Name: Identyfikacja interaktomii MyoD za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa sprzężonego ze spektrometrią mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 47 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji partnerów białkowych MyoD za pomocą podwójnego oczyszczania powinowactwa i spektrometrii mas w komórkach HeLa S3. Technika ta umożliwia wykrywanie partnerów o niskiej obfitości w podjądrzowych kompartmentach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium Ait-Si-Ali była wspierana przez Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot i "Kim jestem?" Laboratorium Doskonałości #ANR-11- LABX-0071 finansowane przez rząd francuski w ramach programu "Inwestycje dla przyszłości" prowadzonego przez ANR w ramach grantu #ANR-11-IDEX-0005-01. EB otrzymał wsparcie z grantu INCa.

<ol><li>Ait-Si-Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suv39h-dependent+mechanism+for+silencing+S-phase+genes+in+differentiating+but+not+in+cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells.</a> Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+differentiation%3A+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li>
<li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+determination+and+differentiation%3A+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li>
<li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li>
<li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding%2C+interacting+proteins%2C+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li>
<li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circuitry+of+a+master+switch%3A+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li>
<li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1%2F2+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li>
<li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li>
<li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li>
<li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li>
<li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1%3A+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li>
<li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li>
<li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li>
<li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1%2C+G9a%2C+GLP%2C+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li>
<li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270(2007).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li>
<li>Yahi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cooperation+between+heterochromatin+protein+HP1+isoforms+and+MyoD+in+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
<li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li>
<li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SWI%2FSNF+subunit%2Ftumor+suppressor+BAF47%2FINI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858(2014).</li>
<li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+density+gradient+sedimentation+to+separate+and+analyze+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KAP1+phosphorylation+switch+controls+MyoD+function+during+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation.</a> Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li>
<li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+117%22%5BJournal%5D)">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li>
<li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicases+p68%2Fp72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li>
<li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1%2FPrep1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li>
<li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+complexes%2C+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis%3A+it%27s+time+to+exchange%21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li>
<li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona metoda pozwala na wyczerpującą identyfikację partnerów czynnika transkrypcyjnego MyoD. Okazało się, że partnerzy MyoD znajdują się w heterologicznym systemie odpornym na różnicowanie indukowane przez MyoD, a mianowicie w komórkach HeLa-S3. Tak więc, z definicji, zidentyfikowani partnerzy MyoD są wszechobecni. Należą do nich ogólne i specyficzne dla sekwencji czynniki transkrypcyjne, enzymy modyfikujące chromatynę, białka przetwarzające RNA, kinazy (tabele 1 i 2). Ponieważ k...

