Name: Badanie sygnalizacji Wnt podczas wzorcowania przewodzenia dróg oddechowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Poznaj metody badania sygnalizacji Wnt w rozwoju dróg oddechowych u myszy. Techniki barwienia i mikroskopii pozwalają analizować wzorcowanie tchawicy oraz formowanie chrząstki u embrionów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za pomoc Mike'owi Muntiferingowi i Mattowi Kofronowi w obrazowaniu konfokalnym oraz Gail Macke w procedurach histologicznych. Prace te były częściowo wspierane przez National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 do D.S.).

Zwierzęta były trzymane w warunkach wolnych od patogenów. Myszy obchodzono się zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez CCHMC Institutional Animal Care and Use Committee (Cincinnati, OH USA). Myszy wykorzystywane w tych badaniach były utrzymywane w mieszanym tle.
1. Barwienie całego górnika X-galaktozydazy
<ol>
	<li>Poddać eutanazji ciężarną kobietę w wieku od E11,5 do E14,5 przez wdychanie CO2 . Umieść zwierzęta w komorze CO2, naładuj komorę CO2 . Trzymaj zwierzęta w komorze przez minimum 5 minut. Wykonać wtórną metodę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Oczyść okolice brzucha etanolem (EtOH) 70% i wykonaj laparotomię z pojedynczym nacięciem linii środkowej brzucha. Używaj nożyczek chirurgicznych i kleszczy o standardowym wzorze (prostym ząbkowanym).</li>
	<li>Odizoluj rogi macicy za pomocą kleszczy i cienkich nożyczek i natychmiast umieść tkankę na szalce Petriego zawierającej schłodzony roztwór PBS. Utrzymuj tkankę na lodzie do momentu przystąpienia do izolacji zarodków.</li>
	<li>Odizoluj zarodki z rogów macicy. Wypreparować embrionalną tkankę płucną tchawicy za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Użyj kleszczyków i nożyczek z cienką końcówką, aby przytrzymać i nakłuć tkankę macicy i poczęcie, uwalniając zarodki.
	<ol>
		<li>Usuń pozostałe błony zarodkowe. Za pomocą ostrzy igieł odetnij głowę zarodków i dolną część ciała poniżej przepony. Zlokalizuj wątrobę jako punkt orientacyjny.</li>
		<li>Po wyizolowaniu okolicy piersiowej zarodka przystąp do usuwania bocznych stron ściany ciała, kręgosłupa i serca za pomocą ostrzy igieł. Zachowaj ostrożność podczas usuwania serca, aby uniknąć uszkodzenia tkanki tchawicy. Na koniec ostrożnie oddziel przełyk od tchawicy, ciągnąc przełyk za pomocą ostrzy igieł. Utrzymuj tkankę w roztworze PBS na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić tkankę w 4 ml fiolkach z zakrętką za pomocą pipet szklanych lub transferowych. Utrwalić tchawiczą tkankę płucną w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS przez 30 min. Po utrwaleniu spłucz tkankę PBS. Podczas płukania przygotować roztwór barwiący X-gal (dodać 5 mM K3Fe(CN)6, (100 μl 0,5 M zapasu) 5 mM K4Fe(CN)6 (100 μl 0,5 M zapasu) 2 mM MgCl2, (20 μl 1 M zapasu) 0,01% NaDOC (50 μl 2% zapasu), 0,02% NP4O (100 μl 2% zapasu), 1 mg/ml X-gal (500 μl z 20 mg/ml podstawy) i 9,13 ml wody destylowanej do uzyskania końcowej objętości 10 ml).</li>
	<li>Usunąć resztki PBS i dodać 2 ml roztworu barwiącego X-gal do szklanej fiolki. Umieścić fiolki na tacy na shakerze. Barwieć tkanki przez 1 do 2 godzin w roztworze barwiącym X-gal. Inkubować tkankę w roztworze X-gal przez 4 godziny w celu dalszego przetwarzania i zatopienia.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję, przemywając tkanki w 3% dimetylosulfotlenku-PBS. Spłucz w PBS, 3 razy po 5 minut każde mycie i przechowuj w 70% etanolu.</li>
	<li>Napełnij szalki Petriego 1% roztworem agarozy/PBS. Pozwól agarozie stężać. Za pomocą szklanych pipet transferowych umieść tkankę na płytkach pokrytych agarozą wypełnionych roztworem PBS. Sfotografuj całe mocowania za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Wybierz odpowiedni filtr dla jasnego pola.</li>
	<li>Aby lepiej rozróżnić miejsca barwienia X-gal, należy pobrać próbki z procesu do zatapiania i cięcia parafiny. Umieść próbki w kasetach z drobnym sitem.
	<ol>
		<li>Aby przetworzyć próbki do zatapiania w parafinie, użyj automatycznego procesora i ustaw krótki cykl w następujący sposób: sześć zmian alkoholu: 5 minut pierwszej zmiany i 3 minuty na każdą pozostałą zmianę. Trzy zmiany ksylenu: 5 min pierwsza zmiana i 3 min następne dwie zmiany. Poprzednie kroki są wykonywane w temperaturze 30 °C. Na koniec należy wykonać trzy zmiany parafiny w temperaturze 62 °C: 25 min, 8 min i 5 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić próbki do zatopienia z tkanką leżącą płasko na dnie łodzi do zatapiania. Ostrożnie dodaj parafinę, aby wypełnić łódkę do zatapiania. Natychmiast schłodzić na zimnej płycie stacji zatapiania do momentu zestalenia się parafiny. Usuń blok z łodzi do osadzania. Za pomocą mikrotomu wygeneruj skrawki o wielkości 6 μm. Zamontuj sekcje na szkiełkach wstępnych i suchych szkiełkach na podgrzewaczu do szkiełków ustawionym na 42 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Piecz szkiełka przez noc w piekarniku w temperaturze 56 ºC. Umieść szkiełka w rusztach. Deparafinizuj szkiełka z trzema zmianami 100% ksylenu każda, 10 minut każda. Użyj naczyń barwiących wypełnionych 200 ml ksylenu.</li>
	<li>Ponownie uwodnić szkiełka za pomocą stopniowanej serii EtOH (100%, 70%, 50% i 30%, 1 minuta na krok) do PBS przed barwieniem przeciwstawnym za pomocą Nuclear Fast Red przez 10 do 30 sekund. Spłucz szkiełka wodą z kranu trzy razy przez 5 minut za każdym razem, aby usunąć nadmiar Nuclear Fast Red.</li>
	<li>Odwodnić szkiełka w stopniowanej serii EtOH (50%, 70% i 100% EtOH) przed umyciem trzema zmianami ksylenu (20 zanurzeń na każdą zmianę) i poślizgnięciem pokrywy za pomocą środków montażowych na bazie ksylenu.</li>
</ol>
2. Barwienie lektyny
<ol>
	<li>Rozciąć tkankę tchawicy płuc E13.5 i E14.5 zgodnie z opisem w krokach od 1.1 do 1.4. Za pomocą szklanych pipet transferowych umieść tkankę w fiolkach z zakrętką. Utrwalić tchawiczą tkankę płucną za pomocą 2 ml 2% roztworu PFA przez noc w temperaturze 4 °C. Po utrwaleniu próbki należy płukać w PBS trzy razy przez 10 minut przy każdym płukaniu.</li>
	<li>Przygotować bufor blokujący, zwykle końcową objętość 10 ml roztworu. Dodać 0,1 g BSA (1%) do 8 ml PBS. Poczekaj, aż BSA się rozpuści. Dodaj 0,2 ml koziej surowicy (2%), 0,03 ml Triton X-100 (0,3%). Doprowadzić końcową objętość do 10 ml za pomocą PBS. Próbki należy blokować przez 1 godzinę w 0,5 ml buforu blokującego w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć bufor blokujący za pomocą pipety transferowej i zastąpić roztworem lektyny składającym się z 50 μg/μl lektyny, 10% surowicy koziej i PBS. Użyć 250 μl roztworu lektyny na próbkę. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że szklana fiolka zawierająca chusteczkę jest pokryta folią aluminiową. Po inkubacji z roztworem lektyny przepłukać próbki w PBS trzykrotnie przez 10 minut.</li>
