Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej w połączeniu z mikrojonoforowym zastosowaniem substancji neuroaktywnych u obudzonych myszy
May 21st, 2016
Prezentujemy metody budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Technika ta pozwala na szczegółową analizę przypuszczalnych lokalnych wejść synaptycznych do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania.
Ogólnym celem tej procedury jest manipulowanie wpływem wejść synaptycznych przetwarzania neuronalnego za pomocą mikrojonoforetycznych iniekcji substancji neuroaktywnych u obudzonych zwierząt. Metoda ta może pomóc w rozwikłaniu kluczowych funkcji za pomocą systemów sensorycznych, takich jak rola neuroprzekaźników i ich interakcja z bodźcami sensorycznymi i kodowaniem. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia manipulowanie lokalnymi wejściami synatycznymi do karty i badanie neuronalnych systemów modulacyjnych bez wpływu znieczulenia.
Chociaż ten marnotrawny był tutaj u skrępowanych myszy, może być również stosowany u innych ssaków, takich jak nietoperze, szczury czy świnki morskie. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść druty wolframowe w specjalnie skonstruowanym narzędziu do wyrównywania w celu cięcia. Ostrożnie przymocuj luźne końce przewodów taśmą klejącą i przytnij je na żądaną długość.
Następnie delikatnie pociągnij taśmę, aby usunąć druty wolframowe z narzędzia do wyrównywania. Upewnij się, że wszystkie przewody pozostają przymocowane do taśmy. Następnie zwiń taśmę na polerowany mosiężny trzpień i mocno przytrzymaj druty do wrzeciona, aby zapewnić dobre połączenie elektryczne.
Następnie podłącz wrzeciono do silnika o prędkości 5 obr./min w stacji roboczej. Dostęp wrzeciona jest ustawiony pod kątem 45 stopni w stosunku do powierzchni roztworu do trawienia. Następnie zanurz jedną trzecią przewodów w roztworze.
Następnie zanurz elektrodę prętową z pręta węglowego w kąpieli trawiącej, aby zamknąć obwód. Włącz stację roboczą tak, aby wrzeciono zaczęło się obracać, a następnie dostosuj prąd przepływający przez elektrody i roztwór trawiący do 250 miliamperów. Zatrzymaj wytrawianie końcówki, gdy prąd spadnie do 200 miliamperów, aby wytrawić końcówki drutu w bardzo drobnych punktach.
Teraz umieść drut w kapilarze ze szkła borokrzemianowego tak, aby jego dolny koniec był zablokowany plasteliną. Trzymać pipetę za pomocą cewki grzewczej i zawieszonego tłoka. Przymocuj drut pokryty szkłem do szkiełka przed umieszczeniem go pod mikroskopem.
Ustaw końcówkę i dotknij koralika borowego w pozycji ostrej. Następnie podgrzej koralik, aż lekko się rozpuści. Następnie włóż około 10 do 15 mikronów końcówki drutu i wyłącz potencjometry grzewcze.
Gdy koralik ostygnie, zdejmij szkło z końcówki elektrody, aby odsłonić wolfram. Aby uzyskać końcówkę o grubości około 15 milimetrów, należy ustawić biegun na odpowiednie parametry. Pociągnij kapilarę, aby uzyskać dwie pipety z odosobnioną końcówką.
Zamontuj pipetę na szkiełku podstawowym za pomocą plasteliny i odłam jej końcówkę za pomocą cienkich nożyczek, kleszczyków lub płaskiej strony skalpela. Nieznacznie wyreguluj kąt między elektrodą a wielolufą, aby uzyskać lepsze wiązanie i cieńszy zestaw. Pod mikroskopem ostrożnie ustaw elektrodę wolframową nad końcówką wielolufową.
Po wyrównaniu opuść elektrodę, aż zetknie się z wielolufą. Dopasowując się do rowka między dwiema górnymi lufami, przesuń końcówkę elektrody, aż wystaje na odległość od 15 do 20 mikrometrów od końcówki wielolufowej. Teraz nałóż niewielką kroplę światłoutwardzalnego kleju na wolfram i zestaw wielolufowy w odległości około 5 milimetrów od ich końcówek.
