Name: Metoda celowania i izolowania neuronów czuciowych unerwiających drogi oddechowe u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Poznaj metodę izolacji neuronów czuciowych unerwiających drogi oddechowe u myszy przy użyciu techniki Fast Blue. Ta technika umożliwia ekstrakcję wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w neurobiologii obwodowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wspierane przez R01HL105635 grantowe NIH dla SEJ. Autorzy pragną podziękować Diego V. Bohórquezowi za porady techniczne. Dziękujemy również R. Ianowi Cummingowi za pomoc techniczną i wykonanie cytometrii przepływowej w Duke Human Vaccine Institute Research Flow Cytometry Shared Resource Facility (Durham, Karolina Północna). Cytometrię przepływową przeprowadzono w Regionalnym Laboratorium Biologicznym w Duke, które otrzymało częściowe wsparcie na budowę od National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (UC6-AI058607).

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Duke'a.
1. Donosowe podawanie Fast Blue
W przypadku Fast Blue należy podać barwnik co najmniej 2 dni przed eutanazją myszy. Barwnik utrzyma się do ośmiu tygodni.
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy lekkim znieczuleniem wziewnym (2,5% sewofluranu) do momentu, aż oddech zacznie zwalniać.</li>
	<li>Użyj pipety o pojemności 200 μl z filtrowanymi końcówkami, aby powoli wkroplić 40 μl roztworu barwnika (0,4 mM Fast Blue, 1% dimetylosulfotlenku, DMSO, w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej, PBS) do nozdrza, zatrzymując się od czasu do czasu, aby upewnić się, że mysz zasysa roztwór (Rysunek 1A).</li>
	<li>Trzymaj mysz pionowo, głowę do góry i delikatnie masuj klatkę piersiową, aby upewnić się, że barwnik rozprowadzi się po płucach.</li>
</ol>
2. Przygotowania do Dnia Preparacji i Analizy
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml roztworu dysocjacyjnego zwojów nerwowych (GaDS), łącząc składniki zgodnie z tabelą 1.</li>
	<li>Wykonaj ekstrakcję RNA w przeznaczonym do tego obszarze laboratoryjnym. Przed rozpoczęciem eksperymentu wyczyść powierzchnie 70% etanolem, 10% wybielaczem i odczynnikiem do odkażania RNazy. Obejmuje to wirówkę RNA, wszelkie stojaki na probówki i pipety. Upewnij się, że istnieją dedykowane pudełka na końcówki filtrów tylko do użytku z RNA. Nie używaj tego sprzętu i obszaru do przygotowania DNA, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie próbek.</li>
	<li>Wymieszaj świeży 70% i 80% etanol z wodą wolną od RNaz. Przygotować 1 ml na próbkę do wykorzystania w ekstrakcji RNA.</li>
</ol>
<tabela dla:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>składnik</td>
			<td>kwota</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zaawansowany DMEM/f12</td>
			<td>Pojemność 9,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamina</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FILTR ELEKTROMAGNETYCZNY (10 mM)</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suplement N2</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (bez witaminy A)</td>
			<td>200 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF (50 μg/ml)</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Mieszanina odczynników do roztworu dysocjacji zwojów nerwowych (GaDS).
3. Procedura preparacji
<ol>
	<li>Napełnij probówki o pojemności 1,5 ml 500 μl GaDS, po jednej dla każdej próbki doświadczalnej, jednej dla pozytywnej kontroli sortowania i jednej dla negatywnej kontroli sortowania. Przechowuj probówki na lodzie podczas sekcji.</li>
	<li>Wypreparuj ganglion bez dawki i wykonaj dwa częściowe cięcia, aby ułatwić dysocjację, a następnie umieść go w probówce z próbką eksperymentalną. Proszę zapoznać się z poniższym protokołem JoVE w celu rozwarstwienia zwojów16 i DRG17 bez dawki.</li>
	<li>Wypreparuj i częściowo przeciąć nieoznakowane zwoje, takie jak zwoje korzenia grzbietowego (DRG), do kontroli sortowania. Użyć dwóch zwojów do kontroli dodatniej i dwóch zwojów do kontroli ujemnej.</li>
	<li>Aby uzyskać wystarczającą ilość neuronów bez dawki do pomyślnego sortowania, połącz zwoje mózgowe 5 myszy w jednej eksperymentalnej probówce zawierającej GaDS.</li>
</ol>
4. Dysocjacja zwojów sensorycznych
<ol>
	<li>Odpipetować 500 μl GaDS, pozostawiając zwoje jaj w probówce. Umyj zwoje raz dodając 1 ml PBS, poczekaj, aż zwoje osiądą na dnie probówki, a następnie odpipetuj PBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml GaDS i 22 μl enzymu wytrawiającego (kolagenaza I/II i mieszanina proteazy, 2,5 mg/ml w H2O) do każdej probówki.</li>
