Zastosowania pojedynczej sondy: obrazowanie spektrometrią mas i analiza pojedynczych komórek w warunkach otoczenia

Ogólnym celem tej metody jest stworzenie urządzenia do pobierania próbek w mikroskali, Single-probe, do analizy żywych pojedynczych komórek za pomocą spektrometrii mas w warunkach otoczenia. Oraz do wykonywania obrazowania tkanek biologicznych za pomocą spektrometrii mas otoczenia z wysoką rozdzielczością przestrzenną. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach biologicznych i farmaceutycznych.

Na przykład, jakie cząsteczki są obecne w żywych pojedynczych komórkach i jak są rozmieszczone w tkankach. Główną zaletą tej techniki jest to, że pojedyncza sonda jest wielofunkcyjnym urządzeniem, które może być używane zarówno do analizy pojedynczych komórek na żywo, jak i do eksperymentów obrazowania spektrometrią mas w otoczeniu o wysokiej rozdzielczości. Chociaż metoda ta może analizować pojedyncze komórki i tkanki, może być również stosowana w innych systemach, w których pożądane jest pobieranie próbek w mikroskali, takich jak analiza prętów chemikaliów oraz żywych mikrokolonii i biofilmów.

Procedurę zademonstruje mi Wei Rao, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Umieść cały interesujący nas narząd myszy w środku małej plastikowej studzienki. Zanurz narząd w związku zatapiającym tkanki do wysokości około 10 mm.

Natychmiast umieść tkanki w ciekłym azocie w celu błyskawicznego zamrożenia. Aby przygotować wycinek tkanki myszy, weź zamrożony narząd myszy i rozmroź go do 15 stopni Celsjusza w kriomikrotomie o kontrolowanej temperaturze. Przymocuj tkankę do stalowej podstawy za pomocą około 500 mikrolitrów środka do zatapiania tkanek i umieść na uchwycie do cięcia kriomikrotomu tak, aby nóż przedstawił żądaną orientację cięcia.

Przekrój tkankę na grubość 12 mikronów. Następnie umieść pokrojone plastry tkanki na poliwęglanowych szkiełkach mikroskopowych i pozostaw je do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej. Uzyskaj próbkę komórki, taką jak 1 mililitr zawiesiny komórek HeLa, i dodaj ją do 9 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych na standardowej 10-centymetrowej płytce do hodowli komórkowych.

Utrzymuj komórki w kulturze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% CO2 przez dwa do trzech dni, aż powierzchnia wzrostu zostanie pokryta w 70-80% na płytce hodowli komórkowej. Wykonaj pasażowanie komórek na płytce hodowli komórkowej. Aby to zrobić, odessać pożywkę wzrostową i przepłukać komórki 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.

Usuń PBS za pomocą sterylnej końcówki aspiracyjnej i inkubuj komórki z 2,5 ml trypsyny przez około 5 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby odłączyć komórki od płytki hodowlanej. Zatrzymaj aktywność trypsyny, dodając 7,5 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych, a następnie równomiernie ponownie zawiesić komórki. Aby przygotować próbki komórek do jednokomórkowej spektrometrii mas lub eksperymentu SCMS, najpierw umieść pojedyncze szkiełka z mikropokrywą w dołkach 12-dołkowej płytki.

Następnie dodaj 1,8 ml pożywki do hodowli komórkowych i 0,2 ml zawiesiny komórkowej do studzienki. Delikatnie wymieszaj komórki, delikatnie mieszając płytkę, a następnie inkubuj w środowisku 5% CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 24 godziny. Aby przeprowadzić leczenie farmakologiczne hodowanych komórek, dodaj roztwór związku leczniczego do 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.

Umieść rurkę kwarcową z podwójnym otworem w laserowym ściągaczu do mikropipet i pociągnij igłę kwarcową z podwójnym otworem. Jako punkty wyjścia ustaw ciepło na 400, żarnik na trzy, prędkość na 80, opóźnienie na 150, a ciąg na 250. Przytnij końcówkę ciągnącą tak, aby na drugim końcu pozostało około 5 mm nienaciągniętej kapilary kwarcowej z podwójnym otworem.

