Name: Wykorzystanie techniki laminowania do wykonania mikroskopii konfokalnej twardówki człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj technikę laminowania do mikroskopii konfokalnej twardówki człowieka. Ta metoda umożliwia badanie rozmieszczenia komórek odpornościowych i statusu naczyniowego w zdrowej oraz patologicznej twardówce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niemiecka Fundacja Badawcza (FOR2240 "(Limfa) angiogeneza i odporność komórkowa w chorobach zapalnych oka" do CC i LMH; HE 6743/2-1 i HE 7643/3-1 do LMH; CU47/6-1 do CC), German Cancer Aid (do LMH i CC), program GEROK Uniwersytet w Kolonii (do SLS i LMH) oraz EU COST BM1302 "Joining Forces to Corneal Regeneration" (do CC).

Stosowanie tkanek ludzkich musi zostać poddane przeglądowi i zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną lub równoważną instytucję. Opisana tutaj praca została zatwierdzona przez lokalną komisję etyczną i uzyskała zgodę na badania naukowe. Prace te zostały wykonane zgodnie z Deklaracją Helsińską. Próbki twardówki ludzkiej pobrano z oczu dawców globusów (maksymalny czas pośmiertny 24 godziny) w Banku Oczu Wydziału Okulistyki Uniwersytetu w Kolonii w Niemczech.
1. Przygotowanie do eksperymentu
<ol>
	<li>Przygotuj 96% etanol i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w różnych probówkach. Przygotować pierwszorzędowe przeciwciała w zalecanym rozcieńczeniu PBS zawierającym 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i utrzymać wszystkie roztwory na lodzie. Przygotować 100 μl na próbkę.</li>
	<li>Wyczyść wszystkie narzędzia i użyj ostrych skalpeli. Po wielokrotnym cięciu tym samym skalpelem należy wymienić skalpel.</li>
	<li>Zaopatrz się w 1-2 kleszczyki do colibri, proste nożyczki do mikropreparowania, skalpel #10 lub mikropióro skalpela okulistycznego i cztery igły 26 G.</li>
	<li>Owiń folię aluminiową wokół płyty polistyrenowej lub użyj płytki korkowej, aby przymocować chusteczkę. Pracuj pod lornetkowym mikroskopem stereoskopowym. W razie potrzeby pracuj sterylnie pod laminarnym przepływem powietrza.</li>
</ol>
2. Przygotuj twardówkę
<ol>
	<li>Delikatnie przytrzymaj bańkę i wykonaj trepanację perforacyjną na części korowo-twardówkowej, a następnie obróć trepan. Obróć trepan ostrożnie i równomiernie na powierzchnię, aby wykonać równie okrągłe cięcie. Użyj trepana o rozmiarze 15.5 mm. Wytnij pozostałe nasadki zakrzywionymi nożyczkami. Usunąć trepanację rogówkowo-twardówkową. Spowoduje to otwarcie żarówki z przodu.
	<ol>
		<li>Połóż twardówkę na waciku otwartą częścią do góry. Usuń siatkówkę i błonę naczyniową oka, używając kleszczyków colibri, aby ściągnąć obie warstwy (siatkówkę i błonę naczyniową oka) z twardówki. Nie pozostawiaj pigmentowanej błony naczyniowej oka na wewnętrznej twardówce. Użyj zakrzywionych nożyczek, aby usunąć siatkówkę i błonę naczyniową oka z brodawki. Usuń pozostałą spojówkę, mięśnie zewnątrzgałkowe i torebkę czopa z twardówki powierzchownej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń próbkę twardówki w wymaganym rozmiarze za pomocą prostych nożyczek i kleszczy colibri. Pobrać próbki twardówkio wielkości około 2 cm z różnych lokalizacji. Ze względu na mały rozmiar, delikatnie przytrzymaj twardówkę i wytnij wymagany rozmiar jako kwadraty za pomocą prostych nożyczek. Trepanacja korneotwardówkowa określa przedni brzeg próbek twardówki.
	<ol>
		<li>Unikaj wielokrotnego chwytania kleszczami, ponieważ obszar, w którym tkanka została złapana, nie nadaje się do analiz mikroskopowych konfokalnych. Przygotować wymaganą liczbę próbek w zależności od rodzaju eksperymentu (np. z przodu lub z tyłu, porównaj rysunek 1) i ilości użytych przeciwciał.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić próbki w probówkach o pojemności 1,5 ml do późniejszego wykorzystania. Utrwalić próbki w 1,5 ml 96% etanolu przez 15 minut, a następnie umyć je trzy razy przez 5 minut w 1,5 ml PBS na wytrząsarce. Jeśli pracujesz z zamrożoną tkanką, wykonaj ten krok przed zamrożeniem.</li>