	<li>Dodać 20 μl Fast Blue (5,26 mM) do probówki kontroli dodatniej.</li>
	<li>Umieścić rurki w łaźni wodnej lub bloku grzewczym już ustawionym na 37 °C. 
	Uwaga: Czas trawienia zwojów zależy od wieku enzymu trawiącego. W ciągu 1 miesiąca od rozpuszczenia enzymu wytrawiającego trawić przez 30 min, w ciągu 2 - 6 miesięcy trawić przez 45 min. Jeśli enzym ma więcej niż 6 miesięcy, trawić zwoje jaj przez 60 minut.</li>
	<li>Co 15 minut krótko potrząsaj probówkami i przesuwaj je, aby upewnić się, że zwoje są pokryte roztworem.</li>
	<li>Podczas trawienia zwojów jajowych należy przygotować gradienty gęstości za pomocą roztworu cząstek (koloidalne cząstki krzemionki pokryte poliwinylopirolidonem).
	<ol>
		<li>Zmieszać 12% roztwór cząstek w GaDS, 500 μl na próbkę.</li>
		<li>Wymieszać 28% roztwór cząstek w GaDS, 500 μl na próbkę.</li>
		<li>Powoli i ostrożnie dodawać 400 μl roztworu o gęstości 12% na wierzch 400 μl roztworu o gęstości 28% w świeżej probówce o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki. Nie pozwól, aby dwie warstwy się zmieszały. W probówce powinny być widoczne dwie wyraźne warstwy; jeden ciemniejszy od drugiego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas trawienia zwojów jajowych należy oznaczyć nowe probówki zbiorcze o pojemności 1,5 ml do sortowania (jedna probówka z dodatnim wynikiem Fast Blue i jedna probówka z ujemnym kolorem Fast Blue na próbkę do sortowania). W zależności od wymagań sortowni, probówki te muszą mieć zdejmowane pokrywy, aby nie kolidować z sortownikiem komórek.</li>
	<li>Po odpowiednim czasie trawienia usunąć GaDS enzymem wytrawiającym i dwukrotnie przemyć zwoje jaj 1 ml PBS. Do każdej probówki dodać 200 μl świeżego GaDS.</li>
	<li>Użyj pipety o pojemności 200 μl, ustaw objętość 100 μl i kilkakrotnie pipetuj zwoje w górę i w dół, aby rozdzielić komórki. Powtarzaj, aż nie będzie widać nienaruszonego kawałka tkanki. Unikaj tworzenia pęcherzyków w roztworze.</li>
	<li>Przepuść zdysocjowane komórki przez sitko o średnicy 70 μm.</li>
	<li>Dodaj kolejne 100 μl GaDS do oryginalnej probówki dysocjacyjnej, aby zebrać wszelkie pozostałe zabłąkane komórki i przepuścić dodatkowy roztwór przez sitko do komórek. Używając nowej końcówki pipety, zbierz pozostałą ciecz zawierającą komórki, która przeszła przez sitko i przylgnęła do siatki. Ostateczna objętość komórek zawieszonych w GaDS wynosi 300 μl.</li>
	<li>Ostrożnie ułóż 300 μl komórek na wcześniej utworzonym gradiencie gęstości. Unikaj pęcherzyków i mieszania komórek z warstwami gęstości.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut przy 2 900 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Gdy komórki znajdują się w wirówce, wymieszaj bufor do lizy (1 ml na próbkę doświadczalną) w następujący sposób: 10 μl 2-merkaptoetanolu w 1 ml buforu RLT (z zestawu do ekstrakcji RNA).
	<ol>
		<li>Dodać 300 μl buforu do lizy do probówki do pobierania dodatniego Fast Blue i 600 μl do probówki do pobierania ujemnych próbek Fast Blue (probówki oznaczone w kroku 4.7). Objętość ta zależy od liczby komórek, które mają zostać zebrane. W przypadku <2 000 komórek dodaj 300 μl, w przypadku > 7 000 komórek dodaj 600 μl. Zapewni to, że płyn w osłonie sortującej nie rozcieńczy znacząco buforu do lizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu wirowania ostrożnie usuń i wyrzuć górną warstwę 700 μl. Warstwa ta zawiera większość resztek komórek, które w przeciwnym razie będą przeszkadzać w sortowaniu komórek.</li>
	<li>Dodać 700 μl świeżego GaDS do pozostałej komory zawierającej roztwór i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.</li>
	<li>Wirować przez 15 minut przy 2,900 x g do komórek osadzających.</li>
	<li>Gdy komórki znajdują się w wirówce, wymieszaj sortowanie GaDS (500 μl na próbkę), dodając 5 μl DNazy (10 mg / ml) do 1 ml GaDS.</li>
	<li>Po zakończeniu wirowania ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant, pozostawiając osad komórkowy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w sortowniku GaDS o pojemności 200 - 300 μl, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl ustawionej na 200 μl. Umieść próbki na lodzie. Komórki są teraz gotowe do sortowania.</li>
</ol>
5. Sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją (FAC)
Uwaga: Ta sekcja wymaga znajomości obsługi sortera FACS lub pomocy wykwalifikowanego personelu.
<ol>
