Name: Zastosowania pojedynczej sondy: obrazowanie spektrometrią mas i analiza pojedynczych komórek w warunkach otoczenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Poznaj analizę pojedynczych komórek i obrazowanie spektrometrią mas w warunkach otoczenia przy użyciu urządzenia Single-probe. Ta metoda umożliwia badanie dystrybucji cząsteczek w tkankach z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Laskinowi (Pacific Northwest National Laboratory) za udostępnienie zmotoryzowanego oprogramowania do sterowania sceną i programu do wizualizacji MSI. Dziękujemy również dr Mao (University of Oklahoma) za dostarczenie próbek narządów myszy oraz panu Chadowi E. Cunninghamowi (University of Oklahoma) za pomoc w pracach związanych z obróbką skrawaniem i elektroniką. Badania te były wspierane przez granty Rady Badawczej University of Oklahoma Norman Campus, American Society for Mass Spectrometry Research Award (sponsorowanej przez Waters Corporation), Oklahoma Center for the Advancement of Science and Technology (Grant HR 14-152) oraz National Institutes of Health (R01GM116116).

Wykorzystanie i dobrostan zwierząt powinny być zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych zgodnie z protokołami sprawdzonymi i zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Próbki tkanek myszy zostały dostarczone przez współpracownika dr Chuanbin Mao.
1. Przygotowanie sekcji tkanek myszy
<ol>
	<li>Umieść cały interesujący nas narząd myszy (mózg, nerka, wątroba itp.) w środku małego plastikowego dołka (np. 12-dołkowej płytki do hodowli komórek) i zanurz w tkance osadzającej związek do wysokości około 10 mm. Upewnij się, że w związku zatapiającym tkankę nie tworzy się pęcherzyk i że narząd jest umieszczony w pożądanej orientacji (tj. strzałkowej, czołowej itp.).</li>
	<li>Natychmiast umieść tkanki w ciekłym azocie w celu błyskawicznego zamrożenia. W przypadku długotrwałego przechowywania zamrożone próbki należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Wziąć zamrożony narząd myszy i rozmrozić do temperatury -15 °C w kriomikrotomie o kontrolowanej temperaturze.</li>
	<li>Przymocuj tkankę do stalowej podstawy za pomocą około 500 μl masy do zatapiania tkanek i umieść na uchwycie do cięcia kriomikrotomu tak, aby nóż przedstawił żądaną orientację cięcia.</li>
	<li>Przeciąć tkankę do grubości 12 μm. Umieść pokrojone plastry tkanki na poliwęglanowych szkiełkach mikroskopowych i pozostaw do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej. W przypadku długotrwałego przechowywania zamrożone szkiełko należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
Uwaga: Hodowla komórkowa została przeprowadzona w komorze bezpieczeństwa biologicznego (poziom bezpieczeństwa biologicznego II) w sterylnych warunkach. Linia komórkowa HeLa została wykorzystana jako system modelowy, a komórki hodowano w kompletnej pożywce hodowlanej przy użyciu następujących konwencjonalnych protokołów:
<ol>
	<li>Ciepłe odczynniki (tj. trypsyna, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) i pożywka do hodowli komórkowych) do 37 °C. 
	Uwaga: Pożywka do hodowli komórkowych zawiera sole nieorganiczne, aminokwasy, witaminy i inne. Pełna lista składników znajduje się w składzie producenta.</li>
	<li>Pobrać próbkę komórek (np. 1 ml zawiesiny komórek HeLa) i dodać ją do 9 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych na standardowej 10-centymetrowej płytce do hodowli komórkowych. Początkowa liczba komórek wynosi około 0,5 x 106 komórek/ml. Utrzymywać komórki w hodowli w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2-3 dni, aż powierzchnia wzrostu pokryje się w 70-80% na płytce do hodowli komórkowej. Zapisz liczbę przejść komórki dla każdej kolejnej rundy.</li>
	<li>Wykonaj pasażowanie komórek (tj. dzielenie komórek) na płytce do hodowli komórkowej.
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę wzrostową i użyć 5 ml 1x PBS do przepłukania komórek. Usunąć PBS za pomocą sterylnej końcówki aspiracyjnej i inkubować komórki z 2,5 ml trypsyny (0,25%) przez ~5 minut w temperaturze 37 °C, aby odłączyć komórki od płytki hodowlanej. 
		Uwaga: Rzeczywisty czas leczenia trypsyną należy zoptymalizować zgodnie z konkretnym produktem trypsynowym zakupionym od producenta. Nieodpowiedni czas leczenia pozostawia komórki przyczepione do płytki, podczas gdy nadmierne leczenie prowadzi do śmierci komórki.</li>
		<li>Zatrzymaj aktywność trypsyny, dodając 7,5 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych, a następnie równomiernie ponownie zawiesić komórki (całkowita objętość 10 ml). Zawiesinę komórkową należy wykorzystać do hodowli (etap 2.2) lub przygotowania próbek SCMS (etap 2.4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj próbki komórek do eksperymentów SCMS.
	<ol>
		<li>Umieść pojedyncze szkiełka z mikro pokrywką na 12-dołkowej płytce i dodaj do dołka 1,8 ml pożywki do hodowli komórkowych i 0,2 ml zawiesiny komórek.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać komórki z łagodnym mieszaniem płytki i inkubować w środowisku 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez ~24 godziny. Aby przeprowadzić leczenie farmakologiczne hodowanych komórek, dodać roztwór związku leczniczego (np. w DMSO (dimetylosulfotlenek)) do 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. 
		Uwaga: Końcowe stężenie leku (np. 10 nM, 100 nM, 1 μM i 10 μM) i czas leczenia (np. 4 godziny) różnią się w zależności od konkretnego celu badań. Komórki są przymocowane do mikro szkiełek i gotowe do eksperymentów CSMS (krok 6).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Produkcja z pojedynczą sondą
<ol>
	<li>Umieść rurkę kwarcową z podwójnym otworem (średnica wewnętrzna (ID) 127 μm, średnica zewnętrzna (OD) 500 μm) w laserowym ściągaczu do mikropipet i pociągnij igłę kwarcową o podwójnym otworze. Jako punkty wyjścia należy przyjąć następujące parametry: Heat = 400, Fil = 3, Vel = 80, Del =150 i Pul = 250 (wszystkie jednostki są jednostkami producenta). Upewnij się, że ciągnięta igła kwarcowa z podwójnym otworem ma zwężającą się końcówkę, aby zapewnić optymalne właściwości sondy. Przytnij wyciągniętą końcówkę tak, aby na drugim końcu pozostała nienaciągnięta kapilara kwarcowa o podwójnym otworze o długości ~5 mm. 
	Uwaga: Rzeczywiste parametry ściągacza laserowego powinny być zoptymalizowane zgodnie z konkretnymi warunkami urządzenia.</li>
	<li>Wytnij ~80 mm odcinek kapilary ze stopionej krzemionki (ID 40 μm, OD 105 μm) jako rozpuszczalnik dostarczający kapilę i włóż go do jednego otworu na płaskim końcu igły kwarcowej z podwójnym otworem.</li>
	<li>Wytnij ~40 mm odcinek kapilary ze stopionej krzemionki (ID 40 μm, OD 105 μm) i użyj brzytwy, aby ogolić ~5 mm powłoki poliimidowej od punktu środkowego. Użyj płomienia propanu, aby szybko podgrzać i wciągnąć stopioną kapilę do emitera jonizacji nano-elektronrozpylania (ESI) z drobnym stożkiem. Wytnij emiter nano-ESI (o długości ~7-10 mm) i włóż go do drugiego otworu na płaskim końcu igły kwarcowej z podwójnym otworem. Alternatywnie użyj ściągacza laserowego, aby uzyskać drobny stożek.</li>
	<li>Nałóż minimalną ilość (~1-2 μl) żywicy utwardzanej promieniami UV na płaski koniec igły kwarcowej z podwójnym otworem i zestal żywicę za pomocą lampy LED UV przez ~20 sekund, aby zabezpieczyć rozpuszczalnik zapewniający kapilarność i emiter nano-ESI. Procedury montażu poszczególnych części w pojedynczą sondę przedstawiono na rysunku 1a.</li>
	<li>Przetnij standardowe szkiełko mikroskopowe (1" x 3") na pół wzdłuż. Umieść pojedynczą sondę na jednym końcu szklanego szkiełka tak, aby emiter nano-ESI był skierowany na zewnątrz. Nałóż zwykłą żywicę epoksydową na korpus pojedynczej sondy tak, aby została przymocowana do szkiełka podstawowego (Rysunek 1b). Pozostaw na noc do stwardnienia. Sprzęgnij wyprodukowaną pojedynczą sondę ze zintegrowanym zestawem z pojedynczą sondą (rysunek 1c), który jest podłączony do spektrometru mas, jak pokazano na rysunku 1d.</li>
</ol>
4. Zbuduj zintegrowaną konfigurację MS z pojedynczą sondą
<ol>
	<li>Zmodyfikuj kołnierz interfejsu źródła jonów spektrometru mas i wyprodukuj statyw (z regulowaną pozycją i wysokością) cyfrowego stereoskopu (rysunki 1e i 1f).
	<ol>
		<li>Wywierć kołnierz interfejsu źródła jonów z dwoma otworami umożliwiającymi zamocowanie aluminiowej płytki optycznej. Wykonać szynę ślizgową i pręt regulacji wysokości (przymocowany do stolika XY w celu precyzyjnego dostrojenia pozycji), tak aby cyfrowy system stereoskopowy można było przymocować do aluminiowej płytki optycznej (rysunek 1e).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przymocuj zmodyfikowany cyfrowy mikroskop stereoskopowy, mikroskop cyfrowy USB, miniaturowy ręczny stolik translacyjny XYZ z elastycznym uchwytem zaciskowym, zmotoryzowany system stolika translacyjnego XYZ do aluminiowej płytki optycznej, która jest zamontowana na niestandardowym kołnierzu interfejsu źródła jonów spektrometru mas (rysunki 1c i 1f). Użyj elastycznego clamp uchwyt, aby zamocować szklaną szkiełko przymocowane za pomocą pojedynczej sondy.</li>
	<li>Podłącz konfigurację z pojedynczą sondą do spektrometru mas (rysunek 1f). Wyreguluj elastyczny uchwyt zaciskowy i miniaturowy stolik XYZ, aby umieścić emiter pojedynczej sondy przed wlotem spektrometru masowego. Użyj mikroskopu cyfrowego USB (z regulowanym kątem widzenia) z boku pojedynczej sondy, aby uzyskać powiększony obraz końcówki pojedynczej sondy lub emitera nano-ESI, oraz cyfrowego stereoskopu (z regulowaną wysokością) nad pojedynczą sondą, aby view komórki i końcówka sondy. 
	Uwaga: Korzystając z odpowiedniego kołnierza źródła jonów, ten zintegrowany system z pojedynczą sondą może być sprzężony z dowolnymi innymi typami spektrometrów masowych wyposażonych w źródła jonizacji otoczenia.</li>
</ol>
5. Otoczenie MSI
<ol>
	<li>Rozmrozić fragment próbki w temperaturze pokojowej i umieścić go na zmotoryzowanym systemie stolika translacyjnego XYZ pod pojedynczą sondą. Dostosuj pozycję próbki, zmieniając współrzędne w oprogramowaniu sterującym.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki przepompować rozpuszczalnik do pobierania próbek z odpowiednią szybkością (np. 0,2 μl/min) i przyłożyć napięcie jonizacji (np. 5 kV). Dobór rozpuszczalnika do pobierania próbek jest elastyczny, a do najczęściej spotykanych należą MeOH:woda (9:1) i acetonitryl. Objętość martwa emitera nano-ESI oszacowano na ~3 nl, a czas między kontaktem sondy-powierzchnia a obserwacją sygnału jonowego wynosi zwykle mniej niż 1 sek 15, 
	Uwaga: Dostosowany kołnierz interfejsu źródła jonów umożliwia dostarczenie napięcia jonizacji ze spektrometru mas do złącza przewodzącego przez zacisk krokodylkowy. Napięcie jonizacji jest następnie przenoszone przez przewodzące złącze do rozpuszczalnika wewnątrz kapilary i kanałów z pojedynczą sondą i nakładane na emiter nano-ESI w celu jonizacji pobranych analitów. Upewnij się, że jonizacjatage jest wyłączone podczas łączenia zacisku krokodylkowego ze złączem przewodzącym.</li>
	<li>Dostosować wysokość pojedynczej sondy tak, aby spoczywała tuż nad powierzchnią próbki i była w stanie przeprowadzić ekstrakcję powierzchniową metabolitów. Ostrożnie podnieś stolik Z, a następnie użyj mikroskopu cyfrowego USB (z boku pojedynczej sondy), aby monitorować zmianę odległości między końcówką pojedynczej sondy a powierzchnią tkanki. Monitoruj zmiany w widmie masowym podczas tej regulacji wysokości i przestań podnosić stopień Z, gdy zaobserwuje się zmianę sygnału jonowego z tła rozpuszczalnika na metabolity tkankowe.</li>
	<li>Powtórz krok 5.3 trzy razy, aby ustawić trzy różne punkty w programie sterowania stolikiem w celu automatycznej regulacji spłaszczania powierzchni. Umieść końcówkę pojedynczej sondy w trzech punktach na powierzchni próbki w odległości około 10 mm od siebie. Wykonaj regulację wysokości, naciskając ikony w górę i w dół, a następnie zablokuj trzy punkty w pozycji w ramach "Metody planowania".</li>