	<li>Użyj świeżej chusteczki. Jeśli jednak nie jest to możliwe, należy zamrozić twardówkę w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Jeśli pracujesz z zamrożoną tkanką, rozmroź ją przed użyciem. Unikaj powtarzających się cykli rozmrażania i zamrażania.</li>
	<li>Każdą próbkę należy przechowywać w PBS zawierającym 1,5 ml 5% BSA w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Ten etap indukuje pęcznienie próbki, które jest pomocne w laminowaniu, a także zapobiega niespecyficznemu wiązaniu.</li>
	<li>Po spęcznieniu próbek przygotuj kwadraty twardówki do laminowania. Pracuj pod mikroskopem, np. lornetkowym mikroskopem stereoskopowym. Próbki twardówki tylnej części ciała należy przymocować do membrany polistyrenowej owiniętej folią aluminiową lub płytką korkową za pomocą igieł o masie 26 G.</li>
	<li>Zegnij krawędzie igieł, aby nie zakłócały pola widzenia pod mikroskopem.</li>
	<li>Zalaminuj próbki twardówki o pełnej grubości.
	<ol>
		<li>Najpierw przytrzymaj przednią krawędź twardówki za pomocą kleszczyków colibri. Następnie ostrożnie odetnij cienką warstwę powierzchownej twardówki za pomocą skalpela #10, mikropiórka skalpela okulistycznego lub ostrza szpatułki. Trzymaj skalpel poziomo i odetnij powierzchowną warstwę tak cienko, jak to możliwe, od warstwy spodniej.</li>
		<li>Wytnij cienką warstwę twardówki z kwadratu twardówki. Metoda ta jest porównywalna ze standardowymi technikami chirurgicznymi mającymi na celu przygotowanie płata podczas trabekulektomii i powinna skutkować warstwami o grubości 30-80 μm (porównaj ryc. 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapobiegaj wysuszeniu twardówki poprzez dodanie niewielkich ilości PBS do tkanki, np. 50 μl PBS za pomocą pipety.</li>
	<li>Umieść pocięte warstwy w 100 μl PBS na płytce 96-dołkowej i oznacz zarówno orientację (w kierunku zewnętrznym i wewnętrznym), jak i warstwę (powierzchowną i głęboką), np. wodoodpornym kolorem.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 2.7-2.9, aż tkanka zostanie całkowicie laminowana.</li>
</ol>
3. Wykonaj immunohistochemię
<ol>
	<li>Dodać 100 μl wymaganych przeciwciał pierwszorzędowych do zalecanego rozcieńczenia. W tym przypadku należy np. użyć CD 31 (monoklonalny mysi anty człowiek) i przeciwciała LYVE1 (królicze przeciwciało antyludzkie), oba w rozcieńczeniu 1:100 w PBS (zawierającym 2% BSA) i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Aby zmienić pożywkę w płytce 96-dołkowej, przyłóż pipetę do ścianki studzienki i usuń płyn.</li>
	<li>Następnego dnia przemyj próbki trzy razy przez 5 minut za pomocą 200-300 μl PBS na wytrząsarce. Dodać 100 μl odpowiednich przeciwciał drugorzędowych; tutaj użyj koziego izotiocyjanianu fluoresceiny przeciwko myszom (FITC) i kozich barwników cyjaninowych przeciw królikom 3 (Cy3) i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:300 w PBS zawierającym 2% surowicy koziej.</li>
	<li>Próbki należy ponownie przepłukać trzykrotnie przez 5 minut w 200-300 μl PBS na wytrząsarce.</li>
	<li>Przeprowadzić barwienie jądra, np. 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) (rozcieńczenie 1:2,000, 100 μl w każdym dołku i inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej), a następnie ponownie przemyć 2 razy w 200-300 μl PBS na wytrząsarce.</li>
	<li>Przenieść próbki na szkiełka mikroskopowe, zanurzyć je w 1-2 kroplach fluorescencyjnego podłoża mocującego, dodać szkiełko nakrywkowe, uszczelnić je, pokrywając krawędzie przezroczystym lakierem i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia lub bezpośrednio zbadać szkiełka za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Użyj mikroskopu konfokalnego (lub jego odpowiednika) do analizy próbek. Użyj żądanego powiększenia, np. powiększenie 10-40X.</li>
	<li>Aby zweryfikować grubość próbek, należy dokonać pomiaru za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu Z-Stacks. Ilość możliwych przekrojów twardówki zależy od lokalizacji twardówki, ponieważ grubość różni się równikowo i tylnie (porównaj wprowadzenie).</li>
</ol>

