Name: Celowanie w Staphylococcus aureus związany z biofilmem za pomocą testu wrażliwości na leki opartego na resazurynie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę testowania wrażliwości na antybiotyki biofilmów Staphylococcus aureus z wykorzystaniem barwnika resazuryny w formacie 96-well. Technika umożliwia szybką i powtarzalną ocenę skuteczności związków przeciwbakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Saranowi Kupulowi za pomoc techniczną. Praca ta była częściowo wspierana przez grant NIH R01-AI104952 dla FW. Dalsze wsparcie zostało zapewnione przez University of Alabama at Birmingham (UAB) Center for AIDS Research (CFAR), program finansowany przez NIH (P30 AI027767), który był możliwy dzięki następującym instytutom NIH: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.

1. Inicjacja biofilmu
<ol>
	<li>Wyhoduj kulturę organizmu wytwarzającego biofilm w pożywce bogatej w składniki odżywcze. Zaszczepić szczep Staphylococcus aureus Newman w 10 ml pożywki Muellera-Hintona z bulionu glicerynowego. Wszystkie prace związane z obchodzeniem się z S. aureus należy wykonywać w rękawicach i w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Inkubować przez 16 godzin w temperaturze 37 °C na wytrząsarce obrotowej (100-200 obr./min).</li>
	<li>Oznacz OD600 kultury za pomocą spektrofotometru i standardowej kuwety (długość ścieżki: 1 cm).</li>
	<li>Obliczyć objętość (V) kultury potrzebną do przygotowania 20 ml inokulum z OD600 (inokulum) 0,1 w pożywce cheleksowanej Roswell Park Memorial Institute (CRPMI)9, korzystając ze wzoru: [V = 20 ml*0,1/OD600 (kultura)] 
	Uwaga: Odniesienie 9 zawiera szczegółowe informacje na temat przygotowania CRPMI.
	<ol>
		<li>Dodać obliczoną objętość kultury (od góry) do probówki wirówkowej i komórek osadu, wirując przez 1 minutę przy 10 000 x g. Aby przygotować inokulum biofilmu, należy odessać zużytą pożywkę wzrostową i ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 ml CRPMI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wlać inokulum do zbiornika o pojemności 25 ml.</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij pokrywkę ze sterylnej 96-dołkowej płytki kołkowej, pociągając ją prosto do góry. 
	Uwaga: Należy uważać, aby nie zanieczyścić kołków zwisających z pokrywy. Pokrywę można położyć do góry nogami na czystej powierzchni w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Używając pipety wielokanałowej o pojemności 200 μl, dodaj 125 μl inokulum do każdej studzienki w rzędach od A do G dolnej płytki.</li>
	<li>Napełnij 125 μl sterylnego podłoża CRPMI w każdym dołku rzędu H jako kontrolę sterylności.</li>
	<li>Weź pokrywkę kołka i przytrzymaj ją nad dnem talerza z kołkami skierowanymi w dół. Ostrożnie wyrównaj poszczególne kołki z odpowiednimi dołkami. Unikaj fizycznego kontaktu między płytą a kołkami. Po wyrównaniu ostrożnie opuść pokrywę w dół. Unikaj niewspółosiowości, ponieważ ponowna regulacja wykonana po dotknięciu kołków dolnej płyty może zanieczyścić kontrolę sterylności w rzędzie H.</li>
	<li>Uszczelnij pokrywkę do płytki folią parafinową, aby zapobiec parowaniu i umieść w zamykanej plastikowej torbie, szczelnie zamykając. Utrzymuj objętość powietrza w worku na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować parowanie.</li>
	<li>Inkubować bez wytrząsania w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . 
	Uwaga: 48 godzin wzrostu było optymalne dla S. aureus, ale będzie się różnić w zależności od użytego organizmu. 
	Uwaga: Chociaż inkubacja statyczna jest dobrym punktem wyjścia do optymalizacji testu, delikatne wytrząsanie z prędkością 150 obr./min na wytrząsarce mikropłytek jest możliwą odmianą, która może zwiększyć tworzenie biofilmu niektórych izolatów S. aureus.</li>
</ol>
2. Przygotowanie Płytki Wyzwania Biofilmu
<ol>
	<li>W dniu, w którym odbywa się wyzwanie dotyczące biofilmu, należy wziąć świeżą 96-dołkową płytkę i dodać 100 μl CRPMI, zrównoważonej do RT, do każdej studzienki w rzędach od B do H. Aby uniknąć niespójnych wyników, należy użyć płytki 96-dołkowej, która może pomieścić 200 μl pożywki, gdy kołki znajdują się w środku, i zawiera studzienki o wymiarach identycznych z wymiarami płytki inicjującej biofilm.</li>
	<li>Rozcieńczyć oddzielnie do 4 badanych związków w 1,0 ml CRPMI do 2x pożądanego stężenia końcowego, w celu uwzględnienia końcowego rozcieńczenia w kroku 2.7. 
	Uwaga: Dobrym punktem wyjścia jest 8-krotne zwiększenie stężenia hamującego komórek planktonowych.</li>
	<li>Dodać 200 μl związku 1 w studzienkach A1 do A3, związku 2 w studzienkach A4 do A6, związku 3 w studzienkach A7 do A9 i związku 4 w studzienkach A10 do A12.</li>