	<li>Za pomocą tego programu można ustawić inne parametry rastrowania w poprzek interesującego nas przekroju w próbce. W przypadku przedstawionych tutaj odcinków nerki myszy należy użyć prędkości rastrowej 10,0 μm/s i odległości między liniami 20 μm. Zmotoryzowany system stolika ma minimalny ruch przyrostowy 0,1 μm. Odległość między końcówką pojedynczej sondy a tkanką uzyskuje się z kroku 5.3.</li>
	<li>Skonfiguruj metodę automatycznego pozyskiwania widm MS ze spektrometru mas. Aby uzyskać MSI o wysokiej rozdzielczości masowej na próbce nerki myszy, użyj następujących parametrów: rozdzielczość masowa 60 000 (m/Δm), tryb dodatni ~5 kV, 1 mikroskop, maksymalny czas wstrzyknięcia 150 ms i AGC włączone. Wszystkie uzyskane widma MS reprezentujące poszczególne linie obrazu MS miały taką samą liczbę skanów z jednolitymi odstępami czasowymi między każdym skanem, co wskazuje, że rozmiary pikseli dla wytworzonych obrazów były równomiernie rozłożone.</li>
	<li>Rozpocznij pobieranie danych MSI. Zainicjuj sekwencję akwizycji MS dla spektrometru mas, a następnie zainicjuj sekwencję rastrową dla programu sterującego XYZ.
	<ol>
		<li>Na przykład w używanym tutaj programie do akwizycji danych MS przejdź do "Ustawienia sekwencji", wybierz "Nowa sekwencja", wygeneruj zestaw plików dla nowej sekwencji o numerze od 01 do X, gdzie X to liczba wierszy użytych do wykonania żądanego obrazu MS, a następnie naciśnij "Uruchom sekwencję".</li>
		<li>Użyj domowego urządzenia elektronicznego, aby umożliwić oprogramowaniu wytworzenie sygnału zamknięcia styku dla spektrometru mas w celu zebrania danych. Schemat obwodu pokazano na rysunku uzupełniającym (rysunek S1) jako odniesienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonstruuj obrazy MS z surowych plików MS za pomocą odpowiedniego oprogramowania do wizualizacji MSI. Na przykład w przypadku korzystania z pakietu oprogramowania opracowanego przez grupę Laskina pod adresem PNNL 17 należy wykonać następujące czynności.
	<ol>
		<li>Kliknij "Brows File" (Plik przeglądań). Wybierz pierwszy plik uzyskany z eksperymentu MSI. Określ miejsce rozpoczęcia i zakończenia pliku w polu "Liczba wierszy". Wybierz zakres wartości m/z dla zakresu obrazów MS w polu "Wprowadź zakres MZ".</li>
		<li>Naciśnij przycisk "Start", aby rozpocząć proces tworzenia obrazu. Po utworzeniu obrazu MS kliknij "Zapisz obraz" w "Pasku narzędzi", aby zapisać obrazy na komputerze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. SCMS na żywo na miejscu
<ol>
	<li>Skonfiguruj system z jedną sondą zgodnie z instrukcjami dla MSI. Dostosuj natężenie przepływu rozpuszczalnika (np. MeOH/H2O lub acetonitrylu) (np. ~25 nl/min).</li>
	<li>Umyj hodowane komórki, które są przymocowane do szkiełek z mikro pokrywą, PBS w celu usunięcia pożywek hodowlanych i zewnątrzkomórkowych składników leku. Umieść komórkę zawierającą szkiełko w zmotoryzowanym systemie etapu translacji XYZ w celu eksperymentu. 
	Uwaga: Alternatywnie można użyć pożywki do hodowli świeżych komórek (bez zawierającej płodowej surowicy bydlęcej) do przepłukania hodowanych komórek. Zaobserwowano mniejszą supresję jonów. Ponadto komórka może przetrwać przez dłuższy czas podczas eksperymentu, w którym temperatura otoczenia (~20 °C) jest znacznie niższa niż temperatura hodowli (37 °C). Rodzaj leku, stężenie roztworu i czas leczenia różnią się w różnych badaniach.</li>
	<li>Ustaw cyfrowy mikroskop stereoskopowy (nad próbką) na końcówce pojedynczej sondy, aby monitorować penetrację komórek podczas analizy. Użyj mikroskopu cyfrowego USB (z boku pojedynczej sondy), aby monitorować warunki pracy emitera nano-ESI na pojedynczej sondzie.</li>
	<li>Użyj zmotoryzowanego programu sterującego stolikiem XYZ i cyfrowego mikroskopu stereoskopowego (nad komórkami), aby zlokalizować interesującą komórkę i precyzyjnie ustawić końcówkę pojedynczej sondy nad próbką. Rozpocznij akwizycję danych MS przed włożeniem końcówki pojedynczej sondy do komórki.
	<ol>
		<li>Użyj następujących parametrów jako odniesień do analizy MS przy użyciu spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości: rozdzielczość masowa 100 000 (m/Δm), tryb dodatni i ujemny ~3 kV, 1 mikroskop, maksymalny czas wstrzykiwania 150 ms, włączony tryb AGC. Automatyczne pozyskiwanie widm MS odbywa się poprzez kliknięcie "Start" w programie do akwizycji danych MS.</li>
		<li>Podnieś zmotoryzowany stopień Z, klikając ikonę, aby przeniknąć przez błonę komórkową i kontynuować nagrywanie sygnału MS generowanego z komórki. Zwykle obserwuje się opóźnienie czasowe wynoszące 1-2 sekundy między włożeniem sondy a wykryciem sygnału MS. Jako drugie potwierdzenie penetracji komórki, po penetracji błony komórkowej można zaobserwować dramatyczną zmianę sygnałów SM. Sygnały MS związków wewnątrzkomórkowych zwykle mogą trwać przez ~ 15-20 sekund, zanim znacznie się zmniejszą.</li>
		<li>Opuść płytkę zawierającą celę, aby wyciągnąć końcówkę pojedynczej sondy z ogniwa. Zwykle potrzeba <15 sekundy, aby sygnały jonowe związków komórkowych zbliżyły się do poziomu szumu. Pozwól rozpuszczalnikowi przepływać przez ~ 3 minuty, aby całkowicie przepłukać pojedynczą sondę. W międzyczasie ustaw zmotoryzowany system stolika XYZ, aby zlokalizować następną komórkę do analizy. Każdy eksperyment z komórką wymaga wykonania ~3 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vickerman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+and+depth+profiling+by+mass+spectrometry-SIMS%2C+MALDI+or+DESI%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging and depth profiling by mass spectrometry-SIMS, MALDI or DESI?</a> Analyst. 136 (11), 2199-2217 (2011).</li>
<li>Schwamborn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+in+biomarker+discovery+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry in biomarker discovery and validation.</a> J. Proteomics. 75 (16), 4990-4998 (2012).</li>
<li>Schwamborn, K., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+-+Painting+Molecular+Pictures%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">MALDI Imaging Mass Spectrometry - Painting Molecular Pictures.</a> Mol Oncol. 4 (6), 529-538 (2010).</li>
<li>Kraft, M. L., Klitzing, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipids+with+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1841 (8), 1108-1119 (2014).</li>
<li>Wiseman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry%3A+Imaging+drugs+and+metabolites+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18120-18125 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+small+metabolites+and+lipids+in+rat+brain+tissues+at+atmospheric+pressure+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of small metabolites and lipids in rat brain tissues at atmospheric pressure by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 82 (3), 982-988 (2010).</li>
<li>Laskin, J., Heath, B. S., Roach, P. J., Cazares, L., Semmes, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Imaging+Using+Nanospray+Desorption+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tissue Imaging Using Nanospray Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 84 (1), 141-148 (2012).</li>
<li>Wu, C., Dill, A. L., Eberlin, L. S., Cooks, R. G., Ifa, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+under+ambient+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass.+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging under ambient conditions.</a> Mass. Spectrom. Rev. 32 (3), 218-243 (2013).</li>
<li>Altschuler, S. J., Wu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity%3A+do+differences+make+a+difference%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity: do differences make a difference?</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li>
<li>Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+MALDI-MS+as+an+Analytical+Tool+for+Studying+Intrapopulation+Metabolic+Heterogeneity+of+Unicellular+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-Cell MALDI-MS as an Analytical Tool for Studying Intrapopulation Metabolic Heterogeneity of Unicellular Organisms.</a> Anal. Chem. 82 (17), 7394-7400 (2010).</li>
<li>Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+lipidomics%3A+characterizing+and+imaging+lipids+on+the+surface+of+individual+Aplysia+californica+neurons+with+cluster+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-cell lipidomics: characterizing and imaging lipids on the surface of individual Aplysia californica neurons with cluster secondary ion mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 85 (4), 2231-2238 (2013).</li>
<li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+metabolite+and+lipid+analysis+of+Xenopus+laevis+eggs+by+LAESI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Subcellular metabolite and lipid analysis of Xenopus laevis eggs by LAESI mass spectrometry.</a> PLoS One. 9 (12), e115173(2014).</li>
<li>Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+single-cell+video-mass+spectrometry+for+cellular+and+subcellular+molecular+detection+and+cell+classification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification.</a> J. Mass. Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+metabolic+analysis+of+single+plant+cells+by+capillary+microsampling+and+electrospray+ionization+mass+spectrometry+with+ion+mobility+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation.</a> Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).</li>
<li>Rao, W., Pan, N., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Tissue+Imaging+Using+the+Single-probe+Mass+Spectrometry+under+Ambient+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 26 (6), 986-993 (2015).</li>
<li>Pan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-probe%3A+a+miniaturized+multifunctional+device+for+single+cell+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis.</a> Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).</li>
<li>Thomas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+High+Resolution+Spatial+Mass+Spectrometric+Data+during+Acquisition%5BTitle%5D)+AND+%222012+Annual+International+Conference+of+the+Ieee+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society+%28Embc%29%22%5BJournal%5D)">Visualization of High Resolution Spatial Mass Spectrometric Data during Acquisition.</a> 2012 Annual International Conference of the Ieee Engineering in Medicine and Biology Society (Embc). , 5545-5548 (2012).</li>
<li>Luxembourg, S. L., Mize, T. H., McDonnell, L. A., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-spatial+resolution+mass+spectrometric+imaging+of+peptide+and+protein+distributions+on+a+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-spatial resolution mass spectrometric imaging of peptide and protein distributions on a surface.</a> Anal. Chem. 76 (18), 5339-5344 (2004).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSW-1%3A+a+natural+compound+with+potent+anticancer+activity+and+a+novel+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">OSW-1: a natural compound with potent anticancer activity and a novel mechanism of action.</a> J Natl Cancer Inst. 97 (23), 1781-1785 (2005).</li>
<li>Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Ambient+MS+Imaging+of+Negative+Ions+in+Positive+Ion+Mode%3A+Using+Dicationic+Reagents+with+the+Single-Probe%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 27 (1), 124-134 (2016).</li>
<li>Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+ion+MS+imaging+to+relatively+quantify+cholesterol+in+the+membranes+of+individual+cells+from+differentially+treated+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Secondary ion MS imaging to relatively quantify cholesterol in the membranes of individual cells from differentially treated populations.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3554-3560 (2007).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych konfliktów interesów, który moglibyśmy zadeklarować w związku z prezentowaną tu pracą.

