweryfikować wartości pH. Przygotuj 15% roztwór glicerolu, mieszając roztwór stokowy 50% glicerolu z wodą destylowaną w stosunku od trzech do siedmiu. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 mL i igły, dodaj 3 mL 15% roztworu glicerolu do sześciu ultraczystych probówek do wirowania.Po każdym kroku płucz igłę w wodzie dwukrotnie destylowanej. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i długiej igły ostrożnie wstrzyknij 3,4 ml 25% roztworu glicerolu pod warstwę 15% glicerolu, dbając o to, aby nie wymieszać obu warstw. Granica między obiema warstwami jest wyraźnie widoczna.Powtórz tę procedurę dla wszystkich sześciu warunków testowych, używając odpowiednich roztworów glicerolu o dostosowanym pH. Następnie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II, użyj jednego mililitra klarownego, rozcieńczonego płynu allantoisowego zawierającego wirus grypy A, aby delikatnie nałożyć go na gradienty glicerolu. Przenieś probówki do wiader rotora, zrównoważ przeciwległe probówki i ostrożnie umieść je w schłodzonym wcześniej rotorze do ultrawirowania SW-41.Wiruj przy 2100 rpm i 12 stopniach Celsjusza przez 150 minut. Po wirowaniu, używając czystej pipety Pasteura i aspiratora, ostrożnie usuń obie warstwy glicerolu. Następnie, za pomocą 40 mililitrów 1X nieredukującego buforu do próbek LDS, całkowicie resuspenduj osad poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieś próbkę do probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5 mililitra.Aby przeprowadzić SDS-PAGE, należy podgrzać wszystkie próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Na gotowy gradientowy mini-żel Bis-Tris należy nanieść 20 µL rozpuszczonych osadów i prowadzić elektroforezę przy napięciu 200 V przez jedną godzinę w 1X buforze do elektroforezy MOPS SDS. Żel należy inkubować w roztworze utrwalającym przez jedną godzinę.Przepłucz jeden do dwóch razy wodą, a następnie barw przez noc w 15-centymetrowej szalce do hodowli komórkowych w wystarczającej objętości roztworu koloidalnego Coomassie, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Odbarwiaj żel w wodzie dwukrotnie destylowanej, wymieniając ciecz co 15 do 20 minut, aż tło żelu stanie się przejrzyste. Przechowuj żel w wodzie dwukrotnie destylowanej w temperaturze 4°C do momentu zeskanowania w celu kwantyfikacji prążków.Na koniec zeskanuj żel w wysokiej rozdzielczości i użyj dostępnego komercyjnie, specjalistycznego oprogramowania do kwantyfikacji intensywności prążków białkowych. Odejmij sygnał tła z obszaru znajdującego się blisko odpowiednich prążków i znormalizuj wartości względem wartości kontrolnych bez dodatku detergentu. W tym eksperymencie X31 wyizolowany z klarownego płynu allantoisowego poddano wirowaniu w gradiencie prędkości przy wartościach pH od 7,4 do 5,0, a następnie przeanalizowano metodą SDS-PAGE.W przypadku braku detergentu w gradiencie, nienaruszone wiriony osadzają się w postaci pelletu, co odzwierciedla charakterystyczny wzór prążków reprezentujących HA, NP i M1 w żelu barwionym Coomassie. Po dodaniu NP40 do dolnej warstwy glicerolu, otoczka wirusowa, zawierająca HA, NA i M2, uległa solubilizacji, a podczas ultrawirowania w pellet osadził się jedynie rdzeń wirusa. Począwszy od pH poniżej 6,5, białko M1 jest stopniowo usuwane z frakcji pelletu, osiągając minimum w zakresie pH od 5,8 do 5,4.Poniżej pH 5,8 vRNP ulegały dysocjacji, a w konsekwencji nie pozostawały w osadzie. Analiza prążków białkowych ujawniła dwa odrębne progi pH dla rozpadu warstwy M1 oraz dysocjacji pęczków vRNP, wynoszące odpowiednio pH 6,5 i pH 5,8. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że w zależności od konkretnego szczepu lub mutantu wirusa grypy A mogą być obserwowane różne właściwości rozpadu.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia elektronowa, aby uzyskać dodatkowe informacje, np. na temat struktury wyizolowanych kapsydów wirusa grypy.

in-vitro-disassembly-influenza-virus-capsids-gradient

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Genom wirusa grypy typu A składa się z ośmiu oddzielnych kompleksów RNA i białek, zwanych wirusowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi (vRNP). Niniejsza praca opisuje oczyszczanie vRNP wirusa grypy A w gradiencie glicerolu oraz ich wizualizację za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy A

Opisujemy proces izolacji wysokiej czystości DNA nukleokapsydu herpeswirusa z zainfekowanych komórek. Końcowe DNA odzyskane z roztworu charakteryzuje się wysokim stężeniem i czystością, co czyni je idealnym do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, reakcji PCR o wysokiej wierności oraz transfekcji w celu otrzymania nowych rekombinantów wirusowych.