	<li>Dodać 1 μl roztworu podstawowego jodku propidyny (PI) (50 μg/ml) do każdej próbki, aby sprawdzić żywotność komórek. Podziel kontrolę negatywną na 2 probówki, jedną z PI i jedną bez. PI wiąże DNA tylko w martwych komórkach. Jeśli po kilku pierwszych sortowaniach nie ma martwych komórek do oznaczenia, użycie PI nie jest potrzebne.</li>
	<li>Przenieś komórki do przyrządu do cytometrii przepływowej, np. BD FACS AriaII z oprogramowaniem Diva 8, na lodzie.</li>
	<li>Ponieważ rozmiar komórek w tej populacji jest zmienny, do sortowania należy użyć dużej dyszy (100 μm). Aby zmniejszyć ilość stresu, którego doświadczają komórki i zwiększyć ich żywotność, użyj niskiego ciśnienia (20 psi).</li>
	<li>W razie potrzeby użyj oprogramowania sortującego FACS, aby skonfigurować wykresy analizy, rozproszenie do przodu, rozproszenie boczne (SSC), Fast Blue i PI.</li>
	<li>Aby ponownie zawiesić komórki, delikatnie przeprowadź próbkę przez krótki czas wirować przed załadowaniem jej do sortera.</li>
	<li>Zacznij od kontroli ujemnej, bez Fast Blue lub PI, aby ustawić próg bramki (rysunek 2A). To określi ilość autofluorescencji w populacji komórek. Opcjonalnie: Uruchom ujemną próbkę z PI, aby określić, czy istnieje populacja martwych komórek.</li>
	<li>Posortuj pozytywną próbkę kontrolną (inkubowaną z Fast Blue), aby ustawić parametry kompensacji.</li>
	<li>Po ustawieniu bramek i parametrów rozpocznij sortowanie próbek eksperymentalnych. Próbki sortuje się do przygotowanych probówek zbiorczych zawierających bufor do lizy RNA.</li>
	<li>Posortowane próbki należy przechowywać na lodzie do czasu zakończenia sortowania komórek.</li>
	<li>Rozpocznij etap ekstrakcji RNA natychmiast po posortowaniu komórek.</li>
</ol>
6. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Wiruj posortowane komórki w buforze do lizy przez 1 minutę w celu homogenizacji.</li>
	<li>Dodać 1 objętość 70% etanolu i wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Przenieść do 700 μl próbki do kolumny wirowej. Wirować przez 15 sekund przy 8 000 x g. Odrzuć przepływ.
	<ol>
		<li>Powtarzać tę czynność do momentu, gdy całkowita objętość próbki zostanie przepuszczona przez kolumnę wirową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 350 μl buforu RW1 i kontynuować proces oczyszczania RNA, w tym etap leczenia DNazą, zgodnie z protokołem producenta dla komórek.</li>
	<li>Po ekstrakcji RNA należy przetestować jakość RNA za pomocą systemu elektroforezy mikroprzepływowej zgodnie ze specyfikacją producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Manteniotis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+RNA-Seq+Expression+Analysis+of+Sensory+Ganglia+with+a+Focus+on+Ion+Channels+and+GPCRs+in+Trigeminal+Ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia.</a> PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).</li>
<li>Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+mRNA+expression+analysis+of+TRP+channel+genes+at+the+single+trigeminal+and+dorsal+root+ganglion+level+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse.</a> BMC Neurosci. 14 (1), 21(2013).</li>
<li>Paintal, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+sensory+receptors+and+their+reflex+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Vagal sensory receptors and their reflex effects.</a> Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).</li>
<li>Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+tracing+shows+that+CGRP-immunoreactive+nerves+of+rat+trachea+and+lung+originate+from+vagal+and+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Auton+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia.</a> J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).</li>
<li>Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interganglionic+segregation+of+distinct+vagal+afferent+fibre+phenotypes+in+guinea-pig+airways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways.</a> J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).</li>
<li>Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transient+receptor+potential+channels+and+two-pore+potassium+channels+in+subtypes+of+vagal+afferent+neurons+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).</li>
<li>Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemistry+of+the+nodose+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neurochemistry of the nodose ganglion.</a> Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).</li>
<li>Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+Sensory+Neuron+Subtypes+that+Differentially+Control+Breathing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing.</a> Cell. 161, 1-12 (2015).</li>