Pojedyncza sonda to wielofunkcyjne urządzenie, które może być używane zarówno do eksperymentów MSI, jak i SCMS. Konfiguracja z pojedynczą sondą (w tym systemy stolików translacyjnych, mikroskopy, kołnierz interfejsu źródła jonów itp.) została zaprojektowana jako element dodatkowy, który można elastycznie dostosować do istniejącego spektrometru masowego. Szybka wymiana między konfiguracją z pojedynczą sondą a konwencjonalnym źródłem jonów ESI może być zrealizowana w ciągu jednej minuty. Zasadniczo, przy użyciu odpowiedniego kołnierza interfejsu źródła jonów, konfigurację z pojedynczą sondą można dostosować do dowolnych innych spektrometrów masowych. Dodatkowo, rozpuszczalnik do pobierania próbek zawierający różne odczynniki może być używany z konfiguracją z pojedynczą sondą do reaktywnych eksperymentów MSI i SCMS, co znacznie usprawnia wykrywanie szerszych zakresów biomolekuł. Oprócz tkanek zwierzęcych i linii komórkowych, pojedyncza sonda jest również w stanie analizować inne systemy biologiczne, takie jak rośliny. W związku z tym, przy tej samej konfiguracji eksperymentalnej i podobnym szkoleniu użytkowników, różne badania mogą być wykonywane przy użyciu jednego urządzenia i przez tych samych użytkowników, co pozwala na przeprowadzanie wydajnych i wszechstronnych eksperymentów przy minimalnym czasie szkolenia i kosztach oprzyrządowania.
Kluczowym elementem techniki MS z pojedynczą sondą jest sama sonda. Jakość pojedynczej sondy ma znaczący wpływ na jej wydajność, co w dużej mierze decyduje o jakości eksperymentów zarówno MSI, jak i SCMS. Podczas wytwarzania pojedynczych sond należy upewnić się, że kapilary wewnątrz rurki z podwójnym otworem są bezpiecznie sklejone, aby wyeliminować ryzyko wycieku rozpuszczalnika podczas eksperymentów. Bardzo ważne jest, aby użyć minimalnej ilości żywicy epoksydowej utwardzanej promieniami UV, tak aby otwory i kapilary nie były zatkane podczas produkcji sondy.
Pojedyncza sonda została wykorzystana do przeprowadzenia MSI otoczenia o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i masowej na próbkach biologicznych 15. Główną zaletą MSI w temperaturze otoczenia w porównaniu z metodami nieopartymi na temperaturze otoczenia jest to, że przygotowanie próbki jest ograniczone do minimum, bez potrzeby stosowania środowiska pobierania próbek próżniowych, co pozwala na analizę próbki w stanie zbliżonym do natywnego 8. Jedną z głównych przeszkód dla większości innych technik otoczenia MSI był brak rozdzielczości przestrzennej 1. W porównaniu z technikami MSI opartymi na desorpcji (takimi jak DESI i LAESI), mały rozmiar końcówki pojedynczej sondy pozwala na przeprowadzenie bardziej niezawodnej i wydajnej mikroekstrakcji cieczy powierzchniowej na małym obszarze, co prowadzi do wysokiej rozdzielczości przestrzennej 8,5 μm, która jest jedną z najwyższych osiągniętych przy użyciu technik MSI w otoczeniu 15. Ponadto dostosowanie składników rozpuszczalnika do pobierania próbek zapewnia dodatkową elastyczność w przeprowadzaniu eksperymentów. Na przykład do przeprowadzenia reaktywnych eksperymentów MSI wykorzystano rozpuszczalniki do pobierania próbek zawierające odczynniki (np. związki dikationowe), co pozwoliło na znaczne zwiększenie liczby metabolitów zidentyfikowanych w jednym eksperymencie 20. Kolejną zaletą pojedynczej sondy jest zintegrowana konstrukcja, która zapewnia łatwość obsługi podczas całego procesu akwizycji danych. Ponieważ odległość między końcówką a powierzchnią tkanki jest bardzo wrażliwa na intensywność i stabilność sygnału jonowego, uzyskanie płaskiego przekroju tkanki i przeprowadzenie regulacji spłaszczenia powierzchni w celu zminimalizowania odchylenia odległości jest kluczem do wysokiej jakości eksperymentów MSI. Wynika z tego, że techniki MSI z pojedynczą sondą nie są odpowiednie do uzyskiwania wysokoprzestrzennych obrazów MS nierównych powierzchni.
Oprócz wyprodukowania wysokiej jakości sondy, staranne dostrojenie instrumentu jest niezbędne do udanego eksperymentu MSI. Spośród wszystkich etapów strojenia, najbardziej krytyczna jest regulacja wysokości końcówki pojedynczej sondy nad powierzchnią przekroju tkanki. Podczas regulacji wysokości sondy należy przepompować rozpuszczalnik do pobierania próbek i włączyć napięcie jonizacji, tak aby można było zaobserwować tylko sygnały jonów tła rozpuszczalnika. Następnie monitoruj zmianę widma masowego, ostrożnie zmniejszając odległość sondy-powierzchnia, podnosząc zmotoryzowany stopień Z, aż będzie można zaobserwować silne i stabilne sygnały jonowe z przekroju tkanki; ta wysokość sondy zostanie wykorzystana do zbierania danych MSI podczas eksperymentu. Ponadto zoptymalizowane natężenie przepływu rozpuszczalnika jest niezbędne w eksperymentach MSI. Dostosuj natężenie przepływu za pomocą zoptymalizowanej wysokości sondy. Upewnij się, że na powierzchni tkanki nie ma rozprowadzonego rozpuszczalnika (tj. natężenie przepływu jest zbyt wysokie) lub nie tworzy się pęcherzyki wewnątrz emitera nano-ESI (tj. natężenie przepływu jest zbyt niskie).
Pojedyncza sonda jest wielofunkcyjnym urządzeniem do bioanalizy. Oprócz eksperymentów MSI, jest w stanie przeprowadzać SCMS in-situ w czasie zbliżonym do rzeczywistego w celu wyjaśnienia szczegółowych informacji chemicznych z żywych komórek eukariotycznych16, co jest główną zaletą w porównaniu z innymi technikami SCMS opartymi na próżni (takimi jak MALDI10 i SIMS21). Niewielki rozmiar końcówki sondy zapewnia możliwość wprowadzenia jej do żywej komórki eukariotycznej oraz ekstrakcji i jonizacji związków wewnątrzkomórkowych w celu natychmiastowej analizy stwardnienia rozsianego. Podobnie, rozpuszczalniki do pobierania próbek zawierające odczynniki (np. związki dicationowe) mogą być używane w eksperymentach SCMS, a w żywej pojedynczej komórce można wykryć szerszy zakres składników komórkowych niż kiedykolwiek wcześniej (trwające badania, dane nie są pokazane). Chociaż analiza w czasie rzeczywistym dostarczy profili chemicznych żywych pojedynczych komórek, ze względu na penetrację błony komórkowej i ekstrakcję zawartości komórkowej, badana komórka zostanie zabita po eksperymencie, co oznacza, że technika SCMS z pojedynczą sondą jest nadal metodą destrukcyjną. Ponadto końcówka sondy i emiter nano-ESI w pojedynczej sondzie mogą być łatwo zatkane przez niedoświadczonych użytkowników. Aby zmniejszyć ryzyko zatkania urządzenia, należy unikać dotykania jądra podczas wkładania końcówki pojedynczej sondy do komórki. Jeśli dojdzie do zatkania, urządzenie można zregenerować, podgrzewając zatkaną końcówkę sondy lub emiter nano-ESI za pomocą domowej cewki grzewczej16. Innym ograniczeniem techniki SCMS z pojedynczą sondą jest to, że tylko komórki adhezyjne (tj. komórki są przymocowane do powierzchni) mogą być analizowane przy użyciu bieżącej konfiguracji. Jednak dzięki włączeniu systemu manipulacji komórkami do aparatu SM z pojedynczą sondą, w przyszłości można badać szersze typy komórek.
Podobnie jak w przypadku eksperymentu MSI, uzyskanie wysokiej jakości sondy i zoptymalizowanego natężenia przepływu rozpuszczalnika ma kluczowe znaczenie dla badań SCMS. Podczas dostrajania natężenia przepływu rozpuszczalnika, końcówka pojedynczej sondy jest umieszczana nad próbką (tj. nie ma kontaktu z komórką lub pożywką hodowlaną) i upewnij się, że z końcówki sondy nie kapie rozpuszczalnik ani nie tworzy się pęcherzyków wewnątrz emitera nano-ESI.

