In vitro Demontaż kapsydów wirusa grypy A przez wirowanie gradientowe

Ogólnym celem tego wirowania w gradiencie prędkości jest analiza kapsydów wirusa grypy A w warunkach naśladujących środowisko endocytarne, z którym nawiązujące wirusy napotykają podczas wnikania do komórki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób kapsydy wirusa grypy A rozkładają się podczas wnikania do komórki, takie jak specyficzny wpływ lekko kwaśnego pH na stabilność kapsydu. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona analizę ilościową procesu odsłaniania wirusa grypy A w określonych warunkach eksperymentalnych.

Oprócz zapewnienia wglądu w to, w jaki sposób rozpoczyna się proces odsłaniania wirusa grypy A, metoda ta może być również zastosowana do badania innych wirusów otoczkowych z powiązanymi mechanizmami odwarstwiania. Procedurę zademonstruje Firat Nebloglu, były student z mojego laboratorium. Po przygotowaniu podstawowych i odczynników zgodnie z protokołem tekstowym, dla każdego warunku pH do przetestowania, należy przygotować główną mieszankę buforu detergentu, mieszając dziewięć mililitrów jednego molowego chlorku sodu, sześć mililitrów 10% NP40, 2,4 mililitra zapasu inhibitora proteazy 25X i dziewięć mililitrów podwójnie destylowanej wody.

Następnie dla każdego warunku pH odpipetować 4,4 mililitra mieszanki wzorcowej do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. W przypadku wartości pH powyżej 5,8 dodaj do probówki 0,6 mililitra odpowiedniego 500-milimolowego roztworu podstawowego Tris o dostosowanym pH do probówki. W przypadku wartości pH 5,8 i niższych dodaj 0,6 mililitra odpowiedniego 500-milimolowego roztworu podstawowego MES o dostosowanym pH.

Przygotuj pięć mililitrów roztworu buforowego zawierającego 300 milimolowy chlorek sodu, 2X inhibitor proteazy, 60 milimolowy Tris, dostosowany do pH 7,4 i podwójnie destylowaną wodę. Będzie on służył jako bezdetergentowy bufor gradientu sterowania. Następnie dodaj pięć mililitrów 50% glicerolu do pięciu mililitrów mieszanin buforowych zawierających detergenty i bezdetergentowych, otrzymując sześć różnych roztworów 25% glicerolu.

Użyj pasków pH, aby sprawdzić wartości pH. Przygotuj 15% roztwór glicerolu, mieszając proporcje od trzech do siedmiu 50% glicerolu z wodą destylowaną. Za pomocą pięciomililitrowej strzykawki i igły dodaj trzy mililitry 15% roztworu glicerolu do sześciu ultraprzezroczystych probówek wirowych.

Po każdym kroku umyj igłę w wodzie podwójnie destylowanej. Użyj pięciomililitrowej strzykawki i długiej igły, aby ostrożnie wstrzyknąć 3,4 mililitra 25% roztworu glicerolu pod warstwę 15% glicerolu, uważając, aby nie wymieszać dwóch warstw. Interfejs między obiema warstwami jest wyraźnie widoczny.

Powtórz tę czynność we wszystkich sześciu warunkach, aby przeprowadzić test z odpowiednimi roztworami glicerolu o dostosowanym pH. Następnie, w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, użyj jednego mililitra oczyszczonego, rozcieńczonego płynu omoczniowego, zawierającego wirusa grypy A, aby delikatnie nałożyć gradienty glicerolu. Przenieś probówki do wiader wirnika, zrównoważ przeciwległe rury i ostrożnie umieść je we wstępnie schłodzonym wirniku ultrawirówkowym SW-41.

Wirować z prędkością 2100 obr./min i 12 stopni Celsjusza przez 150 minut. Po odwirowaniu użyj czystej pipety Pasteura i aspiratora, aby ostrożnie usunąć obie warstwy glicerolu. Następnie, za pomocą 40 mililitrów nieredukującego buforu do próbek LDS 1X, całkowicie ponownie zawieś osad, pipetując w górę iw dół przed przeniesieniem próbki do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej.

Aby przeprowadzić SDS-PAGE, podgrzej wszystkie próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Załaduj 20 mikrolitrów rozpuszczonych granulek na prefabrykowany gradientowy mini-żel Bis-Tris i pracuj pod napięciem 200 woltów przez godzinę w buforze do pracy 1X MOPS SDS. Inkubować żel w roztworze utrwalającym przez godzinę.

Spłucz raz do dwóch razy wodą i zabarwij przez noc w 15-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych wystarczającą ilością koloidalnego roztworu Coomassie, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Odbarwić żel w wodzie podwójnie destylowanej, wymieniając płyn co 15 do 20 minut, aż tło żelu stanie się czyste. Przechowuj żel w podwójnie destylowanej wodzie o temperaturze czterech stopni Celsjusza, dopóki nie zostanie zeskanowany w celu ilościowego określenia pasma.

Na koniec zeskanuj żel w wysokiej rozdzielczości i użyj dostępnego na rynku oprogramowania dostosowanego do ilościowego określania intensywności pasm białkowych. Odejmij sygnał tła z obszaru znajdującego się w pobliżu odpowiednich pasm i znormalizuj wartości do wartości kontrolnych bez detergentów. W tym eksperymencie X31 pochodzący z oczyszczonego płynu omoczniowego poddano wirowaniu w gradiencie prędkości przy poziomach pH od 7,4 do 5,0 i przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE.

Bez detergentu obecnego w gradiencie, nienaruszone wiriony są granulowane, co odzwierciedla charakterystyczny wzór pasm, reprezentujący HA, NP i M1 w żelu barwionym Coomassie. Po dodaniu NP40 do dolnej warstwy glicerolu, otoczka wirusa, w tym HA, NA i M2, została rozpuszczona, a sam rdzeń wirusa osadzony w osadzie podczas ultrawirowania. Począwszy od pH poniżej 6,5, M1 jest stopniowo tracony z frakcji granulek, osiągając minimum między pH 5,8 a pH 5,4.

Poniżej pH 5,8 vRNP uległy dysocjacji, a tym samym zostały utracone z osadu. Z analizowanych prążków białkowych ujawniono dwa odrębne progi pH dla demontażu warstwy M1 i dysocjacji wiązek vRNP, w tym odpowiednio pH 6,5 i pH 5,8. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że w zależności od konkretnego szczepu lub mutanta wirusa grypy A można zaobserwować różne właściwości demontażu.

Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia elektronowa, w celu uzyskania dodatkowych informacji, takich jak struktura izolowanych kapsydów wirusa grypy.