Wielokomórkowe organizmy eukariotyczne składają się z różnych organów i tkanek. Każda funkcjonalna tkanka ma określoną ekspresję wzorca genetycznego, która jest określana na każdym etapie różnicowania. Różnicowanie komórkowe polega na aktywacji określonych genów, utrzymaniu ich ekspresji i, ogólnie, wyciszeniu zestawu genów, takich jak te zaangażowane w proliferację komórek. Różnicowanie mięśni szkieletowych, czyli miogeneza, jest zatem procesem wieloetapowym, który rozpoczyna się od wyznaczenia mezodermalnych komórek macierzystych w mioblasty, a następnie prowadzi do końcowego różnicowania tych mioblastów najpierw w miotubki jednojądrowe, a następnie wielojądrkowe. Tak więc mioblasty są "zdeterminowanymi" komórkami, które nadal są zdolne do proliferacji, ale są zaangażowane w linię mięśni szkieletowych, a zatem mogą różnicować się wyłącznie w komórki mięśni szkieletowych podczas rozwoju embrionalnego lub regeneracji mięśni dorosłych. Proces różnicowania końcówek mięśni szkieletowych jest koordynowany przez specyficzny program genetyczny, który rozpoczyna się od trwałego wyjścia z cyklu komórkowego komórek prekursorowych mioblastów, co prowadzi do ostatecznego wyciszenia genów związanych z proliferacją, takich jak geny docelowe E2F1. Rzeczywiście, podczas procesu końcowego różnicowania, zatrzymanie proliferacji mioblastów jest kluczowym krokiem, który poprzedza ekspresję genów specyficznych dla mięśni szkieletowych i fuzję mioblastów z miotubami2. Taki program pozwala dorosłym komórkom macierzystym mięśni, zwanym również komórkami satelitarnymi, różnicować się podczas procesu regeneracji po urazie mięśni szkieletowych.
Miogeneza ssaków jest krytycznie zależna od rodziny miogennych podstawowych czynników transkrypcyjnych helisa-pętla-helisa (bHLH) MyoD, Myf5, MRF4 i Myogenin, często określanych jako rodzina czynników determinacji mięśni szkieletowych lub MRF (Muscle Regulatory Factors)3. Każdy z nich odgrywa istotną rolę w specyfikacji i różnicowaniu komórek mięśni szkieletowych i ma określony wzorzec ekspresji4, 5-7. Aktywacja Myf5 i MyoD stanowi decydujący krok, który angażuje komórki do linii miogennej, a późniejsza ekspresja miogeniny wyzwala miogenezę z aktywacją genów specyficznych dla mięśni szkieletowych, takich jak MCK (kinaza kreatynowa mięśniowa). Miogenne czynniki transkrypcyjne bHLH współpracują z członkami rodziny MEF2 w aktywacji genów mięśniowych z wcześniej niemych loci8. Stymulują również transkrypcję genów mięśni szkieletowych jako heterodimery z wszechobecnymi białkami bHLH, E12 i E47, znanymi jako białka E, które wiążą tak zwane E-boxy w różnych regionach regulatorowych genów8. Twist, Id (inhibitor różnicowania) i inne czynniki negatywnie regulują ten proces, konkurując z MyoD o wiązanie białek E8.
MyoD jest uważany za głównego gracza w wywoływaniu różnicowania końcówek mięśniowych9, ponieważ ma zdolność do wywoływania miogennego programu determinacji/różnicowania (trans-dyferencjacji) w wielu w pełni zróżnicowanych układach niemięśniowych10-13. Rzeczywiście, wymuszona ekspresja MyoD indukuje trans-różnicowanie różnych typów komórek, nawet tych pochodzących z innego pochodzeniaembriologicznego12. Na przykład MyoD może przekształcać hepatocyty, fibroblasty, melanocyty, neuroblasty i adipocyty w komórki podobne do mięśni. Transróżnicujące działanie MyoD polega na nieprawidłowej aktywacji miogennego programu genetycznego (w szczególności jego genów docelowych) w środowisku niemięśniowym, co towarzyszy wyciszeniu pierwotnego programu genetycznego (w szczególności genów proliferacji).
W proliferujących mioblastach, MyoD ulega ekspresji, ale nie jest w stanie aktywować swoich docelowych genów, nawet gdy wiąże się z ich promotorami14-16. W związku z tym wymóg, aby MyoD ulegał ciągłej ekspresji w niezróżnicowanych mioblastach, pozostaje dość nieuchwytny. MyoD może tłumić swoje docelowe geny z powodu rekrutacji represyjnych enzymów modyfikujących chromatynę w proliferujących mioblastach przed załadowaniem aktywujących enzymów remodelujących chromatynę14,17. Na przykład w proliferujących mioblastach MyoD jest związany z korepresorem transkrypcji KAP-1, deacetylazami histonowymi (HDAC) i represyjnymi metylotransferazami lizyny (KMT), w tym histonem H3 lizyną 9 lub H3K9 i H3K27 KMT, i aktywnie hamuje ekspresję genów docelowych poprzez ustanowienie lokalnie represyjnej struktury chromatyny14,17. Co ważne, niedawny raport wykazał, że MyoD sam w sobie jest bezpośrednio metylowany przez H3K9 KMT G9a, co powoduje zahamowanie jego aktywności transaktywującej16.
Mechanizmy epigenetyczne związane z tym trans-różnicowaniem komórek niemięśniowych przez MyoD są w dużej mierze nieznane. Warto zauważyć, że niektóre linie komórkowe są odporne na transdyferencję indukowaną przez MyoD. Tak więc w komórkach HeLa MyoD jest albo nieaktywny, albo nawet może funkcjonować jako represor, a nie aktywator transkrypcji z powodu braku ekspresji podjednostki BAF60C kompleksu przebudowującego chromatynę SWI / SNF18. Model ten może być zatem przydatny do lepszego scharakteryzowania mechanizmów represji genów indukowanej przez MyoD. Nadaje się również do badania zdolności MyoD do indukowania represyjnego środowiska chromatyny w docelowych loci z powiązanymi partnerami, a tym samym do odkrycia zależnych od MyoD mechanizmów represyjnych w proliferujących mioblastach w celu precyzyjnego dostrojenia różnicowania końcowego.
Tutaj opisujemy protokół identyfikacji partnerów MyoD za pomocą Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) sprzężonego z charakteryzacją spektrometrii mas (MS). Zastosowanie komórek HeLa-S3 stabilnie eksprymujących Flag-HA-MyoD pozwoliło uzyskać wystarczającą ilość materiału do oczyszczenia kompleksów MyoD z frakcjonowanych ekstraktów jądrowych. Po identyfikacji partnerów MyoD w systemie heterologicznym nastąpiła walidacja w odpowiednim systemie.

