Metoda celowania i izolowania neuronów czuciowych unerwiających drogi oddechowe u myszy

Ogólnym celem tego eksperymentu jest oznakowanie i izolacja neuronów zwoju błędnego unerwiających drogi oddechowe. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii obwodowej, takie jak: jakie cechy identyfikacyjne posiadają neurony unerwiające drogi oddechowe?

Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona niezawodną i wysokoprzepustową metodę celowania i izolowania specyficznych populacji neuronalnych. Po pobraniu zwojów czuciowych odessaj 500 µl roztworu do dysocjacji zwojów z każdej probówki, nie naruszając zwojów. Następnie dodaj 1 mL PBS do każdej próbki i odczekaj, aż zwoje opadną na dno probówek.

Następnie usunąć PBS i dodać do neuronów jeden mililitr roztworu do dysocjacji zwojów uzupełnionego o enzym trawienny, a następnie dodać 20 µL Fast Blue do probówki z kontrolą pozytywną. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez odpowiedni czas, zależnie od wieku enzymu trawiennego. Krótko wstrząsać i potrząsać probówkami co 15 minut, aby upewnić się, że zwoje są pokryte roztworem trawiennym.

Podczas trawienia komórek nerwowych powoli i ostrożnie dodaj 400 µL świeżo przygotowanego roztworu o gęstości 12% nad 400 µL roztworu o gęstości 28% w jednej probówce 1,5 ml na próbkę. Powinny być widoczne dwie wyraźne warstwy, jedna ciemniejsza od drugiej. Następnie opisz probówki zbiorcze 1,5 ml do sortowania, w tym jedną probówkę dla frakcji Fast Blue dodatniej i jedną dla frakcji Fast Blue ujemnej na każdą próbkę do sortowania.

Po zakończeniu okresu trawienia należy usunąć enzym trawienny i dwukrotnie przemyć zwoje 1 ml PBS, tak jak pokazano przed chwilą. Po drugim przemyciu do każdej probówki należy dodać 200 µL świeżego roztworu do dysocjacji zwojów. Następnie, używając pipety 200 µL ustawionej na objętość 100 µL, należy kilkakrotnie pipetować zwoje w górę i w dół, aby zdysocjować komórki do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, uważając przy tym, aby nie tworzyć pęcherzyków powietrza.

Gdy nie będą widoczne żadne nienaruszone fragmenty tkanki, trzymając mocno w jednej ręce sitko do komórek o rozmiarze oczek 70 mikronów, pipetuj roztwór dysocjowanych komórek do centrum sitka. Następnie przemyj probówkę do dysocjacji 100 mikrolitrami świeżego roztworu do dysocjacji zwojów, aby zebrać pozostałe komórki. Przefiltruj płuczynkę przez sitko i za pomocą nowej końcówki do pipety odessij pozostały roztwór zawierający komórki z dolnej strony sitka, dodając go do zawiesiny komórkowej.

Teraz ostrożnie nanieś wszystkie 300 µL komórek na wcześniej przygotowany gradient gęstości. Następnie wyizoluj komórki zwojów poprzez wirowanie. Podczas wirowania komórek dodaj 300 µL świeżo przygotowanego buforu do lizy do probówki przeznaczonej dla frakcji Fast Blue pozytywnej oraz 600 µL buforu do lizy do probówki dla frakcji negatywnej, aby zapobiec znacznemu rozcieńczeniu buforu do lizy przez płyn osłonowy sortera.

Po zakończeniu wirowania ostrożnie usuń górne 700 µl roztworu zawierającego większość szczątków komórkowych. Następnie zmieszaj 700 µl świeżego roztworu do dysocjacji zwojów z pozostałymi komórkami. Odwiruj komórki, tworząc osad, a następnie ostrożnie odlej nadsącz.

Następnie resuspender komórki w 200 do 300 µL roztworu do dysocjacji zwojów do sortowania, używając pipety 1 000 µL ustawionej na 200 µL. Komórki należy przechowywać na lodzie do momentu sortowania. Po oczyszczeniu komórek zwojowych metodą FACS, neurony należy homogenizować w buforze lizującym przez jedną minutę przy użyciu wstrząsarki wortex.

Następnie kilka razy wymieszaj komórki z taką samą objętością 70% etanolu i przenieś do kolumny wiriówek do 700 µL próbki. Wirować kolumnę przez 15 sekund przy 8 000 × g w mikrowirówce, a następnie odrzucić frakcję przepuszczoną. Po przejściu całej próbki przez kolumnę wiriówek, wyizoluj RNA zgodnie ze standardowymi protokołami oczyszczania RNA.

Następnie należy użyć mikrofluidycznego systemu elektroforezy, aby sprawdzić jakość RNA zgodnie ze specyfikacjami producenta. Na tych wykresach przedstawiono negatywne i pozytywne kontrole Fast Blue, użyte do ustawienia bramek sortowania. Rozdzielone komórki węzla z oznakowaniem Fast Blue można następnie posortować na populacje Fast Blue dodatnie oraz Fast Blue ujemne.

Wydajność sortowania dla tej metody wynosi od 73 do 85%, przy czym średnio zebrać można około 1 500 lub mniej komórek pozytywnych dla Fast Blue oraz prawie 60 000 komórek negatywnych dla Fast Blue. Jak zaobserwowano dla tej reprezentatywnej próbki, piki 18S i 28S uzyskane za pomocą elektroforezy mikroprzepływowej mogą następnie posłużyć do obliczenia wskaźnika integralności RNA (RNA integrity number) w celu określenia jakości ekstrahowanego RNA. Po opanowaniu techniki, w przypadku jej prawidłowego wykonania, cały proces może zająć cztery i pół godziny.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby sprawnie przechodzić przez kolejne etapy i używać świeżo przygotowanych roztworów do ekstrakcji RNA. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak hodowle neuronalne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład: jakie właściwości funkcjonalne są charakterystyczne dla neuronów unerwiających drogi oddechowe? Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie neurobiologii obwodowej do zbadania unikalnych właściwości specyficznej populacji neuronów unerwiających drogi oddechowe w zwojach węzłowych nerwu błędnego.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak znakować i dysocjować konkretne neurony zwojów węzlowych nerwu błędnego, które mogą być następnie wykorzystane do sekwencjonowania RNA lub wysiane do badań funkcjonalnych. Należy pamiętać, że praca z 2-merkaptoetanolem może być niezwykle niebezpieczna i podczas używania tego związku zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i praca w dygestorium chemicznym.