Obrazowanie spektrometrii mas (MSI) jest stosunkowo nową techniką obrazowania molekularnego, która zapewnia przestrzenny rozkład interesujących związków na powierzchniach. Podczas analizy MSI pomiary spektrometrii mas (MS) są rejestrowane na całej powierzchni na podstawie pojedynczych pikseli w celu stworzenia obrazu 2D gatunków będących przedmiotem zainteresowania 1. Techniki MSI mają zdolność do zapewnienia przestrzennie rozdzielczego rozkładu cech dla szerokiego zakresu metabolitów, co pozwala na uzyskanie znacznie większej ilości informacji z próbki niż przy użyciu tradycyjnych technik obrazowania molekularnego, a także mają potencjał, aby znacznie poprawić analizę próbek biologicznych do badań biologicznych i farmakologicznych 2. MSI można ogólnie podzielić na podejścia niezwiązane z otoczeniem i podejścia ambientowe. Techniki analizy MSI poza otoczeniem, takie jak jonizacja desorpcji laserowej wspomagana matrycą (MALDI) MS 3 i czas przelotu jonów wtórnych MS (ToF SIMS) 4, są zdolne do uzyskania wysokiej rozdzielczości przestrzennej (odpowiednio około 5 μm i 100 nm) i wysokiej czułości. Metody te wymagają jednak intensywnego przygotowania próbki, takiego jak nałożenie cząsteczek matrycy na powierzchnię próbki oraz środowisko próbkowania próżniowego, które może wprowadzić artefakty do uzyskanych danych. Techniki otoczenia, takie jak desorpcja, jonizacja elektronatryskowa (DESI) MS 5, jonizacja elektronrozpylania metodą ablacji laserowej (LAESI) MS 6 i nano-DESI MS 7, są zdolne do MSI próbek z niewielką lub żadną wcześniejszą przygotowaniem w środowisku otoczenia, co jest w stanie wytworzyć obrazy MS, które potencjalnie odzwierciedlają próbkę w jej najbardziej natywnym stanie. Jednak większość z tych technik na ogół nie ma wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czułości wykrywania w porównaniu z technikami bez otoczenia, przy czym eksperymenty są zwykle przeprowadzane przy około 150 μm na piksel 8.
Analiza pojedynczych komórek (SCA) to rozwijająca się dziedzina, która ma możliwość charakteryzowania składu chemicznego próbek biologicznych na poziomie komórkowym. SCA umożliwia analizę systemów biologicznych na bardziej podstawowym poziomie niż tradycyjne techniki analizy komórek, które dają uśredniony wynik populacji komórek, potencjalnie dostarczając informacji, które wcześniej były trudne do opanowania 9. Techniki MS zostały ostatnio zastosowane do SCA (określanej jako spektrometria mas pojedynczej komórki lub SCMS) przy użyciu technik niezwiązanych z otoczeniem, takich jak MALDI MS 10 i ToF SIMS 11, w których komórki są poddawane wstępnej obróbce przed analizą, oraz technik otoczenia, takich jak LAESI MS 12 i metod ekstrakcji bezpośredniej, takich jak wideo na żywo z pojedynczej komórki-MS 13, 14, do analizy szerokiej gamy typów komórek, takich jak jaja, rośliny i rak. Techniki otoczenia mają tę zaletę, że są stosowane do żywych komórek, co ponownie minimalizuje artefakty, prowadząc do lepszej reprezentacji metabolitów w żywych komórkach. Opisane powyżej metody oparte na ekstrakcji bezpośredniej przeprowadzają jednak proces ekstrakcji i analizy próbki na dwóch różnych etapach, co powoduje przerwę czasową podczas analizy, która może potencjalnie zmienić metabolity obecne w próbce. 
Pojedyncza sonda, zminiaturyzowane wielofunkcyjne urządzenie, które jest zdolne do przeprowadzania wysokiej rozdzielczości przestrzennej otoczenia MSI na sekcjach tkanek biologicznych 15 oraz SCMS w czasie zbliżonym do rzeczywistego in-situ na żywych pojedynczych komórkach 16. Pojedyncza sonda ma zintegrowaną konstrukcję, która składa się z ciągnionej kapilary kwarcowej z podwójnym otworem połączonej z wlotem rozpuszczalnika i emiterem nano-ESI wykonanym z kapilar ze stopionej krzemionki, umożliwiając dostarczanie rozpuszczalnika i ekstrakcję analitu za pomocą jednego urządzenia. W trybie otoczenia MSI pojedynczą sondę umieszcza się nad tkanką próbki i następuje mikroekstrakcja powierzchniowa, co pozwala na uzyskanie rastrowego obrazu MS w wysokiej rozdzielczości przestrzennej. W szczególności stożkowa końcówka pojedynczej sondy jest na tyle mała, że można ją wprowadzić do żywych komórek eukariotycznych w celu analizy SCMS in-situ, gdzie wykrywanie metabolitów trwa mniej niż dwie sekundy między wprowadzeniem sondy a wykryciem MS, co pozwala na uzyskanie informacji chemicznych w czasie zbliżonym do rzeczywistego. Poniżej przedstawiono protokoły do produkcji urządzenia z pojedynczą sondą i przeprowadzania zarówno trybów otoczenia MSI, jak i SCMS przy użyciu technik MS z jedną sondą.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><mocny>Produkcja pojedynczej sondy</td></tr><tr><td>Rurka kwarcowa dwuotworowa, 1.120' &rsquo; &czasy; 0,005" &czasy; 12"</td><td>Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ&nbsp;</td><td>MBT-005-020-2Q</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz laserowy do mikropipet&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co., Novato, CA&nbsp;</td><td>Model P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara z topionej krzemionki, ID: 40&nbsp; &mikro; m, OD: 110&nbsp; &mikro; m</td><td>Molex, Lisle, IL</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>żywica utwardzana promieniami UV&nbsp;</td><td>Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA</td><td>Nr artykułu 006.030</td><td></td></tr><tr><td>Lampa UV LED</td><td>Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, Chiny</td><td>LY-C240</td><td></td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa</td><td>Devcon, Danvers, MA&nbsp;</td><td>Nr kat. 20945</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofiltr liniowy&nbsp;</td><td>IDEX Zdrowie & Science LLC, Jezioro Leśne, IL</td><td>M-520</td><td></td></tr><tr><td>Microunion&nbsp;</td><td>IDEX Zdrowie & Science LLC, Lake Forest, IL</td><td>M-539</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe (szkło)</td> <td>C & Naukowy - premiera, Manassas, VA&nbsp;</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka&nbsp;</td><td>Hamilton, Reno, NV</td><td>1725LTN 250UL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Spektrometr masowy</td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Mass sprectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA&nbsp;</td><td>Oprogramowanie LTQ Orbitrap XL</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur 2.1</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA&nbsp;</td><td></td><td></td>XCALIBUR21</tr><tr><td>Fance Stage Control</td><td>Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSI QuickView</td><td>Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Urządzenie zamykające kontakty</td></tr><tr><td>USB-6009 Multifunction DAQ</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>779026-01</td><td></td></tr><tr><td>DR-5V SDS Przekaźnik</td><td>Panasonic, Kadoma, Japonia&nbsp;</td><td>DR-SDS-5</td><td></td></tr><tr><td>Bramki logiczne 50 Ohm Sterownik</td><td>liniowy Texas Instruments, Dallas, TX&nbsp;</td><td>SN74128N</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Konfiguracja z jedną sondą</td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stolik liniowy i kontroler (3 zestawy)</td><td>Newport, Irvine, CA</td><td>Conex-MFACC</td><td></td></tr><tr><td>Miniaturowy stolik XYZ</td><td>Newport, Irvine, CA</td><td>MT-XYZ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tłumaczenie Stopień XY</td><td>ThorLab, Newton, NJ</td><td>PT1 i PT102</td><td></td></tr><tr><td>Thermo LTQ XL kołnierz interfejsu źródła jonów</td><td>Nowy obiektyw, Woburn, MA&nbsp;</td><td>PV5500</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy mikroskop stereoskopowy, 250X - 2,000X</td><td>Shenzhen D& F Co., Shenzhen, Chiny</td> Mikroskop fotografii cyfrowej <td>Supereyes T004</td><td></td></tr><tr><td>USB&nbsp;</td><td>DX.com, Hongkong, Chiny</td><td>S02 25~500X&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Chemyx Inc., Stafford, TX&nbsp;</td><td>Nexus 3000</td><td></td></tr><tr><td>Solidna aluminiowa płytka optyczna do krojenia chlebowego, 8" x 8" x 1/2"</td> <td>Thorlabs, Newton, NJ</td><td>MB810</td><td></td></tr><tr><td>Elastyczny uchwyt zaciskowy</td><td>Siskiyou, Grants Pass, LUB&nbsp; &nbsp;</td><td>MXB-3h</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Rozpuszczalniki</silny></td></tr><tr><td>Metol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>34860 Chromasolv</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>34967 Chromasolv</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni (DMEM)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>10% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco/Life Technologies, Long Island, NY</td><td>10100-139</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>10 mM HEPES (pH 7,4)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA&nbsp;</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 12-dołkowe&nbsp;</td><td>Corning Inc., Corning, Nowy Jork&nbsp;</td><td>Kolba Falcon 351143</td><td></td></tr><tr><td>T25</td><td>Corning Inc., Corning, Nowy Jork&nbsp;</td><td>Okulary Micro Cover Falcon 3055</td><td></td></tr>, <tr><td>okrągłe, nr 1</td><td>VWR International, Radnor, PA&nbsp;</td><td>48380-046</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (sulcotlenek dimetylu)</td><td>VWR International, Radnor, PA&nbsp;</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Obrazowanie tkanek</td></tr><tr><td>Cyro-Cut Microtome</td><td>American Optical Coporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek, Optymalna temperatura cięcia (OCT)&nbsp;</td><td>Sakura Finetek Inc., Torrance, CA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe (poliwęglan)</td><td>Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL</td><td>P11011P</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowania pojedynczej sondy: obrazowanie spektrometrią mas i analiza pojedynczych komórek w warunkach otoczenia

