Metoda celowania i izolowania neuronów czuciowych unerwiających drogi oddechowe u myszy

Ogólnym celem tego eksperymentu jest oznakowanie i wyizolowanie unerwiających drogi oddechowe neuronów nodose nerwu błędnego. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii obwodowej. Na przykład, jakie właściwości identyfikacyjne posiadają neurony unerwiające drogi oddechowe?

Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia solidną i wysokoprzepustową metodę celowania i izolowania określonych populacji neuronów. Po pobraniu zwojów czuciowych należy odessać 500 mikrolitrów roztworu dysocjacji zwojów z każdej probówki, nie naruszając zwojów. Następnie dodaj jeden mililitr PBS do każdej próbki i poczekaj, aż zwoje osiądą na dnie probówek.

Następnie usuń PBS i dodaj jeden mililitr roztworu dysocjacji zwojów komórkowych uzupełnionego enzymem trawiącym do neuronów, a następnie dodaj 20 mikrolitrów Fast Blue do probówki kontroli pozytywnej. Inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez odpowiedni czas w zależności od wieku enzymu trawiącego. Potrząsanie i krótkie przesuwanie rurek co 15 minut, aby upewnić się, że zwoje są pokryte roztworem trawiącym.

Podczas trawienia komórek nerwowych powoli i ostrożnie dodaj 400 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu o gęstości 12% zamiast 400 mikrolitrów roztworu o gęstości 28% w jednej probówce o gęstości 1,5 mililitra na próbkę. Powinny być widoczne dwie wyraźne warstwy, jedna ciemniejsza od drugiej. Następnie oznacz 1,5 mililitra probówki zbiorcze do sortowania, w tym jedną probówkę Fast Blue dodatnią i jedną ujemną Fast Blue na próbkę do sortowania.

Pod koniec okresu trawienia wyrzuć enzym wytrawiający i przemyj zwoje dwukrotnie jednym mililitrem PBS, jak właśnie pokazano. Po drugim praniu dodaj 200 mikrolitrów świeżego roztworu dysocjacji zwojów do każdej probówki. Następnie, używając pipety o pojemności 200 mikrolitrów ustawionej na objętość 100 mikrolitrów, kilkakrotnie odpipetuj zwoje w górę iw dół, aby zdysocjować komórki w zawiesinę pojedynczej komórki, uważając, aby uniknąć pęcherzyków.

Gdy nie widać nienaruszonych kawałków tkanki, trzymając mocno w jednej ręce sitko o wielkości 70 mikronów, odpipetuj zdysocjowany roztwór komórkowy do środka sitka. Następnie umyj rurkę dysocjacyjną 100 mikrolitrami świeżego roztworu do dysocjacji zwojów, aby zebrać dodatkowe komórki. Przepłukać płuczkę przez sitko i za pomocą nowej końcówki pipety odessać pozostałą komórkę zawierającą roztwór na spodniej stronie sitka, dodając ją do zawiesiny komórek.

Teraz ostrożnie ułóż wszystkie 300 mikrolitrów komórek na wcześniej przygotowanym gradiencie gęstości. I zbierz komórki zwojowe przez odwirowanie. Podczas wirowania komórek dodaj 300 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu do lizy do probówki do dodatniego roztworu Fast Blue i 600 mikrolitrów buforu do lizy do probówki do ujemnego roztworu, aby upewnić się, że płyn z osłonki sortującej nie rozcieńczy znacząco buforu do lizy

Pod koniec wirowania ostrożnie usuń górne 700 mikrolitrów roztworu zawierającego większość resztek komórek. Następnie wymieszaj 700 mikrolitrów świeżego roztworu dysocjacji zwojów z pozostałymi komórkami. Osadzać komórki przez odwirowanie i ostrożnie wyrzucić supernatant.

Następnie ponownie zawiesić komórki w 200 do 300 mikrolitrach sortującego roztworu dysocjacji zwojów za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów ustawionej na 200 mikrolitrów. I umieść komórki na lodzie, aż będą gotowe do sortowania. Po oczyszczeniu komórek zwojowych za pomocą FACS, homogenizuj neurony w buforze do lizy przez jedną minutę z wirowaniem.

Następnie kilkakrotnie wymieszaj komórki z jedną objętością 70% etanolu i przenieś do 700 mikrolitrów próbki do kolumny wirowej. Odwirować kolumnę przez 15 sekund przy 8 000 x g w mikrowirówce i odrzucić przepływ. Gdy cała próbka zostanie przepuszczona przez kolumnę wirową, wyekstrahuj RNA zgodnie ze standardowymi protokołami oczyszczania RNA.

Następnie użyj systemu elektroforezy mikroprzepływowej, aby przetestować jakość RNA zgodnie ze specyfikacją producenta. Na tych wykresach pokazane są ujemne i dodatnie kontrolki Fast Blue używane do ustawiania bramek sortowania. Zdysocjowane komórki Nodose znakowane Fast Blue można następnie posortować na populacje Fast Blue dodatnie i Fast Blue ujemne.

Wydajność sortowania dla tej metody wynosi od 73 do 85%, przy czym średnio zbiera się około 1 500 lub mniej komórek Fast Blue dodatnich i prawie 60 000 komórek Fast Blue ujemnych. Jak zaobserwowano w przypadku tej reprezentatywnej próbki, piki 18S i 28S osiągnięte za pomocą elektroforezy mikroprzepływowej można następnie wykorzystać do obliczenia liczby integralności RNA w celu określenia jakości wyekstrahowanego RNA. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w cztery i pół godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkim przejściu przez kolejne etapy i użyciu świeżo przygotowanych roztworów do ekstrakcji RNA. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak hodowla neuronów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak jakie właściwości funkcjonalne są unikalne dla neuronów unerwiających drogi oddechowe? Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neurobiologią obwodową do zbadania unikalnych właściwości specyficznej populacji neuronów unerwiających drogi oddechowe w zwojach nerwu błędnego bez dozowania.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczyć i zdysocjować określone neurony zwojów bez dawki, które można następnie wykorzystać do sekwencjonowania RNA lub posiać do badań funkcjonalnych. Nie zapominaj, że praca z 2-merkaptoetanolem może być niezwykle niebezpieczna i że podczas stosowania tego związku należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i praca w kapturze chemicznym.