<ol><li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+lymphatic+vessel+endothelial+hyaluronan+receptor+1+%28LYVE1%29-positive+macrophages+around+blood+vessels+in+the+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).</li>
<li>Schlereth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+lymphatic+vessels+in+the+developing+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Absence of lymphatic vessels in the developing human sclera.</a> Exp Eye Res. 125, 203-209 (2014).</li>
<li>Hos, D., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessels+in+the+development+of+tissue+and+organ+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Embryol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessels in the development of tissue and organ rejection.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 119-141 (2014).</li>
<li>Hos, D., Schlereth, S. L., Bock, F., Heindl, L. M., Cursiefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antilymphangiogenic+therapy+to+promote+transplant+survival+and+to+reduce+cancer+metastasis%3A+what+can+we+learn+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Antilymphangiogenic therapy to promote transplant survival and to reduce cancer metastasis: what can we learn from the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li>
<li>Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+privilege+as+the+result+of+local+tissue+barriers+and+immunosuppressive+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments.</a> Curr Opin Immunol. 5 (3), 428-432 (1993).</li>
<li>Streilein, J. W., Niederkorn, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+anterior+chamber-associated+immune+deviation+requires+an+intact%2C+functional+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of anterior chamber-associated immune deviation requires an intact, functional spleen.</a> J Exp Med. 153 (5), 1058-1067 (1981).</li>
<li>Streilein, J. W., Yamada, J., Dana, M. R., Ksander, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+chamber-associated+immune+deviation%2C+ocular+immune+privilege%2C+and+orthotopic+corneal+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Anterior chamber-associated immune deviation, ocular immune privilege, and orthotopic corneal allografts.</a> Transplant Proc. 31 (3), 1472-1475 (1999).</li>
<li>Keeley, F. W., Morin, J. D., Vesely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+collagen+from+normal+human+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of collagen from normal human sclera.</a> Exp Eye Res. 39 (5), 533-542 (1984).</li>
<li>Lee, R. E., Davison, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+composition+and+turnover+in+ocular+tissues+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen composition and turnover in ocular tissues of the rabbit.</a> Exp Eye Res. 32 (6), 737-745 (1981).</li>
<li>Moses, R. A., Grodzki, W. J., Starcher, B. C., Galione, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+content+of+the+scleral+spur%2C+trabecular+mesh%2C+and+sclera%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Elastin content of the scleral spur, trabecular mesh, and sclera.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 17 (8), 817-818 (1978).</li>
<li>Foster, C. S., Sainz de la Maza, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoster%2C+CS+%22The+sclera%22">The sclera</a>. , Springer. (2012).</li>
<li>Kiss, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Der+Blutkreislauf+des+Auges%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Der Blutkreislauf des Auges.</a> Ophthalmologica. 106, 225(1943).</li>
<li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+Part+I.+Aqueous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. Part I. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 35 (5), 291-303 (1951).</li>
<li>Ashton, N., Smith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts.+III.+Arterial+relations+of+Schlemm%27s+canal%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts. III. Arterial relations of Schlemm's canal.</a> Br J Ophthalmol. 37 (10), 577-586 (1953).</li>
<li>Ashton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+Schlemm%27s+canal+and+aqueous+veins+by+means+of+neoprene+casts+II.+Aqueous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of Schlemm's canal and aqueous veins by means of neoprene casts II. Aqueous veins.</a> Br J Ophthalmol. 36 (5), 265-267 (1952).</li>
<li>Hayreh, S. S., Scott, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+iris+angiography.+II.+Disturbances+in+iris+circulation+following+strabismus+operation+on+the+various+recti%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Fluorescein iris angiography. II. Disturbances in iris circulation following strabismus operation on the various recti.</a> Arch Ophthalmol. 96 (8), 1390-1400 (1978).</li>
<li>Virdi, P. S., Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+segment+ischemia+after+recession+of+various+recti.+An+experimental+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Anterior segment ischemia after recession of various recti. An experimental study.</a> Ophthalmology. 94 (10), 1258-1271 (1987).</li>
<li>Bron, A. J., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+of+the+globe+and+anterior+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Ophthalmol+Soc+U+K%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography of the globe and anterior segment.</a> Trans Ophthalmol Soc U K. 90, 339-367 (1970).</li>
<li>Ikegami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+of+the+anterior+ocular+segment.+Part+1.+Hemodynamics+in+the+anterior+ciliary+vessels+%28author%27s+transl%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon+Ganka+Gakkai+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography of the anterior ocular segment. Part 1. Hemodynamics in the anterior ciliary vessels (author's transl).</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 78 (7), 371-385 (1974).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LYVE-1%2C+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein%2C+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).</li>
<li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries%3A+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li>
</ol>