	<li>Szeregowo rozcieńczyć badane związki za pomocą pipety wielokanałowej i przenieść 100 μl z rzędu A do rzędu B i wymieszać.</li>
	<li>W ten sposób kontynuuj przenoszenie 100 μl dobrze do dołka. Wymieszaj po każdym przeniesieniu i zatrzymaj w rzędzie F.</li>
	<li>Po wymieszaniu wyrzucić 100 μl z rzędu F do pojemnika na odpady. Nie przelewaj żadnych płynów do rzędów G i H.</li>
	<li>Dodać 100 μl CRPMI do każdego dołka płytki za pomocą pipety wielokanałowej, aby doprowadzić objętość do 200 μl. Patrz rysunek 1, aby zapoznać się z ostatecznym układem płyt.</li>
</ol>
3. Wyzwanie Biofilmu
<ol>
	<li>Dodać 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do świeżej sterylnej płytki 96-dołkowej, która zawiera studzienki o wymiarach identycznych z wymiarami płytki inicjującej biofilm</li>.
	<li>Usunąć plastikową torbę i folię parafinową z inkubowanej płytki inicjującej biofilm.</li>
	<li>Podnieś pokrywę prosto do góry. Unikaj kontaktu kołków z dnem płytki, ponieważ może to spowodować uszkodzenie biofilmu. Zachowaj dolną część do późniejszej analizy OD600 (patrz 3.8).</li>
	<li>Spłukać komórki planktonu, umieszczając wieczko kołka na płytce zawierającej PBS (od kroku 3.1). Zanurz kołki na 5 sekund, wyjmij z PBS i zanurz się ponownie, uważając, aby nie uderzyć kołkami o boki studni.</li>
	<li>Umieść wypłukaną pokrywkę kołka w talerzu wyzywającym. Unikaj niepotrzebnego kontaktu kołków z dolną płytą, ponieważ spowoduje to uszkodzenie biofilmu, prowadząc do niespójnych wyników.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę folią parafinową i umieść w zamykanej plastikowej torbie, jak opisano w kroku 1.10.</li>
	<li>Inkubować płytkę bez wstrząsania przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	<li>Pobrać dolną część płytki inicjującej biofilm z ppkt 3.3. Ponownie zawiesić bakterie w każdym dołku za pomocą pipety wielokanałowej i zmierzyć OD600 za pomocą odpowiedniego czytnika mikropłytek, aby potwierdzić wzrost występujący we wszystkich studzienkach z wyjątkiem kontroli sterylności w rzędzie H.</li>
</ol>
4. Oznaczanie biofilmu
<ol>
	<li>Użyć czytnika płytek wyposażonego w komorę inkubacyjną i zdolnego do wykonywania odczytów fluorescencji kinetycznej w celu wykrycia konwersji rezazuryny. Skonfiguruj 24-godzinny pomiar fluorescencji kinetycznej przy wzbudzeniu 530 nm i emisji 590 nm.</li>
	<li>Ustaw temperaturę komory na 37 °C i odczytuj tabliczkę co 20 minut. Ustaw czytnik płytek na pomiar od spodu płytki zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przygotować płytkę do mycia, dodając 200 μl PBS za pomocą pipety wielokanałowej do sterylnej płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do odzyskiwania biofilmu, dodając 400 μl 0,8 mg/ml roztworu podstawowego resazuryny do 20 ml pożywki CRPMI do końcowego stężenia 16 μg/ml resazurin. 
	Uwaga: Rezazuryna jest znanym środkiem drażniącym skórę. Podczas obsługi używaj fartucha laboratoryjnego, okularów przeciwbryzgowych i rękawiczek. Zastosowano CRPMI jako pożywkę do odzyskiwania biofilmu, ponieważ zapewnia ona najniższy sygnał tła, ale w razie potrzeby można ją zastąpić pożywką Muellera Hintona.</li>
	<li>Dodać 150 μl pożywki do odzyskiwania biofilmu za pomocą pipety wielokanałowej do każdego dołka świeżej 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Przenieś płytkę prowokacyjną z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego i ostrożnie usuń plastikową torbę i folię uszczelniającą.</li>
	<li>Zdjąć pokrywkę kołka z płytki prowokacyjnej i spłukać komórki planktonowe w PBS, jak opisano w ppkt 3.4. Zachowaj dolną część płytki prowokacyjnej do późniejszej analizy OD600 (patrz 4.10).</li>
	<li>Po wypłukaniu umieść pokrywkę kołka w dnie płytki zawierającej pożywkę do odzyskiwania biofilmu.</li>
	<li>Owiń bok płyty folią parafinową, uważając, aby nie zasłaniać dna studzienek obwodowych. Natychmiast po owinięciu płytki należy umieścić ją na czytniku płytek i rozpocząć odczyt kinetyczny w ciągu 24 godzin, inicjując wcześniej wykonany protokół kinetyczny reazuryny od kroku 4.1.</li>
	<li>Aby określić ilościowo wzrost komórek planktonowych, który może, ale nie musi wystąpić podczas prowokacji, odczytaj OD600 całego dna płytki prowokacyjnej za pomocą czytnika mikropłytek. Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w kroku 3.8. 
	Uwaga: Ostrożnie ponownie zamieszaj zawartość każdej studzienki, ponieważ komórki zrzucające biofilm mają tendencję do wzrostu w kępach na dnie studzienki. Wszelkie pęcherzyki w studni będą silnie zakłócać odczyty OD600 i należy ich unikać lub usunąć przed odczytem.</li>
</ol>

