Name: Selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj metodę selektywnego pobierania leukocytów wątrobowych z marginesów przez wymuszoną perfuzję wątroby szczura lub myszy. Technika ta pozwala izolować komórki odpornościowe bez zanieczyszczeń z innych przedziałów wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy i ta praca byli wspierani przez grant NIH/NCI # R01CA172138 (dla SBE).

Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie w Tel-Awiwie.
1. Protokół dla szczurów
<ol>
	<li>Preparaty
	<ol>
		<li>Przygotować heparynizowany roztwór PBS (30 jednostek/ml) do użycia w temperaturze pokojowej (RT), dodając 30 jednostek heparyny wolnej od konserwantów na ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1x. Oblicz 35 ml na zwierzę.</li>
		<li>Przepuścić heparynizowany PBS przez przewody pompy perystaltycznej i igły motylkowe, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Sterylizuj narzędzia chirurgiczne – 2 pary nożyczek, kleszcze o krawędziach, 2 hemostatyki i kleszczyki do tkanek zębów (autoklaw w temperaturze 121 °C przez co najmniej 30 minut w ustawieniu grawitacyjnym (na sucho)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja wątroby i zbiór MH-leukocytów
	<ol>
		<li>Poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie 8% izofluranu. Na wszelki wypadek umieścić probówkę o pojemności 50 ml zawierającą podkładkę nasączoną izofluranem wokół głowy szczura, aż do otwarcia jej klatki piersiowej.</li>
		<li>Otworzyć jamy otrzewnej i klatki piersiowej, aby odsłonić wątrobę i kompleks krążeniowo-oddechowy natychmiast po ustaniu oddychania. Unikaj krwawienia przez ten proces.
		<ol>
			<li>W szczególności rozpocznij nacięcie w dolnym punkcie linii środkowej brzucha, nie uszkadzając narządów wewnętrznych, i przesuwaj się na obie strony po przekątnej w kierunku żeber, przecinając je do górnych poziomów jamy klatki piersiowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W ciągu około minuty zbierz jak najwięcej krwi (~6 ml od zwierzęcia o wadze 250 g) z prawej komory do strzykawki.</li>
		<li>Zacisnąć żyłę główną ogona hemostatem jak najbliżej serca, aby umożliwić zebranie perfuzatu.</li>
		<li>Wyciągnij jelita i umieść je na zewnątrz zwierzęcia po prawej stronie eksperymentatora, aby odsłonić żyłę wrotną.</li>
		<li>Wprowadzić cewnik dożylny 25 G, podłączony do pompy perystaltycznej, do żyły wrotnej, jak to możliwe, ale rostralnie do żyły śledzionowej.</li>
		<li>Wprowadzić igłę motylkową o pojemności 25 g, połączoną ze strzykawką o pojemności 5 ml, do żyły głównej dolnej, doogonowej do hemostatu.</li>
		<li>Włączyć pompę perystaltyczną z prędkością około 3 ml/min i delikatnie pobrać do strzykawki pierwszy ml perfuzatu zanieczyszczonego krwią. Kontynuuj, aż kolor perfuzatu zmieni kolor na bladoczerwony (około 3-5 ml). Zauważ, że kolor wątroby zmienia się w kierunku jasnobrązowego.</li>
		<li>Nie zatrzymując pompy perystaltycznej, wymienić strzykawkę o pojemności 5 ml na strzykawkę o pojemności 20 ml i pobrać co najmniej 20 ml perfuzatu wątrobowego, stosując większą prędkość perfuzji (do 4 ml/min). Stale monitorować przepływ perfuzatu do strzykawki zbiorczej i unikać zbyt silnego podciśnienia (które może zatkać igłę poprzez zapadnięcie się ścianek żyły głównej).</li>
		<li>Zakończ perfuzję, gdy kolor wątroby zmieni się na jasnobrązowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja leukocytów
	<ol>
		<li>Odwirować perfuzat przez 10 minut w temperaturze 400 x g, 24 °C.</li>
		<li>Odessać supernatant</li>
		<li>Dodać 10 ml PBS, odwirować przy 400 x g przez 10 minut i odessać sklarowany sklaratant. W oparciu o cele badania, należy zastosować preparat w takiej postaci, w jakiej jest, lub przeprowadzić dodatkowe oczyszczanie (np. separację od gradientu gęstości).
		<ol>
			<li>W szczególności należy nałożyć 4 ml perfuzatu na 4 ml masy separacji o gradiencie gęstości w probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 cm3. Wirować probówki o gramaturze 754 x RT przez 30 minut z odrywaniem.</li>
			<li>Otrzymać warstwy jednojądrzaste na granicy faz separacja-gradient gęstości-supernatant za pomocą ręcznego pipetowania, przemyć w PBS i włożyć do probówki o pojemności 5 ml.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Protokół myszy
<ol>
	<li>Preparaty
	<ol>