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Obrazowanie spektrometrii mas (MSI) i analiza spektrometrii mas in-situ pojedynczej komórki (SCMS) w warunkach otoczenia to dwie nowe dziedziny o dużym potencjale dla szczegółowej analizy spektrometrii mas (MS) biomolekuł z próbek biologicznych. Pojedyncza sonda, zminiaturyzowane urządzenie ze zintegrowanymi możliwościami próbkowania i jonizacji, jest w stanie wykonywać zarówno analizę MSI w otoczeniu, jak i analizę SCMS in-situ. W przypadku MSI otoczenia pojedyncza sonda wykorzystuje mikroekstrakcję powierzchniową do ciągłego przeprowadzania analizy MS próbki, a technika ta umożliwia tworzenie obrazów MS o wysokiej rozdzielczości przestrzennej (8,5 μm) z próbek biologicznych, takich jak mózg myszy i skrawki nerek. Ambient MSI ma tę zaletę, że przed analizą nie jest wymagane żadne przygotowanie próbki, co zmniejsza ilość potencjalnych artefaktów obecnych podczas pozyskiwania danych i pozwala na bardziej reprezentatywną analizę próbki, która ma zostać pozyskana. W przypadku SCMS in-situ końcówka z pojedynczą sondą może być bezpośrednio wprowadzana do żywych komórek eukariotycznych, takich jak komórki HeLa, ze względu na mały rozmiar końcówki do pobierania próbek (< 10 μm), a technika ta jest w stanie wykryć szeroki zakres metabolitów wewnątrz pojedynczych komórek w czasie zbliżonym do rzeczywistego. SCMS umożliwia uzyskanie większej czułości i dokładności informacji chemicznych na poziomie pojedynczej komórki, co może poprawić nasze zrozumienie procesów biologicznych na bardziej podstawowym poziomie niż było to możliwe wcześniej. Urządzenie z pojedynczą sondą może być potencjalnie sprzężone z różnymi spektrometrami mas dla szerokiego zakresu badań MSI i SCMS.

