Name: Selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj metodę selektywnego pobierania leukocytów wątrobowych z marginesów przez wymuszoną perfuzję wątroby szczura lub myszy. Technika ta pozwala izolować komórki odpornościowe bez zanieczyszczeń z innych przedziałów wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy i ta praca byli wspierani przez grant NIH/NCI # R01CA172138 (dla SBE).

Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie w Tel-Awiwie.
1. Protokół dla szczurów
<ol>
	<li>Preparaty
	<ol>
		<li>Przygotować heparynizowany roztwór PBS (30 jednostek/ml) do użycia w temperaturze pokojowej (RT), dodając 30 jednostek heparyny wolnej od konserwantów na ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1x. Oblicz 35 ml na zwierzę.</li>
		<li>Przepuścić heparynizowany PBS przez przewody pompy perystaltycznej i igły motylkowe, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Sterylizuj narzędzia chirurgiczne – 2 pary nożyczek, kleszcze o krawędziach, 2 hemostatyki i kleszczyki do tkanek zębów (autoklaw w temperaturze 121 °C przez co najmniej 30 minut w ustawieniu grawitacyjnym (na sucho)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja wątroby i zbiór MH-leukocytów
	<ol>
		<li>Poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie 8% izofluranu. Na wszelki wypadek umieścić probówkę o pojemności 50 ml zawierającą podkładkę nasączoną izofluranem wokół głowy szczura, aż do otwarcia jej klatki piersiowej.</li>
		<li>Otworzyć jamy otrzewnej i klatki piersiowej, aby odsłonić wątrobę i kompleks krążeniowo-oddechowy natychmiast po ustaniu oddychania. Unikaj krwawienia przez ten proces.
		<ol>
			<li>W szczególności rozpocznij nacięcie w dolnym punkcie linii środkowej brzucha, nie uszkadzając narządów wewnętrznych, i przesuwaj się na obie strony po przekątnej w kierunku żeber, przecinając je do górnych poziomów jamy klatki piersiowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W ciągu około minuty zbierz jak najwięcej krwi (~6 ml od zwierzęcia o wadze 250 g) z prawej komory do strzykawki.</li>
		<li>Zacisnąć żyłę główną ogona hemostatem jak najbliżej serca, aby umożliwić zebranie perfuzatu.</li>
		<li>Wyciągnij jelita i umieść je na zewnątrz zwierzęcia po prawej stronie eksperymentatora, aby odsłonić żyłę wrotną.</li>
		<li>Wprowadzić cewnik dożylny 25 G, podłączony do pompy perystaltycznej, do żyły wrotnej, jak to możliwe, ale rostralnie do żyły śledzionowej.</li>
		<li>Wprowadzić igłę motylkową o pojemności 25 g, połączoną ze strzykawką o pojemności 5 ml, do żyły głównej dolnej, doogonowej do hemostatu.</li>
		<li>Włączyć pompę perystaltyczną z prędkością około 3 ml/min i delikatnie pobrać do strzykawki pierwszy ml perfuzatu zanieczyszczonego krwią. Kontynuuj, aż kolor perfuzatu zmieni kolor na bladoczerwony (około 3-5 ml). Zauważ, że kolor wątroby zmienia się w kierunku jasnobrązowego.</li>
		<li>Nie zatrzymując pompy perystaltycznej, wymienić strzykawkę o pojemności 5 ml na strzykawkę o pojemności 20 ml i pobrać co najmniej 20 ml perfuzatu wątrobowego, stosując większą prędkość perfuzji (do 4 ml/min). Stale monitorować przepływ perfuzatu do strzykawki zbiorczej i unikać zbyt silnego podciśnienia (które może zatkać igłę poprzez zapadnięcie się ścianek żyły głównej).</li>
		<li>Zakończ perfuzję, gdy kolor wątroby zmieni się na jasnobrązowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja leukocytów
	<ol>
		<li>Odwirować perfuzat przez 10 minut w temperaturze 400 x g, 24 °C.</li>
		<li>Odessać supernatant</li>
		<li>Dodać 10 ml PBS, odwirować przy 400 x g przez 10 minut i odessać sklarowany sklaratant. W oparciu o cele badania, należy zastosować preparat w takiej postaci, w jakiej jest, lub przeprowadzić dodatkowe oczyszczanie (np. separację od gradientu gęstości).
		<ol>
			<li>W szczególności należy nałożyć 4 ml perfuzatu na 4 ml masy separacji o gradiencie gęstości w probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 cm3. Wirować probówki o gramaturze 754 x RT przez 30 minut z odrywaniem.</li>
			<li>Otrzymać warstwy jednojądrzaste na granicy faz separacja-gradient gęstości-supernatant za pomocą ręcznego pipetowania, przemyć w PBS i włożyć do probówki o pojemności 5 ml.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Protokół myszy
<ol>
	<li>Preparaty
	<ol>