		<li>Przygotować heparynizowany roztwór PBS (30 jednostek/ml) do użycia w temperaturze pokojowej (RT), dodając 30 jednostek heparyny wolnej od konserwantów na ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1x. Oblicz 20 ml na zwierzę.</li>
		<li>Przepuścić heparynizowany PBS przez przewody pompy perystaltycznej i igły motylkowe, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Sterylizuj narzędzia chirurgiczne – 2 pary nożyczek, kleszcze o krawędziach, 2 hemostatyki i kleszczyki do tkanek zębów (autoklaw w temperaturze 121 °C przez co najmniej 30 minut w ustawieniu grawitacyjnym (na sucho)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja wątroby i zbiór MH-leukocytów
	<ol>
		<li>Poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie 8% izofluranu. Na wszelki wypadek umieść wokół głowy myszy probówkę o pojemności 15 ml zawierającą podkładkę nasączoną izofluranem, aż do otwarcia jej klatki piersiowej.</li>
		<li>Przymocuj kończyny myszy do łóżka.</li>
		<li>Otwórz jamy otrzewnej i klatki piersiowej, aby odsłonić wątrobę i kompleks krążeniowo-oddechowy natychmiast po ustaniu oddychania, pozostawiając dolną część przepony w stanie nienaruszonym (aby stworzyć drenującą kałużę klatki piersiowej). Unikaj krwawienia przez ten proces.
		<ol>
			<li>W szczególności rozpocznij nacięcie w dolnym punkcie linii środkowej brzucha, nie uszkadzając narządów wewnętrznych, i przesuwaj się na obie strony po przekątnej w kierunku żeber, przecinając je do górnych poziomów jamy klatki piersiowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyciągnij jelita i umieść je na zewnątrz zwierzęcia po prawej stronie eksperymentatora, aby odsłonić żyłę wrotną.</li>
		<li>Wprowadzić igłę o wadze 30 g, podłączoną do pompy perystaltycznej, do żyły wrotnej rostralnej do żyły śledziony.</li>
		<li>Przeciąć żyłę główną dolną powyżej przepony, aby umożliwić drenaż i zebranie perfuzatu z jamy klatki piersiowej.</li>
		<li>Włączyć pompę perystaltyczną z prędkością około 3 ml/min i delikatnie pobrać pierwsze 3 ml perfuzatu zanieczyszczonego krwią z kałuży klatki piersiowej.</li>
		<li>Odrzuć ten perfuzat. W razie potrzeby powtórz takie mycie ponownie, używając soli fizjologicznej, a dopiero potem zacznij zbierać perfuzat wątroby.</li>
		<li>Ponownie rozpocząć perfuzję z prędkością do 4 ml/min i pobrać 10 ml perfuzatu z jamy klatki piersiowej za pomocą motylka podłączonego do strzykawki.</li>
		<li>Zakończ perfuzję, gdy kolor wątroby zmieni się na jasnobrązowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja leukocytów
	<ol>
		<li>Odwirować perfuzat przez 10 minut przy 400 x g.</li>
		<li>Odessać supernatant.</li>
		<li>Dodać 10 ml PBS, odwirować przy 400 x g przez 10 minut i odessać supernatant W oparciu o cele badania, należy zastosować preparat w takiej postaci, w jakiej jest, lub przeprowadzić dodatkowe oczyszczanie (np. separację w gradinie gęstości).
		<ol>
			<li>W szczególności co 4 ml perfuzatu nakładać na 4 ml masy separacyjnej o gradiencie gęstości w probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 cm3. Wirować probówki o gramaturze 754 x RT przez 30 minut z odrywaniem.</li>
			<li>Otrzymać warstwy jednojądrzaste na granicy faz separacja-gradient gęstości-supernatant za pomocą ręcznego pipetowania, przemyć w PBS i włożyć do probówki o pojemności 5 ml.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
<li>Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).</li>
<li>Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pit+cell%3A+description+of+a+new+type+of+cell+occurring+in+rat+liver+sinusoids+and+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood.</a> Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).</li>
<li>Vermijlen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+natural+killer+cells+exclusively+kill+splenic%2Fblood+natural+killer-resistant+tumor+cells+by+the+perforin%2Fgranzyme+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway.</a> J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).</li>
<li>Gao, B., Radaeva, S., Park, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+natural+killer+and+natural+killer+T+cells%3A+immunobiology+and+emerging+roles+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases.</a> J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).</li>
<li>Kaneda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-associated+large+granular+lymphocytes%3A+morphological+and+functional+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects.</a> Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).</li>