<table><tbody><tr><td><silne>Linie komórkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-S3</td><td>ATCC</td><td>CCL-2.2</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td></td><td>ATCC CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Corning</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator:&nbsp; Homogenizator dounce&nbsp;</td><td>Wheaton</td><td>432-1273 i 432-1271</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło do błystek</td><td>Bellco</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD 200</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Marienfeld Superior&nbsp;</td><td>640610</td><td></td></tr><tr><td>Probówki nisko wiążące</td><td>Sorenson</td><td>27210</td><td></td></tr><tr><td>Pusta kolumna wirowa</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-poliakryloamid 4-12%&nbsp; żel</td><td>Technologie życia</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>4x bufor ładowania&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>10x środek redukujący</td><td>Technologie życia</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia srebra</td><td>Life technologies</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe, 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Białko G kulki agarozowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4691</td><td></td></tr><tr><td>Białko A/G&nbsp; Żywica</td><td>Thermo Scientific</td><td>53132</td><td></td></tr><tr><td>Żywica flagowa (żel powinowactwa anty-Flag M2-agaroza)</td><td>Żywica Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>HA (monoklonalna agaroza anty-HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2095</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Peptyd bez flagi (DYKDDDDK)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Niestandardowa synteza</td><td>Ponowne zawieszenie do 4 mg/ml w 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>Peptyd wolny od HA (YPYDVPDYA)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>Niestandardowa synteza</td><td>Ponowne zawieszenie do 4 mg / ml w 50 mM Tris-HCl, pH 7,8</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek na bazie kwasu bicunchoninowego: zestaw BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Wzmocniony substrat HRP chemiluminescencji na bazie luminolu (ECL)</td><td>Technologie życiowe</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>DNA nasienia łososia z naciętymi nóżkami (sól sodowa kwasu dezoksyrybonukleinowego z jąder łososia)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Tetrachlorowodorek sperminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MOPS running buffer</td><td>Life technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (wysoki poziom glukozy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0822</td><td>Pre-warm&nbsp; przy 37 &deg; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05% czerwieni fenolowej</td><td>Life technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Serum</td><td>GE opieka zdrowotna nauki przyrodnicze&nbsp;</td><td>PAA A15-102</td><td>Każda partia surowicy musi być najpierw przebadana na obecność komórek.</td></tr><tr><td>Penicylina i Streptomycyna&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Technologie życia</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Woda (sterylnie filtrowana)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HA ze szczura (12CA5)</td><td>Roche</td><td>11583816001</td><td></td></tr><tr><td>Flag</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32758</td><td>Do stosowania do western blot</td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-760</td><td>Do stosowania do immunoprecypitacji i western blot</td></tr><tr><td>CBFbeta</td><td>Santa Cruz</td><td>FL-182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HP1alpha</td><td>Euromedex</td><td>2HP2G9</td><td></td></tr><tr><td>HP1beta</td><td>Euromedex</td><td>1MOD1A9AS</td><td></td></tr><tr><td>HP1gamma</td><td>Euromedex</td><td>2MOD1GC</td><td></td></tr><tr><td>Suv39h1</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>8729</td><td></td></tr><tr><td>BAF47</td><td>BD Biosciences</td><td>612111</td><td></td></tr><tr><td>Myf5</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-302</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>Actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>IgG Mysz</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2025</td><td></td></tr><tr><td>IgG Królik</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2027</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-szczur -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9037</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysz -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja interaktomii myod za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa sprzężonego ze spektrometrią mas