<ol><li>Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+insights+from+biofilm+biology+to+drug+development+-+can+a+new+approach+be+developed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prosthesis+infections+after+orthopedic+joint+replacement%3A+the+possible+role+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Rev+%28Pavia%29%22%5BJournal%5D)">Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms.</a> Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases).</a> Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li>
<li>Bordi, C., de Bentzmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hacking+into+bacterial+biofilms%3A+a+new+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intensive+Care%22%5BJournal%5D)">Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge.</a> Ann Intensive Care. 1, 19(2011).</li>
<li>Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+laboratory+reference+strains+mirror+%27real-world%27+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis?</a> Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).</li>
<li>Kwasny, S. M., Opperman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+biofilm+cultures+of+Gram-positive+pathogens+grown+in+a+microtiter+format+used+for+anti-biofilm+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery.</a> Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18(2010).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MBEC+Assay+System%3A+multiple+equivalent+biofilms+for+antibiotic+and+biocide+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing.</a> Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calgary+Biofilm+Device%3A+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinical+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li>
<li>Baker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+stress+induces+a+global+stress+response+in+Staphylococcus+aureus+and+represses+sae+and+agr+expression+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation.</a> Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).</li>
<li>Haeili, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+complexation+screen+reveals+compounds+with+potent+antibiotic+properties+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).</li>
<li>O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+Alamar+Blue+%28resazurin%29+fluorescent+dye+for+the+assessment+of+mammalian+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity.</a> Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+the+minimal+bactericidal+concentration+of+an+antimicrobial+agent+for+planktonic+cells+%28MBC-P%29+and+biofilm+cells+%28MBC-B%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B).</a> J Vis Exp. (83), e50854(2014).</li>
<li>Junker, L. M., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persisters%3A+a+distinct+physiological+state+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persisters: a distinct physiological state of E. coli.</a> BMC Microbiol. 6, 53(2006).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riddle+of+biofilm+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Riddle of biofilm resistance.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisaliśmy zmodyfikowany test biofilmu do określania aktywności badanych inhibitorów na biofilmy S. aureus, koncentrując się na stanie metabolicznym komórek związanych z biofilmem. Podczas gdy opisane procedury inicjacji i prowokacji biofilmu w większości naśladowały zalecenia producenta, zastosowanie barwnika resazuryny do wykrywania i ilościowego oznaczania komórek związanych z biofilmem, które przetrwały 24-godzinną prowokację inhibitorem, znacznie upraszcza zalecaną procedurę odzyskiwania komór...

