Name: Różnicowanie kardiomiocytów przedsionkowych od pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą antagonisty BMP Grem2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj protokół różnicowania kardiomiocytów przedsionkowych z mysich komórek macierzystych mESC przy użyciu czynnika Grem2. Ta metoda zapewnia jednorodne populacje komórek do badań nad arytmiami i rozwojem serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH HL083958 i HL100398 (A.K.H.) oraz 2T32HL007411-33 "Program in Cardiovascular Mechanisms: Training in Investigation" (J.B.).

<ol><li>Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+differentiation+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hepatic differentiation of pluripotent stem cells.</a> Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).</li>
<li>Narazaki, G., Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+and+systematic+differentiation+of+cardiovascular+cells+from+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., Pak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li>
<li>Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+as+models+of+trophoblast+differentiation%3A+progress%2C+opportunities%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations.</a> Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).</li>
<li>Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+Into+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).</li>
<li>Burridge, P. W., Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).</li>
<li>Cai, C. L., Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isl1+Identifies+a+cardiac+progenitor+population+that+proliferates+prior+to+differentiation+and+contributes+a+majority+of+cells+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart.</a> Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).</li>
<li>Fujiwara, M., Yan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+enhancement+of+cardiac+cell+differentiation+from+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+Cyclosporin-A%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A.</a> PLoS ONE. 6 (2), e16734(2011).</li>
<li>Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+antagonism+by+Dkk1+counter+activates+canonical+wnt+signaling+and+promotes+cardiomyocyte+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Lian, X., Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Klos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gremlin+2+promotes+differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+atrial+fate+by+activation+of+the+JNK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway.</a> Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).</li>
<li>Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Müller, I. I., Melville, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modeling+in+zebrafish+demonstrates+that+the+atrial-fibrillation-associated+gene+GREM2+regulates+cardiac+laterality%2C+cardiomyocyte+differentiation+and+atrial+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).</li>
<li>Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+protein+related+to+DAN+and+cerberus+%28PRDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC).</a> Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).</li>
<li>Schulz, H., Kolde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FunGenES+Database%3A+A+genomics+resource+for+mouse+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS ONE. 4 (9), e6804(2009).</li>
<li>Phosphate-buffered saline (PBS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+Real-Time+quantitative+PCR+and+the+2%E2%88%92%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egr-1+regulates+expression+of+the+glial+scar+component+phosphacan+in+astrocytes+after+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke.</a> American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).</li>
<li>Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).</li>
<li>Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%B6pfl%2C+G+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. , 254-279 (2004).</li>
<li>Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mouse+embryonic+stem+cell+based+assay+for+quantifying+cardiogenic+Induction+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li>
<li>Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAntonchuk%2C+J+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22">Basic Cell Culture Protocols</a>. 946, 523-533 (2013).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
</ol>

Autorzy tego manuskryptu nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten rutynowo wytwarza kultury z wysokim odsetkiem CM, które są charakterystyczne dla linii przedsionkowej. Podobnie jak w przypadku każdego protokołu różnicowania, należy zwrócić szczególną uwagę na jakość mESC przed różnicowaniem. mESC powinny być rutynowo monitorowane pod kątem prawidłowej morfologii (ryc. 1A). Jakiekolwiek spontaniczne różnicowanie, które występuje przed utworzeniem EB, poważnie ograniczy skuteczność kardiogenezy i powinno zostać usunięte przed pasażowaniem (ryc. 1B</...

