Name: Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę FRET do bezpośredniego pomiaru wahań stężenia wapnia w siatkówce sarkoplazmatycznej komórek mięśni gładkich naczyń. Technika ta umożliwia dokładniejsze badanie cyklu wapniowego w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez fundusze z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem [MOP-1112666 dla CVB & ME].

Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty i procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego laboratorium Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej w Vancouver w Kanadzie.
1. Przygotowanie naczyń hodowlanych o średnicy 35 mm ze szklanym dnem do mikroskopii konfokalnej opartej na FRET
<ol>
	<li>Przygotuj płytki, stosując poniższą procedurę 36-48 godzin przed eksperymentami.</li>
	<li>Pobrać wybraną galaretowatą mieszaninę białek i 0,25% trypsyny-EDTA z magazynu w temperaturze -20 °C i przechowywać je w mobilnej łaźni lodowej do czasu użycia. 
	UWAGA: Mieszaninę białek powlekających należy wystawić na działanie RT tylko przez krótki czas, aby zapobiec zestaleniu się mieszaniny przed użyciem. Roztwór trypsyny powinien być również schłodzony do czasu, gdy będzie potrzebny; alternatywnie, trypsynę można pobrać z magazynu w temperaturze -20 °C po wykonaniu kroku 1.5.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę białek w rozcieńczeniu 1:25: DMEM (bez dodatku surowicy, schłodzona). Przenieść odpowiednią objętość mieszanki białkowej/DMEM na każdą przygotowywaną płytkę. W przypadku płytek ze szklanym dnem o średnicy 35 mm dodaj około 200 μl, aby całkowicie pokryć wewnętrzny szklany okrąg na spodzie płytki.</li>
	<li>Pozostaw płytki na co najmniej 30 minut w komorze bezpieczeństwa i w temperaturze pokojowej. W tym czasie ogrzej DMEM z 10% NCS do 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Podgrzej trypsynę w łaźni wodnej do temperatury 37 °C bezpośrednio przed kolejnymi krokami.</li>
	<li>Usunąć DMEM, który znajduje się obecnie w kolbie hodowlanej, za pomocą szklanej pipety i odsysania. Umyć podłogę kolby ciepłym sterylnym PBS, aby usunąć pozostałe pozostałości DMEM.</li>
	<li>Usunąć wcześniej wyhodowane komórki mięśni gładkich z dna kolby: 
	UWAGA: Kolba została założona kilka dni po tym etapie, aby umożliwić komórkom osiągnięcie pożądanej konfluencji (około 80%) przed przygotowaniem płytki. Komórki pierwotnie zawieszono w kolbie w 20 ml DMEM z 10% NCS i inkubowano w temperaturze 37 °C z 5% dopływem CO2 przez 24 godziny, po czym zapas DMEM został odświeżony, a komórki zostały zwrócone do inkubatora. DMEM był odświeżany co 48 godzin, postępując zgodnie z tymi początkowymi krokami, aż komórki osiągnęły konfluencję.
	<ol>
		<li>Szybko umyć kolbę 1 ml trypsyny, a następnie usunąć 1 ml trypsyny za pomocą odsysania.</li>
		<li>Dodać kolejny 1 ml trypsyny i pozostawić na dłuższy okres (około 30-60 sekund), przetrząsając kolbę, aby upewnić się, że enzym styka się z całym dnem kolby.</li>
		<li>Obserwuj, ile komórek oderwało się pod mikroskopem, aż do momentu, gdy będą zadowolone z oddzielenia od kolby. Naprzemiennie przetrząsać roztwór trypsyny i sprawdzać oderwanie komórek, aż do uzyskania zadowalającej proporcji komórek oddzielonych od kolby. 
		UWAGA: Kolbę można umieścić z powrotem w inkubatorze na około 30-60 sekund, aby przyspieszyć ten proces w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po usunięciu komórek za pomocą trypsyny, dodać świeży DMEM z 10% NCS do kolby, aby zatrzymać reakcję trypsyny (wystarczająca objętość, aby trypsyna stanowiła 1/8 całkowitej objętości w kolbie). 
		UWAGA: Na przykład, przy użyciu kolby hodowlanej o pojemności 250 ml, byłoby to 7 ml DMEM dodane do 1 ml trypsyny, aby uzyskać 8 ml roztworu komórkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otrzymany roztwór komórkowy przenieść z kolby do czystej (oznakowanej) stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 1 ml świeżego DMEM plus 10% NCS do każdej przygotowywanej płytki (wystarczająca pożywka wystarczy na 24 godziny).</li>
	<li>Delikatnie odwróć probówkę zawierającą roztwór komórkowy wiele razy, aby rozbić wszelkie osady, które mogły się uformować.</li>
	<li>Odpipetować odpowiednią objętość delikatnie wymieszanego roztworu komórkowego do każdej płytki. 
	UWAGA: Zalecany numer SMC platerowany dla tego protokołu to 0,5-0,8 x 106 na 35 mm szalek hodowlanych. Liczby te mogą się różnić w zależności od typu ogniwa i powinny być testowane i modyfikowane przez każde laboratorium.</li>
	<li>Dokładnie obracaj każdą płytkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara/przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek na szklanym dnie.</li>
</ol>
2. Transfekcja przejściowa z wektorem adenowirusowym przenoszącym wskaźnik D1SR Ca2+
<ol>
	<li>Po dodaniu pożywki i roztworu komórkowego do każdej płytki, pozostawić płytki do inkubacji w temperaturze 37 °C przy 5% dopływie CO2 przez co najmniej 1 godzinę, aby umożliwić komórkom prawidłowe przyłączenie się do szkła na dnie naczyń. Sprawdzaj płytki pod mikroskopem w odstępach 15 minut, aż komórki zostaną wyraźnie przymocowane.</li>