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Różnicowanie końcówek mięśni szkieletowych zaczyna się od zaangażowania pluripotencjalnych komórek prekursorowych mezodermalnych do mioblastów. Komórki te mają nadal zdolność do namnażania się lub mogą różnicować się i łączyć w wielojądrowe miotuby, które dojrzewają dalej, tworząc włókna mięśniowe. Różnicowanie końcówek mięśni szkieletowych jest koordynowane przez skoordynowane działanie różnych czynników transkrypcyjnych, w szczególności członków czynników regulacyjnych mięśni lub MRF (MyoD, Myogenin, Myf5 i MRF4), zwanych również rodziną miogennych czynników transkrypcyjnych bHLH. Czynniki te współpracują z kompleksami przebudowującymi chromatynę w ramach skomplikowanej transkrypcyjnej sieci regulacyjnej, aby osiągnąć miogenezę szkieletu. W tym przypadku MyoD jest uważany za główny miogenny czynnik transkrypcyjny w wyzwalaniu różnicowania końcówek mięśniowych. Pogląd ten jest wzmocniony przez zdolność MyoD do przekształcania komórek niemięśniowych w komórki mięśni szkieletowych. W tym miejscu opisujemy podejście stosowane do identyfikacji partnerów białkowych MyoD w wyczerpujący sposób w celu wyjaśnienia różnych czynników zaangażowanych w różnicowanie końcówek mięśni szkieletowych. Długoterminowym celem jest zrozumienie mechanizmów epigenetycznych zaangażowanych w regulację genów mięśni szkieletowych, tj. celów MyoD. Partnerzy MyoD są identyfikowani za pomocą Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) z systemu heterologicznego sprzężonego z charakterystyką spektrometrii mas (MS), a następnie walidacji roli odpowiednich partnerów podczas różnicowania końcówek mięśni szkieletowych. Nieprawidłowe formy czynników miogennych lub ich nieprawidłowa regulacja są związane z szeregiem zaburzeń mięśni: miastenią wrodzoną, dystrofią miotoniczną, mięsakiem prążkowanokomórkowym i defektami regeneracji mięśni. W związku z tym czynniki miogenne stanowią pulę potencjalnych celów terapeutycznych w zaburzeniach mięśniowych, zarówno w odniesieniu do mechanizmów wywołujących samą chorobę, jak i mechanizmów regeneracyjnych, które mogą poprawić leczenie choroby. W związku z tym szczegółowe zrozumienie oddziaływań międzycząsteczkowych i programów genetycznych kontrolowanych przez czynniki miogenne jest niezbędne do racjonalnego projektowania skutecznych terapii.

Aby zrozumieć regulację aktywności MyoD, przeprowadziliśmy szczegółową charakterystykę kompleksów MyoD przy użyciu oczyszczania biochemicznego, opartego na immunopuryfikacji formy MyoD z podwójnym znacznikiem, a następnie spektrometrii mas (MS). Wykorzystanie linii komórkowej HeLa-S3 eksprymującej MyoD z tagiem Flag-HA oraz linii komórkowej kontrolnej eksprymującej Flag-HA pozwala na uzyskanie wystarczającej ilości materiału do oczyszczenia kompleksu MyoD poprzez przeprowadzenie podwójneg...

MyoD to miogenny czynnik transkrypcyjny o dużej zdolności do indukowania miogennego transdyferencjacji wielu w pełni zróżnicowanych linii komórkowych niezwiązanych z mięśniami. Mechanizmy epigenetyczne zaangażowane w tę transdyferencjację są w dużej mierze nieznane. Tutaj opisujemy metodę oczyszczania z podwójnym powinowactwem, a następnie spektrometrię mas, aby wyczerpująco scharakteryzować partnerów MyoD.

