Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Ogólnym celem tej techniki obrazowania jest monitorowanie wahań poziomu wapnia w świetle SR w odpowiedzi na środki mobilizujące wapń, konkretnie w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Metoda ta może być pomocna w bardziej bezpośrednim wyjaśnieniu cyklu wapniowego w komórkach. Na przykład bardzo ważne jest poznanie zależności między transportem wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej a stresem ER.

Zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniego pomiaru stężenia wapnia wewnątrz światła siateczki sarkoplazmatycznej, zamiast konieczności ekstrapolowania go z pośrednich pomiarów zmian w cytoplazmie. Technikę tę zaprezentuje Gabriela Ziomek, doktorantka w moim laboratorium. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować rozcieńczenie mieszaniny białek w DMEM w stosunku od 1:25.

Następnie przenieś 200 µL mieszaniny białek w DMEM do każdej szklanej płytki o średnicy 35 mm, aby całkowicie pokryć wewnętrzny szklany obszar dna. Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego na co najmniej 30 minut. W międzyczasie podgrzej DMEM z 10% NCS do 37 °C w łaźni wodnej.

Następnie usuń DMEM z kolby hodowlanej za pomocą pipety szklanej. W dalszej kolejności przemyj dno kolby ciepłym, sterylnym PBS, aby usunąć pozostałości DMEM. W celu ododerwania hodowanych komórek mięśni gładkich od dna kolby, szybko przemyj kolbę jednym mililitrem trypsyny, a następnie go usuń.

Następnie dodaj kolejny mililitr trypsyny. Delikatnie potrząśnij kolbą przez około 30 do 60 sekund, aby enzym miał kontakt z całym dnem naczynia przed jego zdjęciem. Po odklejeniu komórek za pomocą trypsyny, do kolby dodaj świeże DMEM z 10% NCS, aby zatrzymać działanie trypsyny.

Przenieś otrzymaną zawiesinę komórek z kolby do czystej, opisanej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie do każdej przygotowywanej płytki dodaj 1 ml świeżego DMEM z dodatkiem 10% NCS. Po tym delikatnie kilkukrotnie odwróć probówkę z zawiesiną komórek, aby rozbić ewentualnie utworzony osad.

Pipetuj pożądaną objętość delikatnie wymieszanego roztworu komórek do każdej płytki. Następnie dokładnie zakręć każdą płytką zgodnie lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek na szkle na dnie. Należy dodać do płytki odpowiednią liczbę komórek, aby upewnić się, że w ciągu następnych 48 godzin osiągną one wystarczający stopień konfluencji dla efektywnego obrazowania.

Po dodaniu pożywki i zawiesiny komórek do każdej płytki, inkubuj płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez co najmniej jedną godzinę, aby umożliwić prawidłowe przywieranie komórek do szklanego dna. Kontroluj płytki pod mikroskopem w odstępach piętnastominutowych, aż do momentu wyraźnego przywierania komórek. Następnie wyjmij alikwot Adenovira D1 SR z przechowywania w temperaturze -80 °C i przenieś go do komory bezpieczeństwa biologicznego w mobilnej kąpieli lodowej. Następnie.

Pipetuj pożądaną dawkę schłodzonego D one SR na każdą płytkę i inkubuj zakażone komórki w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia uzupełnij pożywkę komórek, dodając 1 mL świeżego DMEM z dodatkiem 10% NCS. Następnie inkubuj płytki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez noc.

Po inkubacji nocnej usunąć pożywkę hodowlaną z płytki. Płytkę hodowlaną przemyć trzykrotnie jednym mililitrem ciepłego fizjologicznego buforu HEPES-PSS. Następnie, bezpośrednio przed rozpoczęciem rejestracji, dodać jeden mililitr świeżego ciepłego buforu HEPES-PSS.

Wykonaj wstępne obrazowanie za pomocą aplikacji FRET SE, otwierając powiązane oprogramowanie mikroskopu konfokalnego. Po otwarciu aplikacji kliknij zakładkę setup, aby dostosować pożądane ustawienia eksperymentalne. Ręcznie zmień ustawienia kanałów tak, aby komórki były pobudzane sekwencyjnie przy 440 nanometrach dla donora i FRET oraz 513 nanometrach dla akceptora.

Następnie ustaw długości fal emisji na 488 nanometrów dla donora oraz 535 nanometrów dla FRET i akceptora. Następnie ustaw natężenie światła na 15% transmisji, czas ekspozycji wzbudzenia komórek na 150 milisekund oraz odstępy między ekspozycjami na 10 sekund. Następnie ustabilizuj płytkę na stole mikroskopu.

