Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej w połączeniu z mikrojonoforowym zastosowaniem substancji neuroaktywnych u obudzonych myszy
21 maja 2016
Prezentujemy metody budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Technika ta pozwala na szczegółową analizę przypuszczalnych lokalnych wejść synaptycznych do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania.
Ogólnym celem tej procedury jest manipulowanie wpływem wejść synaptycznych przetwarzania neuronalnego za pomocą mikrojonoforetycznych iniekcji substancji neuroaktywnych u obudzonych zwierząt. Metoda ta może pomóc w rozwikłaniu kluczowych funkcji za pomocą systemów sensorycznych, takich jak rola neuroprzekaźników i ich interakcja z bodźcami sensorycznymi i kodowaniem. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia manipulowanie lokalnymi wejściami synatycznymi do karty i badanie neuronalnych systemów modulacyjnych bez wpływu znieczulenia.
Chociaż ten marnotrawny był tutaj u skrępowanych myszy, może być również stosowany u innych ssaków, takich jak nietoperze, szczury czy świnki morskie. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść druty wolframowe w specjalnie skonstruowanym narzędziu do wyrównywania w celu cięcia. Ostrożnie przymocuj luźne końce przewodów taśmą klejącą i przytnij je na żądaną długość.
Następnie delikatnie pociągnij taśmę, aby usunąć druty wolframowe z narzędzia do wyrównywania. Upewnij się, że wszystkie przewody pozostają przymocowane do taśmy. Następnie zwiń taśmę na polerowany mosiężny trzpień i mocno przytrzymaj druty do wrzeciona, aby zapewnić dobre połączenie elektryczne.
Następnie podłącz wrzeciono do silnika o prędkości 5 obr./min w stacji roboczej. Dostęp wrzeciona jest ustawiony pod kątem 45 stopni w stosunku do powierzchni roztworu do trawienia. Następnie zanurz jedną trzecią przewodów w roztworze.
Następnie zanurz elektrodę prętową z pręta węglowego w kąpieli trawiącej, aby zamknąć obwód. Włącz stację roboczą tak, aby wrzeciono zaczęło się obracać, a następnie dostosuj prąd przepływający przez elektrody i roztwór trawiący do 250 miliamperów. Zatrzymaj wytrawianie końcówki, gdy prąd spadnie do 200 miliamperów, aby wytrawić końcówki drutu w bardzo drobnych punktach.
Teraz umieść drut w kapilarze ze szkła borokrzemianowego tak, aby jego dolny koniec był zablokowany plasteliną. Trzymać pipetę za pomocą cewki grzewczej i zawieszonego tłoka. Przymocuj drut pokryty szkłem do szkiełka przed umieszczeniem go pod mikroskopem.
Ustaw końcówkę i dotknij koralika borowego w pozycji ostrej. Następnie podgrzej koralik, aż lekko się rozpuści. Następnie włóż około 10 do 15 mikronów końcówki drutu i wyłącz potencjometry grzewcze.
Gdy koralik ostygnie, zdejmij szkło z końcówki elektrody, aby odsłonić wolfram. Aby uzyskać końcówkę o grubości około 15 milimetrów, należy ustawić biegun na odpowiednie parametry. Pociągnij kapilarę, aby uzyskać dwie pipety z odosobnioną końcówką.
Zamontuj pipetę na szkiełku podstawowym za pomocą plasteliny i odłam jej końcówkę za pomocą cienkich nożyczek, kleszczyków lub płaskiej strony skalpela. Nieznacznie wyreguluj kąt między elektrodą a wielolufą, aby uzyskać lepsze wiązanie i cieńszy zestaw. Pod mikroskopem ostrożnie ustaw elektrodę wolframową nad końcówką wielolufową.
Po wyrównaniu opuść elektrodę, aż zetknie się z wielolufą. Dopasowując się do rowka między dwiema górnymi lufami, przesuń końcówkę elektrody, aż wystaje na odległość od 15 do 20 mikrometrów od końcówki wielolufowej. Teraz nałóż niewielką kroplę światłoutwardzalnego kleju na wolfram i zestaw wielolufowy w odległości około 5 milimetrów od ich końcówek.