Identyfikacja interaktomii MyoD za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa sprzężonego ze spektrometrią mas

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wyczerpujące scharakteryzowanie partnerów białkowych MyoD. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii mięśni szkieletowych, takie jak molekularna regulacja deformacji tonalnej mięśni szkieletowych przez kluczowy czynnik transkrypcyjny mięśni, MyoD. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam ona rozwikłać partnerów MyoD, którzy mają wybieralnie niską liczebność, z których jeden jest zlokalizowany w jednym określonym przedziale subjądrowym.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w regulację różnicowania mięśni, może być również stosowana do innych systemów, takich jak inne tkanki, w szczególności różnicowanie jądrowe. Procedurę zademonstruje dr Lauriane Fritsch, asystentka naukowa z naszego laboratorium. W tym protokole kompleksy MyoD zostaną oczyszczone z komórek HeLa S3, które stabilnie wyrażają MyoD za pomocą znaczników gluteniny FLAG.Komórki HeLa S3 transdukowane pustym wektorem zostaną użyte jako kontrola. Obie linie komórkowe były wcześniej hodowane, zbierane i przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, jak opisano w tekście protokołu. Szybko rozmrozić granulki komórek w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Wszystkie i homogenizatory powinny być wstępnie schłodzone, a cała procedura powinna być wykonywana w chłodni. Zazwyczaj w każdym punkcie doświadczalnym używa się 20 gramów komórek, ale na potrzeby tej demonstracji przetwarza się tylko 10 gramów, czyli około 10 ml komórek. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml hipotonicznego buforu A, używając najpierw 5 ml buforu.Następnie dodaj 2,5 ml, a następnie kolejne 2,5 ml. Dobrze umyj pipetę świeżym buforem, aby uzyskać maksymalną liczbę komórek. Przenieść 20 ml zawiesiny komórkowej do wstępnie schłodzonego homogenizatora za pomocą ściśle dopasowanego tłuczka.Homogenizuj komórki za pomocą 20 pociągnięć. Przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki. Aby uzyskać maksymalny odzysk komórek, przemyj homogenizator 3,5 ml buforu sacharozy.Zawiesinę należy szybko przenieść do probówki o pojemności 50 ml, aby zachować jądra i ograniczyć przeciekanie. Wybarwić 30 mikrolitrową podwielokrotność zawiesiny komórek 30 mikrolitrami 4% błękitu trypanowego i przeanalizować pod mikroskopem w celu określenia wydajności lizy. Wszystkie jądra powinny być niebieskie, jeśli liza się powiedzie.W razie potrzeby powtórzyć homogenizację. Wirować przez siedem minut w temperaturze 10 000 x g i w czterech stopniach Celsjusza w celu osadzenia jąder. Zachowaj supernatant jako frakcję cytoplazmatyczną.Rozpocząć procedurę przygotowania frakcji ekstrahowalnej soli jądrowej od ponownego zawieszenia osadu jądrowego w 4 ml buforu sacharozy. Następnie dodawaj kropla po kropli 4 ml buforu o wysokiej zawartości soli, dokładnie mieszając w wirze, aby uzyskać końcowe stężenie 300 mM chlorku sodu. Inkubować przez 30 minut na lodzie z mieszaniem co pięć minut.Następnie zmniejszyć stężenie chlorku sodu do 150 mM, dodając 8 ml buforu sacharozy. Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 x g i czterech stopniach Celsjusza. Zebrać sklarowany nad osadem, który jest frakcją ekstrahowalną soli i pozostawić go na lodzie.Aby przygotować frakcję związaną z chromatyną, należy skrupulatnie zawiesić osad w 3,5 ml buforu sacharozy. Dodać chlorek wapnia do końcowego stężenia 1 mM i wymieszać. Chlorek wapnia aktywuje nukleazę mikrokokową, która zostanie dodana później.Podgrzewać zawiesinę przez minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 35 mikrolitrów 5 jednostek na mikrolitr mikrokokowej nukleazy, aby uzyskać końcowe stężenie 25 10-tysięcznej jednostki na mikrolitr. Inkubować dokładnie przez 12 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Mieszaj co cztery minuty. Po 12 minutach natychmiast umieść reakcję na lodzie. Aby zatrzymać aktywność nukleazy mikrokokowej, dodaj 56 mikrolitrów 5 molowych EDTA o pH 8,0 do końcowego stężenia 4 mM i wiruj.Inkubować przez pięć minut na lodzie. Sonikować pięć razy przez jedną minutę, za każdym razem przy dużej amplitudzie, pozostawiając jednominutową przerwę między sonifikacjami. Zmieniaj wirowanie zarówno frakcji ekstrahowanej solą, jak i frakcji wzbogaconej w nukleosomy przez 30 minut w temperaturze 85 000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zebrać supernatanty. Frakcja ekstrahowana solą powinna wynosić około 13 ml. A frakcja wzbogacona w nukleasomy powinna wynosić około 6 ml.Kompleksy białkowe MyoD zostaną oczyszczone przez oczyszczanie o podwójnym powinowactwie. Ponieważ procedury oczyszczania opartego na LGR i HA są podobne, zademonstrowane zostanie tylko oczyszczanie oparte na LGR. Po dodaniu TEGN przenieś odpowiednią objętość żywicy FLAG do probówki o pojemności 50 ml.Na każdy punkt doświadczalny potrzeba 300 mikrolitrów żywicy FLAG z komercyjnej żywicy FLAG do mycia wstępnego w 50%. Wirować przez dwie minuty przy 1 000 x g. Usunąć supernatant, dodać zimny TEGN i ponownie odwirować.