Pluripotencjalne komórki macierzyste są potężnym narzędziem do generowania i badania komórek z wielu trudno dostępnych tkanek do badań podstawowych i przedklinicznych, szczególnie u ludziw wieku 1-5 lat. Właściwa modulacja rozwojowych szlaków sygnałowych może skierować różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do pożądanego losu fenotypowego. Opracowano wiele protokołów generowania kardiomiocytów (CM) z pluripotencjalnych komórek macierzystych6-14. Protokoły te na ogół obejmują modulację nadrodziny TFGβ (aktywina, BMP i TGFβ) i szlaków Wnt poprzez czasowe dodawanie egzogennych czynników wzrostu i / lub małych cząsteczek10,12-15. Protokoły te są na ogół skuteczne w zwiększaniu odsetka komórek, które stają się CM, ale brakuje im swoistości, generując mieszaną populację komórek reprezentujących linie układu przedsionkowego, komorowego i węzłowego/przewodzącego. W celu zbadania określonych podtypów serca konieczne jest bardziej ukierunkowane podejście różnicujące.
Gremlin2 (Grem2, zwany także Białko Związane z Dan i Cerberusem lub w skrócie PRDC) jest wydzielanym antagonistą BMP, który jest niezbędny do prawidłowego różnicowania serca i tworzenia komory przedsionkowej podczas rozwoju serca u danio pręgowanego16. Traktowanie różnicujących się embrionalnych komórek macierzystych Grem2 w 4 dniu różnicowania, tuż po szczytowej ekspresji mezodermalnych markerów T-Brachyury i Cerberus takich jak 1, zwiększa wydajność CM i generuje pulę komórek głównie linii przedsionkowej14.
Rekombinowany Grem2 jest używany do leczenia różnicujących się komórek i może być wytwarzany przy użyciu standardowych technik produkcji białek17 lub może być zakupiony komercyjnie. Jest dobrze rozpuszczalny w roztworach wodnych i może być dodawany egzogennie do kultur w pożądanym punkcie czasowym.
Różnicowanie można śledzić za pomocą RT-qPCR do ilościowego określenia ekspresji markerów reprezentatywnych dla komórek progenitorowych układu sercowo-naczyniowego, progenitorów sercowych i zaangażowanych CMs. Immunofluorescencja może być również wykorzystana do identyfikacji i wizualizacji przestrzennego rozmieszczenia typów komórek serca.
Aplikacje, które wymagają czystych populacji, są łatwiej realizowane, gdy używa się systemu reporterowego do identyfikacji i izolowania CM. W tym celu wprowadziliśmy konstrukt αMHC-DsRedNuc do mysiej linii komórkowejCGR8 ES 14. Komórki CGR8 rosną i pozostają pluripotencjalne bez komórek zasilających, co ułatwia testy ekspansji i różnicowania18. Linia komórkowa ES zawiera sekwencję kodującą białko fluorescencyjne DSR z sygnałem lokalizacji jądrowej pod specyficznym dla serca promotorem genu łańcucha ciężkiego alfa miozyny (αMhc lub Myh6). Korzystając z tych komórek, CM można łatwo zidentyfikować i wyizolować w celu oceny ilościowej, sortowania komórek, elektrofizjologii, badań przesiewowych leków i badania mechanizmów różnicowania przedsionków.

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Sigma</td><td>I3390</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Płytki do hodowli tkankowych</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Bakteryjne szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Bakteryjne szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko Gremlin 2</td><td>R& Amp; D Systems</td><td>2069-PR-050</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne jednostki filtrujące</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna (ze skóry wieprzowej)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS, Sterylna</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>0,05% roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie kardiomiocytów przedsionkowych od pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą antagonisty bmp grem2

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Opracowano protokoły generowania populacji kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych, ale zazwyczaj dają one komórki o mieszanych fenotypach. Naukowcy zainteresowani prowadzeniem badań obejmujących określone podtypy miocytów wymagają bardziej ukierunkowanego podejścia różnicującego. Poprzez traktowanie mysich embrionalnych komórek macierzystych (ES) Grem2, wydzielanym antagonistą BMP, który jest niezbędny do tworzenia komory przedsionkowej in vivo, można wygenerować dużą liczbę komórek serca o fenotypie przedsionkowym. Zastosowanie zmodyfikowanej linii pluripotencjalnych komórek macierzystych Myh6-DSRed-Nuc pozwala na identyfikację, selekcję i oczyszczanie kardiomiocytów. W tym protokole ciała zarodkowe są generowane z komórek Myh6-DSRed-Nuc przy użyciu metody wiszącej kropli i utrzymywane w zawieszeniu do 4 dnia różnicowania (d4). W d4 komórki są traktowane Grem2 i powlekane na płytkach pokrytych żelatyną. Pomiędzy k8-d10 w kulturach obserwuje się duże obszary kurczenia się, które kontynuują ekspansję i dojrzewanie do d14. Analizy molekularne, histologiczne i elektrofizjologiczne wskazują, że komórki w komórkach poddanych działaniu Grem2 uzyskują cechy podobne do przedsionków, zapewniając model in vitro do badania biologii kardiomiocytów przedsionkowych i ich odpowiedzi na różne czynniki farmakologiczne.

Przed różnicowaniem pluripotencjalne komórki macierzyste powinny być zwarte i wolne od spontanicznego różnicowania. Komórki przedstawione na Rysunku 1A są gotowe do dysocjacji i wykorzystania w metodzie wiszących kropel, zgodnie z opisem w punkcie 5.1 sekcji protokołu. Komórki przedstawione na Rysunku 1B ulegają spontanicznemu różnicowaniu i nie powinny być stosowane do przygotowania wiszących kropel.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa...

Generowanie kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych in vitro umożliwia dostęp do dużych ilości tkanki serca in vitro dla nauk podstawowych i zastosowań klinicznych. Protokół ten wykorzystuje czynnik przedsionkowy Grem2 zarówno do zwiększenia liczby uzyskanych kardiomiocytów, jak i do wytworzenia kardiomiocytów o fenotypie przedsionkowym.