	<li>Umieść eksplantaty na pokrytych agarozą szalkach Petriego, zawierających wystarczającą ilość PBS, aby pokryć próbki. Sfotografuj całe mocowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Wybierz odpowiedni filtr do wykrywania fluorescencji. Lektyna PNA jest zwykle sprzężona z GFP.</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne całej góry i mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Wyizolować tkankę płucną tchawicy, przenieść do szklanych fiolek z zakrętką o pojemności 4 ml i utrwalić na noc w 4% PFA. Tkanka E11.5 może być utrwalona w 2% PFA. Przechowywać w 100% w metanolu. Próbki mogą być przechowywane do kilku miesięcy w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Usuń metanol za pomocą pipety transferowej i przepuszczaj próbki za pomocą wybielacza Dent's Bleach (4 części metanolu, 1 część DMSO i 1 część 30% H2O2) przez 2 godziny. Uwodnić tkankę w stopniowanej serii metanolu rozcieńczonego w PBS w następujący sposób: 100% metanolu, 75% metanolu, 50% metanolu, 25 % metanolu, 100% PBS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej podczas każdego etapu nawadniania.</li>
	<li>Zablokować tkankę w 0,5% odczynniku blokującym rozcieńczonym w PBS (szczegółowe informacje znajdują się w Materiałach) przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze blokującym (Sox9 1:100, Nkx2,1 1:200, αSMA 1:250) i inkubować próbki przez noc w temperaturze 4 °C. Próbki przemyć pięciokrotnym PBS w temperaturze pokojowej. Wykonuj każde pranie przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zastosować przeciwciało drugorzędowe w rozcieńczeniu 1:500 w 0,5% roztworze blokującym. Ostrożnie dobieraj przeciwciała drugorzędowe, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciał drugorzędowych. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w ciemnym pomieszczeniu. Próbki należy myć trzykrotnie przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Próbki odwodnić w stopniowanej serii metanolu rozcieńczonego w PBS w następujący sposób: 25% metanolu, 50% metanolu, 75% metanolu, 100% metanolu, 10 minut każdy krok. 
	UWAGA: Upewnij się, że próbki pozostają pokryte folią aluminiową i zminimalizuj ekspozycję na światło. Tkanka może być teraz przechowywana w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni do czasu sfotografowania.</li>
	<li>Przenieść próbki na specjalnie wykonane płytki sceniczne, usunąć metanol i oczyścić około 200 μl klarownego roztworu Murraya19,20 (2 części benzoesanu benzylu, 1 część alkoholu benzylowego) bezpośrednio przed obrazowaniem. Zdjęcie za pomocą mikroskopu konfokalnego. Przetwarzaj i analizuj obraz za pomocą oprogramowania do obrazowania.</li>
</ol>
4. Proliferacja komórek
<ol>
	<li>Ciężarnym myszom należy wstrzyknąć E11.5 dootrzewnowo roztwór BrdU o stężeniu 100 μg BrdU/g masy ciała. Złożyć ofiarę samicy zgodnie z opisem w sekcji 1 protokołu i wyizolować zarodki w E12.5 lub E13.5. Za pomocą ostrzy noży, główek akcyzowych i dolnej części ciała poniżej klatki piersiowej.</li>
	<li>Umieścić tkankę klatki piersiowej w 4 ml fiolkach z zakrętką i utrwalić w 1 ml 4% PFA na noc. Przemywać próbki PBS dwukrotnie przez 5 minut i odwadniać próbki za pomocą serii etanolu rozcieńczonej w wodzie destylowanej do 70% etanolu w następujący sposób: 30%, 50% i 70% etanolu, przez 5 minut każdy etap.
	<ol>
		<li>Umieść próbki w średniej wielkości kasetach sitowych. Przetwarzaj tkankę do zatapiania parafiny za pomocą automatycznego procesora. Ustaw cykl w następujący sposób: sześć podmian alkoholu po 8 minut każda, trzy zmiany ksylenu po 6 minut, trzy zmiany parafiny po 25 minut, 9 minut i 8 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurzyć w parafinie, ustawiając tkankę w żądanej pozycji, aby wytworzyć przekroje poprzeczne lub podłużne o wielkości 6 μm, jak opisano w sekcji 1. Umieść skrawki na szkiełkach podstawowych i pozwól chusteczce przylegać do szkiełka nastawionego na szkiełko podstawowe ustawione w temperaturze 42 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Szkiełka upieczemy na boku przez noc w piekarniku w temperaturze 56 °C. Umieść szkiełka w plastikowych rusztach. Szkiełka odparafinowane przez zanurzenie w trzech zmianach 100 % ksylenu, 10 minut na zmianę. Użyj 200 ml ksylenu, aby całkowicie zanurzyć szkiełka. Nawilżać szkiełka za pomocą stopniowanych serii EtOH (100%, 70%, 50% i 30%, 5 minut na krok z mieszaniem) do PBS (5 min).</li>
	<li>Przeprowadzić pobieranie antygenu przy użyciu 10 mM buforu cytrynianowego, pH 6. Aby przygotować 100 ml buforu cytrynianowego, zmieszać 18 ml 0,1 M jednowodnego kwasu cytrynowego i 82 ml 0,1 M cytrynianu sodu.
	<ol>
		<li>Umieść próbki w plastikowych słoikach z kopiną wypełnionych roztworem do pobierania antygenu i kuchence mikrofalowej przez 6,5 minuty z dużą mocą. Dodaj wodę destylowaną do słoika z kopinem, aby skompensować bufor odparowanego cytrynianu i podgrzewaj przy 40% mocy przez 6 minut.</li>
		<li>Napełnij słoik z kopiną do góry wodą i ponownie podgrzej przy 40% mocy przez 6 minut. Czas podgrzewania w kuchence mikrofalowej może się różnić w zależności od używanej kuchenki mikrofalowej.</li>
		<li>Pozostaw szkiełka do ostygnięcia przez 20 minut w temperaturze pokojowej przed umyciem szkiełek w wodzie destylowanej przez 1 minutę, a następnie PBS przez 5 minut. Po przemyciu PBS blokować przez 2 godziny w roztworze blokującym zawierającym TBS (2,425 g zasady Tris i 8,765 g NaCl rozcieńczone w 1 l wody destylowanej), 10% surowicy osła i 1% BSA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym (TBS zawierający 10% surowicy osła i 1% BSA). BrdU (marker mitozy), Nkx2.1 (nabłonek dróg oddechowych), Sox9 (komórki, które dadzą początek chrząstce) i αSMA (komórki mięśni gładkich). Szkiełka inkubować przez noc, w temperaturze 4 °C. W celu zachowania przeciwciał należy stosować metodę nakładania. Nanieść 180 μl przeciwciała na uszczelkę, a następnie przymocować szkiełko tak, jakby się ślizgało pokrywą.</li>
	<li>Odczep uszczelkę, zanurzając szkiełka w wodzie destylowanej. Po usunięciu uszczelki przemyć niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe, wykonując sześć 5-minutowych płukań TBS zawierającym 0,1% Tween-20.
	<ol>
		<li>Inkubować szkiełka z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym w rozcieńczeniu 1:200 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Ostrożnie dobieraj przeciwciała drugorzędowe, aby zapobiec niepożądanemu wiązaniu między nimi. Usunąć niezwiązane przeciwciało drugorzędowe, wykonując trzy pięciominutowe płukania TBS zawierającym 0,1% Tween.</li>