		<li>Przygotować heparynizowany roztwór PBS (30 jednostek/ml) do użycia w temperaturze pokojowej (RT), dodając 30 jednostek heparyny wolnej od konserwantów na ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) 1x. Oblicz 20 ml na zwierzę.</li>
		<li>Przepuścić heparynizowany PBS przez przewody pompy perystaltycznej i igły motylkowe, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Sterylizuj narzędzia chirurgiczne – 2 pary nożyczek, kleszcze o krawędziach, 2 hemostatyki i kleszczyki do tkanek zębów (autoklaw w temperaturze 121 °C przez co najmniej 30 minut w ustawieniu grawitacyjnym (na sucho)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja wątroby i zbiór MH-leukocytów
	<ol>
		<li>Poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie 8% izofluranu. Na wszelki wypadek umieść wokół głowy myszy probówkę o pojemności 15 ml zawierającą podkładkę nasączoną izofluranem, aż do otwarcia jej klatki piersiowej.</li>
		<li>Przymocuj kończyny myszy do łóżka.</li>
		<li>Otwórz jamy otrzewnej i klatki piersiowej, aby odsłonić wątrobę i kompleks krążeniowo-oddechowy natychmiast po ustaniu oddychania, pozostawiając dolną część przepony w stanie nienaruszonym (aby stworzyć drenującą kałużę klatki piersiowej). Unikaj krwawienia przez ten proces.
		<ol>
			<li>W szczególności rozpocznij nacięcie w dolnym punkcie linii środkowej brzucha, nie uszkadzając narządów wewnętrznych, i przesuwaj się na obie strony po przekątnej w kierunku żeber, przecinając je do górnych poziomów jamy klatki piersiowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyciągnij jelita i umieść je na zewnątrz zwierzęcia po prawej stronie eksperymentatora, aby odsłonić żyłę wrotną.</li>
		<li>Wprowadzić igłę o wadze 30 g, podłączoną do pompy perystaltycznej, do żyły wrotnej rostralnej do żyły śledziony.</li>
		<li>Przeciąć żyłę główną dolną powyżej przepony, aby umożliwić drenaż i zebranie perfuzatu z jamy klatki piersiowej.</li>
		<li>Włączyć pompę perystaltyczną z prędkością około 3 ml/min i delikatnie pobrać pierwsze 3 ml perfuzatu zanieczyszczonego krwią z kałuży klatki piersiowej.</li>
		<li>Odrzuć ten perfuzat. W razie potrzeby powtórz takie mycie ponownie, używając soli fizjologicznej, a dopiero potem zacznij zbierać perfuzat wątroby.</li>
		<li>Ponownie rozpocząć perfuzję z prędkością do 4 ml/min i pobrać 10 ml perfuzatu z jamy klatki piersiowej za pomocą motylka podłączonego do strzykawki.</li>
		<li>Zakończ perfuzję, gdy kolor wątroby zmieni się na jasnobrązowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja leukocytów
	<ol>
		<li>Odwirować perfuzat przez 10 minut przy 400 x g.</li>
		<li>Odessać supernatant.</li>
		<li>Dodać 10 ml PBS, odwirować przy 400 x g przez 10 minut i odessać supernatant W oparciu o cele badania, należy zastosować preparat w takiej postaci, w jakiej jest, lub przeprowadzić dodatkowe oczyszczanie (np. separację w gradinie gęstości).
		<ol>
			<li>W szczególności co 4 ml perfuzatu nakładać na 4 ml masy separacyjnej o gradiencie gęstości w probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 cm3. Wirować probówki o gramaturze 754 x RT przez 30 minut z odrywaniem.</li>
			<li>Otrzymać warstwy jednojądrzaste na granicy faz separacja-gradient gęstości-supernatant za pomocą ręcznego pipetowania, przemyć w PBS i włożyć do probówki o pojemności 5 ml.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
<li>Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).</li>
<li>Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pit+cell%3A+description+of+a+new+type+of+cell+occurring+in+rat+liver+sinusoids+and+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood.</a> Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).</li>
<li>Vermijlen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+natural+killer+cells+exclusively+kill+splenic%2Fblood+natural+killer-resistant+tumor+cells+by+the+perforin%2Fgranzyme+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway.</a> J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).</li>
<li>Gao, B., Radaeva, S., Park, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+natural+killer+and+natural+killer+T+cells%3A+immunobiology+and+emerging+roles+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases.</a> J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).</li>
<li>Kaneda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-associated+large+granular+lymphocytes%3A+morphological+and+functional+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects.</a> Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).</li>