Autorzy deklarują nieujawnianie informacji finansowych. Wyłączną odpowiedzialność za treść tego artykułu ponoszą autorzy.

Laminowanie ludzkiej twardówki jest metodą wykonywania mikroskopii konfokalnej na tej tkance. Krytycznym krokiem w tym procesie jest użycie etanolu zamiast formaliny do mocowania tkanki. Z naszego doświadczenia wynika, że lepsze wyniki uzyskuje się przy użyciu etanolu zamiast formaliny do utrwalania. skalpele pogarszają procedurę i należy ich unikać. Podobnie należy unikać wysychania twardówki, ponieważ komplikuje to procedurę i obniża jakość obrazów.
Jeśli chodzi o barwienie immunohistochemic...

Twardówka to sztywna zewnętrzna warstwa pokrywająca oko, która jest wykonana z gęstej tkanki łącznej. Pomaga chronić struktury wewnątrzgałkowe i utrzymywać ciśnienie wewnątrzgałkowe. Tak więc twardówka jest niezbędna do jasnego widzenia. Jest pozbawiony naczyń limfatycznych 1,2, a tym samym tworzy zewnętrzną, wolną od limfy granicę między nim a wolnym od limfy okiem wewnętrznym 3-7. Zapewnia również miejsca przyczepu mięśni zewnątrzgałkowych, dzieląc w ten sposób anatomiczne podobieństwa ze ścięgnami. Ponieważ twardówka składa się głównie z gęstych wiązek kolagenu typu I i ma mniejszą liczbę kolagenu typu III, IV, V, VI, VIII 8,9 i elastyny 10,11, tkanka ta nie jest łatwa do wykorzystania w immunohistochemii.
Anatomicznie, twardówkę można podzielić na trzy główne warstwy: (1) powierzchownie unaczynioną twardówkę, znajdującą się pod spojówką i torebką czopa oraz w kierunku boków i tyłu oka skierowanego w stronę oczodołu; (2) zrąb twardówki, główna część twardówki; oraz (3) blaszka fusca, która jest cienką, pigmentowaną warstwą znajdującą się bezpośrednio nad błoną naczyniową oka. Nasza wiedza anatomiczna na temat twardówki wywodzi się głównie z pierwszej połowyXX wieku. W tym czasie naukowcy badali anatomię naczyń krwionośnych głównie za pomocą iniekcji z tuszu indyjskiego 12 i odlewu naczyniowego 13-15. Później badano go w badaniach angiograficznych 16-19.
Od tego czasu starsze techniki zostały ulepszone i opracowano nowe, które pozwoliły nam uzupełnić dotychczasową wiedzę anatomiczną. Na przykład minęło zaledwie około dziesięciu lat, odkąd mamy tak wiarygodne markery limfatyczne, jak receptor hialuronowy specyficzny dla śródbłonka naczyń limfatycznych 1 (LYVE1) 20 lub podoplanina 21. Mikroskopia konfokalna oferuje nowe możliwości badania cech anatomicznych różnych tkanek oka. Pozwala na wykorzystanie wielu barwień do różnicowania markerów komórek lub do lokalizacji komórek w odniesieniu do naczyń krwionośnych i innych struktur anatomicznych. Zapewnia przegląd, gdy próbka ma większy rozmiar i pozwala nam przeskanować próbkę w poszukiwaniu określonego typu komórki. Dzięki technologii Z-Stack mikroskopia konfokalna może być stosowana do próbek o wielkości do 100-200 μm. Twardówka różni się grubością od 0,3 mm za przyczepami mięśniowymi i 1 mm na tylnym biegunie 11. Zarówno ze względu na swoją grubość, jak i nieprzezroczystość twardówka nie nadaje się do mikroskopii konfokalnej przy użyciu tradycyjnych metod.
Aby temu zaradzić, tkanki twardówki zostały zalaminowane, aby umożliwić ich analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technologia ta jest przydatna do lepszego zrozumienia zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych sytuacji w twardówce człowieka.

<table><tbody><tr><td>96% etanol</td><td>Merck Chemicals, Darmstadt, Niemcy</td> Lornetkowy mikroskop stereoskopowy <td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Motic, Hongkong, Chiny</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Igły 26 G&nbsp;</td><td>Terumo, Leuven, Belgia</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>Trepan 15,5 mm</td><td>Geuder, Heidelberg, Niemcy</td><td>n.a no.10</td><td></td></tr><tr><td>skalpel&nbsp;</td><td>Pióro, pfm medical, Osaka, Japonia</td><td>2E+08</td><td></td></tr><tr><td>skalpel okulistyczny mikro pióro&nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japonia</td><td>nr 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD 31 (monoklonalne mysie przeciwciało antyludzkie)</td><td>Dako, USA</td><td>Przeciwciało IR610</td><td></td></tr><tr><td>LYVE1&nbsp; (poliklonalny królik anty człowiek)</td><td>Zytomed, Niemcy</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty myszy FITC</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, Niemcy</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty królicze Cy3</td><td>Dianova, Niemcy</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Kozia surowica normalna</td><td>Dako, Glostrup, Dania</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy</td><td>Mikroskop 6335.1</td><td></td></tr><tr><td> Slajdy&nbsp;</td><td>Engelbrecht, Ederm&uuml; nde, Niemcy</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24 mm x 24 mm</td><td>Th. Gayer, Lohmar, Niemcy</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>DAKO Medium do montażu fluorescencyjnego&nbsp;</td><td>DAKO, USA</td> Mikroskopia konfokalna <td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510&nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Jena, Niemcy</td><td>n.d</td><td></td>.</tr></tbody></table>

wykorzystanie techniki laminowania do wykonania mikroskopii konfokalnej twardówki człowieka