Przygotowanie viralnego DNA z nukleokapsydów

Odsłonięcie (uncoating) jest kluczowym etapem wczesnej fazy cyklu życiowego HIV-1 i definiuje się je jako rozpad otoczki kapsydu oraz uwolnienie wirusowego kompleksu rybonukleoproteinowego (vRNP). W niniejszej pracy prezentujemy techniki izolacji nienaruszonych rdzeni z wirionów HIV-1 oraz metody ilościowego oznaczania ich odsłaniania in vitro.

In vitro rozpakowywanie rdzeni HIV-1

Opisano prosty, wydajny i niezawodny sposób synchronizacji dostarczania wielu komponentów wirusowych do komórek roślinnych za pomocą przejściowej ekspresji pośredniczonej przez Agrobacterium. Podejście to umożliwia badanie replikacji i enkapsydacji, a następnie ponowne składanie komponentów niewirusowych in vitro w pozbawione genomu optyczne „duchy” wirusowe (viral ghosts), odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Prosta i niezawodna metoda in vivo oraz in vitro do badania składania wirusów

Wirusy grypy replikują swój genom RNA w powiązaniu z chromatyną komórki gospodarza. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę oczyszczania nienaruszonych kompleksów wirusowych rybonukleoprotein z chromatyny zainfekowanych komórek. Oczyszczone kompleksy wirusowe można analizować zarówno za pomocą techniki Western blot, jak i metody przedłużania starterów w celu oceny zawartości białek i RNA.

Oczyszczanie powinowactwem kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Source: Stauffer, S. et al. In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the pH-dependent disassembly of influenza A virus (IAV) cores using gradient ultracentrifugation. It outlines glycerol gradient preparation, ultracentrifugation, and how different pH conditions affect IAV core disassembly.

In Vitro Disassembly of the Influenza A Virus Core Using pH-Controlled Gradient Centrifugation

Source: Stauffer, S. et al., In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the effect of pH on the solubilization of influenza A viral cores. Gel electrophoresis and protein staining reveal the progressive disassembly of the core structure under acidic conditions.

Visualizing the Effect of pH on Solubilization of the Influenza A Viral Core

Rutynowe metody wykrywania wykorzystujące amplifikację genomu wirusa są ograniczone przez ich niezdolność do odróżnienia cząsteczek zakaźnych od niezakaźnych. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów alternatywnych metod wspomagających dyskryminację zakaźnych cząstek norowirusa za pomocą wiązania aptamerów, dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Alternatywne metody in vitro do oznaczania integralności strukturalnej kapsydu wirusa

Rekombinowana integraza retrowirusowa i oligomery DNA naśladujące końcówki DNA wirusa mogą tworzyć enzymatycznie aktywny kompleks znany jako intasom. Intasomy mogą być wykorzystywane do badań biochemicznych, strukturalnych i kinetycznych. Protokół ten szczegółowo opisuje, jak składać i oczyszczać prototypowe pieniste intasomy wirusa.

Montaż i oczyszczanie prototypowych pienistych intasomów wirusowych

Wirus związany z adenowirusem jest wytwarzany w hodowli komórek zawiesinowych i oczyszczany przez wirowanie w gradiacji gęstości podwójnego jodixanolu. Uwzględniono kroki mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się wirusa i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego. Oczekiwane końcowe miana osiągają10-12 cząstek wirusa/ml i nadają się do przedklinicznego stosowania in vivo.

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

Poznaj metodę wirowania gradientowego do analizy demontażu kapsydów wirusa grypy A w warunkach imitujących środowisko endosomalne. Technika umożliwia ilościowe badanie wpływu pH na stabilność kapsydów.

In vitro Demontaż kapsydów wirusa grypy A przez wirowanie gradientowe

Przeglądaj więcej filmów