Różnicowanie kardiomiocytów przedsionkowych od pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą antagonisty BMP Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Ogólnym celem tego protokołu różnicowania jest wygenerowanie jednorodnych populacji kardiomiocytów przedsionkowych w hodowli. Tak więc ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad rozwojem serca i chorobami serca, takimi jak arytmia przedsionków. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że wytwarza ona jednorodne kultury kardiomiocytów przedsionkowych in vitro i że można to zrobić przy minimalnym treningu.Do czterech dni przed założeniem embrionalnych komórek macierzystych myszy lub kultur mESC, należy zakodować 10-centymetrowe szalki tkankowe z 5 mililitrami 0,2% roztworu żelatyny każda, w sześciu dołkach z 1 mililitrem żelatyny na studzienkę w wysterylizowanym kapturze do hodowli tkankowych. W dniu hodowli usuń nadmiar roztworu żelatyny i dodaj 10 mililitrów pożywki do jednej z 10-centymetrowych naczyń pokrytych żelatyną. Następnie użyj kriotongu, aby delikatnie zawirować fiolkę od 1 razy 10 do 6 mESC w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż w środku fiolki pozostanie tylko mały kryształek lodu.Osusz fiolkę jednorazową, niestrzępiącą się chusteczką i wysterylizuj ją 70% etanolem. Następnie umieść fiolkę w kapturze do hodowli tkankowych i użyj pipety P1000, aby dodać ESC do naczynia. Umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych z wilgotnością 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i delikatnie przesuwaj płytkę od przodu do tyłu i z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić komórki.Pod koniec inkubacji użyj mikroskopu jasnego pola, aby potwierdzić przyczepienie komórek. Będą obserwowane niektóre szczątki i martwe komórki. Zastąp pożywkę 10 mililitrami świeżej pożywki mESC i włóż komórki z powrotem do inkubatora.Gdy kultura jest w 60 do 70% zlewna, przepłucz płytkę 5 mililitrami sterylnego DPBS bez magnezu i wapnia i inkubuj komórki w 2 mililitrach trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Podczas inkubacji komórek odessaj nadmiar roztworu żelatyny z jednego nowego 10-centymetrowego naczynia na pasażowaną kulturę i dodaj 10 mililitrów pożywki do każdej płytki. Następnie zbierz oderwane komórki przez odwirowanie w 15-mililitrowej probówce i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach pożywki mESC.W zależności od pożądanego współczynnika podziału, dodaj od 0,5 do 1 mililitra zawiesiny komórek do każdej 10-centymetrowej płytki i włóż komórki z powrotem do inkubatora, delikatnie rozprowadzając komórki w każdym naczyniu, jak pokazano. Gdy pasażowane komórki zlewają się w 70%, odłącz je za pomocą trypsyny EDTA, jak właśnie pokazano, a następnie ponownie zawieś zawiesinę pojedynczej komórki w 5 mililitrach ciała zarodka lub pożywki EB. Policz mESC, a następnie rozcieńcz je w odpowiedniej objętości pożywki EB do końcowego stężenia 2,5 razy 10 do 3 komórek na mililitr.Następnie dodaj 2 mililitry PBS na dno jednej sterylnej 10-centymetrowej bakteryjnej szalki Petriego na wiszącą kulturę kroplową i przenieś zawiesinę EB do sterylnego miski na roztwór. Teraz zdejmij pokrywkę z jednego z przygotowanych naczyń i za pomocą wielokanałowej pipety, wyposażonej w sześć końcówek, ostrożnie nanieś 60 20-mikrolitrowych kropli zawiesiny EB na wewnętrzną powierzchnię. Delikatnie umieść pokrywkę z powrotem na naczyniu, uważając, aby nie usunąć wiszących kropli i umieść szalki w inkubatorze do hodowli komórkowych na dwa dni.Aby umyć EB'ss, ostrożnie zdejmij pokrywkę z wiszącej kultury kroplowej i przechyl ją pod kątem 45 stopni. Następnie, za pomocą 5-mililitrowej pipety serologicznej zawierającej pożywkę EB o temperaturze pokojowej, delikatnie umyj EB w kałuży na dnie pokrywki. Dokładnie sprawdź pokrywkę pod kątem EB, które przykleiły się do powierzchni, a następnie przenieś EB na niepowlekaną, 6-centymetrową szalkę Petriego.Umieść EB z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych na kolejne dwa dni, codziennie sprawdzając płytki pod kątem agregacji i przyłączenia EB. Przed posiewem EB należy zastąpić nadmiar żelatynowego roztworu powlekającego w każdym dołku przygotowanej sześciodołkowej płytki 2 mililitrami świeżo przygotowanego podłoża Grem2 o temperaturze pokojowej. Następnie użyj pipety P1000 ustawionej na 100 mikrolitrów, aby przenieść 30 EB do każdej studzienki, a następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora na noc, równomiernie rozpraszając komórki delikatnym ruchem, jak pokazano.Po przyczepieniu się EB do dna studzienek, wymieniaj pożywkę Grem2 co dwa dni do 10 dnia. Następnie co dwa dni karmić komórki świeżą pożywką EB, aby utrzymać zdrową hodowlę komórkową. Przed hodowlą w postaci kropli do zawieszania pluripotencjalne komórki macierzyste powinny być zwarte i wolne od spontanicznego różnicowania.Jeśli obserwuje się spontaniczne różnicowanie, komórki nie powinny być używane w hodowlach wiszących kropli. Jakość EB jest na ogół najlepiej formowana w równomiernie rozmieszczonych, dobrze zaokrąglonych wiszących kroplach. Do drugiego dnia różnicowania EB powinny być widoczne gołym okiem, jako kuliste układy różnicujących się komórek macierzystych na końcach zwisających kropli.W czwartym dniu dobrze uformowane EB powinny być swobodnie pływające i jednorodne pod względem wielkości i kształtu. Po platerowaniu EB spłaszczają się, gdy komórki migrują z EB na powierzchnię płytki hodowli tkankowej, jak zaobserwowano tutaj w ósmym i dziesiątym dniu różnicowania. W nieleczonych studzienkach kontrolnych małe, powoli kurczące się plamy obserwuje się już w szóstym dniu i dopiero w dziewiątym dniu.Podczas gdy w studniach traktowanych Grem2 powszechne są duże plamy o stosunkowo szybkim tempie kurczenia się. Analiza RT-QPCR ekspresji genów w zróżnicowanych komórkach zazwyczaj ujawnia wysoki poziom genów strukturalnych i regulatorowych serca w hodowlach poddanych działaniu Grem2. Jeśli stosuje się linię komórek jądrowych alfa-MHC DsRed, zwiększoną wydajność kardiomiocytów obserwuje się jako większą liczbę jąder znakowanych DsRed w studzienkach traktowanych Grem2.Leczenie Grem2 powoduje również różnicowanie w kierunku fenotypu podobnego do przedsionkowego, co potwierdzają pomiary RT-QPCR i patch clamp czasu trwania potencjału czynnościowego komórkowego. Po opanowaniu, różnicujące się komórki macierzyste można poddać leczeniu Grem2 w ciągu zaledwie 60 minut, a komórki perełkowe są zwykle obserwowane już w siódmym dniu. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o konsekwentnym dodawaniu Grem2 w czwartym dniu po szczytowej ekspresji markerów gastrulacji, takich jak brachyury.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak elektrofizjologia i QPCR, aby zrozumieć cechy funkcjonalne i molekularne wygenerowanych komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować kardiomiocyty przedsionkowe z mysich ESC za pomocą Grem2.