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

Twardówka to gęsta tkanka łączna, która pokrywa i chroni oko. Składa się głównie z gęstych wiązek kolagenowych (typy I, III, IV, V, VI i VII). Ze względu na swoją autofluorescencję, nieprzezroczystość i grubość, nie został uznany za odpowiedni do mikroskopii konfokalnej. Alternatywne podejście do przedstawionego tutaj, które wykorzystuje do immunohistochemii twardówkę utrwaloną w parafinie osadzoną w parafinie, wiąże się z wyzwaniami technicznymi, zwłaszcza podczas wstępnego podgrzewania tkanki w celu pobrania antygenu. Ponieważ twardówka jest stosunkowo uboga zarówno w komórkach, jak i naczyniach, zbadano użycie większych próbek tkanek, aby zapobiec przeoczeniu komórek i zrozumieć ich lokalizację w stosunku do naczyń i innych miejsc anatomicznych. Aby umożliwić analizę większych próbek tkanek pod mikroskopem konfokalnym, przeprowadzono technikę laminowania w celu stworzenia cienkich warstw twardówki. Po analizie wyników badań naczyń krwionośnych CD31 i komórek dodatnich receptora hialuronowego 1 śródbłonka naczyń limfatycznych (LYVE1), dla których uzyskano zgodę do badań naukowych, omówiono zalety i ograniczenia tej metody.

W przeprowadzonych tutaj reprezentatywnych eksperymentach wykazano wymierne korzyści wynikające z zastosowania tej konkretnej techniki laminowania. Pierwszy eksperyment ilustruje zróżnicowaną sieć splotu naczyń krwionośnych nadtwardówki na trzech reprezentatywnych zdjęciach (Rycina 3). Naczynia wykazują pozytywną reakcję na CD31.
Drugi eksperyment przedstawia komórki odpornościowe, w szczególności komórki LYVE1 ...

Ludzka tkanka twardówki to głównie kolagen; dlatego nie jest łatwo wykorzystać ją do celów immunohistochemicznych. Aby osiągnąć cel, jakim było wykonanie immunohistochemii do mikroskopii konfokalnej tkanki twardówki, zastosowano technikę laminowania.

Wykorzystanie techniki laminowania do wykonania mikroskopii konfokalnej twardówki człowieka