<li>Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+of+perforin+in+cytolysis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">A central role of perforin in cytolysis?</a> Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).</li>
<li>Kamada, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+carboxypeptidase+and+tryptic+esterase+activities+that+are+complexed+to+proteoglycans+in+the+secretory+granules+of+human+cloned+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells.</a> J Immunol. 142, 609-615 (1989).</li>
<li>Wisse, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+function+of+pit+cells%2C+the+liver-specific+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells.</a> Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).</li>
<li>Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+granular+lymphocytes+or+%26%2334%3Bpit+cells%26%2334%3B+from+rat+liver%3A+isolation%2C+ultrastructural+characterization+and+natural+killer+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Large granular lymphocytes or &#34;pit cells&#34; from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity.</a> Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).</li>
<li>Vanderkerken, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+differentiation+of+hepatic+natural+killer+cells+%28pit+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells).</a> Hepatology. 18, 919-925 (1993).</li>
<li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+adhesion+molecules+in+the+recruitment+of+hepatic+natural+killer+cells+%28pit+cells%29+in+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver.</a> Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).</li>
<li>Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+and+lymphokine-activated+killer+cells+require+granzyme+B+for+the+rapid+induction+of+apoptosis+in+susceptible+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).</li>
<li>Luo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+LFA-1+in+hepatic+NK+cell+%28pit+cell%29-mediated+cytolysis+and+apoptosis+of+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells.</a> J Hepatol. 31, 110-116 (1999).</li>
<li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+mouse+liver-associated+natural+killer+activity+by+biologic+response+modifiers+occurs+largely+via+rapid+recruitment+of+large+granular+lymphocytes+from+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow.</a> J Immunol. 143, 372-378 (1989).</li>
<li>Schluter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastatic+tumor+cell+adhesion+and+extravasation+of+colon+carcinoma+cells+with+different+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential.</a> Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).</li>
<li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+organ-associated+natural+killer+activity+by+biological+response+modifiers.+Isolation+and+characterization+of+large+granular+lymphocytes+from+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver.</a> J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).</li>
<li>Winnock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+liver-associated+lymphocytes+in+patients+with+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis.</a> Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).</li>
<li>Hata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+phenotyping%2C+and+functional+analysis+of+lymphocytes+from+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver.</a> Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).</li>
<li>Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+phenotypically+and+functionally+distinct+subset+of+large+granular+lymphocytes+%28pit+cells%29+in+rat+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids.</a> Hepatology. 12, 70-75 (1990).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona w niniejszym artykule metoda perfuzji wątroby umożliwia selektywne pobieranie i badanie unikalnej populacji leukocytów wątrobowych z marginesem. Komórki NK wątroby, zwane również komórkami PIN3, stanowią charakterystyczną populację komórek NK, które znajdują się w sinusoidach wątroby. Występują u szczurów, myszy17 i u ludzi18,19. W porównaniu z izolowanymi obwodowymi komórkami NK, komórki pit wykazywały wyższą cytotoksyczność wobec docelowych linii komórkowych YAC-1 i CC531<...