Mikroby chorobotwórcze mogą tworzyć biofilmy in vivo, prowadząc do nieostrych przewlekłych infekcji 1. Zakażenie związane z biofilmem jest poważnym czynnikiem ryzyka procedur medycznych, które obejmują implantację ciał obcych (np. sztucznych protez kości, implantów piersi) lub instalację rurek dotchawiczych lub cewników moczowych 2. W tych kontekstach terapia przeciwinfekcyjna jest prawie zawsze konieczna, ponieważ infekcje oparte na biofilmie rzadko są usuwane samodzielnie, nawet u osób immunokompetentnych. Staphylococcus aureus jest jednym z najczęściej obserwowanych patogenów związanych z powikłaniami związanymi z biofilmem występującymi podczas stosowania inwazyjnych wyrobów medycznych 3.
Niestety, sama natura biofilmów jako bariery ochronnej sprawia, że są one bardziej odporne na leczenie niż komórki planktonowe 1,4, a ocena przewidywanej skuteczności klinicznej jest krytyczną częścią zarówno początkowego rozwoju leku, jak i nadzoru nad opornością na leki. Coraz częściej uznaje się, że warunki laboratoryjne, skoncentrowane na kulturach planktonowych, mogą nie odzwierciedlać wiernie rzeczywistej choroby 5. Problem dodatkowo komplikuje fakt, że replikacja fenotypów biofilmu jest trudna, a istniejące modele biofilmu są żmudne i cierpią z powodu dużej zmienności między i wewnątrz testów 6. W związku z tym wielu badaczy, z konieczności, domyślnie stosuje testy wrażliwości komórek planktonowych pod kątem wrażliwości na leki, potencjalnie zaniedbując w ten sposób ważny aspekt zjadliwości i choroby bakteryjnej.
Tutaj opisujemy protokół oznaczania bakterii, w szczególności S. aureus, w wcześniej wyhodowanych biofilmach, wykorzystując 96-dołkowy system biofilmu oparty na 96 dołkach 7,8. Podczas gdy protokół tworzenia i prowokacji biofilmu jest zasadniczo zgodny z zaleceniami producenta, przedstawiamy alternatywną, bogatą w informacje metodologię ilościowego określania żywotności biofilmu po prowokacji. Krótko mówiąc, bakterie są hodowane w płytce kołkowej, gdzie biofilmy tworzą się na wystających kołkach przymocowanych do pokrywy płytki. Po utworzeniu biofilmu kołki delikatnie zanurza się w studzienkach świeżej płytki wypełnionej PBS w celu usunięcia komórek planktonu. Pokrywka kołkowa, z dołączonymi biofilmami, jest przenoszona na nową płytkę prowokacyjną, zawierającą różne stężenia antybiotyków do oznaczenia. Po drugiej inkubacji pokrywki są ponownie usuwane, myte i przenoszone na płytkę regeneracyjną zawierającą barwnik rezazurynowy, gdzie poddawane są końcowej inkubacji. Konwersja resazuryny może być rejestrowana kinetycznie lub traktowana jako odczyt końcowy po określonym okresie rekonwalescencji. Ta oparta na barwniku metoda ilościowego określania żywotności biofilmów różni się znacznie od żmudnej metodologii opartej na zliczaniu CFU (jednostki tworzące kolonie) opisanej w pierwotnym protokole 7. Pomiary OD600 płytki prowokacyjnej leku i kinetyki konwersji resazuryny służą jako odczyty żywotności odpowiednio komórek planktonu i biofilmu, oferując szybki, wiarygodny, bogaty w informacje i technicznie prosty test na przeżycie biofilmu.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Mueller-Hinton Medium</td><td>Oxoid</td><td>CM0405</td><td>Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta</td></tr><tr><td>RPMI-medium</td><td>Corning&nbsp;</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>CRPMI</td><td>Ref 9</td><td></td><td>RPMI-1640 średni cheleks przez 1 godzinę z żywicą Chelex 100, a następnie uzupełniony 10% niecheleksedem RPMI-1640</td></tr><tr><td>Żywica Chelex 100</td><td>Bio Rad</td><td>142-2822</td><td></td></tr><tr><td>MBEC-płytki</td><td>Innovotech</td><td>19111</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin Sól sodowa</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>800 &micro; g/ml w wodzie DI&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Sterylna</td></tr><tr><td>platforma do wytrząsania mikropłytek z filtrem&nbsp;</td><td>Heidolph Titramax 1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 Czytnik płytek</td><td>Oprogramowanie Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5</td><td>Biotek</td><td></td><td>Rejestracja i analiza konwersji resazuryny</td></tr><tr><td>Neocuproine</td><td>Sigma</td><td>N1501&nbsp;</td><td>przygotować 10 mM zapasu w 100% etanolu, przechowywać w temperaturze -80 &ordm; C</td></tr><tr><td>Siarczan miedzi</td><td>Acros Organics</td><td>7758-99-8</td><td>przygotować 100 mM roztwór podstawowy w wodzie, przechowywać w temperaturze 4 &ordm; C</td></tr><tr><td>Cu-Neocuproine</td><td>Self-Made</td><td></td><td>Wytwarzany przez zmieszanie równych molowców neokuproiny i siarczanu miedzi. Mieszaninę rozcieńczono w pożywce CRPMI do pożądanego stężenia.</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