Utrzymuj klej przed dotarciem do końcówek, aby uniknąć zablokowania kanałów wielolufowych i utwardź klej za pomocą lampy LED o niebieskim świetle Teraz umieść znieczulone zwierzę na kocu grzewczym, aby utrzymać jego temperaturę na poziomie 38 stopni Celsjusza i ustabilizuj głowę zwierzęcia w stereotaktycznej ramie z dwoma nausznikami i paskiem do gryzienia Następnie nałóż żel okulistyczny, aby chronić oczy. Następnie ogol skórę głowy i nałóż jod powidonu, aby zdezynfekować skórę. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę i cofnąć usztywnienie pokrywające okołobiegunową i bardziej rostralną część kości potylicznych.
Następnie nałóż cienką warstwę światłoutwardzalnego kleju na czaszkę i podstawę słupka głowy. Odczekaj 10 sekund i umieść słupek głowy nad obszarem rostralnym kości ciemieniowych wzdłuż linii środkowej. Użyj źródła niebieskiego światła, aby utwardzić klej przez 20 sekund, aby uzyskać skuteczną siłę wiązania.
Następnie wywierć dwa otwory wokół i za podstawą słupka głowicy za pomocą małego wiertła. Umieść zegarka w wywierconym otworze, aby służyła jako dodatkowy punkt kontaktowy między czaszką a stopniem głowy. Wykonaj półtora obrotu, aby dokładnie dopasować i przetestuj kleszczami, aby upewnić się, że nie są luźne.
Następnie włóż końcówkę srebrnego przewodu uziemiającego do trzeciego otworu i upewnij się, że styka się z oponą twardą. Nałóż niewielką kroplę wodoodpornego kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować drut do czaszki. Następnie nałóż kompozyt światłoutwardzalny, aby wzmocnić połączenie słupka głowicy z czaszką, zakrywając podstawę słupka głowicy, dolną część srebrnego drutu i.
Należy uważać, aby nie wychodzić poza lambda, aby umożliwić dostęp podczas nagrywania i utwardzać kompozyt za pomocą źródła światła niebieskiego. Następnie wycofaj mięsień z tyłu szyi w pobliżu jego przyczepu do czaszki. Za pomocą małej trepanacji wywierć okrągłe okienko tuż pod szwem lambda i bocznie do linii środkowej, aby odsłonić dolny wzgórek.
W tej procedurze umieść ciało zwierzęcia w specjalnie wykonanym piankowym amortyzowanym ograniczniku. Przymocuj sztyft górny do uchwytu przymocowanego do ramy stereotaktycznej. To dobry moment, aby dać zwierzęciu płynną nagrodę.
Następnie przykryj ciało zwierzęcia bawełnianym kocem i luźno zapnij je za pomocą plastikowego półcylindra i taśmy klejącej. Użyj strzykawki z elastyczną końcówką, aby napełnić beczki wybranymi lekami. Za pomocą mikromanipulatora umieść elektrodę wielolufową na jego uchwycie.
Następnie umieść niekodowany srebrny drut w każdej beczce, tak aby jeden koniec stykał się z roztworem, a drugi koniec był dostępny. Następnie podłącz te końce do urządzenia do mikrojonoforezy. Następnie podłącz zacisk dodatni do końca elektrody wolframowej, a zacisk uziemiający do srebrnego drutu, który styka się z oponą twardą.
Następnie przesuń elektrodę wielolufową, aż końcówka zetknie się z powierzchnią mózgu. Zastosuj ciepłą sterylną sól fizjologiczną, aby zapobiec wysuszeniu tkanki mózgowej. W tym momencie zastosuj prąd retencyjny, aby uniknąć wycieku leku z końcówki lufy, szukając aktywności pojedynczej jednostki.
Rejestruj aktywność neuronalną i jonoforetyczne zastosowanie gabazyny. Pokazano tutaj obszar odpowiedzi częstotliwościowej czterech zarejestrowanych neuronów w wzgórku dolnym przed i podczas mikrojonoforetycznego wstrzykiwania gabazyny. Czarne krzyżyki oznaczają, że częstotliwości wybrane do przedstawienia są rzadkimi i powtarzającymi się dźwiękami.
Oto skumulowane histogramy czasowe perybodźca odpowiedzi neuronalnej na wszystkie częstotliwości i intensywności przedstawione w celu skonstruowania obszaru odpowiedzi przed i podczas wstrzykiwania gabazyny. Czarne paski wskazują czas trwania dźwięku. Poniżej przedstawiono rastry punktowe reakcji impulsowej na parę częstotliwości przedstawionych jako rzadkie w kolorze czerwonym i powtarzający się bodziec w kolorze niebieskim przed i w trakcie stosowania gabazyny.