<li>Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodose+ganglia-modulatory+effects+on+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Res%22%5BJournal%5D)">Nodose ganglia-modulatory effects on respiration.</a> Physiol Res. 62, 227-235 (2013).</li>
<li>Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pulmonary+oxidative+stress+by+lung+vagal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).</li>
<li>Bautista, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+mediates+the+inflammatory+actions+of+environmental+irritants+and+proalgesic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents.</a> Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).</li>
<li>Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+survival+of+vagal+and+glossopharyngeal+sensory+neurons+is+dependent+upon+dystonin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin.</a> Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).</li>
<li>Hondoh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+expression+of+cold+receptors+%28TRPM8+and+TRPA1%29+in+the+rat+nodose-petrosal+ganglion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex.</a> Brain Res. 1319, 60-69 (2010).</li>
<li>Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+and+sympathetic+innervation+of+guinea-pig+lung+and+trachea+as+studied+by+retrograde+neuronal+tracing+and+double-labelling+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry.</a> Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).</li>
<li>Choi, D., Li, D., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+retrograde+neuronal+tracers+that+label+the+rat+facial+nucleus%3A+A+comparison+of+Fast+Blue%2C+Fluoro-ruby%2C+Fluoro-emerald%2C+Fluoro-Gold+and+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI.</a> J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).</li>
<li>Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+of+Nodose+Ganglia+Injection+in+Sprague-Dawley+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat.</a> J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).</li>
<li>Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+sensory+neuron+populations+for+study+of+expressed+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels.</a> J Vis Exp. (82), e50782(2013).</li>
<li>Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM8+function+and+expression+in+vagal+sensory+neurons+and+afferent+nerves+innervating+guinea+pig+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+-+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus.</a> Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).</li>
<li>Kwong, K., Lee, L. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE%282%29+sensitizes+cultured+pulmonary+vagal+sensory+neurons+to+chemical+and+electrical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli.</a> J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).</li>
<li>Joachim, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+induces+substance+P+in+vagal+sensory+neurons+innervating+the+mouse+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways.</a> Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).</li>
<li>Kaan, T. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+blockade+of+P2X3+and+P2X2%2F3+receptors+attenuates+bone+cancer+pain+behaviour+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats.</a> Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).</li>
<li>Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helt+determines+GABAergic+over+glutamatergic+neuronal+fate+by+repressing+Ngn+genes+in+the+developing+mesencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon.</a> Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).</li>
<li>Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-array+profiling+of+striatal+projection+neuron+subtypes+in+juvenile+and+adult+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje metodę celowania w neurony unerwiające drogi oddechowe w zwojach nerwu błędnego bez dozowania. Po znakowaniu zwoje są delikatnie dysocjowane, aby optymalnie zachować liczbę komórek i żywotność. Neurony te są następnie sortowane FAC bezpośrednio do buforu do lizy i ekstrahowane jest RNA. Znaczenie tego protokołu polega na możliwości celowania, izolowania i zachowywania jakości określonej populacji komórek czuciowych. Ekspresja genów jest opisana w tej małej populacji neuronów, a także identyfikowane s...