Pojedyncza sonda została z powodzeniem wykorzystana do analizy MSI w warunkach otoczenia w przypadku przekrojonej tkanki nerki myszy 15. Urządzenie wykorzystuje mechanizm powierzchniowej mikroekstrakcji cieczy (Rycyna 1a), co zapewnia wysoce wydajną ekstrakcję analitytów z małego obszaru, prowadząc do wysokich intensywności sygnałów jonowych w wynikach MSI. Na przykład, dla niektórych obfitych metabolitów osiągnięto intensywności sygnału przekraczające 107 (Rycina 2a). W ten sposób wykryto dużą liczbę metabolitów, w tym szereg gatunków sfingomieliny (SM) i fosfatydylocholiny (PC), takich jak [SM (34:1) + Na]+ (725,5575 m/z), [PC (32:0) + H]+ (734,5700 m/z), [PC (34:1) + Na]+ (782,5696 m/z) oraz [PC (38:5 + Na)]+ (814,5726 m/z). Związki te zostały zidentyfikowane z wysoką rozdzielczością i dokładnością masy dzięki zastosowaniu spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości. Na przykład, w przedstawionych tutaj wynikach identyfikacja została przeprowadzona z dokładnością masy poniżej 4 ppm m/z (t.j. różnica między wartościami obserwowanymi a teoretycznymi) dla każdego metabolitu (Rycina 2b). Ponadto przeprowadzono analizy tandemowe MS (t.j. MS/MS) w celu bardziej pewnej identyfikacji interesujących gatunków.15
Dzięki możliwości wydajnej mikroekstrakcji cieczy z niewielkiego obszaru, urządzenie z pojedynczą sondą może być wykorzystywane do przeprowadzania eksperymentów MSI o wysokiej rozdzielczości przestrzennej w warunkach otoczenia.15Na przykład uzyskano szczegółowe obrazy MS przekrojów nerek myszy, ilustrujące przestrzenną dystrybucję wybranych metabolitów (Rycina 2c). Rozdzielczość przestrzenną obrazu MS określono na poziomie 8.5 µmzgodnie z powszechnie stosowaną metryką, według której punkt przejścia wyraźnej cechy wyznacza się w zakresie 20–80% zmiany natężenia sygnału MS. 18 W przypadku fosfolipidu [PC (38:5 + Na)]+ na przekroju nerki myszy, przejście cech między rdzeniem wewnętrznym a rdzeniem zewnętrznym następuje w obrębie jednego cyklu skanowania w chronogramie, wykazując zmianę intensywności przekraczającą zakres 20-80%. Na podstawie prędkości przemieszczania się próbki (10.0 µm/sec) oraz szybkość akwizycji danych MS (0,85 s/widmo), odległość przemieszczania się próbki w jednym cyklu skanowania MS (8.5 µm), t. j., rozdzielczość przestrzenną MSI, można obliczyć (Rysunek 2d). Rozdzielczość przestrzenna ta należy do najwyższych dotychczas osiągniętych w technikach MSI w warunkach ambientowych przeprowadzanych na próbkach biologicznych.
W przypadku SCMS pojedyncza sonda pozwoliła na analizę poszczególnych żywych komórek HeLa 16. Rozmiar końcówki pojedynczej sondy wynosi zazwyczaj mniej niż 10 µm (Rysunek 3a), co jest wystarczająco małe, aby można było ją wprowadzić bezpośrednio do wielu typów komórek eukariotycznych, których średnica wynosi ~10 µm, w celu ekstrakcji i analizy MS. Proces wprowadzania końcówki pojedynczej sondy do komórki można monitorować wizualnie za pomocą cyfrowego mikroskopu stereoskopowego (Rysunek 3b), a penetrację błony komórkowej można potwierdzić poprzez szybką i znaczącą zmianę widm mas z PBS (lub świeżej pożywki hodowlanej) na związki wewnątrzkomórkowe (Rysunki 3c oraz 3d). Eksperymenty można prowadzić zarówno w trybie jonów dodatnich, jak i ujemnych, aby wykryć szerszą gamę gatunków molekularnych. Na przykład w trybie dodatnim zidentyfikowano 18 różnych gatunków lipidów, w tym sfingomieliny (SM) i fosfatydylocholiny (PC), natomiast w trybie jonów ujemnych wykryto fosforany adenozyny (AMP, ADP i ATP) (Rysunki 3c oraz d). Opóźnienie czasowe między wprowadzeniem pojedynczej sondy do komórki a detekcją sygnału wynosiło zazwyczaj mniej niż dwie sekundy, co umożliwiło detekcję metabolitów komórkowych niemal w czasie rzeczywistym. SCMS zastosowano również w eksperymentach, w których komórki były traktowane lekami przeciwnowotworowymi (np. OSW-1, paklitakselem i doksorubicyną) 19]. Odpowiednie leki można wykryć w komórkach HeLa po 4-godzinnej inkubacji w serii stężeń (tj. 10 nM, 100 nM, 1 µM i 10 µM) w DMSO (dimetylosulfoksydzie), używając komórek nietraktowanych (dodano tylko DMSO) jako kontroli. Sygnały MS leków nie były obecne w pozakomórkowym PBS ani w kontroli (Rysunek 3e), lecz zostały wykryte w pojedynczych komórkach przy użyciu techniki pojedynczej sondy MS (na Rysunku 3f przedstawiono wyniki tylko dla stężenia 100 nM). Ponieważ komórki zostały przepłukane PBS (lub świeżą pożywką hodowlaną) w celu usunięcia związków pozakomórkowych i zanieczyszczeń, detekcja metabolitów endogennych (np. lipidów komórkowych i fosforanów adenozyny) oraz związków egzogennych (np. leków przeciwnowotworowych) wskazuje, że technika pojedynczej sondy MS może być stosowana do analizy związków wewnątrzkomórkowych.
<img alt="Układ nano-ESI z jedną sondą do spektrometrii mas; zawiera schematy i mikroskopy cyfrowe." src="/files/ftp_upload/53911/53911fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wykonanie i konfiguracja pojedynczej sondy do analiz MSI i SCMS w warunkach otoczenia. a) Procedury wykonania pojedynczej sondy. b) Fotografia wykonanej pojedynczej sondy przymocowanej do szkiełka przedmiotowego. c) Fotografia układu z pojedynczą sondą podłączonego do spektrometru mas. d) Schemat układu z pojedynczą sondą sprzężonej ze spektrometrem mas. Podczas eksperymentu rozpuszczalnik pobierający jest stale dostarczany ze strzykawki, napięcie jonizacji jest przykładane do przewodzącego złącza ze spektrometru mas, dwa mikroskopy cyfrowe służą do monitorowania umiejscowienia próbki, zmotoryzowany system stołu XYZ służy do kontroli ruchu próbki, a spektrometr mas jest wykorzystywany do analizy. e) Fotografia dostosowanego systemu cyfrowego stereoskopu. f) Fotografia przedstawiająca cyfrowy stereoskop przymocowany do kołnierza interfejsu źródła jonów za pomocą płyty optycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza spektrometrią mas; wykres m/z, tabela fosfolipidów, obrazowanie tkanki nerek; porównanie intensywności jonów." src="/files/ftp_upload/53911/53911fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
Rycina 2. Wyniki badania MSI w warunkach ambientowych na przekroju nerki mysiej z wysoką rozdzielczością przestrzenną i masową. a) Reprezentatywne widmo masowe z MSI z pojedynczą sondą. Maksymalna intensywność wykrytych metabolitów może osiągnąć 3.39 x 107 (jednostki arbitralne). b) Wybrane wykryte metabolity przedstawione wraz z dokładnością masy. c) Obrazy MS dla [PC(32:0) + H]+ oraz [PC(34:1) + Na]+ uzyskane z przekroju nerki mysiej przy rozdzielczości przestrzennej 8.5 µm. PC: fosfatydylocholina. Pasek skali: 2 mm; 0.20 mm (wstawka). d) Wyznaczenie rozdzielczości przestrzennej obrazu MS dla [PC(38:5) + Na]+ (zaadaptowano z uprawnieniem z odniesienia 15). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza spektrometrii mas komórek HeLa; układ z pojedynczą sondą; dane o metabolitach; wykres porównawczy widm." src="/files/ftp_upload/53911/53911fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wyniki analizy SCMS w warunkach otoczenia komórek HeLa traktowanych lekiem przy wysokiej rozdzielczości masy. a) Powiększona fotografia końcówki pojedynczej sondy pokazująca typową średnicę &lt; 10 µm. b) Fotografia wykonana w punkcie wprowadzenia pojedynczej sondy do komórki HeLa. Pasek skali: 50 µm. c) Typowe widmo mas w dodatnim trybie jonizacji z identyfikacją szeregu gatunków PC (fosfatydylocholiny). d) Reprezentatywna lista metabolitów wykrytych w analizie SCMS komórek HeLa zarówno w dodatnim, jak i ujemnym trybie jonizacji. e-f) Widma mas dla komórek kontrolnych i traktowanych (100 nM OSW-1) (zaadaptowane za zgodą z referencji 16). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina S1. Schemat obwodu urządzenia elektronicznego służącego do generowania sygnału zamknięcia styku dla spektrometru mas w celu zbierania danych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911figS1.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić lub pobrać tę figurę, kliknij tutaj.</a>

Tutaj prezentujemy protokoły do wykonywania zarówno obrazowania tkanek za pomocą spektrometrii mas otoczenia (MSI), jak i analizy MS na żywo (SCMS) in situ przy użyciu pojedynczej sondy, która jest zminiaturyzowanym wielofunkcyjnym urządzeniem do analizy MS.