celowanie w staphylococcus aureus związany z biofilmem za pomocą testu wrażliwości na leki opartego na resazurynie

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Większość bakterii chorobotwórczych jest w stanie tworzyć biofilmy podczas infekcji, ale ze względu na trudności w manipulowaniu i ocenie biofilmów, zdecydowana większość prac laboratoryjnych jest przeprowadzana na komórkach planktonowych. W tym miejscu opisujemy test biofilmu na płytce kołkowej wykonany z użyciem Staphylococcus aureus. Biofilmy bakteryjne są hodowane na kołkach przymocowanych do 96-dołkowej pokrywy płytki mikromiareczkowej, przemywane przez delikatne zanurzenie w buforze i umieszczane na płytce prowokacyjnej leku. Po późniejszej inkubacji są one ponownie myte i przenoszone na końcową płytkę odzysku, w której fluorescencyjny barwnik rezazuryna służy jako wskaźnik żywotności. Test ten oferuje znacznie zwiększoną łatwość użycia, niezawodność i odtwarzalność, a także bogactwo danych, gdy jest przeprowadzany jako odczyt kinetyczny. Co więcej, test ten można dostosować do średnioprzepustowego podejścia do badań przesiewowych leków, w którym zamiast tego pobierany jest odczyt fluorescencyjny punktu końcowego, co stanowi ścieżkę dla wysiłków związanych z odkrywaniem leków.