Sinusoidy wątroby zawierają liczne podtypy leukocytów o różnych aktywnościach immunologicznych krytycznych dla organizmu. Na przykład komórki NK (Natural Killer) wątroby z marginesacją (MH), znane również jako komórki pit, są scharakteryzowane morfologicznie jako limfocyty o dużych ziarnistych limfocytach (LGL) i funkcjonalnie jako leukocyty o spontanicznej zdolności cytotoksycznej, umożliwiającej oporność wątroby na tworzenie przerzutów nowotworowych przenoszonych przez krew. Celem przedstawionej w niniejszym artykule metody jest umożliwienie selektywnego pozyskiwania leukocytów MH w celu zbadania tej ważnej i unikalnej populacji komórek (i kompartmentu immunologicznego) oraz wyjaśnienia wpływu różnych manipulacji (np. aktywacji immunologicznej) na te specyficzne komórki.
Pomimo niepowodzenia odporności w eliminacji rozwijającego się guza pierwotnego, dowody u pacjentów z rakiem i modelach zwierzęcych wskazują, że układ odpornościowy może kontrolować krążące komórki nowotworowe, mikroprzerzuty i choroby resztkowe poprzez odporność komórkową (CMI). Istnieje jednak wyraźna niespójność między tymi możliwościami in vivo a badaniami in vitro na ludziach i zwierzętach, które wykazują, że większość autologicznych komórek nowotworowych jest odporna na cytotoksyczność przez krążące lub śledzioniczne leukocyty1,2. Niespójność tę można przypisać, przynajmniej częściowo, istnieniu in vivo odrębnej subpopulacji leukocytów, a mianowicie leukocytów wątroby z marginesem (sinusoidami) i ich subpopulacji aktywowanych komórek NK, a mianowicie komórek pit3. Rzeczywiście, niepublikowane dane z naszego laboratorium wskazały, że u szczurów F344 syngeniczne komórki nowotworowe (MADB106), które okazały się odporne na leukocyty krążące i śledzionowe, były lizowane przez komórki MH-NK4. Tak więc komórki nowotworowe, które są rzekomo "oporne" na krążące leukocyty, mogą być kontrolowane przez komórki MH-NK. Warto zauważyć, że u myszy zwiększona aktywność MH-NK jest widoczna dopiero po stymulacji immunologicznej in vivo (np. poprzez zastosowanie Poly I:C lub CpG-C)5.
Komórki NK specyficzne dla wątroby (MH-NK) znajdują się wewnątrz światła sinusoidalnego, przylegając do komórek śródbłonka i komórek Kupffera. Komórki MH-NK charakteryzują się wyłącznie kulistymi, gęstymi granulkami i pęcherzykami z rdzeniempręcikowym 6, które zawierają kwaśną fosfatazę jako enzymy lizosomalne oraz perforynę i granzymy jako substancje bioaktywne7,8. W porównaniu z krążącymi komórkami NK, komórki MH-NK wykazują większą liczbę i wielkość granulek i pęcherzyków9-11. W warunkach zapalnych wykazano, że komórki MH-NK wykazują wyższą ekspresję LFA-112 w porównaniu z krążącymi komórkami NK. Ta zwiększona ekspresja może stanowić mechanizm, dzięki któremu komórki MH-NK są bardziej cytotoksyczne wobec niektórych komórek nowotworowych niż krążące komórki NK 13,14. Co ciekawe, po inkubacji in vitro z interleukiną (IL)-2, komórki MH-NK ulegają powiększeniu, a ich liczba i rozmiar granulek wzrastają, z których wszystkie są zgodne z profilem komórek zabójcy aktywowanych limfokiną (LAK)15.
Aktywne leukocyty MH nie mogą być uzyskane wyłącznie za pomocą standardowych metod pozyskiwania leukocytów wątrobowych, które opierają się na mieleniu i biologicznej degradacji tkanki. Nasze podejście perfuzyjne opisane w niniejszym dokumencie ma dwie główne zalety w porównaniu z podejściami standardowymi. Po pierwsze, podejście perfuzyjne selektywnie zbiera leukocyty MH, zapobiegając zanieczyszczeniu przez inne leukocyty z innych przedziałów wątroby. Po drugie, technika perfuzji lepiej zachowuje integralność, aktywność i środowisko fizjologiczne leukocytów MH, w przeciwieństwie do podejść do przetwarzania tkanek, które uszkadzają komórki lub zmieniają ich morfologię, a z powodu uszkodzenia tkanek indukują uwalnianie różnych czynników, które wyraźnie modulują aktywność immunologiczną.
Wątroba jest głównym organem docelowym dla przerzutów nowotworowych i różnych infekcji16. Ponieważ komórki MH wykazują unikalne cechy, ważne jest, aby badać tę specyficzną populację w różnych warunkach w odniesieniu do tych patologii. Na przykład warto zauważyć, że wykazano, że ogólnoustrojowa aktywacja immunologiczna przez różne BRM (np. poli I:C lub CpG-C) aktywuje MH-leukocyty bardziej niż krążące leukocyty5.