Zacienione tło wskazuje czas trwania bodźca. Te rastry punktowe pokazują reakcje, gdy względne prawdopodobieństwa paraczęstotliwości zostały zamienione. Ten wykres pokazuje reakcje pojedynczych neuronów na siedem par częstotliwości przedstawionych jako rzadki i powtarzający się dźwięk przed i podczas aplikacji gabazyny.
Ten wykres pokazuje wskaźniki SSA odpowiedzi neuronalnej na rzadkie i powtarzające się dźwięki, mierzone przed i w trakcie stosowania gabazyny. Po opanowaniu, opisana procedura pozwala na dostosowanie określonych parametrów do struktury neuronalnej i typu neuronu będącego przedmiotem zainteresowania. Próbując nagrywać zwierzęta z zagłówkami, należy pamiętać, że czas nagrywania jest zdeterminowany i ograniczony przez poziom przyzwyczajenia zwierzęcia, ale ważną zaletą jest to, że wiele nacięć rejestracyjnych można wykonać na tym samym zwierzęciu przez kilka dni, minimalizując liczbę wykorzystanych zwierząt.
Wykonując mikrojonoforetyczne przy użyciu elektrod typu piggy back, można połączyć inne procedury, takie jak wstrzyknięcia tranzystorów neuronowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak źródło danych wejściowych i cel projekcji neuronów w miejscu rejestracji. Krytyczną kwestią podczas pracy z obudzonymi zwierzętami jest ich dobre samopoczucie, więc nigdy nie przekraczaj czasu powrotu zatwierdzonego w protokole i prosimy o ciągłe monitorowanie, aby sprawdzić wszelkie oznaki dyskomfortu. Jeśli tak, musisz natychmiast przerwać nagrywanie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono metodę manipulowania wejściami synaptycznymi u czuwających myszy za pomocą mikroiontoforetycznych iniekcji substancji neuroaktywnych. Technika ta umożliwia szczegółową analizę lokalnych wejść synaptycznych oraz ich wpływu na przetwarzanie neuronalne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- elektrofizjologia
- neurofarmakologia
Wstęp
- Zrozumienie wejść synaptycznych jest kluczowe dla badania procesów neuronalnych.
- Mikrojontoforeza umożliwia lokalne podawanie substancji neuroaktywnych.
- Przeprowadzanie eksperymentów na zwierzętach w stanie czuwania pozwala uniknąć efektów zakłócających wywołanych przez znieczulenie.
- Metodę tę można zastosować u różnych gatunków ssaków.
Cel badania
- Zbadanie roli neuroprzekaźników w przetwarzaniu sensorycznym.
- Analiza oddziaływania substancji neuroaktywnych na bodźce sensoryczne.
- Pogłębienie zrozumienia neuronalnych systemów modulacyjnych.
Zastosowane metody
- Konstrukcja elektrod do jednoczesnej rejestracji i uwalniania substancji.
- Iniekcje mikrojontoforetyczne u czuwających myszy.
- Wykorzystanie drucików wolframowych do wykonania elektrod.
- Niestandardowe narzędzia do wyrównywania w celu precyzyjnego przycinania elektrod.
Główne wyniki
- Osiągnięto skuteczną manipulację lokalnymi wejściami synaptycznymi.
- Przeprowadzono szczegółową analizę roli neuroprzekaźników w przetwarzaniu sensorycznym.
- Wykazano wykonalność metody w różnych modelach ssaków.
- Uzyskano wgląd w modulację neuronalną bez zastosowania znieczulenia.
Wnioski
- Ta metoda stanowi potężne narzędzie do badania dynamiki synaptycznej.
- Pozwala ona na lepsze zrozumienie oddziaływań neuroprzekaźników.
- Przyszłe zastosowania mogą zostać rozszerzone na inne gatunki i konteksty.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia precyzyjną manipulację lokalnymi wejściami synaptycznymi u zwierząt w stanie czuwania, co stanowi istotną przewagę nad podejściami systemowymi lub stosowanymi przy znieczuleniu w celu minimalizacji ryzyka podczas walidacji celów w procesie odkrywania leków w neuronauce. Poprzez izolację funkcji receptorów neurotransmiterów in vivo, metoda ta wspiera mechanistyczne zrozumienie szlaków przetwarzania sensorycznego i zwiększa pewność prognostyczną wczesnych hipotez dotyczących celów terapeutycznych. Technika ta jest szczególnie istotna w przypadku celów w obrębie układu słuchowego i sensorycznego, gdzie zakłócenia wywołane środkami znieczulającymi mogą maskować rzeczywiste odpowiedzi neurofizjologiczne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację wpływu konkretnych receptorów neurotransmiterów (np. GABAA) na przetwarzanie neuronalne u zwierząt budzących się i wykazujących określoną aktywność behawioralną.
