Identyfikacja interaktomii MyoD za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa sprzężonego ze spektrometrią mas

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wyczerpujące scharakteryzowanie partnerów białkowych MyoD. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii mięśni szkieletowych, takie jak molekularna regulacja deformacji tonalnej mięśni szkieletowych przez kluczowy czynnik transkrypcyjny mięśni, MyoD. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam ona rozwikłać partnerów MyoD, którzy mają wybieralnie niską liczebność, z których jeden jest zlokalizowany w jednym określonym przedziale subjądrowym.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w regulację różnicowania mięśni, może być również stosowana do innych systemów, takich jak inne tkanki, w szczególności różnicowanie jądrowe. Procedurę zademonstruje dr Lauriane Fritsch, asystentka naukowa z naszego laboratorium. W tym protokole kompleksy MyoD zostaną oczyszczone z komórek HeLa S3, które stabilnie wyrażają MyoD za pomocą znaczników gluteniny FLAG.

Komórki HeLa S3 transdukowane pustym wektorem zostaną użyte jako kontrola. Obie linie komórkowe były wcześniej hodowane, zbierane i przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, jak opisano w tekście protokołu. Szybko rozmrozić granulki komórek w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Wszystkie i homogenizatory powinny być wstępnie schłodzone, a cała procedura powinna być wykonywana w chłodni. Zazwyczaj w każdym punkcie doświadczalnym używa się 20 gramów komórek, ale na potrzeby tej demonstracji przetwarza się tylko 10 gramów, czyli około 10 ml komórek. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml hipotonicznego buforu A, używając najpierw 5 ml buforu.

Następnie dodaj 2,5 ml, a następnie kolejne 2,5 ml. Dobrze umyj pipetę świeżym buforem, aby uzyskać maksymalną liczbę komórek. Przenieść 20 ml zawiesiny komórkowej do wstępnie schłodzonego homogenizatora za pomocą ściśle dopasowanego tłuczka.

Homogenizuj komórki za pomocą 20 pociągnięć. Przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki. Aby uzyskać maksymalny odzysk komórek, przemyj homogenizator 3,5 ml buforu sacharozy.

Zawiesinę należy szybko przenieść do probówki o pojemności 50 ml, aby zachować jądra i ograniczyć przeciekanie. Wybarwić 30 mikrolitrową podwielokrotność zawiesiny komórek 30 mikrolitrami 4% błękitu trypanowego i przeanalizować pod mikroskopem w celu określenia wydajności lizy. Wszystkie jądra powinny być niebieskie, jeśli liza się powiedzie.

W razie potrzeby powtórzyć homogenizację. Wirować przez siedem minut w temperaturze 10 000 x g i w czterech stopniach Celsjusza w celu osadzenia jąder. Zachowaj supernatant jako frakcję cytoplazmatyczną.

Rozpocząć procedurę przygotowania frakcji ekstrahowalnej soli jądrowej od ponownego zawieszenia osadu jądrowego w 4 ml buforu sacharozy. Następnie dodawaj kropla po kropli 4 ml buforu o wysokiej zawartości soli, dokładnie mieszając w wirze, aby uzyskać końcowe stężenie 300 mM chlorku sodu. Inkubować przez 30 minut na lodzie z mieszaniem co pięć minut.

Następnie zmniejszyć stężenie chlorku sodu do 150 mM, dodając 8 ml buforu sacharozy. Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 x g i czterech stopniach Celsjusza. Zebrać sklarowany nad osadem, który jest frakcją ekstrahowalną soli i pozostawić go na lodzie.

Aby przygotować frakcję związaną z chromatyną, należy skrupulatnie zawiesić osad w 3,5 ml buforu sacharozy. Dodać chlorek wapnia do końcowego stężenia 1 mM i wymieszać. Chlorek wapnia aktywuje nukleazę mikrokokową, która zostanie dodana później.

Podgrzewać zawiesinę przez minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 35 mikrolitrów 5 jednostek na mikrolitr mikrokokowej nukleazy, aby uzyskać końcowe stężenie 25 10-tysięcznej jednostki na mikrolitr. Inkubować dokładnie przez 12 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Mieszaj co cztery minuty. Po 12 minutach natychmiast umieść reakcję na lodzie. Aby zatrzymać aktywność nukleazy mikrokokowej, dodaj 56 mikrolitrów 5 molowych EDTA o pH 8,0 do końcowego stężenia 4 mM i wiruj.

Inkubować przez pięć minut na lodzie. Sonikować pięć razy przez jedną minutę, za każdym razem przy dużej amplitudzie, pozostawiając jednominutową przerwę między sonifikacjami. Zmieniaj wirowanie zarówno frakcji ekstrahowanej solą, jak i frakcji wzbogaconej w nukleosomy przez 30 minut w temperaturze 85 000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zebrać supernatanty. Frakcja ekstrahowana solą powinna wynosić około 13 ml. A frakcja wzbogacona w nukleasomy powinna wynosić około 6 ml.

Kompleksy białkowe MyoD zostaną oczyszczone przez oczyszczanie o podwójnym powinowactwie. Ponieważ procedury oczyszczania opartego na LGR i HA są podobne, zademonstrowane zostanie tylko oczyszczanie oparte na LGR. Po dodaniu TEGN przenieś odpowiednią objętość żywicy FLAG do probówki o pojemności 50 ml.