	<li>Pobrać podwielokrotność adenowirusa-D1SR z magazynu w temperaturze -80 °C i przechowywać w mobilnej łaźni lodowej w celu przetransportowania do komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Odpipetować żądaną dawkę (wielokrotność infekcji 100) schłodzonego D1SR do każdej płytki. 
	UWAGA: Obliczenie objętości roztworu adenowirusa potrzebnego na płytkę zależy od miana wirusa w oryginalnym roztworze podstawowym, które jest przedstawione jako jednostka tworząca blaszkę (PFU). Opierając się na naszym doświadczeniu, zalecamy wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 100, co jest interpretowane jako liczba cząsteczek wirusa potrzebnych do zakażenia jednej komórki mięśni gładkich (SMC) na płytce hodowlanej.</li>
	<li>Inkubować zakażone komórki w temperaturze 37 °C z 5% zapasem CO2 O/N.</li>
	<li>Następnego dnia uzupełnij komórki 1 ml świeżego DMEM plus 10% NCS.</li>
	<li>Inkubować płytki w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 O/N.</li>
</ol>
3. Pomiar SR Luminal Ca2+ za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET
<ol>
	<li>Po inkubacji O/N usunąć pożywkę hodowlaną z płytki.</li>
	<li>Przemyć płytkę hodowlaną 1 ml ciepłego fizjologicznego buforu HEPES-PSS zawierającego (w mmol·L−1) NaCl 140, glukozę 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl2 1,5 i MgCl2 1 (pH 7,4) trzy razy.</li>
	<li>Dodać 1 ml świeżego, ciepłego buforu HEPES-PSS bezpośrednio przed rozpoczęciem zapisu.</li>
	<li>Wykonaj wstępne obrazowanie za pomocą aplikacji FRET SE (Sensitized Emission) (lub podobnej funkcji) w oprogramowaniu powiązanym z mikroskopem konfokalnym.
	<ol>
		<li>Po otwarciu aplikacji kliknij zakładkę "Konfiguracja", aby dostosować ustawienia w celu osiągnięcia pożądanych warunków eksperymentalnych.</li>
		<li>Ręcznie zmień ustawienia kanału, tak aby komórki były wzbudzane w sekwencji przy 440 nm (dla kanałów donorowych i FRET) i 513 nm (dla kanału akceptorowego). Zbierz długości fal emisji przy 488 nm (dla donora) i 535 nm (dla FRET i akceptora).</li>
		<li>Ustaw intensywność światła na 15% transmisji, z czasem ekspozycji na wzbudzenie komórek wynoszącym 150 ms (czas nagrywania dla trzech sekwencyjnych kanałów donorowych CFP, FRET i akceptorowych YFP) i 10-sekundowymi odstępami między ekspozycjami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustabilizuj płytkę na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Użyj przycisku "Na żywo", aby sprawdzić rozdzielczość obrazu. Dostosuj ustawienia dalej, aż zostanie osiągnięta żądana rozdzielczość.</li>
	<li>Pozostając na karcie "Konfiguracja", zrób zdjęcie próbki za pomocą przycisku "Przechwyć obraz".</li>
	<li>Przechodząc do zakładki "Ocena", wybierz odpowiednią metodę obliczania wydajności FRET dla przeprowadzanych eksperymentów. Metoda 3, wykorzystująca obliczenia ratiometryczne [EA(i) = B/A], jest zalecana do eksperymentów z udziałem wielbłądów, takich jak wskaźnik D1SR.</li>
	<li>Przełącz się na zakładkę "Wykres", aby móc obserwować wartości intensywności rejestrowane w formie wykresu podczas eksperymentu.</li>
	<li>Narysuj ROI w przeglądarce obrazów, aby obserwować odpowiednią średnią intensywność tego obszaru zainteresowania na wykresie w miarę postępu eksperymentu. 
	UWAGA: Badacz może również zdecydować się na narysowanie wielu ROI i jednoczesne rejestrowanie i wyświetlanie odpowiednich intensywności na wykresie. Alternatywnie, badacze mogą nakreślić pojedynczy zwrot z inwestycji do wstępnego nagrania i przystąpić do nakreślenia wielu zwrotów z inwestycji w późniejszym czasie, otwierając plik eksperymentu w wersji oprogramowania zorientowanej na analizę danych. 
	UWAGA: Więcej informacji na temat kroków wymaganych do skonfigurowania eksperymentów opartych na FRET można znaleźć w instrukcjach kreatora aplikacji FRET. Jeśli mikroskop nie jest wyposażony w kreatora FRET, do ręcznego ustawienia parametrów nagrywania można użyć następującego protokołu.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie i pozwól na gromadzenie danych przez co najmniej 3 minuty, aby zapewnić stały podstawowy zapis sygnału przed wprowadzeniem interesującego czynnika.</li>
	<li>Wprowadzić czynnik przemieszczający Ca2+ (np. 2 μM thapsigargin; 100 nm endoteliny-1) jako narzędzie do zubożania SR Ca2+, poprzez ręczne pipetowanie wcześniej ustalonej dawki bezpośrednio do płytki w miejscu jak najbliżej rejestrowanego obszaru zainteresowania. Kontynuuj nagrywanie przez żądany czas po zabiegu.</li>
	<li>Rejestruj ratiometryczne obrazy seryjne FRET (512 x 512 pikseli) za pomocą 63-krotnego obiektywu olejowego konfokalnego mikroskopu odwróconego za pomocą aplikacji FRET SE.</li>
	<li>Zbierz dane wynikające z obrazowania z klastra 5-10 SMC w każdym regionie zainteresowania (ROI), a następnie sformatuj i przeanalizuj za pomocą oprogramowania opartego na statystyce.
	<ol>
		<li>Aby zapisać dane do późniejszego wykorzystania, kliknij prawym przyciskiem myszy na nagrany ślad i wybierz opcję "Eksportuj", aby zapisać arkusz kalkulacyjny z zarejestrowanymi średnimi intensywnościami sygnału na wybranym przez badacza dysku.</li>
		<li>Znormalizuj dane z każdego pojedynczego eksperymentu, dzieląc każdy punkt danych przez początkową wartość intensywności obserwowaną w punkcie czasowym 0 sekund.</li>
		<li>Importuj znormalizowane dane z arkuszy kalkulacyjnych do pliku projektu programu statystycznego, ręcznie kopiując i wklejając odpowiednie wiersze danych z ich oryginalnego arkusza kalkulacyjnego na sekundę.</li>