Utrzymuj klej przed dotarciem do końcówek, aby uniknąć zablokowania kanałów wielolufowych i utwardź klej za pomocą lampy LED o niebieskim świetle Teraz umieść znieczulone zwierzę na kocu grzewczym, aby utrzymać jego temperaturę na poziomie 38 stopni Celsjusza i ustabilizuj głowę zwierzęcia w stereotaktycznej ramie z dwoma nausznikami i paskiem do gryzienia Następnie nałóż żel okulistyczny, aby chronić oczy. Następnie ogol skórę głowy i nałóż jod powidonu, aby zdezynfekować skórę. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę i cofnąć usztywnienie pokrywające okołobiegunową i bardziej rostralną część kości potylicznych.
Następnie nałóż cienką warstwę światłoutwardzalnego kleju na czaszkę i podstawę słupka głowy. Odczekaj 10 sekund i umieść słupek głowy nad obszarem rostralnym kości ciemieniowych wzdłuż linii środkowej. Użyj źródła niebieskiego światła, aby utwardzić klej przez 20 sekund, aby uzyskać skuteczną siłę wiązania.
Następnie wywierć dwa otwory wokół i za podstawą słupka głowicy za pomocą małego wiertła. Umieść zegarka w wywierconym otworze, aby służyła jako dodatkowy punkt kontaktowy między czaszką a stopniem głowy. Wykonaj półtora obrotu, aby dokładnie dopasować i przetestuj kleszczami, aby upewnić się, że nie są luźne.
Następnie włóż końcówkę srebrnego przewodu uziemiającego do trzeciego otworu i upewnij się, że styka się z oponą twardą. Nałóż niewielką kroplę wodoodpornego kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować drut do czaszki. Następnie nałóż kompozyt światłoutwardzalny, aby wzmocnić połączenie słupka głowicy z czaszką, zakrywając podstawę słupka głowicy, dolną część srebrnego drutu i.
Należy uważać, aby nie wychodzić poza lambda, aby umożliwić dostęp podczas nagrywania i utwardzać kompozyt za pomocą źródła światła niebieskiego. Następnie wycofaj mięsień z tyłu szyi w pobliżu jego przyczepu do czaszki. Za pomocą małej trepanacji wywierć okrągłe okienko tuż pod szwem lambda i bocznie do linii środkowej, aby odsłonić dolny wzgórek.
W tej procedurze umieść ciało zwierzęcia w specjalnie wykonanym piankowym amortyzowanym ograniczniku. Przymocuj sztyft górny do uchwytu przymocowanego do ramy stereotaktycznej. To dobry moment, aby dać zwierzęciu płynną nagrodę.
Następnie przykryj ciało zwierzęcia bawełnianym kocem i luźno zapnij je za pomocą plastikowego półcylindra i taśmy klejącej. Użyj strzykawki z elastyczną końcówką, aby napełnić beczki wybranymi lekami. Za pomocą mikromanipulatora umieść elektrodę wielolufową na jego uchwycie.
Następnie umieść niekodowany srebrny drut w każdej beczce, tak aby jeden koniec stykał się z roztworem, a drugi koniec był dostępny. Następnie podłącz te końce do urządzenia do mikrojonoforezy. Następnie podłącz zacisk dodatni do końca elektrody wolframowej, a zacisk uziemiający do srebrnego drutu, który styka się z oponą twardą.
Następnie przesuń elektrodę wielolufową, aż końcówka zetknie się z powierzchnią mózgu. Zastosuj ciepłą sterylną sól fizjologiczną, aby zapobiec wysuszeniu tkanki mózgowej. W tym momencie zastosuj prąd retencyjny, aby uniknąć wycieku leku z końcówki lufy, szukając aktywności pojedynczej jednostki.