Żywicę FLAG należy umyć zimnym TEGN w sumie pięć razy. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić żywicę FLAG w równej objętości TEGN. Dla każdego punktu doświadczalnego wymieszaj 300 mikrolitrów przemytej żywicy FLAG i odpowiedniego ekstraktu białkowego.Użyj probówki o pojemności 15 ml dla frakcji wzbogaconej w nukleasom i probówki o pojemności 50 ml dla frakcji ekstrahowanej solą. Inkubuj probówki na obracającym się kole przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia odwirować wszystkie probówki przez dwie minuty w temperaturze 1 000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zebrać supernatanty i utrzymywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu uzyskania wyniku badania skuteczności oczyszczania. W przypadku próbek ekstrahowanych solą należy ponownie zawiesić żywicę FLAG w 4 ml TEGN i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Powtórz ten krok trzy razy, za każdym razem przenosząc do tych samych 15 ml, aby uniknąć utraty kulek.Wirować przez dwie minuty w temperaturze 1 000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu dodać 13 ml TEGN do żywicy FLAG i odwirowywać przez dwie minuty w temperaturze 1 000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj żywicę siedem razy w ten sposób.Po ostatnim praniu ponownie zawiesić żywicę w 1 ml TEGN i przenieść do 1,5 ml probówki o niskiej zawartości wiązania. Wirować przez dwie minuty i usunąć supernatant. Zawiesić żywicę dla każdego punktu doświadczalnego w 100 mikrolitrach roztworu peptydu FLAG o stężeniu 4 mg/ml przy pH 7,8 Dobrze wymieszać i dodać 100 mikrolitrów buforu TEGN.Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny, aby wymyć związane białka. Wirować przez dwie minuty i przenieść żywicę i supernatant do pustej kolumny wirowej umieszczonej w probówce o pojemności 2 ml. Odwirować kolumnę przez jedną minutę przy 6 000 x g.Zebrać resztki sklarowanego osadu w probówce o pojemności 2 ml. Skuteczność oczyszczania jest następnie testowana zgodnie z opisem w tekście protokołu, przed przystąpieniem do oczyszczania na bazie HA. Pokazano tutaj reprezentatywne wyniki oczyszczonych kompleksów MyoD o podwójnym powinowactwie z ekstrahowanych soli jądrowej lub wzbogaconych w nukleasomy frakcji linii komórkowej HeLa S3 stabilnie eksprymującej FLAG HA MyoD.Barwienie srebrem zidentyfikowało FLAG HA MyoD oznaczone strzałką, której nie ma w pozorowanej linii komórkowej. Oczyszczone kompleksy MyoD o podwójnym powinowactwie frakcjonowano na gradientach glicerolu. Zachodnie osuszanie frakcji przy użyciu przeciwciał anty-FLAG ujawniło podkompleksy MyoD w dwóch przedziałach subjądrowych.W szczególności MyoD ekstrahowany solą jest rozmieszczony w trzech podkompleksach, podczas gdy MyoD związany z chromatyną należy głównie do jednego kompleksu. Analiza spektrometrii mas interaktorów MyoD wyizolowanych z frakcji ekstrahowalnych i wzbogaconych w nukleosomy pozwoliła zidentyfikować szereg znanych partnerów i nowych partnerów MyoD. W tym miejscu interakcje MyoD znalezione w obu frakcjach lub, szczególnie dla jednej z frakcji, są pogrupowane na podstawie ich adnotacji funkcjonalnych.Niektóre z ujawnionych interaktorów uzyskanych za pomocą spektrometrii mas zostały potwierdzone przez Western blot na kompleksach MyoD. Należą do nich czynniki transkrypcyjne CBF, podjednostka SWI/SNF BAF47 i białka HP1. Ponieważ komórki HeLa nie są komórkami mięśniowymi i nie wykazują normalnej ekspresji MyoD, konieczne jest potwierdzenie interakcji między nowo zidentyfikowanymi interaktorami a MyoD i mioblastami.Całkowite ekstrakty jądrowe z proliferujących i różnicujących się mioblastów myszy wykorzystano do immunoprecypitacji i zachodniej analizy ze wskazanymi przeciwciałami. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w dwa i pół dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o doprecyzowaniu uzyskanych wyników w mioblastach.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak knockdown konkretnego partnera w systemie istotności, takim jak mioblasty, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak funkcjonalne znaczenie interakcji. Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się rozwojową epigenetyką biologiczną do zbadania sieci regulacji pięciu czynników transkrypcyjnych w większości układów organizmu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować partnerów czynnika transkrypcyjnego, wykonując frakcjonowanie komórek, a następnie tandemowe oczyszczanie powinowactwa w połączeniu ze spektrometrią mas.