		<li>Automatycznie generuj wykresy odpowiadające zestawom danych wklejonym do programu. 
		UWAGA: Domyślne ustawienia programu generują wykresy liniowe na podstawie zaimportowanych danych. Typ wyświetlanego wykresu można zmienić, klikając przycisk "Wybierz inny typ wykresu" pod nagłówkiem "Zmień" znajdującym się na głównym pasku narzędzi.</li>
		<li>Zbierz dane reprezentujące wiele niezależnych badań w większej grupie identycznych eksperymentów w jednym arkuszu danych, aby uzyskać średni ślad dla konkretnego przeprowadzonego testu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie cytoplazmatycznego wskaźnika Ca2+
<ol>
	<li>Rozpuść 0,0125 g kwasu pluronowego (PA) w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w czarnej probówce do mikrowirówki (może być konieczne ogrzanie probówki w mobilnej łaźni wodnej, aby pomóc rozpuścić PA).</li>
	<li>Pobrać probówkę (50 μg) cytoplazmatycznego barwnika wskaźnikowego Ca2+ (Fluo-4 AM) z miejsca przechowywania w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Owiń tubkę z barwnikiem w folię, aby w jak największym stopniu chronić ją przed kontaktem ze światłem.</li>
	<li>Odpipetować 45 μl roztworu DMSO+PA do probówki zawierającej barwnik. Zawiń roztwór DMSO+PA w folię i przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać zawartość probówki, kilkakrotnie pipetując roztwór w górę i w dół. Alternatywnie, sonikować probówkę z barwnikiem przez 10 min. 
	UWAGA: Każda metoda dokładnego rozprowadzenia barwnika w roztworze DMSO+PA będzie wystarczająca; Jest to po prostu kwestia preferencji badacza. Jeśli badacz zdecyduje się na sonikację roztworu, powinno to być wykonane w odizolowanym obszarze/pomieszczeniu, gdzie inni nie będą dotknięci hałasem. Badacz powinien również używać ciężkich tłumików w celu ochrony uszu.
	<ol>
		<li>W przypadku roztworu sonikacyjnego włóż owiniętą folią probówkę zawierającą barwnik do uchwytu rurki piankowej i umieść w 2/3 pełnej (z dH2O) kąpieli sonicyjnej.</li>
		<li>Umieść kąpiel soniczną w odizolowanym miejscu/pomieszczeniu i włącz maszynę (upewnij się, że ochronne nakrycie głowy jest na miejscu przed rozpoczęciem procesu sonikacji). Pozostaw miejsce i pozostaw maszynę włączoną na 10 minut przed jej wyłączeniem i wyjęciem rurki (trzymaj owiniętą folią, aby chronić przed światłem tak długo, jak to możliwe).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dokładnie wymieszany roztwór przelać na ciemne probówki do mikrowirówek (5 μl na probówkę, powinno wystarczyć w sumie 10 probówek).</li>
	<li>Owinąć każdą podwielokrotną probówkę w folię. Oznaczyć probówki i przechowywać w środku osuszającym w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
5. Pomiar cytoplazmatycznego Ca2+
<ol>
	<li>Wykonaj czynności opisane w punktach 1.1-1.12, aby przygotować płytki hodowlane SMC aorty szczura.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki po 48 godzinach od posiewu.</li>
	<li>Usunąć wcześniej przygotowaną podwielokrotność cytoplazmatycznego wskaźnika Ca2+ (5 μl) z miejsca przechowywania w temperaturze -20 °C i przechowywać w mobilnej łaźni lodowej do czasu użycia.</li>
	<li>Przemyć płytkę hodowlaną 1 ml ciepłego fizjologicznego buforu HEPES-PSS zawierającego (w mmol·L−1) NaCl 140, glukozę 10, KCl 5, HEPES 5, CaCl2 1,5 i MgCl2 1 (pH 7,4) trzy razy.</li>
	<li>Wymieszać wskaźnik z 1 ml ciepłego HEPES-PSS i umieścić go na płytce hodowlanej.</li>
	<li>Inkubować SMC ze wskaźnikiem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (24 °C).</li>
	<li>Wyjąć wskaźnik z płytki hodowlanej i trzykrotnie przemyć 1 ml ciepłego fizjologicznego buforu HEPES-PSS.</li>
	<li>Dodać 1 ml świeżego, ciepłego buforu HEPES-PSS bezpośrednio przed rozpoczęciem zapisu.</li>
	<li>Rejestruj obrazy seryjne (512 x 512 pikseli) za pomocą 63-krotnego obiektywu olejowego konfokalnego mikroskopu odwróconego.
	<ol>
		<li>Ręcznie zmień ustawienia tak, aby komórki były wzbudzane przy 488 nm, a długości fal emisyjnych były zbierane przy 555 nm z prędkością skanowania 700 Hz.</li>
		<li>Ustaw intensywność światła na 15% transmisji, z czasem ekspozycji na wzbudzenie 150 ms komórek (czas, w którym komórki są wystawione na działanie światła w wyznaczonych odstępach czasu podczas nagrywania) i 5-sekundowymi przerwami między ekspozycjami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustabilizuj płytkę na stoliku mikroskopu i rozpocznij nagrywanie.</li>
	<li>Nagrywaj przez co najmniej 3 minuty, aby zapewnić stały podstawowy zapis sygnału przed wprowadzeniem czynnika będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Wprowadź czynnik przemieszczający Ca2+ (np. 2 μM thapsigarginę) jako narzędzie do zubożania SR Ca2+ (zgodnie z opisem w kroku 3.16) i kontynuuj rejestrację przez żądany czas po zabiegu.</li>
	<li>Rejestruj intensywność sygnału za pomocą oprogramowania specyficznego dla mikroskopu, uśredniając sygnały fluorescencji (F/F0) z klastra 5-10 SMC w każdym obszarze zainteresowania (ROI). Zbieraj, formatuj i analizuj dane wynikające z obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy danych. Zobacz kroki 3.18.1-3.18.5, aby zapoznać się z opisem zbierania i analizy danych za pomocą tego oprogramowania.</li>
</ol>