<table><tbody><tr><td>Autoclud Pompa</td><td></td><td></td><td></td>perystaltyczna</tr><tr><td>Igła motylkowa</td><td>OMG</td><td></td><td>26 G</td></tr><tr><td>Igła motylkowa</td><td>OMG</td><td></td><td>21 G*3/4"</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>roztwór</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>roztwór</td><td></td><td>2,5 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>roztwór</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Roztwór</td><td></td> <td>10 ml</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Roztwór</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr>Kleszcze <td></td><td></td><td></td>o<td>krawędziach</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hemostat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td>do tkanek</tr><tr><td>22 W Fluorescencyjna lampa</td><td></td><td></td><td></td> lupa do światła dziennego</tr></tbody></table>

selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesami

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Wykazano, że klasa <p='jove_content'>Leukocyty wątroby z marginesem (MH) (leukocyty przylegające do sinusoid wątroby) wykazują unikalny skład i cechy w porównaniu z leukocytami innych kompartmentów immunologicznych. W szczególności dowody sugerują wyraźny profil pro- i przeciwzapalny populacji MH-leukocytów oraz wyższą cytotoksyczność komórek NK specyficznych dla wątroby (a mianowicie komórek pit) w porównaniu z krążącymi lub śledzionowymi immunocytami zarówno u myszy, jak i szczurów. Przedstawiona metoda umożliwia selektywne pobieranie leukocytów MH poprzez wymuszoną perfuzję wątroby u myszy i szczurów. W przeciwieństwie do innych metod stosowanych do ekstrakcji leukocytów wątroby, w tym rozdrabniania tkanek i degradacji biologicznej, ta metoda daje wyłącznie leukocyty z sinusoid wątroby, niezanieczyszczone komórkami z innych przedziałów wątrobowych. Ponadto technika perfuzji lepiej zachowuje integralność i środowisko fizjologiczne leukocytów MH, oszczędzając znane reakcje fizjologiczne na przetwarzanie tkankowe. Ponieważ wiele krążących komórek nowotworowych i zakażonych komórek jest zatrzymywanych podczas przechodzenia przez sinusoidy wątroby, fizycznie oddziałując z komórkami śródbłonka i leukocytami rezydentnymi, unikalna populacja leukocytów MH jest strategicznie zlokalizowana, aby wchodzić w interakcje, identyfikować i reagować na nieprawidłowe krążące komórki. Tak więc selektywne zbieranie MH-leukocytów i ich badanie w różnych warunkach może pogłębić nasze zrozumienie biologicznego i klinicznego znaczenia leukocytów MH, szczególnie w odniesieniu do krążących nieprawidłowych komórek i chorób związanych z wątrobą oraz przerzutów nowotworowych.