<li>Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+of+perforin+in+cytolysis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">A central role of perforin in cytolysis?</a> Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).</li>
<li>Kamada, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+carboxypeptidase+and+tryptic+esterase+activities+that+are+complexed+to+proteoglycans+in+the+secretory+granules+of+human+cloned+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells.</a> J Immunol. 142, 609-615 (1989).</li>
<li>Wisse, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+function+of+pit+cells%2C+the+liver-specific+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells.</a> Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).</li>
<li>Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+granular+lymphocytes+or+%26%2334%3Bpit+cells%26%2334%3B+from+rat+liver%3A+isolation%2C+ultrastructural+characterization+and+natural+killer+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Large granular lymphocytes or &#34;pit cells&#34; from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity.</a> Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).</li>
<li>Vanderkerken, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+differentiation+of+hepatic+natural+killer+cells+%28pit+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells).</a> Hepatology. 18, 919-925 (1993).</li>
<li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+adhesion+molecules+in+the+recruitment+of+hepatic+natural+killer+cells+%28pit+cells%29+in+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver.</a> Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).</li>
<li>Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+and+lymphokine-activated+killer+cells+require+granzyme+B+for+the+rapid+induction+of+apoptosis+in+susceptible+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).</li>
<li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+LFA-1+in+hepatic+NK+cell+%28pit+cell%29-mediated+cytolysis+and+apoptosis+of+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells.</a> J Hepatol. 31, 110-116 (1999).</li>
<li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+mouse+liver-associated+natural+killer+activity+by+biologic+response+modifiers+occurs+largely+via+rapid+recruitment+of+large+granular+lymphocytes+from+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow.</a> J Immunol. 143, 372-378 (1989).</li>
<li>Schluter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastatic+tumor+cell+adhesion+and+extravasation+of+colon+carcinoma+cells+with+different+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential.</a> Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).</li>
<li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+organ-associated+natural+killer+activity+by+biological+response+modifiers.+Isolation+and+characterization+of+large+granular+lymphocytes+from+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver.</a> J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).</li>
<li>Winnock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+liver-associated+lymphocytes+in+patients+with+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis.</a> Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).</li>
<li>Hata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+phenotyping%2C+and+functional+analysis+of+lymphocytes+from+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver.</a> Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).</li>
<li>Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+phenotypically+and+functionally+distinct+subset+of+large+granular+lymphocytes+%28pit+cells%29+in+rat+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids.</a> Hepatology. 12, 70-75 (1990).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona w niniejszym artykule metoda perfuzji wątroby umożliwia selektywne pobieranie i badanie unikalnej populacji leukocytów wątrobowych z marginesem. Komórki NK wątroby, zwane również komórkami PIN3, stanowią charakterystyczną populację komórek NK, które znajdują się w sinusoidach wątroby. Występują u szczurów, myszy17 i u ludzi18,19. W porównaniu z izolowanymi obwodowymi komórkami NK, komórki pit wykazywały wyższą cytotoksyczność wobec docelowych linii komórkowych YAC-1 i CC531<...