<ol><li>Hennings, H., Michael, D., Cheng, C., Steinert, P., Holbrook, K., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Whitfield, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+calcium+and+cyclic+AMP+in+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The roles of calcium and cyclic AMP in cell proliferation.</a> Ann N Y Acad Sci. 339 (1), 216-240 (1980).</li>
<li>Nicotera, P., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcium+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The role of calcium in apoptosis.</a> Cell Calcium. 23 (2-3), 173-180 (1998).</li>
<li>Wei, C., Wang, X., Chen, M., Ouyang, K., Song, L. S., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+flickers+steer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium flickers steer cell migration.</a> Nature. 457 (7231), 901-905 (2009).</li>
<li>Ashby, M. C., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+calcium+and+the+functions+of+intracellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">ER calcium and the functions of intracellular organelles.</a> Sem Cell Dev Biol. 12 (1), 11-17 (2001).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+calcium+and+Alzheimer%27s+disease%3A+in+a+state+of+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+signal%22%5BJournal%5D)">ER calcium and Alzheimer's disease: in a state of flux.</a> Sci signal. 3 (114), (2010).</li>
<li>Rutkowski, D. T., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trip+to+the+ER%3A+coping+with+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A trip to the ER: coping with stress.</a> Trends Cell Biol. 14 (1), (2004).</li>
<li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">ER stress and the unfolded protein response.</a> Mutat Res. 569 (1-2), 29-63 (2005).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Poburko, D., Liao, C. H., van Breemen, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+content+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in vascular smooth muscle cells.</a> Circ Res. 104 (1), 104-112 (2009).</li>
<li>Esfandiarei, M., Fameli, N., Choi, Y. Y., Tehrani, A. Y., Hoskins, J. G., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waves+of+calcium+depletion+in+the+sarcoplasmic+reticulum+of+vascular+smooth+muscle+cells%3A+an+inside+view+of+spatiotemporal+Ca2%2B+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Waves of calcium depletion in the sarcoplasmic reticulum of vascular smooth muscle cells: an inside view of spatiotemporal Ca2+ regulation.</a> PloS one. 8 (2), e55333(2013).</li>
<li>Cobbold, P. H., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+bioluminescence+measurement+of+cytoplasmic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and bioluminescence measurement of cytoplasmic free calcium.</a> Biochem J. 248 (2), 313-328 (1987).</li>
<li>Park, M. K., Ashby, M. C., Erdemli, G., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear%2C+perigranular+and+sub-plasmalemmal+mitochondria+have+distinct+functions+in+the+regulation+of+cellular+calcium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Perinuclear, perigranular and sub-plasmalemmal mitochondria have distinct functions in the regulation of cellular calcium transport.</a> The EMBO journal. 20 (8), 1863-1874 (2001).</li>
<li>Lovett, J. L., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+stores+in+Toxoplasma+gondii+govern+invasion+of+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium stores in Toxoplasma gondii govern invasion of host cells.</a> J Cell Sci. 116 (14), 3009-3016 (2003).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Palmer, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+indicators+based+on+computationally+redesigned+calmodulin-peptide+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs.</a> Chem Biol. 13 (5), 521-530 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten opisuje transfekcję VSMC adenowirusem D1SR w celu zbadania stężeń Ca2+ w świetle SR. Metoda ta pozwala na bezpośredni pomiar Ca2+ w tej organelli, a także na jej przemieszczanie się do/z SR w wyniku zastosowania różnych środków przenoszących wapń. Metoda ta ma wiele zalet dla badaczy pracujących nad kompleksowym zrozumieniem, w jaki sposób zmiany poziomów SR i cytoplazmatycznego Ca2 + wpływają na ogólny stan zdrowia komórek i jak te zmiany są ze sobą powiązane. Tradycyjna obs...

