Różnicowanie kardiomiocytów przedsionkowych od pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą antagonisty BMP Grem2

Ogólnym celem tego protokołu różnicowania jest wygenerowanie jednorodnych populacji kardiomiocytów przedsionkowych w hodowli. Tak więc ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad rozwojem serca i chorobami serca, takimi jak arytmia przedsionków. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że wytwarza ona jednorodne kultury kardiomiocytów przedsionkowych in vitro i że można to zrobić przy minimalnym treningu.

Do czterech dni przed założeniem embrionalnych komórek macierzystych myszy lub kultur mESC, należy zakodować 10-centymetrowe szalki tkankowe z 5 mililitrami 0,2% roztworu żelatyny każda, w sześciu dołkach z 1 mililitrem żelatyny na studzienkę w wysterylizowanym kapturze do hodowli tkankowych. W dniu hodowli usuń nadmiar roztworu żelatyny i dodaj 10 mililitrów pożywki do jednej z 10-centymetrowych naczyń pokrytych żelatyną. Następnie użyj kriotongu, aby delikatnie zawirować fiolkę od 1 razy 10 do 6 mESC w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż w środku fiolki pozostanie tylko mały kryształek lodu.

Osusz fiolkę jednorazową, niestrzępiącą się chusteczką i wysterylizuj ją 70% etanolem. Następnie umieść fiolkę w kapturze do hodowli tkankowych i użyj pipety P1000, aby dodać ESC do naczynia. Umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych z wilgotnością 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i delikatnie przesuwaj płytkę od przodu do tyłu i z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić komórki.

Pod koniec inkubacji użyj mikroskopu jasnego pola, aby potwierdzić przyczepienie komórek. Będą obserwowane niektóre szczątki i martwe komórki. Zastąp pożywkę 10 mililitrami świeżej pożywki mESC i włóż komórki z powrotem do inkubatora.

Gdy kultura jest w 60 do 70% zlewna, przepłucz płytkę 5 mililitrami sterylnego DPBS bez magnezu i wapnia i inkubuj komórki w 2 mililitrach trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Podczas inkubacji komórek odessaj nadmiar roztworu żelatyny z jednego nowego 10-centymetrowego naczynia na pasażowaną kulturę i dodaj 10 mililitrów pożywki do każdej płytki. Następnie zbierz oderwane komórki przez odwirowanie w 15-mililitrowej probówce i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach pożywki mESC.

W zależności od pożądanego współczynnika podziału, dodaj od 0,5 do 1 mililitra zawiesiny komórek do każdej 10-centymetrowej płytki i włóż komórki z powrotem do inkubatora, delikatnie rozprowadzając komórki w każdym naczyniu, jak pokazano. Gdy pasażowane komórki zlewają się w 70%, odłącz je za pomocą trypsyny EDTA, jak właśnie pokazano, a następnie ponownie zawieś zawiesinę pojedynczej komórki w 5 mililitrach ciała zarodka lub pożywki EB. Policz mESC, a następnie rozcieńcz je w odpowiedniej objętości pożywki EB do końcowego stężenia 2,5 razy 10 do 3 komórek na mililitr.

Następnie dodaj 2 mililitry PBS na dno jednej sterylnej 10-centymetrowej bakteryjnej szalki Petriego na wiszącą kulturę kroplową i przenieś zawiesinę EB do sterylnego miski na roztwór. Teraz zdejmij pokrywkę z jednego z przygotowanych naczyń i za pomocą wielokanałowej pipety, wyposażonej w sześć końcówek, ostrożnie nanieś 60 20-mikrolitrowych kropli zawiesiny EB na wewnętrzną powierzchnię. Delikatnie umieść pokrywkę z powrotem na naczyniu, uważając, aby nie usunąć wiszących kropli i umieść szalki w inkubatorze do hodowli komórkowych na dwa dni.

Aby umyć EB'ss, ostrożnie zdejmij pokrywkę z wiszącej kultury kroplowej i przechyl ją pod kątem 45 stopni. Następnie, za pomocą 5-mililitrowej pipety serologicznej zawierającej pożywkę EB o temperaturze pokojowej, delikatnie umyj EB w kałuży na dnie pokrywki. Dokładnie sprawdź pokrywkę pod kątem EB, które przykleiły się do powierzchni, a następnie przenieś EB na niepowlekaną, 6-centymetrową szalkę Petriego.

Umieść EB z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych na kolejne dwa dni, codziennie sprawdzając płytki pod kątem agregacji i przyłączenia EB. Przed posiewem EB należy zastąpić nadmiar żelatynowego roztworu powlekającego w każdym dołku przygotowanej sześciodołkowej płytki 2 mililitrami świeżo przygotowanego podłoża Grem2 o temperaturze pokojowej. Następnie użyj pipety P1000 ustawionej na 100 mikrolitrów, aby przenieść 30 EB do każdej studzienki, a następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora na noc, równomiernie rozpraszając komórki delikatnym ruchem, jak pokazano.

Po przyczepieniu się EB do dna studzienek, wymieniaj pożywkę Grem2 co dwa dni do 10 dnia. Następnie co dwa dni karmić komórki świeżą pożywką EB, aby utrzymać zdrową hodowlę komórkową. Przed hodowlą w postaci kropli do zawieszania pluripotencjalne komórki macierzyste powinny być zwarte i wolne od spontanicznego różnicowania.

Jeśli obserwuje się spontaniczne różnicowanie, komórki nie powinny być używane w hodowlach wiszących kropli. Jakość EB jest na ogół najlepiej formowana w równomiernie rozmieszczonych, dobrze zaokrąglonych wiszących kroplach. Do drugiego dnia różnicowania EB powinny być widoczne gołym okiem, jako kuliste układy różnicujących się komórek macierzystych na końcach zwisających kropli.

W czwartym dniu dobrze uformowane EB powinny być swobodnie pływające i jednorodne pod względem wielkości i kształtu. Po platerowaniu EB spłaszczają się, gdy komórki migrują z EB na powierzchnię płytki hodowli tkankowej, jak zaobserwowano tutaj w ósmym i dziesiątym dniu różnicowania. W nieleczonych studzienkach kontrolnych małe, powoli kurczące się plamy obserwuje się już w szóstym dniu i dopiero w dziewiątym dniu.

Podczas gdy w studniach traktowanych Grem2 powszechne są duże plamy o stosunkowo szybkim tempie kurczenia się. Analiza RT-QPCR ekspresji genów w zróżnicowanych komórkach zazwyczaj ujawnia wysoki poziom genów strukturalnych i regulatorowych serca w hodowlach poddanych działaniu Grem2. Jeśli stosuje się linię komórek jądrowych alfa-MHC DsRed, zwiększoną wydajność kardiomiocytów obserwuje się jako większą liczbę jąder znakowanych DsRed w studzienkach traktowanych Grem2.

Leczenie Grem2 powoduje również różnicowanie w kierunku fenotypu podobnego do przedsionkowego, co potwierdzają pomiary RT-QPCR i patch clamp czasu trwania potencjału czynnościowego komórkowego. Po opanowaniu, różnicujące się komórki macierzyste można poddać leczeniu Grem2 w ciągu zaledwie 60 minut, a komórki perełkowe są zwykle obserwowane już w siódmym dniu. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o konsekwentnym dodawaniu Grem2 w czwartym dniu po szczytowej ekspresji markerów gastrulacji, takich jak brachyury.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak elektrofizjologia i QPCR, aby zrozumieć cechy funkcjonalne i molekularne wygenerowanych komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować kardiomiocyty przedsionkowe z mysich ESC za pomocą Grem2.