Wykorzystanie techniki laminowania do wykonania mikroskopii konfokalnej twardówki człowieka

Ogólnym celem tej metodologii jest wykonanie mikroskopii konfokalnej twardówki człowieka. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki. Takich jak rozmieszczenie komórek odpornościowych i stan naczyń krwionośnych u zdrowych oraz stany patologiczne w twardówce.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na konfokalne obrazowanie gęstej tkanki łącznej. Procedurę zademonstruje Stefan Kremers, doktorant z naszego laboratorium. Na początek przygotuj 96 procent etanolu i PBS w pojedynczych tubkach.

Następnie przygotuj 100 mikrolitrów na próbkę pierwszorzędowych przeciwciał w zalecanym rozcieńczeniu PBS zawierającym dwa procent BSA i trzymaj wszystkie roztwory na lodzie. Ułóż czyste narzędzia, w tym jeden lub dwa kleszcze Colibri, proste nożyczki do mikropreparacji, zakrzywione nożyczki, skalpel numer 10 lub mikropióro skalpela okulistycznego, cztery igły o rozmiarze 26 i wacik. Owiń folię aluminiową wokół płyty polistyrenowej lub przygotuj płytkę korkową do przymocowania tkanki.

Po wyprodukowaniu bańki otwartej do przodu zgodnie z protokołem tekstowym, umieść twardówkę na waciku otwartą częścią skierowaną do góry. Następnie użyj kleszczyków colibri, aby usunąć siatkówkę i pigmentowane warstwy błony naczyniowej oka z wewnętrznej twardówki, aż twardówka będzie wolna od tych warstw. Następnie użyj zakrzywionych nożyczek, jeśli to konieczne, aby usunąć siatkówkę i błonę naczyniową oka z brodawki.

Następnie usuń pozostałą spojówkę, mięśnie zewnątrzjajowe i torebkę czopową z twardówki powierzchownej. Teraz używając kleszczyków colibri do delikatnego przytrzymania tkanki, prostymi nożyczkami wytnij około dwóch centymetrów kwadratowych próbek twardówki z różnych miejsc na tkance, unikając wielokrotnego chwytania kleszczykami, co sprawi, że obszar ten nie będzie odpowiedni do mikroskopii konfokalnej. Umieść próbki w probówkach o pojemności 1,5 mililitra, dodaj 1,5 mililitra 96-procentowego etanolu i inkubuj przez 15 minut, aby utrwalić tkankę.

Następnie, po usunięciu etanolu, użyj 1,5 mililitra PBS, aby umyć próbki trzy razy przez pięć minut każda, potrząsając. Następnie przenieś próbki do 1,5 mililitra PBS z pięcioprocentowym BSA i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, co wywoła pęcznienie próbek, aby pomóc w laminowaniu i zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Gdy próbki pęcznieją, pod mikroskopem stereo-lornetkowym użyj igieł o rozmiarze 26, które zostały wygięte na krawędziach, aby przymocować próbki twardówki tylnej części do owiniętej folią membrany polistyrenowej lub płytki korkowej.

Następnie, aby zalaminować próbki o pełnej grubości, użyj kleszczyków colibri, aby poziomo przytrzymać przednią krawędź tkanki twardówki. Za pomocą skalpela numer 10 ostrożnie odetnij jak najcieńszą warstwę powierzchownej twardówki od warstwy spodniej. Aby zapobiec wysychaniu tkanki, należy nałożyć pipetą 50 mikrolitrów PBS na warstwy.

Następnie, po przecięciu warstw, umieść je w 100 mikrolitrach PBS na 96-dołkowej płytce i użyj wodoodpornego markera, aby oznaczyć zarówno orientację, jak i warstwę. Kontynuuj izolowanie warstw i przenoszenie na płytkę 96-dołkową, aż tkanka zostanie całkowicie zalaminowana. Aby przeprowadzić immunohistochemię, usuń pożywkę z płytki 96-dołkowej, przytrzymując pipetę przy ściance każdej studzienki i odsysając płyn.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów pierwszorzędowych przeciwciał rozcieńczonych od 1 do 100 w PBS z dwoma procentami BSA do odpowiednich studzienek i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia użyj od 200 do 300 mikrolitrów PBS, aby umyć próbki na wytrząsarce trzy razy przez pięć minut każda. W razie potrzeby użyj innego przeciwciała pierwszorzędowego i ponownie inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów odpowiednich przeciwciał drugorzędowych, rozcieńczonych od 1 do 300 w PBS z dwuprocentową surowicą kozią i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin. Po inkubacji należy użyć od 200 do 300 mikrolitrów PBS, aby ponownie przepłukać próbki na wytrząsarce trzy razy przez pięć minut każda. Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczenia DAPI w proporcji jeden do 2000 do każdego dołka i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej.

Przed użyciem od 200 do 300 mikrolitrów PBS należy dwukrotnie umyć próbki. Przenieś próbki na szkiełka mikroskopowe pod mikroskopem stereolornetkowym, aby upewnić się, że próbka leży płasko na szkiełku, i dodaj jedną do dwóch kropli fluorescencyjnego medium montażowego. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu i użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie.

Przechowywać w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania lub badać bezpośrednio za pomocą mikroskopii konfokalnej. Aby zweryfikować grubość próbek, należy wziąć stosy z, ponieważ grubość różni się równikowo i tylnie w zależności od lokalizacji twardówki. Obrazy te pokazują zróżnicowaną sieć splotu naczyń krwionośnych w laminowanej twardówce ludzkiej wywodzącej się z przedniej i tylnej twardówki.

Naczynia krwionośne są dodatnie dla CD31, jak pokazano na zielono. Na tym rysunku zilustrowano komórki odpornościowe LYVE1 nadtwardówki i ich związek z naczyniami krwionośnymi CD31-dodatnimi. Seria z-stack została wykonana w 10-krotnym powiększeniu w celu zbadania trójwymiarowych relacji naczyń krwionośnych i komórek odpornościowych.

Jak pokazano tutaj, mięśnie zewnątrzgałkowe zamknięte w twardówce mogą być również analizowane pod kątem obecności naczyń krwionośnych lub komórek odpornościowych, przy użyciu odpowiednio markerów CD31 i LYVE1. Po opanowaniu techniki laminowania można ją wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby nie dopuścić do wysuszenia tkanki.

Nie zapominaj, że praca z tkanką ludzką może być potencjalnie zakaźna, dlatego należy zawsze wcześniej podjąć środki ostrożności, takie jak diagnostyka mikrobiologiczna i wirusologiczna.