Ca2+ to bardzo ważny jon, który występuje w obfitości w każdej komórce ciała. Odgrywa znaczącą rolę w wielu różnych funkcjach komórkowych, w tym we wzroście, proliferacji, migracji i apoptozie1-4. Powszechnie wiadomo, że Ca2 + może wpływać na te procesy zarówno poprzez działania bezpośrednie, jak i pośrednie, a zatem zmiany normalnych wewnątrzkomórkowych stężeń tego jonu mogą łatwo spowodować negatywne skutki dla dotkniętych komórek. SR jest uważany za największy wewnątrzkomórkowy magazyn Ca2+ w komórce5. Poziomy Ca2+ w stanie stacjonarnym zarówno w SR, jak i cytoplazmie są zwykle utrzymywane poprzez ciągły przepływ do i z kanałów transportowych Ca2+ tej organelli. Stresujące warunki nałożone na komórki z powodu jakiejkolwiek formy urazu lub choroby są często związane ze znaczącymi zmianami w SR Ca2 +, które mają długotrwały wpływ na zdrowie komórki. W najcięższych przypadkach niezdolność zestresowanej komórki do odzyskania i utrzymania poziomu SRCa 2+ w stanie stacjonarnym może nawet doprowadzić do śmierci w wyniku apoptozy6-8.
Obecne badania nad komórkową dynamiką Ca2+ są ograniczone przez fakt, że niewiele badań testuje organelle Ca2+ przechowujące zawartość bezpośrednio9-11. Najczęstszą praktyką jest natomiast pomiar cytoplazmatycznych poziomów Ca2+ jako pośredni pomiar zmian zawartości SR Ca2+ 12-14. W tych eksperymentach Ca2 + jest zwykle indukowany do uwolnienia z SR poprzez zastosowanie środków farmakologicznych powodujących wyczerpanie organelli (np. Thapsigargin). Następnie wyciąga się wnioski dotyczące zmian SR Ca2+ na podstawie wahań stężeń Ca2+ w cytoplazmie. Pomimo tego, że badacze mają jeszcze możliwość wyciągania takich wniosków w sposób okrężny, ta metoda pomiaru SR Ca2+ jest wyraźnie pośrednim sposobem pozyskiwania takich informacji, z wieloma ograniczeniami dotyczącymi interpretacji zebranych danych. Aby ominąć to wyraźne ograniczenie, konieczne jest zmierzenie ilości Ca2+ znajdującej się bezpośrednio w sieci świetlnej SR.
Kluczowe dla końcowego wyniku, jakim jest możliwość bezpośredniego rejestrowania wewnątrzświetlnych poziomów Ca2+ SR, są narzędzia do hodowli komórkowych i wskaźnik Ca 2+. W odniesieniu do danych, do których odwołuje się niniejszy manuskrypt, należy zauważyć, że użyte VSMC pochodziły z zamrożonej linii komórkowej. Komórki hodowano w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) + 10% surowicy nowonarodzonej cielęciny (NCS) w pasażach 22-26 dla opisanych eksperymentów, inkubowanych w stałej temperaturze 37 °C z 5% dopływem CO2 . Na przykład przy użyciu obecnej metody komórki zostały z powodzeniem wyhodowane na mieszance białek, która symuluje środowisko zewnątrzkomórkowe wielu różnych typów tkanek15. Ważnym czynnikiem wpływającym na powodzenie badań nad SR Ca2+ jest rodzaj zastosowanej mieszanki białkowej; w tym przypadku konieczna była odmiana o niskim współczynniku wzrostu, aby składniki tego narzędzia nie wpływały na regularną sygnalizację Ca2+ i ruchy stale zachodzące w badanych komórkach. Po pomyślnym wzroście badanych komórek należy również skutecznie wprowadzić wskaźnik Ca2+ do tych hodowanych komórek. Stało się to możliwe dzięki zastosowaniu wektora adenowirusowego, który przenosi wskaźnik Ca2 + D1SR znajdujący się w SR. Aby osiągnąć wysoką skuteczność transfekcji, komórki muszą być inkubowane z wektorami wirusowymi przez co najmniej 36-48 godzin przed obrazowaniem. Preparat ten stanowi niezawodne narzędzie do pomiaru stanów nieustalonych Ca2+ w świetle SR z wysoką dokładnością i powtarzalnością.
Wskaźnik D1SR używany w tym protokole jest zmodyfikowanym wariantem wskaźnika D1ER Ca2+, który został pierwotnie stworzony przez laboratorium dr Rogera Y. Tsiena na Uniwersytecie Kalifornijskim, San Diego, USA9,16. Oryginalny D1ER należy do drugiej generacji genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + zwanych kameleonami, które wykazują czułość Ca2 + w znacznie szerszym zakresie (0,5-160 μM) w porównaniu z poprzednimi wskaźnikami Ca2 + 9,16. Nowy wariant D1SR, będący darem od dr Wayne'a Chena (University of Alberta, Kanada), zawiera jednak zmutowaną sekwencję kalsekwetryny (zamiast sekwencji kalretykuliny, jak w oryginalnym D1ER). Zmutowana kalsekwestryna ma zmniejszone wiązanie z Ca2 +, co eliminuje problem konkurowania z endogenną kalsekwestryną w wiązaniu z Ca2 + w świetle SR11. Wskaźnik D1SR zawiera skrócone, wzmocnione białko fluorescencyjne cyjanu (CFP) i białko żółtej fluorescencji (YFP), które wiążą się za pomocą białka łącznikowego zawierającego zmodyfikowaną kalmodulinę (CaM) i M13 (26-resztowy peptyd kinazy łańcucha lekkiego miozyny, który wiąże się z CaM). Sekwencja CaM-M13 została zmodyfikowana, aby zapobiec wiązaniu się M13 z endogenną kalmoduliną. Ponadto, aby zapewnić retencję SR, sekwencja kalsekwestryny została dodana na końcu 5' CFP11. Po związaniu z Ca2+ domena CaM-M13 przechodzi zmiany konformacyjne, które powodują wzrost transferu energii między flankującym CFP a YFP, co jest rejestrowane jako wzrost intensywności sygnału FRET. Z drugiej strony, gdy stężenie luminalu SR Ca2+ spada, domena CaM-M13 ulega odwrotnym zmianom konformacyjnym, co skutkuje spadkiem transferu energii między flankującym CFP a YFP i znacznym spadkiem intensywności sygnału FRET.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (wysoka glukoza, pirogronian)</td><td>Technologie życia</td><td>11995-065</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced (Zredukowany czynnik wzrostu membrany podstawnej), 5 ml</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C aż do momentu tuż przed użyciem</td></tr><tr><td>Serum dla nowonarodzonych cieląt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Utrzymuj w temperaturze -20 &deg; C aż do tuż przed użyciem</td></tr><tr><td>35 mm płytki ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 0,2 &mu; M wentylowana niebieska kolba uszczelniająca korek</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td> Trypsyna / <td></td></tr><tr><td>EDTA Technologie żywotności roztworu</td><td></td><td>25200056</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C aż do tuż przed użyciem</td></tr><tr><td>50 ml Polipropylenowa rurka stożkowa</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>D1SR</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Prezent</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Life technologies</td><td>F-23917</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C aż do tuż przed użyciem</td></tr><tr><td>1,5 ml Czarne probówki do mikrowirówek</td><td>Argos Technologies</td><td>T7100BK</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 2.6.3 (z aplikacją FRET SE Wizard)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>Oprogramowanie GraphPad, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na fret