Wytnij 80-milimetrowy odcinek kapilary ze stopionej krzemionki jako kapilarnę dostarczającą rozpuszczalnik. Następnie włóż kapilę do jednego otworu na płaskim końcu igły kwarcowej z podwójnym otworem. Używając płomienia do pociągnięcia stopionej kapilary krzemionkowej jako emitera nanoESI, przyciąć do długości 7-10 mm i włożyć ją do drugiego otworu na płaskim końcu igły kwarcowej z podwójnym otworem.

Nałóż minimalną ilość żywicy utwardzanej promieniami UV na płaski koniec igły kwarcowej z podwójnym otworem. Zestal żywicę za pomocą lampy UV LED przez około 20 sekund, aby zabezpieczyć kapilę dostarczającą rozpuszczalnik i emiter nanoESI. Następnie przetnij standardowe szkiełko mikroskopowe na pół wzdłuż.

Następnie umieść pojedynczą sondę na jednym końcu szkiełka podstawowego, tak aby emiter nanoESI był skierowany na zewnątrz. Nałóż zwykłą żywicę epoksydową na korpus pojedynczej sondy, tak aby została przymocowana do szkiełka przed pozostawieniem na noc w celu stwardnienia. System ten zawiera niestandardowy kołnierz interfejsu źródła jonów spektrometru masowego oraz aluminiową płytkę optyczną, która jest przymocowana do mikroskopu cyfrowego USB, miniaturowego ręcznego stolika translacyjnego XYZ i zmotoryzowanego systemu etapu translacji XYZ.

Zmodyfikuj kołnierz interfejsu źródła jonów spektrometru mas i wyprodukuj statyw cyfrowego mikroskopu stereoskopowego zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przymocuj zmodyfikowany cyfrowy mikroskop stereoskopowy, mikroskop cyfrowy USB, miniaturowy ręczny stolik translacyjny XYZ z elastycznym uchwytem zaciskowym oraz zmotoryzowany system stolika translacyjnego XYZ do aluminiowej płytki optycznej. Użyj elastycznego clamp uchwyt, aby zamocować szklaną szkiełko przymocowane za pomocą pojedynczej sondy.

Następnie podłącz konfigurację z pojedynczą sondą do spektrometru mas. Wyreguluj elastyczny uchwyt zaciskowy i miniaturowy stolik XYZ, aby umieścić emiter pojedynczej sondy przed wlotem spektrometru masowego. Rozmrozić fragment próbki w temperaturze pokojowej i umieścić go na zmotoryzowanym systemie stolika translacyjnego XYZ pod pojedynczą sondą.

Dostosuj pozycję próbki, zmieniając współrzędne w oprogramowaniu sterującym. Za pomocą strzykawki przepompować rozpuszczalnik do pobierania próbek z odpowiednią szybkością. A następnie zastosuj napięcie jonizacji.

Wyregulować wysokość pojedynczej sondy tak, aby spoczywała tuż nad powierzchnią próbki i była w stanie przeprowadzić ekstrakcję powierzchniową metabolitów. Ostrożnie podnieś stolik Z, a następnie użyj mikroskopu cyfrowego USB, aby monitorować zmianę odległości między końcówką pojedynczej sondy a powierzchnią tkanki. Ustaw parametry rastrowania w poprzek interesującego Cię przekroju w próbce.

W przypadku przedstawionych tutaj odcinków nerki myszy należy zastosować prędkość rastrową 10 mikrometrów na sekundę i odległość między liniami wynoszącą 20 mikrometrów. Ustaw parametry rastrowania w poprzek interesującego Cię przekroju w próbce. W przypadku przedstawionych tutaj odcinków nerki myszy użyj prędkości rastrowej 10,0 mikrometrów na sekundę i odległości między liniami wynoszącej 20 mikrometrów.

Skonfiguruj metodę automatycznego pozyskiwania widm MS ze spektrometru mas. Aby uzyskać MSI o wysokiej rozdzielczości masy na próbce nerki myszy, użyj rozdzielczości masy 60 000, trybu dodatniego 5 kV, 1 mikroskopu, maksymalnego czasu wstrzykiwania 150 milisekund i włączonej automatycznej kontroli wzmocnienia. Zainicjuj akwizycję danych MSI, a następnie skonstruuj obrazy MS z nieprzetworzonych plików MS zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Skonfiguruj system z jedną sondą zgodnie z instrukcjami dla MSI i dostosuj natężenie przepływu rozpuszczalnika. Umyj hodowane komórki przymocowane do szkiełek z mikropokrywą PBS w celu usunięcia pożywek hodowlanych i zewnątrzkomórkowych składników leku. Następnie umieść szklane szkiełko zawierające komórki na zmotoryzowanym systemie etapu translacji XYZ na potrzeby eksperymentu.