Nerwy somatosensoryczne przekazują bodźce termiczne, mechaniczne, chemiczne i szkodliwe wywołane zarówno przez czynniki endogenne, jak i środowiskowe. Ciała komórkowe tych nerwów doprowadzających znajdują się w zwojach czuciowych, takich jak korzeń grzbietowy, zwoje nerwu trójdzielnego lub zwoje bez dawki. Każdy zwój czuciowy unerwia określone obszary ciała i zawiera komórki, które unerwiają oddzielne narządy i tkanki w tym obszarze. Na przykład zwoje korzenia grzbietowego (DRG) znajdują się w kręgosłupie i rozciągają się na całe ciało i kończyny, podczas gdy zwoje nerwu trójdzielnego znajdują się w czaszce, zawierając neurony, które unerwiają twarz, oczy, opony mózgowe lub górne drogi oddechowe1,2. Zwoje nerwu błędnego bez dawki znajdują się w szyi poniżej czaszki i zawierają ciała komórkowe, które rozciągają włókna nerwowe w całym przewodzie pokarmowym, sercu oraz dolnych drogach oddechowych i płucach3. U ludzi ganglion nodose występuje samodzielnie, jednak u myszy jest połączony ze zwojem szyjnym, który również unerwia płuca4. Ten zrośnięty ganglion jest często nazywany kompleksem szyjnym / nodose, ganglionem błędnym lub po prostu ganglionem nodose5. Tutaj określa się go mianem zwoju nodose.
Włókna aferentne nodose przekazują informacje z wnętrzności do jądra drogi samotnej (NTS) w pniu mózgu. Sygnały sensoryczne do tego wyjątkowego ganglionu kontrolują różnorodny zakres funkcji, takich jak motoryka jelit6, tętno7, oddychanie8,9 i reakcje oddechowe aktywowane przez czynniki drażniące10,11. Przy tej różnorodności funkcji i unerwionych narządów, kluczowe znaczenie ma ukierunkowanie i wyizolowanie specyficznych dla narządów subpopulacji zwoju nodose w celu zbadania indywidualnych ścieżek neuronalnych. Jednak biorąc pod uwagę mały rozmiar nodose i ograniczoną liczbę neuronów, które zawiera, nie jest to trywialne zadanie. Każdy mysi zwój bez dawki zawiera około 5000neuronów12 oprócz rozległej populacji wspierających komórek satelitarnych. Spośród 5000 neuronów bez dawek, tylko 3 - 5% unerwiają drogi oddechowe. W związku z tym wszelkie zmiany funkcjonalne, morfologiczne lub molekularne w neuronach unerwiających drogi oddechowe, spowodowane stymulacją oddechową lub patologiami, zostaną utracone w gęsto upakowanym zwoju nodose.
Aby rozwiązać ten problem, opracowano metodę identyfikacji i izolacji neuronów, które unerwiają drogi oddechowe. Drogi oddechowe poddano działaniu fluorescencyjnego barwnika znacznikowego w celu zidentyfikowania kolejnych unerwiających neuronów nodose. Fast Blue został wychwycony przez neurony i szybko przemieszcza się do ich ciał komórkowych, gdzie jest przechowywany przez okres do ośmiu tygodni13-15. Po zidentyfikowaniu zastosowano delikatny, ale skuteczny protokół dysocjacji, aby zachować znakowanie barwnika i żywotność komórek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FAC). Posortowane komórki są wykorzystywane do ekstrakcji wysokiej jakości kwasu rybonukleinowego (RNA) w celu określenia ekspresji genów lub do innej dalszej analizy molekularnej. Protokół ten zapewnia użyteczną i solidną technikę izolowania neuronów czuciowych, które unerwiają tkankę będącą przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>Szybki niebieski</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17740-2</td><td>zapas 2 mg/ml w wodzie</td></tr><tr><td>NeuroTrace 530/615 czerwona plama Nissle</td><td>Life Technologies</td><td>N21482</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS) bez Ca i Mg</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>glutamina ( Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 (bez witaminy A)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu nerwów (NGF)</td><td>Sigma</td><td>N6009</td><td>stock 50 &micro; g/ml w PBS/10%</td></tr><tr><td>enzymie trawiennym FBS, Liberase DH Research Grade</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>zapas 2,5 mg/ml w</td></tr><tr><td>roztworze cząstek wody (Percoll)</td><td>Sigma</td><td>P1644-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>LabNet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtr siatkowy</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2484-100</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do odkażania RNazy, RNase AWAY</td><td>invitrogen</td><td>10328-011</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Zestaw do</td> ekstrakcji RNA VWR <td>EM-6010</td><td></td></tr>, <tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNazy, zestaw DNaz bez RNaz</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>zapas 10 mg / ml w 0,15 M</td></tr><tr><td>NaCl Jodek propidium</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td>zapas 10 i mikro; g/ml w</td></tr><tr><td>systemie elektroforezy mikroprzepływowej PBS (TapeStation 2200)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metoda celowania i izolowania neuronów czuciowych unerwiających drogi oddechowe u myszy