Rejestruj aktywność neuronalną i jonoforetyczne zastosowanie gabazyny. Pokazano tutaj obszar odpowiedzi częstotliwościowej czterech zarejestrowanych neuronów w wzgórku dolnym przed i podczas mikrojonoforetycznego wstrzykiwania gabazyny. Czarne krzyżyki oznaczają, że częstotliwości wybrane do przedstawienia są rzadkimi i powtarzającymi się dźwiękami.
Oto skumulowane histogramy czasowe perybodźca odpowiedzi neuronalnej na wszystkie częstotliwości i intensywności przedstawione w celu skonstruowania obszaru odpowiedzi przed i podczas wstrzykiwania gabazyny. Czarne paski wskazują czas trwania dźwięku. Poniżej przedstawiono rastry punktowe reakcji impulsowej na parę częstotliwości przedstawionych jako rzadkie w kolorze czerwonym i powtarzający się bodziec w kolorze niebieskim przed i w trakcie stosowania gabazyny.
Zacienione tło wskazuje czas trwania bodźca. Te rastry punktowe pokazują reakcje, gdy względne prawdopodobieństwa paraczęstotliwości zostały zamienione. Ten wykres pokazuje reakcje pojedynczych neuronów na siedem par częstotliwości przedstawionych jako rzadki i powtarzający się dźwięk przed i podczas aplikacji gabazyny.
Ten wykres pokazuje wskaźniki SSA odpowiedzi neuronalnej na rzadkie i powtarzające się dźwięki, mierzone przed i w trakcie stosowania gabazyny. Po opanowaniu, opisana procedura pozwala na dostosowanie określonych parametrów do struktury neuronalnej i typu neuronu będącego przedmiotem zainteresowania. Próbując nagrywać zwierzęta z zagłówkami, należy pamiętać, że czas nagrywania jest zdeterminowany i ograniczony przez poziom przyzwyczajenia zwierzęcia, ale ważną zaletą jest to, że wiele nacięć rejestracyjnych można wykonać na tym samym zwierzęciu przez kilka dni, minimalizując liczbę wykorzystanych zwierząt.
Wykonując mikrojonoforetyczne przy użyciu elektrod typu piggy back, można połączyć inne procedury, takie jak wstrzyknięcia tranzystorów neuronowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak źródło danych wejściowych i cel projekcji neuronów w miejscu rejestracji. Krytyczną kwestią podczas pracy z obudzonymi zwierzętami jest ich dobre samopoczucie, więc nigdy nie przekraczaj czasu powrotu zatwierdzonego w protokole i prosimy o ciągłe monitorowanie, aby sprawdzić wszelkie oznaki dyskomfortu. Jeśli tak, musisz natychmiast przerwać nagrywanie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Artykuł przedstawia metodę manipulacji synaptycznymi doprowadzeniami u myszy na czuwaniu poprzez mikrojonoforetyczne iniekcje substancji neuroaktywnych. Technika ta umożliwia szczegółową analizę lokalnych synaptycznych doprowadzeń i ich wpływu na przetwarzanie neuronalne.
Kluczowe Elementy Badań
Dziedzina Nauki
- Neurobiologia
- Elektrofizjologia
- Neurofarmakologia
Wprowadzenie
- Zrozumienie synaptycznych doprowadzeń jest kluczowe dla badania przetwarzania neuronalnego.
- Mikrojonofereza umożliwia ukierunkowane dostarczanie substancji neuroaktywnych.
- Przeprowadzanie eksperymentów u zwierząt na czuwaniu pozwala uniknąć wpływów znieczulenia.
- Metodę tę można zastosować do różnych gatunków ssaków.
Cel Badań
- Zbadanie roli neuroprzekaźników w przetwarzaniu sensorycznym.
- Analiza interakcji substancji neuroaktywnych na bodźce sensoryczne.
- Wzmocnienie zrozumienia neuronalnych systemów modulacyjnych.
Wykorzystane Metody
- Konstrukcja elektrod do jednoczesnego rejestrowania i uwalniania substancji.