Test z rezazuryną jest wystarczająco czuły, aby wiarygodnie wykryć bardzo niewielką liczbę żywych komórek zdolnych do replikacji w pożywce wolnej od leku po ekspozycji. W tej metodologii minimalne stężenie eradykujące biofilm definiujemy jako najniższe stężenie, przy którym nie obserwuje się konwersji rezazuryny w ciągu 24 hr. Test z rezazuryną opiera się na cząsteczkach utleniających występujących w metabolicznie aktywnych komórkach, które zmieniają kolor barwnika z niebieskiego na różow...

Większość infekcji bakteryjnych wytwarza biofilm. Ze względu na środowisko, w którym działają, bakterie związane z biofilmem są często fenotypowo odporne na leki. Nowe cząsteczki przeciwbakteryjne, które zabijają bakterie w biofilmach, mają zatem wysoki priorytet. Opracowujemy test do szybkiego badania przesiewowego pod kątem związków przeciwdrobnoustrojowych, które są skuteczne w zwalczaniu biofilmów.

Celowanie w Staphylococcus aureus związany z biofilmem za pomocą testu wrażliwości na leki opartego na resazurynie

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest łatwa i powtarzalna hodowla biofilmów bakteryjnych w formacie płytki 96-dołkowej na przymocowanych do pokrywki kołkach w celu badania podatności na antybiotyki przy użyciu barwnika żywotności. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania i opracowywania antybiotyków poprzez badanie aktywności wobec komórek związanych z biofilmem, które często lepiej reprezentują stany infekcji in vivo. Główną zaletą tej techniki jest możliwość łatwego poddania preformowanych biofilmów działaniu czynników w trzyczęściowym teście w medium i określenie inhibicji przy użyciu powszechnie stosowanego barwnika żywotności.Na początek należy wyhodować kulturę organizmu wytwarzającego biofilm w pożywce bogatej w składniki odżywcze. Zaszczep szczep Newman Staphylococcus aureus z krzepki glicerynowej do 10 mililitrów pożywki Mullera-Hintona. Wszystkie prace związane z obchodzeniem się z S.aureus należy wykonywać w rękawiczkach oraz w komorze bezpiecznej biologicznie.Inkubować przez 16 godzin w temperaturze 37 °C na inkubatorze obrotowym. Przenieść obliczoną objętość hodowli do probówki wirówkowej i odwirować komórki przez jedną

targeting-biofilm-associated-staphylococcus-aureus-using-resazurin

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obecna diagnostyka testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe opiera się na wzroście planktonicznym izolatów w bogatych w składniki odżywcze warunkach tlenowych. W niniejszej pracy wykorzystujemy alternatywne sztuczne podłoże plwociny, aby zbadać wrażliwość biofilmów Pseudomonas aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe zarówno w warunkach tlenowych, jak i mikroaerofilnych, które są bardziej reprezentatywne dla płuc w mukowiscydozie.

Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Źródło: Bucher, T. i in. Metodologie badania biofilmów B. subtilis jako modelu charakteryzowania inhibitorów biofilmu małocząsteczkowego. J. Vis. Exp. (2016).Ten film pokazuje, jak integralność matrycy biofilmu wpływa na odporność bakterii na etanol, porównując jednostki tworzące kolonie w biofilmach nieleczonych i zaburzonych przez inhibitory. Zmniejszone CFU w próbkach objętych inhibitorami pokazują, że macierz zewnątrzkomórkowa jest niezbędna do ochrony komórek osadzonych w biofilmie przed...