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest przeprowadzenie mikroskopii konfokalnej ludzkiej twardówki. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki, takie jak rozkład komórek odpornościowych i stan naczyń krwionośnych w twardówce w warunkach fizjologicznych oraz patologicznych.Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona obrazowanie konfokalne gęstej tkanki łącznej. Procedurę zaprezentuje Stefan Kremers, doktorant z naszego laboratorium. Na początek należy przygotować 96% etanol oraz PBS w osobnych probówkach.Następnie przygotować 100 µL przeciwciał pierwszorzędowych na każdą próbkę w zalecanym rozcieńczeniu w PBS zawierającym 2% BSA i przechowywać wszystkie roztwory w lodzie. Przygotować czyste narzędzia, w tym jedną lub dwie pęsety Colibri, proste nożyczki do mikrodissekcji, nożyczki zakrzywione, skalpel nr 10 lub mikro-skalpel oftalmologiczny, cztery igły o rozmiarze 26 G oraz wymazówkę. Owinąć płytkę polistyrenową folią aluminiową lub przygotować płytkę korkową do przymocowania tkanki.Po przygotowaniu przednio otwartej gałki ocznej zgodnie z protokołem tekstowym, należy umieścić twardówkę na tamponie otwartą częścią do góry. Następnie, używając pęsety typu colibri, należy usunąć siatkówkę oraz pigmentowe warstwy naczyniówki z wewnętrznej strony twardówki, aż do całkowitego oczyszczenia twardówki z tych warstw. W razie potrzeby należy użyć zakrzywionych nożyczek, aby usunąć siatkówkę i naczyniówkę z tarczy nerwu wzrokowego.Następnie usuń pozostałą spojówkę, mięśnie zewnątrzgałkowe oraz torebkę Tenona z powierzchni twardówki. Teraz, delikatnie utrzymując tkankę pęsetą typu colibri, wytnij prostymi nożyczkami próbki twardówki o wielkości około dwóch centymetrów kwadratowych z różnych miejsc tkanki, unikając wielokrotnego chwytania pęsetą, co sprawiłoby, że obszar ten nie nadawałby się do mikroskopii konfokalnej. Umieść próbki w probówkach 1,5 ml, dodaj 1,5 ml 96% etanolu i inkubuj przez 15 minut w celu utrwalenia tkanki.Następnie po usunięciu etanolu należy trzykrotnie przemyć próbki 1,5 ml PBS, wstrząsając je przez pięć minut podczas każdego mycia. Kolejno próbki przenosi się do 1,5 ml PBS z 5% BSA i inkubuje w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, co wywoła obrzęk próbek, ułatwiając laminowanie i zapobiegając nieswoistemu wiązaniu. Po napęcznieniu próbek, korzystając z mikroskopu stereobinokularowego, należy użyć igieł o rozmiarze 26 G z wygiętymi końcówkami, aby przymocować próbki tylnej części twardówki do folią owiniętej membrany polistyrenowej lub płyty korkowej.Następnie, aby wykonać laminację próbek o pełnej grubości, należy użyć pęsety typu colibri, aby poziomo przytrzymać przednią krawędź tkanki twardówki. Za pomocą skalpela nr 10 należy ostrożnie odciąć jak najcieńszą warstwę powierzchownej twardówki od warstwy podścielistej. Aby zapobiec wysychaniu tkanki, należy nanieść pipetą 50 µL PBS na warstwy.Następnie, po wycięciu warstw, umieść je w 100 µL PBS na płytce 96-dołkowej i za