		<li>Szkiełka należy myć w podstawie 0,1 M Tris dwa razy przez 5 minut, a następnie dwukrotnie w bazie 0,05 M Tris przez 5 minut. Szkiełka można pozostawić w podstawie 0,05 M Tris podczas nakrywania za pomocą podłoża montażowego z DAPI lub bez (1,5 μg/ml). Szkiełka należy przechowywać w folderze na slajdy w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem, przykrywając folder folią aluminiową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja barwienia i fotografowanie za pomocą automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego. Policz znakowane komórki i całkowitą liczbę komórek na pole sfotografowane z prędkością 20X i 40X, aby określić stosunek proliferujących komórek do całkowitej liczby komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of lung morphogenesis.</a> Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).</li>
<li>Morrisey, E. E., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+for+the+first+breath%3A+genetic+and+cellular+mechanisms+in+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development.</a> Dev Cell. 18, 8-23 (2010).</li>
<li>Fausett, S. R., Klingensmith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+the+foregut+tube%3A+developmental+origins+of+the+trachea+and+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).</li>
<li>Goss, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt2%2F2b+and+beta-catenin+signaling+are+necessary+and+sufficient+to+specify+lung+progenitors+in+the+foregut%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut.</a> Dev Cell. 17, 290-298 (2009).</li>
<li>Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+promotes+respiratory+progenitor+identity+in+mouse+foregut%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).</li>
<li>Cornett, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wntless+is+required+for+peripheral+lung+differentiation+and+pulmonary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development.</a> Dev Biol. 379, 38-52 (2013).</li>
<li>Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BEndodermal+Wnt+signaling+is+required+for+tracheal+cartilage+formation%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation&#34;.</a> Dev Biol. , (2015).</li>
<li>Shannon, J. M., Hyatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+interactions+in+the+developing+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung.</a> Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).</li>
<li>Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchyme+specifies+epithelial+differentiation+in+reciprocal+recombinants+of+embryonic+lung+and+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea.</a> Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+regulates+Shh+and+Fgf10+signaling+during+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development.</a> Dev Biol. 287, 86-97 (2005).</li>
<li>Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+pulmonary+Wnt5a+directs+airway+and+vascular+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis.</a> Development. 135, 1365-1376 (2008).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+FGF-WNT+gene+regulatory+network+controls+lung+mesenchyme+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development.</a> Dev Biol. 319, 426-436 (2008).</li>
<li>Shu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+acts+upstream+of+N-myc%2C+BMP4%2C+and+FGF+signaling+to+regulate+proximal-distal+patterning+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung.</a> Dev Biol. 283, 226-239 (2005).</li>
<li>Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+OpdA+in+rat+models+of+organic+phosphorus+%28OP%29+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning.</a> Toxicology. 257, (2009).</li>
<li>Goss, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt2+signaling+is+necessary+and+sufficient+to+activate+the+airway+smooth+muscle+program+in+the+lung+by+regulating+myocardin%2FMrtf-B+and+Fgf10+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression.</a> Dev Biol. 356, 541-552 (2011).</li>
<li>Mucenski, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+is+required+for+specification+of+proximal%2Fdistal+cell+fate+during+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis.</a> J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).</li>
<li>Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-10+induces+SP-C+and+Bmp4+and+regulates+proximal-distal+patterning+in+embryonic+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).</li>
<li>Del Moral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li>
<li>Ott, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+in+large+insect+brains%3A+zinc-formaldehyde+fixation+improves+synapsin+immunostaining+and+preservation+of+morphology+in+whole-mounts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts.</a> J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).</li>
<li>Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-reconstruction+of+blood+vessels+by+ultramicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy.</a> Organogenesis. 5, 145-148 (2009).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sox9+by+Sonic+Hedgehog+%28Shh%29+is+essential+for+patterning+and+formation+of+tracheal+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage.</a> Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).</li>
<li>Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+18+gives+growth+and+directional+cues+to+airway+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage.</a> Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).</li>
<li>Ahnfelt-Ronne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+protein+expression+patterns+in+intact+mouse+and+chicken+embryos+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs.</a> J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+method+for+analysis+of+chondrogenesis+in+limb+mesenchyme+from+individual+transgenic+%28hdf%29+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos.</a> Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).</li>
<li>Cohen, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+regulates+smooth+muscle+precursor+development+in+the+mouse+lung+via+a+tenascin+C%2FPDGFR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway.</a> J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).</li>
<li>Boucherat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+functional+redundancy+between+Hoxa5+and+Hoxb5+paralog+genes+during+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).</li>
</ol>

– Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zdarzenia leżące u podstaw morfogenezy dróg oddechowych nie są w pełni poznane, w szczególności procesy wymagane do ułożenia przewodzących dróg oddechowych. W poprzednich badaniach wykorzystano techniki ex vivo , w których rozwijające się eksplantaty są hodowane w interakcji powietrze-ciecz lub zatopione w matrigel21,22. Badania te wykazały, w jaki sposób czynniki wzrostu wpływają na wzorzec rozwijającej się tchawicy i tworzenie chrząstki tchawicy. Ograniczeniem tych badań jest to, że architektura tka...

Rozwój dróg oddechowych jest inicjowany przez 9 dzień embrionalny (E9) wraz z pojawieniem się komórek Nkx2.1 dodatnich w brzusznym endodermalnym jelicie przednim1,2. Separacja rurki przełykowo-tchawiczej ustąpi przez E11.5, gdy rurki można rozróżnić jako odrębne jednostki, z których każda jest otoczona tkanką mezenchymalną3. Sygnalizacja Wnt odgrywa kluczową rolę w specyfikacji dróg oddechowych, ponieważ delecja Wnt2 i Wnt2b, wyrażona przez mezenchymę splanchniczną, a delecja β-kateniny z endodermalnego nabłonka oddechowego spowoduje agenezję płuc4,5. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że delecja Wls, receptora ładunkowego pośredniczącego w wydzielaniu wszystkich ligandów Wnt, z endodermalnych dróg oddechowych powoduje hipoplazję płuc, defekty w rozwoju naczyń płucnych i nieprawidłowy wzorzec mezenchymii tchawicy6,7. Dane te potwierdzają znaczenie wzajemnego oddziaływania nabłonkowo-mezenchymalnego w różnicowaniu i specyfikacji komórek, jak wykazano również w innych badaniach8,9.
Badanie najwcześniejszych etapów rozwoju płuc opiera się na technikach genetycznych, in vitro i ex vivo, które pozwoliły nam lepiej zrozumieć mechanizmy rządzące tożsamością oddechową10-16. Całe kultury eksplantatów płuc w interfazie cieczy powietrznej zostały szeroko wykorzystane do badania wpływu czynników wzrostu we wczesnych stadiach morfogenezy rozgałęzień płucnych10,17,18. Chociaż metoda ta jest stosowana do odczytywania zmian morfologicznych, takich jak morfogeneza rozgałęzień i modulacja ekspresji genów, ogranicza się ona do badania wczesnych etapów procesu rozwojowego, ponieważ sama hodowla nie wspomaga rozwoju układu naczyniowego17. Rozwój chrząstki tchawicy wymaga dłuższego czasu inkubacji, który może być niezgodny z tą techniką hodowli.
Aby przeanalizować rolę sygnalizacji Wnt podczas tworzenia dróg oddechowych, dostosowaliśmy standardowe techniki do potrzeb naszych badań embrionalnych. Zmodyfikowaliśmy objętości, czasy barwienia, cykle przetwarzania do zatapiania parafiny i czas oczyszczania tkanki tchawicy płucnej. Głównym celem optymalizacji technik opisanych w niniejszym badaniu była analiza najwcześniejszych etapów rozwoju tchawicy u myszy, które mają miejsce od E11 do E14.5. Korzystając z linii myszy reporterowych Axin2LacZ precyzyjnie określiliśmy miejsca aktywności Wnt/β-kateniny w rozwijającej się mezenchymie tchawicy. Dostosowaliśmy również procedurę barwienia lektyny do całej tkanki tchawicy wierzchowca. Dzięki temu byliśmy w stanie zwizualizować kondensacje mezenchymalne i przewidzieć miejsca, w których będzie zachodzić chondrogeneza. Barwienie całego wierzchowca i skrawków tkanki embrionalnej uzyskanej od myszy WlsShhCre, w połączeniu z zaawansowanymi technikami mikroskopowymi, pozwoliło nam odkryć rolę ligandów Wnt wytwarzanych przez nabłonek tchawicy w kształtowaniu tchawicy.