Zastosowania pojedynczej sondy: obrazowanie spektrometrią mas i analiza pojedynczych komórek w warunkach otoczenia

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Ogólnym celem tej metody jest stworzenie urządzenia do pobierania próbek w skali mikro, Single-probe, służącego do analizy pojedynczych żywych komórek przy użyciu spektrometrii mas w warunkach otoczenia, a także do obrazowania tkanek biologicznych za pomocą spektrometrii mas w warunkach otoczenia z wysoką rozdzielczością przestrzenną. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach biologicznych i farmaceutycznych.Przykładowo, jakie cząsteczki występują w żywych pojedynczych komórkach oraz w jaki sposób są one rozmieszczone w tkankach. Główną zaletą tej techniki jest to, że pojedyncza sonda stanowi wielofunkcyjne urządzenie, które może być wykorzystywane zarówno do analizy pojedynczych żywych komórek, jak i do wysokorozdzielczych eksperymentów obrazowania metodą spektrometrii mas w warunkach otoczenia. Choć metoda ta pozwala na analizę pojedynczych komórek i tkanek, może być ona również zastosowana w innych układach, w których pożądane jest pobieranie próbek w skali mikro, takich jak analiza rozproszona substancji chemicznych, żywych mikrokolonii oraz biofilmów.Procedurę zaprezentuje Wei Rao, postdoc z mojego laboratorium. Umieść cały wybrany organ mysi w centrum małego plastikowego dołka. Zanurz organ w związku do zatapiania tkanek do wysokości około 10mm.Natychmiast umieść tkanki w ciekłym azocie w celu błyskawicznego zamrożenia. Aby przygotować przekrój tkanki mysiej, pobierz zamrożony organ myszy i rozmroź go do 15 °C w kriomikrotomie z kontrolą temperatury. Przymocuj tkankę do stalowej podstawki, używając około 500 µL związku do zatapiania tkanek, a następnie umieść ją w uchwycie sekcyjnym kriomikrotomu w taki sposób, aby nożowi była dostępna pożądana orientacja cięcia.Wykonaj skrawki tkanki o grubości 12 µm. Następnie umieść skrawki tkanki na poliwęglanowych szkiełkach przedmiotowych i pozostaw je do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej. Pozyskaj próbkę komórek, np. 1 mL zawiesiny komórek HeLa, i dodaj ją do 9 mL pełnej pożywki do hodowli komórkowej w standardowej płytce hodowlanej o średnicy 10 cm.Hodować komórki w temperaturze 37°C przy 5% CO2 przez dwa do trzech dni, aż powierzchnia wzrostu na płytce hodowlanej zostanie pokryta w 70-80%. Przeprowadzić pasażowanie komórek na płytce hodowlanej. W tym celu odessać pożywkę wzrostową i wypłukać komórki 5 mL 1x roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).Usuń PBS za pomocą sterylnego końcówki aspiracyjnej i inkubuj komórki w 2,5 mL trypsyny przez około 5 minut w temperaturze 37°C, aby odłączyć komórki od płytki hodowlanej. Zahamuj działanie trypsyny, dodając 7,5 mL pełnej pożywki do hodowli komórkowych, a następnie jednorodnie resuspenduj komórki. Aby przygotować próbki komórek do eksperymentu spektrometrii mas pojedynczych komórek (SCMS), umieść najpierw pojedyncze mikrokryszalki w dołkach płytki 12-dołkowej.Następnie do studzienki dodaj 1,8 mL pożywki hodowlanej oraz 0,2 mL zawiesiny komórkowej. Delikatnie wymieszaj komórki, lekko kołysząc płytką, a następnie inkubuj w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 24 godziny. Aby przeprowadzić terapię lekową hodowlanych komórek, dodaj roztwór związku leczniczego do 12-dołkowej płytki hodowlanej.Umieść dwukanałową rurkę kwarcową w laserowym wyciągarze mikropipet i wyciągnij dwukanałową igłę kwarcową. Jako wartości początkowe ustaw temperaturę na 400, włókno na trzy, prędkość na 80, opóźnienie na 150 oraz siłę wyciągu na 250. Odetnij końcówkę wyciągu tak, aby po drugiej stronie pozostało około 5mm niewyciągniętej dwukanałowej kapilary kwarcowej.Odetnij odcinek kapilary z topionego kwarcu o długości 80 mm, która będzie służyć jako kapilara doprowadzająca rozpuszczalnik. Następnie wprowadź kapilarę do jednego z otworów na płaskim końcu dwuotworowej igły kwarcowej. Wyciągnij nad palnikiem kapilarę z topionego kwarcu, aby utworzyć emiter nanoESI, odetnij ją do długości 7-10 mm i wprowadź do drugiego otworu na płaskim końcu dwuotworowej igły kwarcowej.Nanieś minimalną ilość żywicy utwardzanej promieniami UV na płaski koniec dwuświatowej igły kwarcowej. Utwardź żywicę za pomocą lampy LED UV przez około 20 sekund, aby zabezpieczyć kapilarę doprowadzającą rozpuszczalnik oraz emiter nanoESI. Następnie przetnij standardowe szkiełko przedmiotowe wzdłuż jego długości.Następnie umieść sondę pojedynczą na jednym końcu szkiełka przedmiotowego w taki sposób, aby emiter nanoESI był skierowany na zewnątrz. Nałóż zwykłą żywicę epoksydową na korpus sondy pojedynczej, aby została ona przymocowana do szkiełka przedmiotowego, a następnie pozostaw do utwardzenia na całą noc. System ten obejmuje dostosowany flansz interfejsu źródła jonów spektrometru mas oraz aluminiową płytkę optyczną, do której przymocowano cyfrowy mikroskop USB, miniaturowy manualny stół translacyjny XYZ oraz zmotoryzowany system stołu translacyjnego XYZ.Zmodyfikuj kołnierz interfejsu źródła jonów spektrometru mas i wykonaj statyw cyfrowego stereomikroskopu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zamocuj zmodyfikowany cyfrowy stereomikroskop, cyfrowy mikroskop USB, miniaturowy ręczny stolik translacyjny XYZ z elastycznym uchwytem zaciskowym oraz zautomatyzowany system stolika translacyjnego XYZ do aluminiowej płyty optycznej. Użyj elastycznego uchwytu zaciskowego, aby przymocować szkiełko przedmiotowe z zamocowaną pojedynczą sondą.Następnie podłącz zestaw z jedną sondą do spektrometru mas. Wyreguluj elastyczny uchwyt zaciskowy oraz miniaturowy stolik XYZ, aby umieścić emiter pojedynczej sondy przed wlotem spektrometru mas. Odmroź fragment próbki w temperaturze pokojowej i umieść go na zmotoryzowanym systemie stolika translacyjnego XYZ pod pojedynczą sondą.Dostosuj pozycję próbki, zmieniając współrzędne w oprogramowaniu sterującym. Użyj strzykawki, aby pompować rozpuszczalnik do pobierania próbek z odpowiednią prędkością. Następnie przyłóż napięcie jonizacji.Dostosuj wysokość pojedynczej sondy tak, aby spoczywała tuż nad powierzchnią próbki, umożliwiając ekstrakcję metabolitów z powierzchni. Ostrożnie podnieś zespół osi Z, a następnie użyj cyfrowego mikroskopu USB, aby monitorować zmianę odległości między końcówką pojedynczej sondy a powierzchnią tkanki. Ustaw parametry skanowania rastrowego obszaru zainteresowania w obrębie próbki.W przypadku przedstawionych tutaj przekrojów nerki myszy należy zastosować prędkość rastrowania 10 µm/s oraz odległość 20 µm między liniami. Należy ustawić parametry rastrowania dla interesującego obszaru przekroju wewnątrz próbki. W przypadku przedstawionych tutaj przekrojów nerki myszy należy zastosować prędkość rastrowania 10,0 µm/s oraz odległość 20 µm między liniami.Skonfiguruj metodę automatycznego pozyskiwania widm MS ze spektrometru mas. W przypadku MSI o wysokiej rozdzielczości masy dla próbki nerki myszej zastosuj rozdzielczość masy 60 000, tryb dodatni 5kV, 1 mikroskan, maksymalny czas wtrysku 150 milisekund oraz włączoną automatyczną kontrolę wzmocnienia (AGC). Rozpocznij akwizycję danych MSI, a następnie sporządź obrazy MS z surowych plików MS zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Skonfiguruj system z jedną sondą zgodnie z instrukcjami dla MSI i dostosuj prędkość przepływu rozpuszczalnika. Przemyj hodowlę komórek przytwierdzonych do szkiełek mikroskopowych z krawędzią z PBS, aby usunąć podłoże hodowlane oraz pozakomórkowe składniki leku. Następnie umieść szkiełko z komórkami na zmotoryzowanym systemie stołu translacyjnego XYZ w celu przeprowadzenia eksperymentu.Ustaw ostrość cyfrowego stereomikroskopu nad próbką, kierując go na końcówkę pojedynczej sondy, aby monitorować penetrację komórki podczas analizy. Użyj cyfrowego mikroskopu USB znajdującego się z boku pojedynczej sondy, aby monitorować warunki pracy emitera nanoESI na sondzie. Wykorzystaj program sterowania zmotoryzowanym stołem XYZ oraz cyfrowy stereomikroskop, aby zlokalizować interesującą komórkę i precyzyjnie ustawić końcówkę pojedynczej sondy nad próbką.Rozpocznij akwizycję danych MS przed wprowadzeniem końcówki z pojedynczą sondą do ogniwa. Obniż płytkę zawierającą ogniwo, aby wyciągnąć końcówkę z pojedynczą sondą z ogniwa. Na koniec pozwól rozpuszczalnikowi przepływać przez około trzy minuty, aby całkowicie przepłukać pojedynczą sondę.Przeprowadzono obrazowanie spektrometrią mas w warunkach otoczenia przekrojów nerki mysiej, co pozwoliło na wykrycie licznej grupy cząsteczek obecnych na powierzchni tkanki. Wykreślono rozkład przestrzenny oraz względną obfitość wielu cząsteczek na powierzchni tkanki. Osiągnięto rozdzielczość przestrzenną wynoszącą 8,5 mikronów, co potwierdzono poprzez obserwację ostrych przejść cech obecnych w danych spektrometrii mas.Wytwarzanie pojedynczej sondy z ostrym grotem i otwartymi kanałami jest kluczowe dla analizy pojedynczych komórek. Mikroskopy są niezbędne do zlokalizowania komórek docelowych i monitorowania procesu penetracji komórki. Zmiana sygnału w widmach masowych dostarcza dodatkowych informacji potwierdzających penetrację komórki.Wykryto ogromną liczbę cząsteczek z żywych pojedynczych komórek. W badaniach nad lekami przeciwnowotworowymi wykorzystuje się eksperymenty na komórkach kontrolnych, aby wykazać różnice wynikające z zastosowania leku przeciwnowotworowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, w jaki sposób wytwarza się pojedynczą sondę oraz jak to urządzenie jest wykorzystywane do analizy pojedynczych komórek metodą spektrometrii mas oraz do obrazowania tkanek biologicznych metodą ambientowej spektrometrii mas.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wymagane są szczegółowe instrukcje dotyczące wykonania urządzenia z pojedynczą sondą, konfiguracji całego systemu oraz obsługi aparatury. Po opanowaniu techniki analiza pojedynczych komórek może być wykonywana seryjnie dla wielu komórek. Każda analiza trwa mniej niż trzy minuty.Zakończenie eksperymentu obrazowania MS w warunkach otoczenia może zająć kilka godzin, w zależności od wielkości próbki, rozdzielczości przestrzennej oraz użytego spektrometru mas. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że kluczowym krokiem jest wykonanie wysokiej jakości pojedynczej sondy. Ponadto strojenie i obsługa instrumentu mają krytyczne znaczenie dla pomyślnego przeprowadzenia eksperymentu.Inne metody można opracować, stosując procedury podobne do tych przedstawionych w niniejszym opracowaniu. Na przykład odczynniki można dodać do rozpuszczalnika próbki, a następnie przeprowadzić reaktywną analizę pojedynczych komórek oraz MSI w warunkach otoczenia, aby poprawić wykrywalność cząsteczek w próbkach. Po opracowaniu technika ta otworzyła nowe możliwości dla badaczy zajmujących się zarówno analizą pojedynczych komórek, jak i obrazowaniem spektrometrią mas w warunkach otoczenia.Technikę tę można potencjalnie wykorzystać w badaniach z zakresu biologii komórki, studiach farmakologicznych oraz testach klinicznych. Należy pamiętać, że praca z ostrymi kapilarami kwarcowymi i żywicą epoksydową utwardzaną promieniami UV może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i okularów ochronnych z filtrem UV.