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Nerwy somatosensoryczne przekazują bodźce termiczne, mechaniczne, chemiczne i szkodliwe wywołane zarówno przez czynniki endogenne, jak i środowiskowe. Ciała komórkowe tych neuronów doprowadzających znajdują się w zwojach czuciowych. Zwoje czuciowe unerwiają określony narząd lub część ciała. Na przykład zwoje korzenia grzbietowego (DRG) znajdują się w kręgosłupie i rozciągają się na całe ciało i kończyny. Zwoje nerwu trójdzielnego znajdują się w czaszce i unerwiają twarz oraz górne drogi oddechowe. Aferenty nerwu błędnego zwojów nodose rozciągają się na jelita, serce i płuca. Neurony nodose kontrolują różnorodny zakres funkcji, takich jak: częstość oddechów, podrażnienie dróg oddechowych i odruchy kaszlowe. Dlatego, aby zrozumieć i manipulować ich funkcją, kluczowe znaczenie ma identyfikacja i wyizolowanie subpopulacji neuronów specyficznych dla dróg oddechowych. U myszy drogi oddechowe są wystawione na działanie fluorescencyjnego barwnika znacznikowego, Fast Blue, w celu wstecznego śledzenia neuronów nodose specyficznych dla dróg oddechowych. Zwoje bez dawki są dysocjowane, a sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją (FAC) służy do zbierania komórek dodatnich pod względem barwnika. Następnie wysokiej jakości kwas rybonukleinowy (RNA) jest ekstrahowany z komórek barwnikowo-dodatnich do sekwencjonowania nowej generacji. Za pomocą tej metody określa się ekspresję genów neuronalnych specyficznych dla dróg oddechowych.