<table><tbody><tr><td>Anty Sox9 ab.</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>1:400 , królik</td></tr><tr><td>Anti Sox9 ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-20095</td><td>1:50, królik</td></tr><tr><td>Anti Smooth Muscle Actin ab.</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:2k, mysz</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Seven Hills</td><td>n/a</td><td>1:100, świnka morska</td></tr><tr><td>Anti NKX2.1 ab.</td><td>Siedem Wzgórz</td><td>n/a</td><td>1:400, mysz</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Abcam</td><td>AB1893</td><td>1:200, owca</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab.</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-32323</td><td>1:4k, mysz</td></tr><tr><td>PNA Lectin</td><td>Sigma</td><td>L 7381</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe</td><td>Technologie</td><td></td> życiowe <td>Alexa fluor Sondy molekularne</td></tr><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaDOC</td><td>Life Technologies</td><td>89905</td><td></td></tr><tr><td>NP4O</td><td>Life Technologies</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A-3157</td><td></td></tr><tr><td>Super-frost marki Fisher plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>PFA (16%)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Sigma</td><td>11K413</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Składnik zestawu TSA #2&nbsp; &nbsp; &nbsp; ( T20932)</td></tr><tr><td>BrDu</td><td>Sigma</td><td>B5002-5g</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield podłoże montażowe</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Kasety Tissue-loc Histoscreen</td><td>Fisher</td><td>C-0250-GR</td><td></td></tr><tr><td>Kasety do biopsji</td><td>Premiere</td><td>BC0109</td><td>Dostępne w różnych kolorach</td></tr><tr><td>Nuclear fast czerwony&nbsp; Kernechtrot 0,1%</td><td>Sigma</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma</td><td>C1909-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny</td><td>Sigma</td><td>S4641-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek Trizma</td><td>Sigma</td><td>T5941-500G</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>399000000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Mikronoże</td><td>FST</td><td>10318-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 z powłoką ceramiczną</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5CO</td><td>FST</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Thermo/Shandon Excelsior ES</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Nikon i90</td><td>Mikroskop</td><td>szerokokątny</td>Nikon NikonA1Rsi Mikroskopia konfokalna firmy Nikon<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>. Ustawienia: aparat NikonA1 plus, skaner: Galvano, detektor: DU4. Optyka Plan Apo lambda 10X. Modalność: Konfokal lasera fluorescencyjnego o szerokim polu.</td></tr><tr><td>Leica MS 16 FA</td><td>Mikroskop preparacyjny fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss Zeiss</td><td></td><td>Zautomatyzowany mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Pakiet aplikacji Leica Oprogramowanie</td><td>do</td><td>obrazowania Leica</td><td></td></tr><tr><td>NIS</td><td>Nikon Nikon</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów</td></tr></tbody></table>

badanie sygnalizacji wnt podczas wzorcowania przewodzenia dróg oddechowych

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Szlaki sygnałowe Wnt odgrywają kluczową rolę podczas rozwoju dróg oddechowych. Zdefiniowanie precyzyjnych mechanizmów różnicowania i morfogenezy kontrolowanych przez sygnalizację Wnt jest konieczne, aby zrozumieć, w jaki sposób tkanki są wzorcowane podczas normalnego rozwoju. Wiedza ta jest również kluczowa dla określenia etiologii wad wrodzonych, takich jak hipoplazja płuc i tchawica i oskrzelomalia. Analiza najwcześniejszych etapów rozwoju dróg oddechowych stanowi wyzwanie, ponieważ ograniczona ilość tkanki uniemożliwia wykonanie standardowych protokołów, które lepiej nadają się do badań poporodowych. W tym artykule omówiono metodologie badania różnicowania i proliferacji komórek w drogach oddechowych. Opisujemy takie techniki, jak barwienie całego wierzchowca, przetwarzanie tkanki do mikroskopii konfokalnej oraz immunofluorescencja w skrawkach parafinowych stosowana do rozwoju tchawicy płuca. Omówiono również metodyki badania różnicowania mezenchymy tchawicy, w szczególności tworzenia się chrząstek. Podejścia i techniki omówione w niniejszej pracy pozwalają obejść ograniczenia materiału podczas pracy z tkanką embrionalną, co pozwala na lepsze zrozumienie procesu tworzenia się przewodzących dróg oddechowych.