pomocą wodoodpornego markera oznacz orientację oraz numer warstwy. Kontynuuj izolowanie warstw i przenoszenie ich na płytkę 96-dołkową, aż tkanka zostanie całkowicie zlaminowana. Aby przeprowadzić immunohistochemię, usuń medium z płytki 96-dołkowej, przykładając końcówkę pipety do ścianki każdego dołka i aspirując płyn.Następnie do odpowiednich dołków dodaje się 100 µL przeciwciał pierwszorzędowych, rozcieńczonych w stosunku 1:100 w PBS z 2% BSA, i inkubuje przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia próbki przemywa się 200–300 µL PBS na wytrząsarce trzykrotnie po 5 minut. W razie potrzeby należy zastosować inne przeciwciało pierwszorzędowe i ponownie inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.Następnie należy dodać 100 µL odpowiednich przeciwciał wtórnych, rozcieńczonych w stosunku 1:300 w PBS z 2% surowicą kozią, i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin. Po inkubacji próbki należy ponownie przemyć na wytrząsarce trzykrotnie, używając od 200 do 300 µL PBS przez pięć minut w każdym cyklu. Następnie do każdego dołka należy dodać 100 µL DAPI w rozcieńczeniu 1:2000 i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej.Przed użyciem należy dwukrotnie przemyć próbki, stosując od 200 do 300 µL PBS. Przenieś próbki na szkiełka przedmiotowe pod mikroskopem stereobinokularnym, aby upewnić się, że próbka leży płasko na szkiełku, a następnie dodaj jedną do dwóch kropli fluorescencyjnego medium montażowego. Następnie nałóż szkiełko nakrywkowe i użyj przezroczystego laku do paznokci, aby uszczelnić krawędzie.Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia lub badać bezpośrednio za pomocą mikroskopii konfokalnej. Aby zweryfikować grubość próbek, należy wykonać serie obrazów w osi z (z-stacks), ponieważ grubość różni się w części równikowej i tylnej, w zależności od lokalizacji w twardówce. Obrazy te przedstawiają zróżnicowaną sieć splotów naczyń krwionośnych w warstwowej twardówce ludzkiej pochodzącej z przedniej i tylnej części nadtwardówki.Naczynia krwionośne są dodatnie pod kątem CD31, co zaznaczono kolorem zielonym. Na tej rycinie przedstawiono dodatnie pod kątem LYVE1 komórki odpornościowe nabłonka nadtwardówki oraz ich relację do dodatnich pod kątem CD31 naczyń krwionośnych. Seria z-stack została wykonana przy powiększeniu 10x w celu zbadania trójwymiarowych zależności między naczyniami krwionośnymi a komórkami odpornościowymi.Jak pokazano tutaj, mięśnie pozagałkowe zamknięte w twardówce mogą być również analizowane pod kątem obecności naczyń krwionośnych lub komórek odpornościowych, stosując odpowiednio markery CD31 i LYVE1. Po opanowaniu technika laminowania może zająć mniej niż godzinę, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zapobiegać wysychaniu tkanki.Należy pamiętać, że praca z tkanką ludzką może wiązać się z ryzykiem zakażenia, dlatego przed rozpoczęciem prac zawsze należy przeprowadzić odpowiednie środki ostrożności, takie jak diagnostyka mikrobiologiczna i wirusologiczna.