Sinusoidy wątroby zawierają liczne podtypy leukocytów o różnych aktywnościach immunologicznych krytycznych dla organizmu. Na przykład komórki NK (Natural Killer) wątroby z marginesacją (MH), znane również jako komórki pit, są scharakteryzowane morfologicznie jako limfocyty o dużych ziarnistych limfocytach (LGL) i funkcjonalnie jako leukocyty o spontanicznej zdolności cytotoksycznej, umożliwiającej oporność wątroby na tworzenie przerzutów nowotworowych przenoszonych przez krew. Celem przedstawionej w niniejszym artykule metody jest umożliwienie selektywnego pozyskiwania leukocytów MH w celu zbadania tej ważnej i unikalnej populacji komórek (i kompartmentu immunologicznego) oraz wyjaśnienia wpływu różnych manipulacji (np. aktywacji immunologicznej) na te specyficzne komórki.
Pomimo niepowodzenia odporności w eliminacji rozwijającego się guza pierwotnego, dowody u pacjentów z rakiem i modelach zwierzęcych wskazują, że układ odpornościowy może kontrolować krążące komórki nowotworowe, mikroprzerzuty i choroby resztkowe poprzez odporność komórkową (CMI). Istnieje jednak wyraźna niespójność między tymi możliwościami in vivo a badaniami in vitro na ludziach i zwierzętach, które wykazują, że większość autologicznych komórek nowotworowych jest odporna na cytotoksyczność przez krążące lub śledzioniczne leukocyty1,2. Niespójność tę można przypisać, przynajmniej częściowo, istnieniu in vivo odrębnej subpopulacji leukocytów, a mianowicie leukocytów wątroby z marginesem (sinusoidami) i ich subpopulacji aktywowanych komórek NK, a mianowicie komórek pit3. Rzeczywiście, niepublikowane dane z naszego laboratorium wskazały, że u szczurów F344 syngeniczne komórki nowotworowe (MADB106), które okazały się odporne na leukocyty krążące i śledzionowe, były lizowane przez komórki MH-NK4. Tak więc komórki nowotworowe, które są rzekomo "oporne" na krążące leukocyty, mogą być kontrolowane przez komórki MH-NK. Warto zauważyć, że u myszy zwiększona aktywność MH-NK jest widoczna dopiero po stymulacji immunologicznej in vivo (np. poprzez zastosowanie Poly I:C lub CpG-C)5.
Komórki NK specyficzne dla wątroby (MH-NK) znajdują się wewnątrz światła sinusoidalnego, przylegając do komórek śródbłonka i komórek Kupffera. Komórki MH-NK charakteryzują się wyłącznie kulistymi, gęstymi granulkami i pęcherzykami z rdzeniempręcikowym 6, które zawierają kwaśną fosfatazę jako enzymy lizosomalne oraz perforynę i granzymy jako substancje bioaktywne7,8. W porównaniu z krążącymi komórkami NK, komórki MH-NK wykazują większą liczbę i wielkość granulek i pęcherzyków9-11. W warunkach zapalnych wykazano, że komórki MH-NK wykazują wyższą ekspresję LFA-112 w porównaniu z krążącymi komórkami NK. Ta zwiększona ekspresja może stanowić mechanizm, dzięki któremu komórki MH-NK są bardziej cytotoksyczne wobec niektórych komórek nowotworowych niż krążące komórki NK 13,14. Co ciekawe, po inkubacji in vitro z interleukiną (IL)-2, komórki MH-NK ulegają powiększeniu, a ich liczba i rozmiar granulek wzrastają, z których wszystkie są zgodne z profilem komórek zabójcy aktywowanych limfokiną (LAK)15.
Aktywne leukocyty MH nie mogą być uzyskane wyłącznie za pomocą standardowych metod pozyskiwania leukocytów wątrobowych, które opierają się na mieleniu i biologicznej degradacji tkanki. Nasze podejście perfuzyjne opisane w niniejszym dokumencie ma dwie główne zalety w porównaniu z podejściami standardowymi. Po pierwsze, podejście perfuzyjne selektywnie zbiera leukocyty MH, zapobiegając zanieczyszczeniu przez inne leukocyty z innych przedziałów wątroby. Po drugie, technika perfuzji lepiej zachowuje integralność, aktywność i środowisko fizjologiczne leukocytów MH, w przeciwieństwie do podejść do przetwarzania tkanek, które uszkadzają komórki lub zmieniają ich morfologię, a z powodu uszkodzenia tkanek indukują uwalnianie różnych czynników, które wyraźnie modulują aktywność immunologiczną.
Wątroba jest głównym organem docelowym dla przerzutów nowotworowych i różnych infekcji16. Ponieważ komórki MH wykazują unikalne cechy, ważne jest, aby badać tę specyficzną populację w różnych warunkach w odniesieniu do tych patologii. Na przykład warto zauważyć, że wykazano, że ogólnoustrojowa aktywacja immunologiczna przez różne BRM (np. poli I:C lub CpG-C) aktywuje MH-leukocyty bardziej niż krążące leukocyty5.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Pompa</td><td></td><td></td><td></td>perystaltyczna</tr><tr><td>Igła motylkowa</td><td>OMG</td><td></td><td>26 G</td></tr><tr><td>Igła motylkowa</td><td>OMG</td><td></td><td>21 G*3/4"</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>roztwór</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>roztwór</td><td></td><td>2,5 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>roztwór</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Roztwór</td><td></td> <td>10 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Roztwór</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr>Kleszcze <td></td><td></td><td></td>o<td>krawędziach</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td>do tkanek</tr><tr><td>22 W Fluorescencyjna lampa</td><td></td><td></td><td></td> lupa do światła dziennego</tr></tbody></table>

selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesami

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Wykazano, że klasa <p='jove_content'>Leukocyty wątroby z marginesem (MH) (leukocyty przylegające do sinusoid wątroby) wykazują unikalny skład i cechy w porównaniu z leukocytami innych kompartmentów immunologicznych. W szczególności dowody sugerują wyraźny profil pro- i przeciwzapalny populacji MH-leukocytów oraz wyższą cytotoksyczność komórek NK specyficznych dla wątroby (a mianowicie komórek pit) w porównaniu z krążącymi lub śledzionowymi immunocytami zarówno u myszy, jak i szczurów. Przedstawiona metoda umożliwia selektywne pobieranie leukocytów MH poprzez wymuszoną perfuzję wątroby u myszy i szczurów. W przeciwieństwie do innych metod stosowanych do ekstrakcji leukocytów wątroby, w tym rozdrabniania tkanek i degradacji biologicznej, ta metoda daje wyłącznie leukocyty z sinusoid wątroby, niezanieczyszczone komórkami z innych przedziałów wątrobowych. Ponadto technika perfuzji lepiej zachowuje integralność i środowisko fizjologiczne leukocytów MH, oszczędzając znane reakcje fizjologiczne na przetwarzanie tkankowe. Ponieważ wiele krążących komórek nowotworowych i zakażonych komórek jest zatrzymywanych podczas przechodzenia przez sinusoidy wątroby, fizycznie oddziałując z komórkami śródbłonka i leukocytami rezydentnymi, unikalna populacja leukocytów MH jest strategicznie zlokalizowana, aby wchodzić w interakcje, identyfikować i reagować na nieprawidłowe krążące komórki. Tak więc selektywne zbieranie MH-leukocytów i ich badanie w różnych warunkach może pogłębić nasze zrozumienie biologicznego i klinicznego znaczenia leukocytów MH, szczególnie w odniesieniu do krążących nieprawidłowych komórek i chorób związanych z wątrobą oraz przerzutów nowotworowych.

U szczurów F344 porównaliśmy cytotoksyczność komórek MH-NK (pozyskanych z zatok wątrobowych poprzez wymuszoną perfuzję wątroby) z cytotoksycznością całej populacji komórek wątroby po mechanicznym rozcieraniu tkanki wątrobowej oraz z cytotoksycznością krążących leukocytów. Wszystkie preparaty komórkowe przemyto co najmniej 3 razy, zgodnie z rutyną w badaniach immunologicznych, a jako linie komórek docelowych wykorzystano allogeniczną linię YAC-1 lub syngeniczną linię MADB106. Jak wskazano ...

Margining-hepatic leukocyty wykazują unikalne cechy i odrębne funkcje immunologiczne w porównaniu z innymi populacjami leukocytów. Tutaj opisujemy metodę selektywnego pobierania tej specyficznej populacji komórek wątroby poprzez wymuszoną perfuzję wątroby szczurów lub myszy. Leukocyty wątroby z marginesem wydają się mieć kluczowe znaczenie w określaniu podatności na choroby wątrobowe i przerzuty.

Selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesami

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest selektywne pozyskanie margynujących leukocytów wątrobowych — komórek odpornościowych przylegających do zatok wątrobowych — poprzez wymuszoną perfuzję wątrób mysich lub szczurzych. Metoda ta pozwala na badanie leukocytów wątrobowych, które wykazują unikalne cechy i odmienne funkcje immunologiczne w porównaniu do innych populacji leukocytów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na uzyskanie leukocytów pochodzących wyłącznie z zatok wątrobowych, bez zanieczyszczenia komórkami z innych obszarów wątroby, takich jak miąższ.Procedurę zademonstrują Liat Sorski i Lee Shaashua, dwaj wybitni studenci studiów doktoranckich z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury perfuzji wątroby przepłucz linie pompy perystaltycznej oraz igły motylkowe heparynowanym PBS, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie, niezwłocznie po ustaniu oddechu, użyj sterylnych nożyczek i pęsety tkankowej do wykonania cięcia w linii środkowej brzucha, zaczynając od dolnej części brzucha uśpionego szczura aż do wyrostka mieczowatego, dbając o to, aby nie uszkodzić narządów wewnętrznych.Następnie, używając pęsety, unieś mostek i ostrożnie przetnij przepo