Aktywność szlaku Wnt/β-katenina
Barwienie Lac-Z całego preparatu wykryto w tkance tchawkowo-płucnej embrionów izolowanych z myszy reporterowych Axin2Lac-Z 11. Miejsca barwienia wskazują na aktywność Wnt/β-catenin. Analiza przekrojów barwienia całego preparatu wykazała, że aktywność Wnt/β-catenin występowała w mezenchymie tchawicy oraz w mezenchymie obszarów obwodowych rozwijających się p...

Użycie myszy reporterowych w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca i sekcji, mikroskopią i testami in vivo ułatwia analizę mechanizmów leżących u podstaw normalnego wzorca dróg oddechowych. Tutaj opisujemy, w jaki sposób techniki te przyczyniły się do analizy sygnalizacji Wnt podczas rozwoju tchawicy.

Badanie sygnalizacji Wnt podczas wzorcowania przewodzenia dróg oddechowych

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Ogólnym celem procedur barwienia jest wykazanie roli szlaku sygnałowego Wnt we wczesnych etapach rozwoju górnych dróg oddechowych z wykorzystaniem tkanki embrionalnej z genetycznie zmodyfikowanych modeli mysich. Metody te mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii płuc, takie jak na przykład sposób kształtowania się struktur podporowych dróg oddechowych przewodzących.Techniki, które tutaj zaprezentujemy, pozwolą nam badać proliferację komórek lub proces kondensacji mezenchymalnej, które są kluczowymi zdarzeniami w formowaniu chrząstki tchawicy. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej zastosowania przy niewielkich ilościach tkanki. Obejmuje to eksplanty płuc oraz tchawice wyizolowane z embrionów E11.Zazwyczaj osoby po raz pierwszy wykonujące tę procedurę mogą napotkać trudności ze względu na rozmiar próbki, a także ograniczoną ilość dostępnej tkanki. Należy wypracować pewność w pracy z tkankami embrionalnymi, co osiąga się poprzez zachowanie szczególnej uwagi na każdym etapie i upewnienie się, że na każdym kolejnym kroku dostępna jest ta sama ilość tkanki. Po uśmierceniu ciężarnej samicy myszy w dniach E11.5 do E14.5 i wykonaniu laparotomii zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć pęsety i precyzyjnych nożyczek, aby wyizolować rogi macicy, a następnie bezzwłocznie umieścić tkankę w czarce Petri zawierającej schłodzony roztwór PBS.Następnie należy umieścić szalkę na lodzie. Aby wyizolować zarodki z rogów macicy, należy użyć precyzyjnej pęsety do przytrzymania tkanki macicy. Następnie za pomocą nożyczek należy przebić tkankę macicy i produkt poczęcia, uwalniając zarodki.Następnie należy usunąć wszelkie pozostałe błony zarodkowe. Potem, pod mikroskopem stereoskopowym, używając ostrzy igłowych, odciąć głowę oraz dolną część ciała poniżej przepony i zlokalizować wątrobę jako punkt orientacyjny. Za pomocą ostrzy igłowych usunąć boczne strony ściany ciała, kręgosłup oraz serce.Należy uważać, aby nie uszkodzić tkanki tchawki. Aby wypreparować embrionalną tkankę tchawki i płuc, ostrożnie oddzielić przełyk od tchawki, odciągając przełyk za pomocą ostrzy igłowych. Umieścić tkankę w PBS na lodzie, a następnie za pomocą pipet szklanych lub transferowych przenieść tkankę do szklanych fiolek z zakrętką śrubową o średnicy czterech milimetrów.Dodaj 4% paraformaldehyd (PFA) w PBS i inkubuj przez 30 minut. Następnie przemyj tkankę roztworem PBS. Po usunięciu PBS z próbek, dodaj dwa milimetry roztworu barwiącego X-gal i inkubuj od jednej do dwóch godzin lub przez cztery godziny w przypadku dalszej obróbki i zatapiania.Zatrzymaj reakcję, przemywając tkankę trzy razy przez pięć minut każdorazowo, używając do tego 3%DMSO w PBS. Następnie przechowuj tkankę w 70%ethanol. Po przetworzeniu próbek w automatycznym procesorze do zatapiania w parafinie zgodnie z protokołem tekstowym, ułóż próbki tak, aby tkanka płasko spoczywała na dnie formy do zatapiania.Ostrożnie dolej parafiny, aby wypełnić kasetkę do odlewania, i natychmiast umieść ją na płytce chłodzącej stacji do odlewania, aż parafina stężeje. Następnie wyjmij blok z kasetki i za pomocą mikrotomu wykonaj skrawki o grubości sześciu mikrometrów. Następnie przenieś skrawki na szkiełka przedmiotowe.Następnie umieść skrawki na podgrzewaczu do szkiełek w temperaturze 42 °C przez jedną godzinę. Susz szkiełka w piecu w temperaturze 56 °C przez noc. Następnie, aby odparafinować próbki, umieść wysuszone szkiełka w koszykach i przenieś je do kuwet do barwienia wypełnionych 200 ml 100% ksylenu, powtarzając czynność trzykrotnie po 10 minut za każdym razem.W celu rehydratacji preparatów należy zastosować szereg roztworów etanolu o malejącym stężeniu, pozostawiając szkiełka w każdym z nich przez jedną minutę. Następnie próbki należy poddać kontrastowaniu barwnikiem Nuclear Fast Red przez 10 do 30 sekund. Preparaty należy przepłukać trzy razy wodą z kranu, za każdym razem przez pięć minut.Aby odwodnić preparaty, należy zastosować szereg stężeń etanolu, a następnie przemyć próbki w trzech zmianach ksylenu. Następnie należy użyć medium montażowego na bazie ksylenu oraz szkiełek cover-slip do zamontowania próbek. Aby przeprowadzić barwienie lektynami, po utrwaleniu tkanki płuc tchawiczych i przygotowaniu buforu blokującego zgodnie z protokołem tekstowym, należy przenieść próbki do 0,5 ml buforu blokującego i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Za pomocą pipety transferowej usunąć bufor blokujący i zastąpić go 250 µL roztworu lektyny na każdą próbkę. Następnie zakryć szklane fiolki folią aluminiową i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia, po wypłukaniu próbek w PBS, umieścić eksplantaty w pokrytych agarozą szalkach Petriego zawierających ilość PBS wystarczającą do całkowitego zakrycia próbek.Następnie należy użyć fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby sfotografować preparaty całych organizmów. W