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Utrzymanie stałego poziomu wapnia (Ca2+) w siateczce sarkoplazmatycznej (SR) komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) jest niezbędne dla ich ogólnego stanu zdrowia. Znaczna część wewnątrzkomórkowej zawartości Ca2 + znajduje się w magazynach SR w VSMC. Jako jedyna organella wewnątrzkomórkowa o ścisłym związku z otaczającą przestrzenią zewnątrzkomórkową poprzez połączenia błony plazmatycznej-SR, SR można uznać za pierwszą linię odpowiedzi na wszelkie nieprawidłowości w stanach przejściowych Ca2+ lub stres doświadczany przez komórkę. Wśród wielu jego funkcji, jedną z najważniejszych jest jego rola w przekazywaniu sygnałów regulowanych przez Ca2+ w całej komórce w celu wywołania dalszych reakcji w całej komórce. Powszechniejsze stosowanie cytoplazmatycznych wskaźników Ca2 + w tym zakresie jest ogólnie niewystarczające do badań nad wysoce dynamicznymi zmianami w śródświetlnym magazynie Ca2 + SR, które nie zostały jeszcze w pełni scharakteryzowane. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół bezpośredniego i przejrzystego pomiaru luminalnego SR Ca2+. To narzędzie jest przydatne do badania niuansów zmian w SR Ca2 +, które mają znaczący wpływ na normalne funkcjonowanie i zdrowie komórki. Wahania zawartości SR Ca2+ mogą dostarczyć nam znacznej ilości informacji dotyczących reakcji komórkowych na choroby lub warunki stresowe doświadczane przez komórkę. W tej metodzie zmodyfikowana wersja wskaźnika Ca2 + ukierunkowanego na SR, D1SR, jest używana do wykrywania wahań Ca2 + w odpowiedzi na wprowadzenie czynników do hodowanych komórek mięśni gładkich aorty szczura (SMC). Po inkubacji ze wskaźnikiem D1SR stosuje się konfokalną mikroskopię fluorescencyjną i obrazowanie oparte na rezonansie fluorescencyjnym (FRET) do bezpośredniej obserwacji zmian wewnątrzświetlnych poziomów Ca2 + SR w warunkach kontrolnych i z dodatkiem środków agonistycznych, które działają w celu indukowania wewnątrzkomórkowego ruchu Ca2 +.