selective-harvesting-of-marginating-hepatic-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano nową metodę pozyskiwania makrofagów z hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura. Metoda ta wykorzystuje proliferację makrofagów w hodowli, a następnie wstrząsanie kolb z kulturą i oczyszczanie poprzez selektywną adhezję do plastikowych naczyń. Technika ta pozwala na wydajne pozyskanie makrofagów wątrobowych bez konieczności stosowania złożonego sprzętu i specjalistycznych umiejętności.

Prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników

Ten film opisuje metodę przestrzennego rozdzielania trzech subpopulacji komórek białaczkowych: zawieszonych komórek białaczkowych swobodnie unoszących się w pożywce, jasnych komórek białaczkowych przylegających do powierzchni monowarstwy komórek mezenchymalnych zrębu oraz komórek białaczkowych ciemnych fazowo, które wyemigrowały pod monowarstwę mezenchymalnych komórek zrębu z kohodowli 2D.

Żniwa subpopulacji białaczkowej: metoda przestrzennego oddzielania subpopulacji komórek białaczkowych od kokultury 2D

W tym filmie pokazujemy izolację leukocytów wątrobowych z wątroby myszy za pomocą wymuszonej perfuzji.

Izolacja marginesujących leukocytów wątrobowych z wątroby myszy

Ten film pokazuje izolację limfocytów, w tym komórek NK lub komórek NK, z ludzkiej tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji. Trawienie enzymatyczne i mechaniczne, po którym następuje separacja w gradieniu gęstości, sprzyja izolacji limfocytów, w tym komórek NK. Pobrane limfocyty mogą być dalej wykorzystywane do selektywnej ekspansji komórek NK.

Izolacja komórek NK z tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Marginating-pulmonary leukocyty wykazują unikalne cechy i odrębne funkcje immunologiczne w porównaniu z innymi populacjami leukocytów. Tutaj opisujemy selektywne zbieranie tej subpopulacji leukocytów płucnych poprzez wymuszoną perfuzję płuc u szczurów i myszy. Leukocyty płucne z marginesem wydają się mieć kluczowe znaczenie w określaniu podatności na choroby krwiopochodne i płucne.

Selektywne pobieranie leukocytów płucnych z marginesem

Urazom wątroby towarzyszy ekspansja komórek progenitorowych, które reprezentują niejednorodną populację komórek. Nowatorska klasyfikacja tego przedziału komórkowego pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów. Opisana tutaj metoda ilustruje analizę cytometrii przepływowej i izolację różnych podzbiorów o wysokiej czystości, które można wykorzystać do dalszych testów.

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Celem tego protokołu jest identyfikacja populacji komórek śródbłonka limfatycznego w wątrobie za pomocą opisanych markerów. Wykorzystujemy kolagenazę IV i DNazę oraz delikatne mielenie tkanki w połączeniu z cytometrią przepływową, aby zidentyfikować odrębną populację komórek śródbłonka limfatycznego.

Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.

Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Komórki śródbłonka limfatycznego (LLEC), niedawno zidentyfikowany typ komórek wewnątrzczaszkowych, mają słabo poznane funkcje. W badaniu przedstawiono powtarzalny protokół zbierania LLEC od myszy i tworzenia kultur pierwotnych in vitro. Protokół ten ma na celu umożliwienie naukowcom zagłębienia się w funkcje komórkowe i potencjalne implikacje kliniczne LLEC.

Zbiór i pierwotna hodowla komórek śródbłonka limfatycznego opon mózgowo-rdzeniowych

Poznaj metodę selektywnego pobierania leukocytów wątrobowych z marginesów przez wymuszoną perfuzję wątroby szczura lub myszy. Technika ta pozwala izolować komórki odpornościowe bez zanieczyszczeń z innych przedziałów wątroby.

Selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesami

Przeglądaj więcej filmów