differentiation-atrial-cardiomyocytes-from-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

W tym protokole zostanie zilustrowane pochodzenie komórek progenitorowych serca zarówno z mysich, jak i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Główną strategią w tym protokole jest wzbogacenie komórek progenitorowych serca za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluorescencyjnych reporterów zmodyfikowanych w embrionalnych liniach komórek macierzystych.

Wyprowadzenie komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy solidny, szybki i skalowalny protokół różnicowania kardiomiocytów dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Kardiomiocyty uzyskane przy użyciu tej metody na dużą skalę mogą zapewnić wystarczającą liczbę komórek do ich skutecznego wykorzystania w modelowaniu chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i potencjalnie zastosowaniach klinicznych.

Produkcja kardiomiocytów na dużą skalę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wysoce powtarzalnego protokołu różnicowania opartego na małych cząsteczkach

Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół generowania i kwantyfikacji różnych przeprogramowanych podtypów serca przy użyciu retrowirusowego dostarczania Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 za pośrednictwem retrowirusa.

Ocena podtypów kardiomiocytów po przeprogramowaniu fibroblastów embrionalnych myszy za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Celem tej metody jest generowanie in vitro komórek progenitorowych serca specyficznych dla pola serca w celu zbadania specyfikacji komórek progenitorowych i właściwości funkcjonalnych, a także generowanie komórek serca specyficznych dla komory do modelowania chorób serca.

Wytwarzanie in vitro komórek progenitorowych serca specyficznych dla pola serca

Ta metoda może być użyta do zbadania skrócenia sarkomeru za pomocą kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych z fluorescencyjnie znakowanymi białkami sarkomerowymi.

Sarkomerowe skracanie pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie białek sarkomerowych.

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

Poznaj protokół różnicowania kardiomiocytów przedsionkowych z mysich komórek macierzystych mESC przy użyciu czynnika Grem2. Ta metoda zapewnia jednorodne populacje komórek do badań nad arytmiami i rozwojem serca.

Różnicowanie kardiomiocytów przedsionkowych od pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą antagonisty BMP Grem2

Przeglądaj więcej filmów