Na każdy punkt doświadczalny potrzeba 300 mikrolitrów żywicy FLAG z komercyjnej żywicy FLAG do mycia wstępnego w 50%. Wirować przez dwie minuty przy 1 000 x g. Usunąć supernatant, dodać zimny TEGN i ponownie odwirować.

Żywicę FLAG należy umyć zimnym TEGN w sumie pięć razy. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić żywicę FLAG w równej objętości TEGN. Dla każdego punktu doświadczalnego wymieszaj 300 mikrolitrów przemytej żywicy FLAG i odpowiedniego ekstraktu białkowego.

Użyj probówki o pojemności 15 ml dla frakcji wzbogaconej w nukleasom i probówki o pojemności 50 ml dla frakcji ekstrahowanej solą. Inkubuj probówki na obracającym się kole przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia odwirować wszystkie probówki przez dwie minuty w temperaturze 1 000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zebrać supernatanty i utrzymywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu uzyskania wyniku badania skuteczności oczyszczania. W przypadku próbek ekstrahowanych solą należy ponownie zawiesić żywicę FLAG w 4 ml TEGN i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Powtórz ten krok trzy razy, za każdym razem przenosząc do tych samych 15 ml, aby uniknąć utraty kulek.

Wirować przez dwie minuty w temperaturze 1 000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu dodać 13 ml TEGN do żywicy FLAG i odwirowywać przez dwie minuty w temperaturze 1 000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj żywicę siedem razy w ten sposób.

Po ostatnim praniu ponownie zawiesić żywicę w 1 ml TEGN i przenieść do 1,5 ml probówki o niskiej zawartości wiązania. Wirować przez dwie minuty i usunąć supernatant. Zawiesić żywicę dla każdego punktu doświadczalnego w 100 mikrolitrach roztworu peptydu FLAG o stężeniu 4 mg/ml przy pH 7,8 Dobrze wymieszać i dodać 100 mikrolitrów buforu TEGN.

Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny, aby wymyć związane białka. Wirować przez dwie minuty i przenieść żywicę i supernatant do pustej kolumny wirowej umieszczonej w probówce o pojemności 2 ml. Odwirować kolumnę przez jedną minutę przy 6 000 x g.

Zebrać resztki sklarowanego osadu w probówce o pojemności 2 ml. Skuteczność oczyszczania jest następnie testowana zgodnie z opisem w tekście protokołu, przed przystąpieniem do oczyszczania na bazie HA. Pokazano tutaj reprezentatywne wyniki oczyszczonych kompleksów MyoD o podwójnym powinowactwie z ekstrahowanych soli jądrowej lub wzbogaconych w nukleasomy frakcji linii komórkowej HeLa S3 stabilnie eksprymującej FLAG HA MyoD.

Barwienie srebrem zidentyfikowało FLAG HA MyoD oznaczone strzałką, której nie ma w pozorowanej linii komórkowej. Oczyszczone kompleksy MyoD o podwójnym powinowactwie frakcjonowano na gradientach glicerolu. Zachodnie osuszanie frakcji przy użyciu przeciwciał anty-FLAG ujawniło podkompleksy MyoD w dwóch przedziałach subjądrowych.

W szczególności MyoD ekstrahowany solą jest rozmieszczony w trzech podkompleksach, podczas gdy MyoD związany z chromatyną należy głównie do jednego kompleksu. Analiza spektrometrii mas interaktorów MyoD wyizolowanych z frakcji ekstrahowalnych i wzbogaconych w nukleosomy pozwoliła zidentyfikować szereg znanych partnerów i nowych partnerów MyoD. W tym miejscu interakcje MyoD znalezione w obu frakcjach lub, szczególnie dla jednej z frakcji, są pogrupowane na podstawie ich adnotacji funkcjonalnych.

Niektóre z ujawnionych interaktorów uzyskanych za pomocą spektrometrii mas zostały potwierdzone przez Western blot na kompleksach MyoD. Należą do nich czynniki transkrypcyjne CBF, podjednostka SWI/SNF BAF47 i białka HP1. Ponieważ komórki HeLa nie są komórkami mięśniowymi i nie wykazują normalnej ekspresji MyoD, konieczne jest potwierdzenie interakcji między nowo zidentyfikowanymi interaktorami a MyoD i mioblastami.

Całkowite ekstrakty jądrowe z proliferujących i różnicujących się mioblastów myszy wykorzystano do immunoprecypitacji i zachodniej analizy ze wskazanymi przeciwciałami. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w dwa i pół dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o doprecyzowaniu uzyskanych wyników w mioblastach.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak knockdown konkretnego partnera w systemie istotności, takim jak mioblasty, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak funkcjonalne znaczenie interakcji. Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się rozwojową epigenetyką biologiczną do zbadania sieci regulacji pięciu czynników transkrypcyjnych w większości układów organizmu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować partnerów czynnika transkrypcyjnego, wykonując frakcjonowanie komórek, a następnie tandemowe oczyszczanie powinowactwa w połączeniu ze spektrometrią mas.