W tej sekcji przedstawiono przykłady wyników, jakie można uzyskać przy użyciu opisanego procesu w celu zarejestrowania danych o stężeniu Ca2+ w świetle SR, w porównaniu do powszechnie stosowanego sposobu pośredniego pomiaru zmian stężeń Ca2+ w magazynach organelli poprzez obserwację fluktuacji Ca2+ w cytoplazmie.
Rysunek 1A przedstawia migawkę obszaru zainteresowania (ROI) kultur...

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Ogólnym celem tej techniki obrazowania jest monitorowanie wahań poziomu wapnia w świetle SR w odpowiedzi na środki mobilizujące wapń, konkretnie w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Metoda ta może być pomocna w bardziej bezpośrednim wyjaśnieniu cyklu wapniowego w komórkach. Na przykład bardzo ważne jest poznanie zależności między transportem wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej a stresem ER.Zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniego pomiaru stężenia wapnia wewnątrz światła siateczki sarkoplazmatycznej, zamiast konieczności ekstrapolowania go z pośrednich pomiarów zmian w cytoplazmie. Technikę tę zaprezentuje Gabriela Ziomek, doktorantka w moim laboratorium. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować rozcieńczenie mieszaniny białek w DMEM w stosunku od 1:25.Następnie przenieś 200 µL mieszaniny białek w DMEM do każdej szklanej płytki o średnicy 35 mm, aby całkowicie pokryć wewnętrzny szklany obszar dna. Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego na co najmniej 30 minut. W międzyczasie podgrzej DMEM z 10% NCS do 37 °C w łaźni wodnej.Następnie usuń DMEM z kolby hodowlanej za pomocą pipety szklanej. W dalszej kolejności prz