U szczurów F344 porównaliśmy cytotoksyczność komórek MH-NK (pozyskanych z zatok wątrobowych poprzez wymuszoną perfuzję wątroby) z cytotoksycznością całej populacji komórek wątroby po mechanicznym rozcieraniu tkanki wątrobowej oraz z cytotoksycznością krążących leukocytów. Wszystkie preparaty komórkowe przemyto co najmniej 3 razy, zgodnie z rutyną w badaniach immunologicznych, a jako linie komórek docelowych wykorzystano allogeniczną linię YAC-1 lub syngeniczną linię MADB106. Jak wskazano ...

Margining-hepatic leukocyty wykazują unikalne cechy i odrębne funkcje immunologiczne w porównaniu z innymi populacjami leukocytów. Tutaj opisujemy metodę selektywnego pobierania tej specyficznej populacji komórek wątroby poprzez wymuszoną perfuzję wątroby szczurów lub myszy. Leukocyty wątroby z marginesem wydają się mieć kluczowe znaczenie w określaniu podatności na choroby wątrobowe i przerzuty.

Selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesami

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest selektywne pozyskanie margynujących leukocytów wątrobowych — komórek odpornościowych przylegających do zatok wątrobowych — poprzez wymuszoną perfuzję wątrób mysich lub szczurzych. Metoda ta pozwala na badanie leukocytów wątrobowych, które wykazują unikalne cechy i odmienne funkcje immunologiczne w porównaniu do innych populacji leukocytów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na uzyskanie leukocytów pochodzących wyłącznie z zatok wątrobowych, bez zanieczyszczenia komórkami z innych obszarów wątroby, takich jak miąższ.Procedurę zademonstrują Liat Sorski i Lee Shaashua, dwaj wybitni studenci studiów doktoranckich z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury perfuzji wątroby przepłucz linie pompy perystaltycznej oraz igły motylkowe heparynowanym PBS, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Następnie, niezwłocznie po ustaniu oddechu, użyj sterylnych nożyczek i pęsety tkankowej do wykonania cięcia w linii środkowej brzucha, zaczynając od dolnej części brzucha uśpionego szczura aż do wyrostka mieczowatego, dbając o to, aby nie uszkodzić narządów wewnętrznych.Następnie, używając pęsety, unieś mostek i ostrożnie przetnij przeponę oraz klatkę piersiową po obu stronach. Zaciśnij kleszczyki hemostatyczne na mostku i odgnij klatkę piersiową w kierunku rostralnym, aby odsłonić kompleks sercowo-płucny. Następnie przygotuj igłę motylkową o rozmiarze 21 G podłączoną do strzykawki o pojemności 10 ml i wprowadź ją do prawej komory serca.Następnie za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml należy pobrać jak największą ilość krwi. Po pobraniu całej krwi należy użyć kleszczyków hemostatycznych, aby zacisnąć tylną część żyły głównej tak blisko serca, jak to możliwe. Następnie należy przesunąć jelita z jamy brzusznej na lewą stronę zwierzęcia, aby odsłonić żyłę wrotną.Następnie należy przygotować cewnik do infuzji żylnej IV o rozmiarze 25G, podłączyć go do rury odpływowej pompy perystaltycznej i wprowadzić do żyły wrotnej tak ogonowo, jak to możliwe, pozostając jednocześnie rostralnie względem żyły śledzionowej. Następnie należy przygotować igłę motylkową o rozmiarze 21G połączoną z strzykawką o pojemności 5 mL i wprowadzić ją do żyły głównej dolnej, ogonowo od zacisku hemostatycznego. Uruchomić pompę perystaltyczną z prędkością około 3 mL/min i zebrać pierwsze mililitry perfuzatu zanieczyszczonego krwią do strzykawki.Zamień strzykawkę do pobierania o pojemności pięciu mililitrów na strzykawkę