celu wykonania barwienia immunofluorescencyjnego preparatów całych organizmów, po utrwaleniu próbek zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć pipety transferowej do usunięcia metanolu, a następnie dodać stężony wybielacz i inkubować tkankę przez dwie godziny w celu permeabilizacji próbek. Korzystając z szeregu rozcieńczeń metanolu w PBS, należy nawodnić tkankę, inkubując ją w temperaturze pokojowej przez 10 minut na każdym etapie.Po zablokowaniu tkanki zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać przeciwciała pierwszorzędowe oraz roztwór blokujący i inkubować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po przemyciu próbek w PBS należy dodać przeciwciała drugorzędowe w rozcieńczeniu 1:500 w PBS i inkubować w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia, po trzykrotnym przemyciu próbek w PBS (każdorazowo przez 20 minut), należy przeprowadzić odwodnienie próbek, stosując szereg roztworów metanolu o rosnącym stężeniu w PBS przez 10 minut na każdym etapie.Przenieś próbki na specjalnie wykonane płytki przedmiotowe. Usuń metanol. Następnie użyj 200 µL klarownego roztworu Murraya, aby sklarować próbki.Wykonaj obrazowanie natychmiast przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Po wstrzyknięciu BrdU ciężarnym myszom w dniu E11.5 i wyizolowaniu embrionów w dniu E12.5 lub E13.5 zgodnie z protokołem tekstowym, użyj ostrzy noża, aby wyciąć głowy embrionalne oraz dolne części ciał, poniżej jam klatki piersiowej. Umieść tkankę klatki piersiowej w probówkach z nakrętką o pojemności czterech mililitrów i dodaj jeden mililitr 4% PFA.Po zatopieniu, cięciu i rehydratacji próbek zgodnie z protokołem tekstowym, należy umieścić preparaty w naczyniach Coplina i wypełnić je 10 mM buforem cytrynianowym o pH 6. Próbki należy naświetlać w kuchence mikrofalowej z wysoką mocą przez 6,5 minuty, a następnie uzupełnić odparowany bufor cytrynianowy wodą destylowaną i ponownie podgrzać. Po schłodzeniu, przemyciu i blokowaniu preparatów zgodnie z protokołem tekstowym, należy nanieść 180 µl przeciwciał pierwszorzędowych, rozcieńczonych w roztworze blokującym, na uszczelkę i przymocować szkiełko w sposób analogiczny do nakładania szkiełka nakrywkowego.Następnego dnia zanurz preparaty w wodzie destylowanej, aby odczepić uszczelkę. Następnie użyj buforu TBS z dodatkiem 0,1% Tween 20, aby przemyć preparaty sześć razy przez pięć minut za każdym razem. Po inkubacji preparatów z przeciwciałami wtórnymi przemyj je dwukrotnie przez pięć minut za każdym razem, używając 0,1 M Tris Base, a następnie przemyj dwukrotnie 0,5 M Tris Base.Przechowywać preparaty w 0,5 M Tris Base podczas nakładania medium montażowego, z DAPI lub bez, a następnie nałożyć szkiełko nakrywkę. Na koniec wykorzystać automatyczny mikroskop fluorescencyjny do obrazowania próbek i przeprowadzić analizę zgodnie z protokołem tekstowym. Na tej figurze przedstawiającej tkankę tchawicy i płuc w całości (whole-mount), wyizolowaną od myszy Reporter oraz dwóch myszy lacZ, barwienie lacZ wykryto w mezenchymie tchawicy oraz w obszarach obwodowych rozwijających się płuc, co wskazuje na aktywność beta-kateniny Wnt.W niniejszym eksperymencie tkanki tchawicy i płuc z embrionów w stadiach E12.5 do E14.5 barwiono lektyną PNA. U zwierząt kontrolnych fluorescencję stwierdzono w postaci okresowych pasm w mezenchymie, w miejscu formowania się chrząstki. Jednak brak barwienia u embrionów Wntless sonic hedgehog Cree wskazuje, że sygnalizacja Wnt jest niezbędna do kondensacji mezenchymalnej.W całej tkance tchawicy embrionów w stadium E11.5 ekspresja SOX9 jest ograniczona do mezenchymy w postaci ciągłego paska, natomiast w rozwijającym się płucu SOX9 obserwuje się na obwodzie nabłonka oddechowego. Jak pokazano tutaj, NKX2.1 jest ograniczony do nabłonka tchawicy. Zapobieganie sekrecji ligandów Wnt z nabłonka zmniejsza ekspresję SOX9 w mezenchymie, ale nie wpływa na ekspresję SOX9 w obwodowym nabłonku płuc.Barwienie na aktynę gładkich mięśni alfa jest wykrywane na niskim poziomie w tkance tchawicy, ale jest wyraźnie widoczne w krtani i żołądku. Wreszcie, jak pokazano na tej rycinie, znakowanie in vivo tkanki tchawicy za pomocą BrdU, SOX9 i aktyny gładkich mięśni alfa wykazuje, że komórki wybarwione na SOX9 proliferują w większym stopniu niż komórki wybarwione na aktynę gładkich mięśni alfa. Wzór proliferacji jest odwrócony w tkance tchawicy Wntless sonic hedgehog Cree.Po opanowaniu większości z tych technik można je przeprowadzić w dwa dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby przy wyborze przeciwciała wtórnego pamiętać o pochodzeniu przeciwciała pierwotnego. Ma to kluczowe znaczenie we wszystkich immunobarwieniach, ale jest szczególnie istotne w przypadku stosowania więcej niż jednego przeciwciała pierwotnego.Po barwieniu β-galaktozydazą można zastosować dodatkowe techniki, takie jak hybrydyzacja in situ, aby uzyskać więcej informacji oraz odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład czy dany gen zainteresowania ulega ekspresji podczas sygnalizacji Wnt. Techniki przedstawione w niniejszym materiale będą przydatne dla badaczy zainteresowanych mechanizmami wzorowania tkanek pośredniczonymi przez sygnalizację Wnt lub innymi kluczowymi szlakami sygnalizacyjnymi odpowiedzialnymi za rozwój. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu badania procesu różnicowania podczas rozwoju dróg oddechowych.Kolejnym celem jest lepsze zrozumienie roli sygnalizacji Wnt w kształtowaniu dróg oddechowych. Podczas pracy z paraformaldehydem i benzoesanem benzylu pamiętaj o zachowaniu odpowiednich środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek, przygotowywanie roztworów pod wyciągiem oraz utylizacja odpadów zgodnie z lokalnymi przepisami i regulacjami.