applications-single-probe-mass-spectrometry-imaging-single-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza pojedynczych komórek jest przeprowadzana za pomocą spektrometrii mas w komórkach roślinnych i zwierzęcych pod ciśnieniem atmosferycznym, wykorzystując zaostrzony światłowód do pobierania próbek komórek w celu przeprowadzenia spektrometrii mas z jonizacją przez rozpylanie wspomaganą ablacją laserową (LAESI).

Bezpośrednia analiza pojedynczych komórek za pomocą spektrometrii mas przy ciśnieniu atmosferycznym

Unieśmiertelnione linie komórek rakowych mogą być hodowane jako hodowle komórek 3D, co jest cennym modelem dla badań biologicznych. Protokół ten opisuje obrazowanie hodowli komórkowych 3D za pomocą spektrometrii mas, w tym ulepszenia platformy przygotowania próbek. Celem tego protokołu jest poinstruowanie użytkowników, jak przygotować hodowle komórek 3D do analizy obrazowania metodą spektrometrii mas.

Strategie przygotowania próbek do obrazowania spektrometrią mas modeli 3D kultur komórkowych

Opisujemy kroki, które umożliwiają szybkie pobieranie próbek in situ małej części pojedynczej komórki z dużą precyzją i minimalną inwazją, przy użyciu mikropróbkowania opartego na kapilarach, aby ułatwić chemiczną charakterystykę migawki aktywności metabolicznej w żywych zarodkach przy użyciu specjalnie zbudowanej platformy do elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas z pojedynczą komórką.

Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis)

Nowatorska metoda przygotowania próbki została opracowana w celu dostosowania kokultury komórek i tkanek do wykrywania wymiany małych cząsteczek za pomocą obrazowania spektrometrii mas.

Uchwycenie komunikacji małych cząsteczek między tkankami a komórkami za pomocą obrazowej spektrometrii mas

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami została opracowana do użytku w połączeniu z jednosondowym zestawem spektrometrii mas do analizy on-line pojedynczych komórek zawiesinowych w warunkach otoczenia.

Zintegrowana platforma do manipulacji komórkami w połączeniu z pojedynczą sondą do analizy spektrometrii mas leków i metabolitów w pojedynczych komórkach zawiesinowych

Ten artykuł przedstawia metody przygotowania próbek dla unikalnej metody analitycznej w czasie rzeczywistym opartej na spektrometrii mas otoczenia. Metoda ta pozwala nam na przeprowadzanie analizy cząsteczek biologicznych in vivo w czasie rzeczywistym bez konieczności przeprowadzania specjalnych zabiegów wstępnych.

Przygotowanie próbki do spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania sondy

Ten protokół przedstawia zintegrowaną platformę spektroskopii Ramana i spektrometrii mas (MS), która jest w stanie osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki. Spektroskopia Ramana może być stosowana do badania odpowiedzi komórkowej na leki, podczas gdy stwardnienie rozsiane może być wykorzystywane do ukierunkowanej i ilościowej analizy wychwytu i metabolizmu leków.

Zintegrowana platforma spektroskopii Ramana i spektrometrii mas do badania wychwytu, metabolizmu i efektów stosowania leków w pojedynczych komórkach

W tym protokole opisujemy, jak przygotować komórki ssaków do analizy proteomicznej pojedynczej komórki za pomocą spektrometrii mas przy użyciu dostępnych na rynku odczynników i sprzętu, z opcjami zarówno ręcznego, jak i automatycznego pipetowania.

Przygotowanie proteomiki jednokomórkowej do analizy spektrometrii mas z wykorzystaniem lizy cieplno-zamrażalniczej i nośnika izobarycznego

Ten protokół opisuje użycie mikroMS do sterowanej fluorescencją, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, umożliwiając lepsze profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczura.

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Ten protokół opisuje spektrometrię masową pojedynczych komórek obrazowania komórek OVCAR-8 z wykorzystaniem jonizacji z desorpcji i elektrozrygowania połączonych ze spektrometrami masowymi Orbitrap do metabolomiki wysokiej rozdzielczości przestrzennej.

Obrazowanie spektrometrii masowej pojedynczych komórek z wykorzystaniem jonizacji z dezorpcją za pomocą elektrycznej emisji rozpyłowej połączonej ze spektrometrami masy Orbitrap

Poznaj analizę pojedynczych komórek i obrazowanie spektrometrią mas w warunkach otoczenia przy użyciu urządzenia Single-probe. Ta metoda umożliwia badanie dystrybucji cząsteczek w tkankach z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Zastosowania pojedynczej sondy: obrazowanie spektrometrią mas i analiza pojedynczych komórek w warunkach otoczenia

Przeglądaj więcej filmów