Stosując tę metodę, neurony unerwiające drogi oddechowe są znakowane poprzez donosowe podanie Fast Blue (Rycina 1A). Po dwóch dniach w zwojach nodose pojawiają się komórki znakowane barwnikiem Fast Blue (Rycina 1C). Komórki te stanowią 3 - 5% całkowitej populacji neuronalnej zwojów nodose. Inne barwniki retrogradowe stosowane w tym celu to DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) oraz Fluorogold. Ekspozycja płuc na DiI znak...

Neurony czuciowe specyficzne dla narządów są trudne do zidentyfikowania. Szybkie śledzenie niebieskie służy do identyfikacji neuronów bez dawki unerwiających drogi oddechowe w celu sortowania komórek. Posortowane neurony bez dawki są używane do ekstrakcji wysokiej jakości kwasu rybonukleinowego (RNA) do sekwencjonowania. Za pomocą tego protokołu określa się ekspresję genów neuronów specyficznych dla dróg oddechowych.

Metoda celowania i izolowania neuronów czuciowych unerwiających drogi oddechowe u myszy

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest oznakowanie i izolacja neuronów zwoju błędnego unerwiających drogi oddechowe. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii obwodowej, takie jak: jakie cechy identyfikacyjne posiadają neurony unerwiające drogi oddechowe?Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona niezawodną i wysokoprzepustową metodę celowania i izolowania specyficznych populacji neuronalnych. Po pobraniu zwojów czuciowych odessaj 500 µl roztworu do dysocjacji zwojów z każdej probówki, nie naruszając zwojów. Następnie dodaj 1 mL PBS do każdej próbki i odczekaj, aż zwoje opadną na dno probówek.Następnie usunąć PBS i dodać do neuronów jeden mililitr roztworu do dysocjacji zwojów uzupełnionego o enzym trawienny, a następnie dodać 20 µL Fast Blue do probówki z kontrolą pozytywną. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez odpowiedni czas, zależnie od wieku enzymu trawiennego. Krótko wstrząsać i potrząsać probówkami co 15 minut, aby upewnić się, że zwoje są pokryte roztworem trawiennym.Podczas trawienia komórek nerwowych powoli i ostrożnie dodaj 400 µL świeżo przygotowanego roztworu o gęstości 12% nad 400 µL roztworu o gęstości 28

a-method-to-target-isolate-airway-innervating-sensory-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wielokrotne pomiary fizjologii układu oddechowego gryzoni oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych są pożądane, lecz zazwyczaj niewykonalne. W niniejszym materiale opisujemy powtarzalną metodę intubacji doustnej myszy, która umożliwia wielokrotne pomiary nadreaktywności dróg oddechowych oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych.

Odwracalna, nieinwazyjna metoda pomiaru oporu dróg oddechowych i pobierania płynu z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego u myszy

Opisujemy procedury powtarzalnego podawania inhibitorów sygnalizacji muskarynowej do mięśnia dźwigacza małżowiny usznej (LAL) u młodych dorosłych myszy oraz późniejszego barwienia immunocytochemicznego jego złącz neuromięśniowych (NMJs) w preparatach całych organów. Mięsień LAL posiada wyjątkowe zalety w kontekście ujawniania farmakologicznych efektów in vivo w złączach NMJs.

Podskórne podawanie antagonistów muskarynowych oraz potrójne barwienie immunocytochemiczne mięśnia dźwigacza małżowiny usznej u myszy

Ten film pokazuje izolację komórek ze zwojów czuciowych myszy. Zwoje są poddawane trawieniu enzymatycznemu w celu rozpuszczenia macierzy zewnątrzkomórkowej. Pojedyncze komórki są następnie zbierane poprzez filtrowanie przez sitko do komórek, a następnie wirowanie w gradiencie gęstości w celu usunięcia zanieczyszczeń. Na koniec wykonuje się mycie i odwirowanie w celu zebrania izolowanych komórek do przyszłej analizy.