studying-wnt-signaling-during-patterning-of-conducting-airways

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Tutaj przedstawiamy proces korzystania z systemu TetON w celu osiągnięcia specyficznej tkankowo ekspresji genów w dorosłej regenerującej się płetwie ogonowej danio pręgowanego.

Wykorzystanie systemu TetON do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

Pierwotne rzęski wpływają na różne szlaki sygnałowe. Ślimak ssaków jest idealny do badania sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP). Dysfunkcja rzęsek wpływa na rozrost ślimaka, wzór komórkowy i orientację komórek rzęsatych, odczyty PCP. Naszym celem jest analiza sygnalizacji PCP w ślimaku myszy za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Ten artykuł wideo szczegółowo opisuje prostą metodologię in vivo, która może być używana do systematycznego i efektywnego charakteryzowania składników złożonych szlaków sygnałowych i sieci regulacyjnych w wielu zarodkach bezkręgowców.

Siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji rozwijających się serc u danio pręgowanego w 4-Dimensions (4-D). Obrazowanie 4D, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszami świetlnymi (LSFM), wykonuje trójwymiarowe (3-D) obrazy w czasie, aby zrekonstruować rozwijające się serca. Pokazujemy jakościowo i ilościowo, że naprężenie ścinające aktywuje sygnalizację wsierdzia Notch podczas rozwoju komory, co sprzyja trabekulacji serca.

Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych w celu uchwycenia 4-wymiarowych obrazów wpływu modulacji naprężeń ścinających na rozwijające się serce danio pręgowanego

Protokół hodowli i manipulacji tkanką embrionalną myszy na chipie mikroprzepływowym jest dostarczony. Stosując impulsy modulatorów szlaku, system ten może być wykorzystany do zewnętrznego sterowania oscylacjami sygnałowymi w celu funkcjonalnego badania somitogenezy myszy.

Podejście mikrofluidyczne do funkcjonalnego badania oscylacji sygnalizacyjnych rządzących somitogenezą

Niniejsze badanie przedstawia wysoce powtarzalną i wykonalną metodę badania parakrynnych niekanonicznych zdarzeń sygnalizacyjnych Wnt in vitro. Protokół ten zastosowano do oceny wpływu parakrynnej sygnalizacji Wnt5a w mysich komórkach grzebienia nerwowego i mioblastach.

Modelowanie parakrynnej niekanonicznej sygnalizacji Wnt in vitro

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy protokoły dla trzech typów hodowli eksplantatów skóry embrionalnej ptaków, które mogą być użyte do badania interakcji tkankowych, obrazowania 4D filmu poklatkowego (3D plus czas), globalnych lub lokalnych zaburzeń funkcji molekularnych oraz charakterystyki biologii systemów.

Wykorzystanie eksplantatów ze skóry ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy

Ten artykuł opisuje metodologię in vivo i in vitro do charakteryzowania przodków osiadania grasicy poprzez analizę kinetyki powstawania, fenotypu i liczby ich potomstwa limfocytów T.

Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Poznaj metody badania sygnalizacji Wnt w rozwoju dróg oddechowych u myszy. Techniki barwienia i mikroskopii pozwalają analizować wzorcowanie tchawicy oraz formowanie chrząstki u embrionów.

Badanie sygnalizacji Wnt podczas wzorcowania przewodzenia dróg oddechowych

Przeglądaj więcej filmów