using-laminating-technique-to-perform-confocal-microscopy-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten protokół opisuje techniki oceny chemicznego sieciowania twardówki królika za pomocą obrazowania drugiej generacji harmonicznej i różnicowa kalorymetria skaningowa.

Sygnały generacji drugiej harmonicznej w twardówce królika jako narzędzie do oceny terapeutycznego sieciowania tkanek (TXL) w przypadku krótkowzroczności

To badanie przedstawia protokół odwracalnego oczyszczania tkanek, barwienia immunologicznego, renderowania 3D i analizy sieci naczyniowych w próbkach ludzkich kosmków łożyskowych rzędu 1 - 2 mm3.

Trójwymiarowe renderowanie i analiza znakowanych immunologicznie, oczyszczonych ludzkich sieci naczyniowych kosmków łożyskowych

Celem protokołu jest pokazanie podłużnego śledzenia tymocytów w czasie rzeczywistym za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej w implantach grasicy w przedniej komorze oka myszy. Przezroczystość rogówki i unaczynienie przeszczepu pozwala na ciągłe rejestrowanie rekrutacji komórek progenitorowych i wyjścia dojrzałych komórek T.

Śledzenie w czasie rzeczywistym in vivo tymocytów w przedniej komorze oka za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Prezentowany jest tutaj protokół techniki Conpokal, która łączy mikroskopię konfokalną i mikroskopię sił atomowych w jedną platformę instrumentów. Conpokal zapewnia tę samą komórkę, ten sam region, prawie równoczesne obrazowanie konfokalne i mechaniczną charakterystykę żywych próbek biologicznych.

Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie nowego modelu neurodegeneracji jaskry opartej na 360° termicznej kauteryzacji rąbkowego splotu naczyniowego, wywołującej podostre nadciśnienie oczne.

Kauteryzacja pełnego koła rąbka splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni

Protokół dostarcza szczegółową metodę obrazowania neuronów w wycinku mózgu za pomocą metody oczyszczania tkanki, ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanki mózgowej, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi wycinkami oraz konfokalne obrazowanie struktur neuronalnych za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej od poziomu mezoskopowego do mikroskopowego.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

Prezentowany protokół opisuje rozwój i wykorzystanie techniki barwienia aktyną na bazie falloidyny z konfokalną laserową mikroskopią skaningową (CLSM) do wizualizacji przylegającej struktury warstwy komórkowej w mikroprzepływowych kanałach hodowli dynamicznej i tradycyjnych komorach do hodowli statycznej ze stałą studnią. Takie podejście pomaga w ocenie zbiegu warstw komórkowych, tworzenia monowarstw i jednorodności grubości warstwy.

Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej

Obecne protokoły opisują nowatorskie obrazowanie całego mocowania do wizualizacji struktur peryferyjnych w soczewce oka z metodami kwantyfikacji obrazu. Protokoły te mogą być wykorzystywane w badaniach w celu lepszego zrozumienia związku między strukturami mikroskali soczewek a rozwojem/funkcją soczewki.

Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek

Poznaj technikę laminowania do mikroskopii konfokalnej twardówki człowieka. Ta metoda umożliwia badanie rozmieszczenia komórek odpornościowych i statusu naczyniowego w zdrowej oraz patologicznej twardówce.

Wykorzystanie techniki laminowania do wykonania mikroskopii konfokalnej twardówki człowieka

Przeglądaj więcej filmów