do pobierania o pojemności 20 mililitrów, nie zatrzymując pompy, gdy perfuzat przybierze bladoróżowy kolor. Następnie pobierz co najmniej 20 mililitrów perfuzatu wątroby z prędkością siedmiu mililitrów na minutę. Gdy cała wątroba stanie się jasnobrązowa, zakończ perfuzję.Następnie odwiruj perfuzat i odessij supernatant. Aby pobrać obrzeżne leukocyty wątrobowe myszy, natychmiast po ustaniu oddychania użyj sterylnych nożyczek i pęsety tkankowej, aby wykonać nacięcie w linii pośrodkowej brzucha aż do wyrostka mieczowatego. Następnie za pomocą pęsety unieś mostek i ostrożnie przetnij przeponę oraz klatkę piersiową po obu stronach.Zaciśnij kleszczyki hemostatyczne na mostku i odchyl klatkę piersiową w stronę rostralną, aby odsłonić kompleks sercowo-płucny. Przesuń jelita poza jamę brzuszną na lewą stronę zwierzęcia, odsłaniając żyłę wrotną. Następnie podłącz igłę 30 G do pompy perystaltycznej i wprowadź ją do żyły wrotnej w miejscu rostralnie względem żyły śledzionowej.Przetnij żyłę główną dolną powyżej przepony, aby umożliwić drenaż i pobranie perfuzatu z jam klatki piersiowej. Następnie włącz pompę perystaltyczną z prędkością około 3 ml/min i pobierz pierwsze mililitry zanieczyszczonego krwią perfuzatu z puli w jamie klatki piersiowej. Po zebraniu 3 ml wyłącz pompę.Następnie, po wprowadzeniu igły motylkowej o rozmiarze 21 G połączonej z strzykawką 10 ml, ponownie rozpocznij perfuzję z prędkością do 4 ml/min, aż do momentu zebrania 10 ml perfuzatu z jamy klatki piersiowej. Gdy wątroba nabierze jasnobrązowego koloru, przerwij perfuzję. Następnie przenieś perfuzat do probówki o pojemności 15 ml.Odwiruj próbkę w wirówce, a następnie odessaj supernatant. Podczas gdy margynujące komórki NK wątroby wykazują silną cytotoksyczność wobec allogenicznych linii komórek docelowych, zarówno cała populacja komórek wątroby, jak i krążące leukocyty wykazują znacznie niższy poziom cytotoksyczności i niemal całkowity brak aktywności zabijania w stosunku do syngeneicznej linii komórek docelowych.Podobnie niskie poziomy cytotoksyczności są widoczne, gdy mechanicznie przetwarzona wątroba poddawana jest przemywaniu i separacji w gradiencie gęstości. Analiza faktów dotyczących specyficznych populacji leukocytów ujawnia głębokie różnice w składzie populacji komórek odpornościowych z przedziałów krążących i wątrobowych. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu kilku minut, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo.Po przeprowadzeniu tej procedury komórki można wykorzystać do cytometrii przepływowej, PCR lub innych metod charakterystyki tej ważnej populacji leukocytów. Technika ta umożliwia selektywne pozyskiwanie leukocytów margynujących w wątrobie, co pozwala na pogłębienie wiedzy na temat ich znaczenia biologicznego i klinicznego. W szczególności spodziewamy się kontroli nad krążącymi komórkami aberracyjnymi oraz chorobami wątroby.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób izolacji leukocyto-hepatycznych.

selective-harvesting-of-marginating-hepatic-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano nową metodę pozyskiwania makrofagów z hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura. Metoda ta wykorzystuje proliferację makrofagów w hodowli, a następnie wstrząsanie kolb z kulturą i oczyszczanie poprzez selektywną adhezję do plastikowych naczyń. Technika ta pozwala na wydajne pozyskanie makrofagów wątrobowych bez konieczności stosowania złożonego sprzętu i specjalistycznych umiejętności.

Prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników

Ten film opisuje metodę przestrzennego rozdzielania trzech subpopulacji komórek białaczkowych: zawieszonych komórek białaczkowych swobodnie unoszących się w pożywce, jasnych komórek białaczkowych przylegających do powierzchni monowarstwy komórek mezenchymalnych zrębu oraz komórek białaczkowych ciemnych fazowo, które wyemigrowały pod monowarstwę mezenchymalnych komórek zrębu z kohodowli 2D.

Żniwa subpopulacji białaczkowej: metoda przestrzennego oddzielania subpopulacji komórek białaczkowych od kokultury 2D

W tym filmie pokazujemy izolację leukocytów wątrobowych z wątroby myszy za pomocą wymuszonej perfuzji.

Izolacja marginesujących leukocytów wątrobowych z wątroby myszy

Ten film pokazuje izolację limfocytów, w tym komórek NK lub komórek NK, z ludzkiej tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji. Trawienie enzymatyczne i mechaniczne, po którym następuje separacja w gradieniu gęstości, sprzyja izolacji limfocytów, w tym komórek NK. Pobrane limfocyty mogą być dalej wykorzystywane do selektywnej ekspansji komórek NK.

Izolacja komórek NK z tkanki wątroby w celu selektywnej ekspansji

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Marginating-pulmonary leukocyty wykazują unikalne cechy i odrębne funkcje immunologiczne w porównaniu z innymi populacjami leukocytów. Tutaj opisujemy selektywne zbieranie tej subpopulacji leukocytów płucnych poprzez wymuszoną perfuzję płuc u szczurów i myszy. Leukocyty płucne z marginesem wydają się mieć kluczowe znaczenie w określaniu podatności na choroby krwiopochodne i płucne.

Selektywne pobieranie leukocytów płucnych z marginesem

Urazom wątroby towarzyszy ekspansja komórek progenitorowych, które reprezentują niejednorodną populację komórek. Nowatorska klasyfikacja tego przedziału komórkowego pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów. Opisana tutaj metoda ilustruje analizę cytometrii przepływowej i izolację różnych podzbiorów o wysokiej czystości, które można wykorzystać do dalszych testów.

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Celem tego protokołu jest identyfikacja populacji komórek śródbłonka limfatycznego w wątrobie za pomocą opisanych markerów. Wykorzystujemy kolagenazę IV i DNazę oraz delikatne mielenie tkanki w połączeniu z cytometrią przepływową, aby zidentyfikować odrębną populację komórek śródbłonka limfatycznego.

Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.

Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Komórki śródbłonka limfatycznego (LLEC), niedawno zidentyfikowany typ komórek wewnątrzczaszkowych, mają słabo poznane funkcje. W badaniu przedstawiono powtarzalny protokół zbierania LLEC od myszy i tworzenia kultur pierwotnych in vitro. Protokół ten ma na celu umożliwienie naukowcom zagłębienia się w funkcje komórkowe i potencjalne implikacje kliniczne LLEC.

Zbiór i pierwotna hodowla komórek śródbłonka limfatycznego opon mózgowo-rdzeniowych

Poznaj metodę selektywnego pobierania leukocytów wątrobowych z marginesów przez wymuszoną perfuzję wątroby szczura lub myszy. Technika ta pozwala izolować komórki odpornościowe bez zanieczyszczeń z innych przedziałów wątroby.

Selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesami

Przeglądaj więcej filmów