Izolacja komórek ze zwojów czuciowych

Ten film demonstruje elektrofizjologiczny zapis węchowych neuronów czuciowych (OSN) u myszy przy użyciu techniki perforowanego patch-clamp. Nabłonek węchowy, zawierający OSN z receptorami zapachowymi znakowanymi fluoroforem, jest izolowany od myszy i umieszczany w komorze rejestracyjnej. Pipeta rejestrująca jest zaciśnięta na dendrytycznym pokrętle OSN, a nystatyna w pipecie perforuje membranę, tworząc połączenie elektryczne z komórką. Na koniec za pomocą kolejnej pipety dostarcza się...

Perforowany zapis węchowych neuronów czuciowych u myszy

Opracowaliśmy prostą, niezawodną i stosunkowo tanią metodę intubacji dotchawiczej u myszy za pomocą bezpośredniej laryngoskopii przy użyciu otoskopu z wziernikiem 2,0 mm. Technika ta jest atraumatyczna i może być stosowana do powtarzania pomiarów w przewlekłych eksperymentach. Uważamy, że jest lepsza od tracheostomii lub wcześniej opisanych technik niechirurgicznych.

Intubacja dotchawicza u myszy za pomocą laryngoskopii bezpośredniej przy użyciu otoskopu

Prezentujemy protokół chirurgiczny szczegółowo opisujący, jak wykonać aksotomię cięcia lub zgniecenia nerwu twarzowego u myszy. Akskotomia nerwu twarzowego może być wykorzystana do badania fizjologicznej reakcji na uszkodzenie nerwu i testowania technik terapeutycznych.

Aksotomia nerwu twarzowego u myszy: model do badania reakcji neuronów ruchowych na uraz

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Celem tego artykułu jest opisanie wyrafinowanej metody intubacji myszy laboratoryjnej. Metoda jest nieinwazyjna i dlatego idealnie nadaje się do badań, które wymagają seryjnego monitorowania funkcji oddechowych i/lub wkraplania leków do płuc.

Wielokrotna intubacja jamy ustnej i tchawicy u myszy

Ten manuskrypt przedstawia protokół chirurgicznego usuwania zazwojowych neuronów współczulnych odcinka lędźwiowego u myszy. Procedura ta ułatwi wiele badań mających na celu zbadanie roli unerwienia współczulnego w dystalnych celach tkankowych.

Chirurgiczna sympatektomia lędźwiowa u myszy

To badanie przedstawia chirurgiczną manipulację polegającą na uwidocznieniu T-DRG u znieczulonych myszy do obrazowania wapnia in vivo, wraz z synchronicznymi zapisami EKG. Metoda ta stanowi najnowocześniejsze narzędzie do badania obwodowej stymulacji nerwów elektrycznych i danych wejściowych narządów trzewnych klatki piersiowej, a także ich interakcji na podstawowym poziomie sensorycznym.

Obrazowanie in vivo wapnia zwojów korzenia grzbietowego klatki piersiowej (DRG) i zapis EKG w celu badania stymulacji nerwów obwodowych

Badanie to ustanowiło modele kaszlu i kichania u myszy poprzez zastosowanie specyficznych bodźców do tchawicy i jamy nosowej oraz opracowało metodę opartą na dźwięku do rozróżniania kaszlu od kichania myszy poprzez analizę różnic w ich sygnałach akustycznych.<br...

Precyzyjna indukcja i rozróżnienie odruchów kaszlu i kichania u myszy

Poznaj metodę izolacji neuronów czuciowych unerwiających drogi oddechowe u myszy przy użyciu techniki Fast Blue. Ta technika umożliwia ekstrakcję wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w neurobiologii obwodowej.

Metoda celowania i izolowania neuronów czuciowych unerwiających drogi oddechowe u myszy

Przeglądaj więcej filmów