Celowanie w Staphylococcus aureus związany z biofilmem za pomocą testu wrażliwości na leki opartego na resazurynie

Ogólnym celem niniejszej procedury jest łatwa i powtarzalna hodowla biofilmów bakteryjnych w formacie płytki 96-dołkowej na przymocowanych do pokrywki kołkach w celu badania podatności na antybiotyki przy użyciu barwnika żywotności. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania i opracowywania antybiotyków poprzez badanie aktywności wobec komórek związanych z biofilmem, które często lepiej reprezentują stany infekcji in vivo. Główną zaletą tej techniki jest możliwość łatwego poddania preformowanych biofilmów działaniu czynników w trzyczęściowym teście w medium i określenie inhibicji przy użyciu powszechnie stosowanego barwnika żywotności.

Na początek należy wyhodować kulturę organizmu wytwarzającego biofilm w pożywce bogatej w składniki odżywcze. Zaszczep szczep Newman Staphylococcus aureus z krzepki glicerynowej do 10 mililitrów pożywki Mullera-Hintona. Wszystkie prace związane z obchodzeniem się z S.aureus należy wykonywać w rękawiczkach oraz w komorze bezpiecznej biologicznie.

Inkubować przez 16 godzin w temperaturze 37 °C na inkubatorze obrotowym. Przenieść obliczoną objętość hodowli do probówki wirówkowej i odwirować komórki przez jedną minutę przy 10 000 Gs. Aby przygotować inokulum biofilmu, odessać zużyte pożywkę i resuspender osad komórkowy w 20 ml CRPMI. Używając wielokanałowej pipety 200 µl, dodać 125 µl inokulum z rezerwuaru o pojemności 25 ml do każdego dołka w rzędach od A do G płyty dolnej.

Wlej 125 µL sterylnego medium CRPMI do każdego dołka w rzędzie H jako kontrolę sterylności. Weź pokrywkę z wypustkami i trzymaj ją nad dnem płytki wypustkami skierowanymi w dół. Ostrożnie dopasuj poszczególne wypustki do odpowiadających im dołków.

Unikaj kontaktu fizycznego między płytką a kołkami. Po wyrównaniu ostrożnie opuść pokrywkę. Uszczelnij pokrywkę i płytkę folią parafinową, aby zapobiec parowaniu, a następnie umieść całość w szczelnej plastikowej torebce i mocno ją zamknij.

Należy utrzymać objętość powietrza w worku na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować parowanie. Inkubować płytkę bez wytrząsania w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w inkubatorze z 5% Carbon Dioxide. W dniu przeprowadzenia testu biofilmu należy wziąć nową płytkę 96-dołkową i dodać 100 µL CRPMI, wyrównanego do temperatury pokojowej, do każdego dołka w rzędach od B do H. Rozcieńczyć oddzielnie do czterech związków testowych w 1,0 mL CRPMI do stężenia 2x pożądanego stężenia końcowego.

Dodaj 200 µL związku 1 do studni A1-A3, 200 µL związku 2 do studni A4-A6, 200 µL związku 3 do studni A7-A9 oraz 200 µL związku 4 do studni A10-A12. Wykonaj rozcieńczenia seryjne badanych związków za pomocą pipety wielokanałowej.

Zacznij od przeniesienia 100 µL z rzędu A do rzędu B, a następnie wymieszaj. W ten sposób kontynuuj przenoszenie 100 µL z dołka do dołka. Mieszaj po każdym przeniesieniu i zakończ w rzędzie F. Po wymieszaniu odlej 100 µL z rzędu F do pojemnika na odpady.

Do nie przelewać żadnego płynu do rzędów G i H. Na koniec, za pomocą pipety wielokanałowej, dodać 100 µL CRPMI do każdego dołka płytki, aby uzyskać końcową objętość 200 µL. Dodać 200 µL soli fizjologicznej (PBS) do nowej, sterylnej płytki 96-dołkowej, której wymiary dołków są identyczne z wymiarami dołków płytki do inicjacji biofilmu. Następnie zdjąć plastikową torbę i folię parafinową z inkubowanej płytki do inicjacji biofilmu.

Podnieś pokrywkę pionowo do góry, unikając kontaktu kołków z dnem płytki, aby nie uszkodzić biofilmu. Zachowaj dolną część do późniejszej analizy OD600. Usuń komórki planktoniczne, przykładając pokrywkę z kołkami do płytki zawierającej PBS.