Ustaw ostrość cyfrowy mikroskop stereoskopowy nad próbką, na końcówce pojedynczej sondy, aby monitorować penetrację komórek podczas analizy. Użyj mikroskopu cyfrowego USB z boku pojedynczej sondy, aby monitorować warunki pracy emitera nanoESI na pojedynczej sondzie. Użyj zmotoryzowanego programu sterującego stolikiem XYZ i cyfrowego mikroskopu stereoskopowego, aby zlokalizować interesującą komórkę i precyzyjnie ustawić końcówkę pojedynczej sondy nad próbką.

Rozpocznij akwizycję danych MS przed włożeniem końcówki pojedynczej sondy do komórki. Opuść płytkę zawierającą ogniwo, aby wyciągnąć końcówkę pojedynczej sondy z ogniwa. Na koniec pozwól rozpuszczalnikowi płynąć przez około trzy minuty, aby całkowicie przepłukać pojedynczą sondę.

Wykonano obrazowanie wycinków nerki myszy za pomocą spektrometrii mas w otoczeniu i wykryto dużą liczbę cząsteczek obecnych na powierzchni tkanki. Wykreślono rozkład przestrzenny i względną obfitość wielu cząsteczek na powierzchni tkanki. Rozdzielczość przestrzenną 8,5 mikrona osiągnięto dzięki obserwacji ostrych przejść cech obecnych w danych ze spektrometrii mas.

Wykonanie pojedynczej sondy z ostrą końcówką i otwartymi kanałami ma kluczowe znaczenie dla analizy pojedynczej komórki. Mikroskopy są potrzebne do zlokalizowania komórek docelowych i monitorowania procesu penetracji komórek. Zmiana sygnału z widm masowych dostarcza również dodatkowych informacji potwierdzających penetrację komórek.

Wykryto dużą liczbę cząsteczek z żywych pojedynczych komórek. W przypadku stosowania do badań nad lekami przeciwnowotworowymi, eksperymenty z komórkami kontrolnymi są wykorzystywane do wykazania różnicy w leczeniu lekami przeciwnowotworowymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób wytwarzana jest pojedyncza sonda i jak to urządzenie jest używane do analizy spektrometrii mas pojedynczych komórek i obrazowania tkanek biologicznych za pomocą spektrometrii mas otoczenia.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć problemy, ponieważ szczegółowe instrukcje są niezbędne do wyprodukowania urządzenia z pojedynczą sondą, skonfigurowania całego systemu i obsługi instrumentów. Po opanowaniu analiza pojedynczych komórek może być wykonywana w sposób ciągły dla wielu komórek. A każda analiza trwa mniej niż trzy minuty.

Zakończenie eksperymentu z obrazowaniem otoczenia MS może zająć kilka godzin, w zależności od wielkości próbki, rozdzielczości przestrzennej i użytego spektrometru masowego. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że kluczowym krokiem jest wyprodukowanie wysokiej jakości pojedynczej sondy. Ponadto strojenie i działanie instrumentu mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego przeprowadzenia eksperymentu.

Inne metody można opracować zgodnie z procedurami podobnymi do przedstawionych tutaj. Na przykład odczynniki można dodać do rozpuszczalnika próbki i przeprowadzić reaktywną analizę pojedynczych komórek oraz MSI w otoczeniu w celu poprawy wykrywania cząsteczek z próbek. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zarówno w zakresie analizy pojedynczych komórek, jak i badań obrazowania spektrometrią mas w warunkach otoczenia.

Technika ta może być potencjalnie wykorzystana do badań biologii komórki, badań farmakologicznych i testów klinicznych. Nie zapominaj, że praca z ostrymi kapilarami kwarcowymi i żywicą epoksydową utwardzaną promieniami UV może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i okularów ochronnych UV.