- Wartość operacyjna: Zapewnia funkcjonalną walidację celu z precyzją przestrzenną, co zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad modulacją synaptyczną.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczanie ilościowych, receptorowo-specyficznych wyników, które odzwierciedlają natywną dynamikę obwodów bez zakłóceń wynikających z podania środków znieczulających.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość testu: Pozwala na stworzenie zwalidowanych systemów biologicznych (kolliculus inferior myszy w stanie czuwania) ze stabilną możliwością rejestracji pojedynczych jednostek do późniejszego przesiewu związków.
- Wynik ilościowy: Dostarcza mierzalne punkty końcowe neurofizjologiczne, w tym przesunięcia obszaru odpowiedzi częstotliwościowej oraz indeksy adaptacji specyficznej dla bodźca.
- Powtarzalność: Umożliwia przeprowadzenie wielu sesji rejestracyjnych u jednego zwierzęcia, co wspiera standaryzację testu oraz podłużną ocenę zaangażowania celu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie kliniczne: Bezpośrednie zastosowanie w zaburzeniach przetwarzania słuchowego i deficytach bramkowania sensorycznego, w których zaangażowana jest modulacja GABAergiczna.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez zachowanie natywnego stanu neuronów oraz kontekstu obwodów neuronalnych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o zaangażowanie celu w fizjologicznie istotnych warunkach u zwierząt w stanie czuwania.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po identyfikację związków wiodących, w szczególności w przypadku celów będących neuromodulatorami i neuroprzekaźnikami, które wymagają walidacji w nienaruszonych obwodach u zwierząt w stanie czuwania.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez, umożliwiając przyczynową manipulację wejściami synaptycznymi w celu wyizolowania wkładu konkretnych receptorów w kodowanie sensoryczne.
- Przesiewanie: Dostarcza preparatów gotowych do analizy z mierzalnymi odczytami elektrofizjologicznymi, odpowiednimi do profilowania efektów związków chemicznych.
- Analityka: Zapewnia wysokorozdzielcze dane czasowo-przestrzenne (histogramy czasu okołobodźcowego, rastry punktowe, indeksy SSA) do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Zachowuje ciągłość od etapu odkryć do prac przedklinicznych, unikając zakłócania naturalnego przetwarzania neuronalnego przez środki znieczulające.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Konstrukcja elektrod jest dostosowalna do różnych struktur neuronalnych i typów neuronów, co umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w różnych systemach sensorycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez ujawnienie naturalnych ról neuroprzekaźników w przetwarzaniu sensorycznym bez zakłóceń wywołanych przez środki znieczulające.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane, reprodukowalne dostarczanie mikrojontoforetyczne oraz jednoczesną elektrofizjologię w preparatach z budzącymi się zwierzętami.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go poprzez redukcję biologicznego ryzyka na późnych etapach, wynikającego z błędnych założeń dotyczących mechanizmu działania celu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów skorygowaną o ryzyko, w oparciu o zwalidowane, specyficzne dla mechanizmu wyniki funkcjonalne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii, wytwarzania mikroelektrod oraz pracy z budzącymi się zwierzętami.
- Zależne od precyzyjnej aparatury, w tym mikromanipulatorów, stanowisk do trawienia oraz urządzeń do mikrojontoforezy.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie konstrukcji elektrod, procedur chirurgicznych i potoków analizy danych.
- Adaptacja do różnych systemów modelowych wymaga dostosowania geometrii elektrod i miejsc implantacji w zależności od docelowej struktury neuronalnej.
- Ograniczenie praktyczne: czas rejestracji jest ograniczony habituacją zwierzęcia (~3 hr/sesję), choć możliwe jest przeprowadzenie wielu sesji z jednym zwierzęciem.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Tungsten Electrodes
3:03
Multibarrel Glass Pipette Manufacturing
4:26
Surgery and Headpost Implantation
6:49
Electrophysiological Recording and Microiontophoresis
8:26
Results: Effect of the Blockade of the GABAA-receptors on the Spectral and Temporal Response Properties as well as the Repetitive and Rare Sounds
9:58
Conclusion