measurement-calcium-fluctuations-within-sarcoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szczegółowe metody obrazowania Ca2+ o wysokiej rozdzielczości w mięśniach gładkich w obrębie izolowanych organów, obejmujące: przygotowanie tkanki, akwizycję obrazu oraz analizę danych.

Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca2+ w mięśniach gładkich

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Przedstawiamy metodę izolacji szybkich (mikrosekundowych) zdarzeń wapniowych od wolniejszych przepływów w żywych komórkach z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii skanującej. Metoda ta mierzy fluktuacje intensywności fluorescencji wskaźników wapnia poprzez rejestrację skanów liniowych obejmujących kilkaset pikseli w komórce. Analiza histogramowa pozwala na wyizolowanie skal czasowych różnych przepływów wapnia.

Pomiar szybkich przepływów jonów wapnia w kardiomiocytach

Opisana tutaj jest metoda bezpośredniego pomiaru iskier wapniowych, podstawowych jednostek uwalniania Ca2+ z siateczki sarkoplazmatycznej w nienaruszonych włóknach mięśni szkieletowych. Metoda ta wykorzystuje wyzwalanie za pośrednictwem stresu osmotycznego uwalniania Ca2 + z receptora ryanodine w izolowanych włóknach mięśniowych. Dynamika i zdolność homeostatyczna wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2 + można wykorzystać do oceny funkcji mięśni w zdrowiu i chorobie.

Ocena iskier wapniowych w nienaruszonych włóknach mięśni szkieletowych

Wapń bierze udział w licznych fizjologicznych i patofizjologicznych szlakach sygnałowych. Obrazowanie żywych komórek wymaga specjalistycznego sprzętu i może być czasochłonne. Zoptymalizowano szybką, prostą metodę wykorzystującą cytometr przepływowy do określenia względnych zmian wapnia cytozolowego w przylegających komórkach nabłonka wprowadzonych do zawiesiny.

Cytozolowe pomiary wapnia w komórkach nabłonka nerek za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Wewnątrzkomórkowy recykling wapnia odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji skurczowej i rozkurczowej w kardiomiocytach. W tym miejscu opisujemy protokół oceny rezerwy Ca2 + retikulum sarkoplazmatycznego i rozkurczowej funkcji usuwania wapnia w kardiomiocytach za pomocą systemu obrazowania wapnia.

Ocena rezerwy wapniowej retikulum sarkoplazmatycznego i wewnątrzkomórkowego rozkurczowego usuwania wapnia w izolowanych kardiomiocytach komorowych

Prezentujemy protokoły zastosowania naszego ukierunkowanego, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GECI) CatchER+ do monitorowania szybkich stanów przejściowych wapnia w retikulum endoplazmatycznym/sarkoplazmatycznym (ER/SR) HEK293 i komórkach C2C12 mięśni szkieletowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym. Omówiono również protokół pomiaru i kalibracji in situ Kd.

Monitorowanie uwalniania wapnia ER/SR za pomocą ukierunkowanego czujnika Ca2+ CatchER+

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Protokół opisuje metodę ładowania fluorescencyjnego barwnika wapniowego przez przecięty nerw do zakończeń nerwu ruchowego myszy. Ponadto przedstawiono unikalną metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Obecny protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie precyzyjnie wyciętych plastrów płuc myszy do oceny kurczliwości dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic wewnątrzpłucnych w środowisku prawie in vivo.

Wykorzystanie precyzyjnie wyciętego wycinka płuc do badania regulacji skurczowej dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic śródpłucnych

Poznaj metodę FRET do bezpośredniego pomiaru wahań stężenia wapnia w siatkówce sarkoplazmatycznej komórek mięśni gładkich naczyń. Technika ta umożliwia dokładniejsze badanie cyklu wapniowego w komórkach.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Przeglądaj więcej filmów