Test odporności na etanol w celu oceny integralności matrycy biofilmu

Źródło: Zhang, M. i in., Szybkie testy podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe poprzez stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana inkorporacji deuteru w pojedynczej bakterii. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje zastosowanie stymulowanej mikroskopii rozpraszającej Ramana do oceny podatności na antybiotyki poprzez śledzenie aktywności metabolycznej oznaczanej deuterem. Poprzez monitorowanie sygnałów węgla–deuteru metoda umożliwia szybkie wykrywanie populacji bakterii odpornych i podatnych.

Wykrywanie podatności na antybiotyki bakteryjne za pomocą stymulowanego mikroskopu rozpraszającego Ramana

Ten film demonstruje test do badania przesiewowego związków przeciwdrobnoustrojowych, które skutecznie eliminują biofilmy za pomocą płytki kołkowej. Metodologia ta monitoruje stan metaboliczny biofilmu po poddaniu działaniu związków przeciwdrobnoustrojowych, ułatwiając określenie minimalnego stężenia eradykacji biofilmu.

Test biofilmu na płytce kołkowej do badań przesiewowych środków przeciwbakteryjnych

Biosensory fagów litycznych i kulki przeciwciał są w stanie odróżnić oporne na metycylinę (MRSA) od wrażliwych bakterii gronkowca. Fagi unieruchomiono metodą Langmuira-Blodgetta na powierzchni czujnika mikrowagi kryształu kwarcu i działały jako sondy gronkowca o szerokim zakresie. Kulki przeciwciał rozpoznają MRSA.

Biosensor do wykrywania bakterii gronkowca opornego na antybiotyki

Infekcje biofilmowe wykazują wysoką tolerancję na chemioterapię. Żaden pojedynczy test nie oddaje złożoności biofilmów. Zamiast tego potrzebne są testy uzupełniające. Przedstawiamy platformę przesiewową (opracowaną dla S. aureus), która łączy testy żywotności, biomasy i matrycy biofilmu. Pozwala to na odkrywanie leków przeciwbiofilmowych, w tym ocenę długoterminowych efektów chemioterapeutycznych.

Platforma testów antybiofilmowych dostosowana do eksploracji bibliotek związków naturalnych

Ten protokół ma na celu opisanie sposobu badania zakresu internalizacji Staphylococcus aureus i jego zdolności do przetrwania wewnątrz ludzkiej komórki gospodarza, a także wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych.

Ulepszony test ochrony enzymatycznej do badania internalizacji Staphylococcus aureus i wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych

Ta metodologia pozwala na stworzenie modelu wielomikrobiologicznego biofilmu w mukowiscydozie do testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w laboratoriach badawczych i klinicznych. Model ten zapewnia dokładne i wiarygodne wyniki w szerokim zakresie danych wyjściowych.

Opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie

Analiza opisuje szybką metodę pomiaru wczesnego tworzenia się biofilmu przez bakterie i grzyby. Metoda ta wykorzystuje płytkę mikrotitracyjną jako podłoże do tworzenia biofilmu mikrobiologicznego, a sam biofilm jest wizualizowany przy użyciu fioletu krystalicznego. Analiza ta pozwala na jakościowe lub ilościowe oznaczenie wczesnego etapu tworzenia biofilmu.

Analiza tworzenia biofilmu w płytkach mikrotitrowych

Szczegółowo przedstawiono protokoły wykorzystania biofilmów w otwartych systemach przepływowych z zastosowaniem reaktorów z przepływem kropelkowym oraz reaktorów z obracającym się dyskiem.

Wykorzystanie reaktorów przepływowych kropelkowych oraz reaktorów z obracającym się dyskiem do analizy biofilmu Staphylococcus aureus

Poznaj metodę testowania wrażliwości na antybiotyki biofilmów Staphylococcus aureus z wykorzystaniem barwnika resazuryny w formacie 96-well. Technika umożliwia szybką i powtarzalną ocenę skuteczności związków przeciwbakteryjnych.

Celowanie w Staphylococcus aureus związany z biofilmem za pomocą testu wrażliwości na leki opartego na resazurynie

Przeglądaj więcej filmów