Użyj przycisku live, aby sprawdzić rozdzielczość obrazu. Dalszo dostosuj ustawienia, aby uzyskać pożądaną rozdzielczość. W karcie setup wykonaj zdjęcie próbki za pomocą przycisku capture image.

Przechodząc teraz do karty ewaluacji, należy wybrać odpowiednią metodę obliczania wydajności FRET dla wykonywanych eksperymentów. Metoda trzecia, oparta na obliczeniach ratiometrycznych, jest zalecana dla eksperymentów z wykorzystaniem białek Cameleons, takich jak wskaźnik D1SR. Następnie należy przejść do karty wykresu, aby obserwować rejestrowane wartości intensywności na wykresie.

W razie potrzeby można wyznaczyć ROI w przeglądarce obrazów, aby obserwować na wykresie odpowiadającą mu średnią intensywność tego obszaru zainteresowania. Należy rozpocząć rejestrację, aby zbierać dane przez co najmniej trzy minuty, co zapewni stabilną linię bazową sygnału przed wprowadzeniem badanego czynnika. Następnie należy wprowadzić czynnik mobilizujący wapń w celu opróżnienia zapasów wapnia w SR, aplikując go bezpośrednio do płytki w pobliżu rejestrowanego obszaru zainteresowania.

Kontynuuj rejestrację przez pożądany czas po potraktowaniu. Następnie wykonaj serię obrazów ratiometrycznego FRET za pomocą konfokalnego mikroskopu odwróconego, korzystając z aplikacji FRET SE. Na tym etapie, aby przygotować płytki hodowlane z komórkami mięśni gładkich aorty szczura, przemyj płytkę hodowlaną trzy razy jednym mililitrem ciepłego fizjologicznego buforu HEPES-PSS.

Następnie zmieszaj wskaźnik z 1 ml ciepłego HEPES-PSS i nanieś go na płytki hodowlane. Inkubuj komórki mięśni gładkich ze wskaźnikiem przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie usuń wskaźnik z płytki hodowlanej i przemyj ją trzykrotnie 1 ml ciepłego fizjologicznego buforu HEPES-PSS.

Następnie, bezpośrednio przed rozpoczęciem rejestracji, dodać jeden mililitr świeżego, ciepłego buforu HEPES-PSS. Wykonać serię obrazów za pomocą konfokalnego mikroskopu odwróconego. Następnie wprowadzić czynnik mobilizujący wapń w celu opróżnienia zapasów wapnia w siateczce śródplazmatycznej (SR) i kontynuować rejestrację przez wymagany czas po zastosowaniu preparatu.

Przedstawiono tutaj reprezentatywne migawki komórki mięśnia gładkiego transfekowanej wskaźnikiem D one SR przy użyciu filtrów pasmowych CFP, FRET i YFP. Rysunek ten pokazuje w czasie rzeczywistym pseudokolorowe migawki hodowanych komórek mięśnia gładkiego aorty szczura transfekowanych D one SR. Leczenie stężeniem 2 µM Thapsigargin wywołało spadek intensywności sygnału, co wskazało na znaczący ubytek zawartości wapnia w SR wynikający z indukowanego przez Thapsigargin uwalniania wapnia. Natomiast ten wykres przedstawia reprezentatywny zapis znormalizowanego stosunku D one SR w hodowanych komórkach mięśnia gładkiego traktowanych 2 µM Thapsigargin, co potwierdziło znaczący spadek poziomu wapnia w SR.

Oto reprezentatywne migawki hodowli komórek mięśni gładkich aorty szczura załadowanych cytoplazmatycznym wskaźnikiem wapnia i traktowanych 2 µM Thapsigarginy. Jak pokazano, Thapsigargina powoduje znaczący wzrost intensywności sygnału w cytoplazmie z powodu uwalniania wapnia z SR. Natomiast ten wykres przedstawia reprezentatywny przebieg znormalizowanego stosunku Fluo four AM w hodowli komórek mięśni gładkich traktowanych 2 µM Thapsigarginy. Przedstawiony wzrost sygnału wapniowego uznaje się za proporcjonalny do ilości wapnia uwolnionego z SR. Po opanowaniu tej techniki cały proces, od początku do końca, można przeprowadzić w około 48 godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest utrzymanie komórek w opisanych warunkach, aby zapewnić ich prawidłowy stan przed transfekcją wskaźnikiem wapnia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne zrozumienie sposobu przygotowania hodowli komórkowych w celu umożliwienia pomiaru poziomu wapnia w świetle SR przy użyciu wskaźnika D one SR.