Zanurz kołki na pięć sekund. Wyjmij je z PBS, a następnie zanurz ponownie, uważając, aby nie uderzyć kołkami o ścianki dołka. Umieść wypłukaną pokrywkę z kołkami na płytce testowej.

Należy unikać niepotrzebnego kontaktu kołków z dnem płytki, ponieważ może to uszkodzić biofilm i doprowadzić do niespójnych wyników. Płytkę należy uszczelnić folią parafinową, a następnie umieścić w szczelnej plastikowej torbie, tak jak wcześniej. Inkubować płytkę bez wytrząsania przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% Carbon Dioxide.

Przesuń dno płytki do inicjacji biofilmu i resuspenduj bakterie w każdej studni za pomocą pipety wielokanałowej. Zmierz OD600 za pomocą odpowiedniego czytnika mikropłytek, aby potwierdzić wzrost we wszystkich studniach z wyjątkiem kontroli sterylności w rzędzie H. Użyj czytnika płytek wyposażonego w komorę inkubacyjną i zdolnego do kinetycznych pomiarów fluorescencji w celu wykrycia konwersji rezazureny. Skonfiguruj 24-godzinny kinetyczny pomiar fluorescencji przy wzbudzeniu 530 nanometrów i emisji 590 nanometrów.

Ustaw temperaturę komory na 37 °C i zaprogramuj odczyt płytki co 20 minut. Skonfiguruj czytnik płytek tak, aby pomiar odbywał się od dołu płytki, zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotuj płytkę do płukania, dodając za pomocą pipety wielokanałowej 200 µL PBS do każdego dołka sterylnej płytki 96-dołkowej.

Następnie należy przygotować pożywkę do regeneracji biofilmu, dodając 400 µL roztworu zapasu rezazureny o stężeniu 0,8 mg/mL do 20 mL pożywki CRPMI, tak aby końcowe stężenie rezazureny wynosiło 16 µg/mL. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej, należy dodać 150 µL pożywki do regeneracji biofilmu do każdego dołka nowej płytki 96-dołkowej. Płytkę z wyzwaniem należy przenieść z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza, a następnie ostrożnie usunąć plastikową torebkę i folię uszczelniającą.

Zdejmij pokrywkę z kołkami z płytki testowej i wypłucz komórki planktoniczne w PBS w taki sam sposób jak poprzednio, zachowując dno płytki testowej do późniejszej analizy OD600. Po wypłukaniu umieść pokrywkę z kołkami w dnie płytki zawierającym medium do odzyskiwania biofilmu. Owiń boki płytki folią parafinową, uważając, aby nie zasłonić dna zewnętrznych dołków.

Niezwłocznie po owinięciu płytki umieść ją w czytniku płytek i rozpocznij pomiar kinetyczny przez okres 24 godzin, uruchamiając wcześniej przygotowany protokół kinetyczny dla rezazuryny. Aby określić wzrost komórek planktonicznych, który mógł lub nie mógł wystąpić podczas testu, zmierz OD600 dna całej płytki testowej za pomocą czytnika mikro płytek. Przedstawiono tutaj przykładowy układ płytki testowej, z wykorzystaniem dwóch pełnych rozcieńczeń w celu miareczkowania stężeń związku.

Wyhodowane biofilmy poddano działaniu neocuproiny lub jej kompleksu miedzi. Odczyty OD600 z dna płytki testowej po 24 godzinach wykazały, że kompleks miedzi z neocuproiną, ale nie sama neocuproina, zapobiegał uwalnianiu i późniejszemu wzrostowi żywych komórek z potraktowanych biofilmów w stężeniach 1.25 micromolar lub wyższych. Następnie odpowiadające im biofilmy przetestowano za pomocą testu z rezazuryną.

Wizualna inspekcja po 24 godzinach pozwala na szybką odpowiedź tak/nie w przypadku równoległego badania wielu płytek. Rezazuryna zmienia kolor na różowy w studzienkach z żywymi biofilmem, natomiast pozostaje niebieska, gdy biofilm został usunięty. Kinetyczny pomiar konwersji rezazuryny może ujawnić efekty zależne od stężenia w odniesieniu do żywotności biofilmu, co pokazano tutaj na przykładzie gentamycyny.

Zależne od stężenia opóźnienie w początkowej konwersji barwnika wskazuje na spadek żywotności biofilmu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie uderzać pinami o ścianki studzienek.