identification-myod-interactome-using-tandem-affinity-purification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Drosophila słynie z potężnej manipulacji genetycznej, ale nie z przydatności do dogłębnej analizy biochemicznej. W tym miejscu przedstawiamy procedurę opartą na TAP, która ma na celu identyfikację oddziałujących partnerów dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania w mózgu muchy. Procedura ta może potencjalnie prowadzić do powstania nowych kierunków badań.

Identyfikacja interakcji białko-białko u dorosłych głów Drosophila za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP)

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Prezentujemy zoptymalizowany protokół etykietowania tandemowego znacznika masy (TMT), który zawiera szczegółowe informacje dla każdego z następujących etapów: ekstrakcja białka, kwantyfikacja, wytrącanie, trawienie, etykietowanie, przesyłanie do ośrodka proteomicznego i analiza danych.

Przygotowanie próbki TMT do przedłożenia przez placówkę proteomiczną i późniejszej analizy danych

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich oddziałujących białek z komórek i tkanek oraz ich identyfikacji i kwantyfikacji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

Niniejszy film prezentuje przygotowanie ultrascienistej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MS).

Przygotowanie próbek do analizy MALDI: metoda ultracienkiej warstwy

Opisano krótki protokół barwienia białek Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 w żelach poliakrylamidowych, który nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego, stosowanych w klasycznych procedurach barwienia CBB.

Barwienie białek w żelach Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

Poznaj metodę identyfikacji partnerów białkowych MyoD za pomocą podwójnego oczyszczania powinowactwa i spektrometrii mas w komórkach HeLa S3. Technika ta umożliwia wykrywanie partnerów o niskiej obfitości w podjądrzowych kompartmentach.

Identyfikacja interaktomii MyoD za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa sprzężonego ze spektrometrią mas

Przeglądaj więcej filmów