- Mikrojonoforetyczne iniekcje u myszy na czuwaniu.
- Wykorzystanie drutów wolframowych do wytwarzania elektrod.
- Niestandardowe narzędzia do ustawiania dla precyzyjnego cięcia elektrod.
Główne Wyniki
- Osiągnięto skuteczną manipulację lokalnymi synaptycznymi doprowadzeniami.
- Szczegółowa analiza roli neuroprzekaźników w przetwarzaniu sensorycznym.
- Wykazano wykonalność w różnych modelach ssaków.
- Dostarczono informacji na temat neuronalnej modulacji bez znieczulenia.
Wnioski
- Metoda ta oferuje potężne narzędzie do badania dynamiki synaptycznej.
- Wzmacnia nasze zrozumienie interakcji neuroprzekaźników.
- Przyszłe zastosowania mogą zostać rozszerzone na inne gatunki i konteksty.
Najczęściej Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
This method enables precise manipulation of local synaptic inputs in awake animals, providing a critical advantage over systemic or anesthesia-affected approaches for de-risking target validation in neuroscience drug discovery. By isolating neurotransmitter receptor function in vivo, it supports mechanistic understanding of sensory processing pathways and enhances predictive confidence in early-stage target hypotheses. The technique is particularly relevant for auditory and sensory system targets where anesthetic confounds can obscure true neurophysiological responses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating the contribution of specific neurotransmitter receptors (e.g., GABAA) to neuronal processing in awake, behaving animals.
- Operational Value: Provides functional target validation with spatial precision, reducing mechanistic ambiguity in synaptic modulation studies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by delivering quantitative, receptor-specific readouts that reflect native circuit dynamics without anesthetic confounds.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems (awake mouse inferior colliculus) with stable single-unit recording capability for downstream compound screening.
- Quantitative Output: Delivers measurable neurophysiological endpoints including frequency response area shifts and stimulus-specific adaptation indices.
- Reproducibility: Enables multiple recording sessions per animal, supporting assay standardization and longitudinal target engagement assessment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to auditory processing disorders and sensory gating deficits where GABAergic modulation is implicated.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by preserving native neuronal state and circuit context.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions based on target engagement in physiologically relevant, awake conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, particularly for neuromodulator and neurotransmitter targets requiring validation in intact, awake circuits.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling causal manipulation of synaptic inputs to isolate receptor-specific contributions to sensory coding.
- Screening: Delivers assay-ready preparations with quantifiable electrophysiological readouts suitable for compound effect profiling.
- Analytics: Provides high-resolution spatiotemporal data (peristimulus time histograms, dot rasters, SSA indexes) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains continuity from discovery to preclinical work by avoiding anesthetic disruption of natural neuronal processing.
- Enterprise Reuse: Electrode design is adaptable to different neural structures and neuron types, supporting platform reuse across sensory systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by revealing native neurotransmitter roles in sensory processing without anesthetic confounds.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible microiontophoretic delivery and simultaneous electrophysiology in awake preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by reducing late-stage biological risk from inaccurate target mechanism assumptions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on validated, mechanism-specific functional outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, microelectrode fabrication, and awake animal handling.
- Dependent on precision instrumentation including micromanipulators, etching workstations, and microiontophoresis devices.
- Necessitates cross-team standardization for electrode construction, surgical procedures, and data analysis pipelines.
- Adaptation across model systems requires adjustment of electrode geometry and implantation sites based on target neural structure.
- Practical limitation: Recording duration is constrained by animal habituation (~3 hr/session), though multiple sessions per animal are feasible.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Tungsten Electrodes
3:03
Multibarrel Glass Pipette Manufacturing
4:26
Surgery and Headpost Implantation
6:49
Electrophysiological Recording and Microiontophoresis
8:26
Results: Effect of the Blockade of the GABAA-receptors on the Spectral and Temporal Response Properties as well as the Repetitive and Rare Sounds
9:58
Conclusion
