Celowanie w Staphylococcus aureus związany z biofilmem za pomocą testu wrażliwości na leki opartego na resazurynie

Ogólnym celem tej procedury jest łatwy i powtarzalny wyhodowanie biofilmów bakteryjnych w formacie 96-dołkowej płytki na kołkach przymocowanych do pokrywki w celu zbadania wrażliwości na antybiotyki przy użyciu barwnika żywotności. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania i opracowywania antybiotyków poprzez badanie działań na komórkach związanych z biofilmem, które często są bardziej reprezentatywne dla stanów infekcji in vivo. Główną zaletą tej techniki jest możliwość łatwego zakwestionowania wstępnie uformowanych biofilmów w trzyczęściowym teście pożywki i określenia inhibicji przy użyciu zwykłego barwnika żywotności.

Na początek wyhoduj kulturę organizmu wytwarzającego biofilm w pożywce bogatej w składniki odżywcze. Zaszczepić szczep Staphylococcus aureus Newman z łodygi glicerolu w 10 mililitrach pożywki Mullera-Hintona. Wszystkie prace związane z obchodzeniem się z S.aureus należy wykonywać w rękawicach i w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Inkubować przez 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce obrotowej. Dodaj obliczoną objętość kultury do probówki wirówkowej i osadzaj komórki, wirując przez jedną minutę w temperaturze 10 000 Gs.To przygotować inokulum biofilmu, odessać zużytą pożywkę wzrostową i ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 mililitrach CRPMI. Używając pipety wielokanałowej o pojemności 200 mikrolitrów, dodaj 125 mikrolitrów inokulum ze zbiornika o pojemności 25 mililitrów do każdej studzienki rzędów od A do G dolnej płytki.

Napełnij 125 mikrolitrów sterylnej pożywki CRPMI w każdym dołku rzędu H jako kontrolę sterylności. Weź pokrywkę kołka i przytrzymaj ją nad dnem talerza, tak aby kołki były skierowane w dół. Ostrożnie wyrównaj poszczególne kołki z odpowiednimi dołkami.

Unikaj fizycznego kontaktu między płytą a kołkami. Po wyrównaniu ostrożnie opuść pokrywę w dół. Uszczelnij pokrywkę do talerza folią parafinową, aby zapobiec parowaniu, i umieść ją w zamykanej plastikowej torbie, szczelnie zamykając.

Utrzymuj objętość powietrza w worku na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować parowanie. Inkubować płytkę bez wstrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. W dniu wyzwania dotyczącego biofilmu należy wziąć świeżą 96-dołkową płytkę i dodać 100 mikrolitrów CRPMI, zrównoważonych do temperatury pokojowej, do każdej studzienki rzędu B do H. Rozcieńczyć oddzielnie do czterech badanych związków w 1,0 mililitra CRPMI, do 2x pożądanego stężenia końcowego.

Dodać 200 mikrolitrów związku 1 w studzienkach A1-A3.200 mikrolitrów związku 2 w studzienkach A4-A6.200 mikrolitrów związku 3 w studzienkach A7-A9. I 200 mikrolitrów związku 4 w studzienkach A10-A12. Seryjnie rozcieńczyć badane związki za pomocą pipety wielokanałowej.

Zacznij od przeniesienia 100 mikrolitrów z rzędu A do rzędu B i wymieszaj. W ten sposób kontynuuj przenoszenie 100 mikrolitrów ze studni do studni. Wymieszaj po każdym przeniesieniu i zatrzymaj się w rzędzie F. Po wymieszaniu wyrzuć 100 mikrolitrów z rzędu F do pojemnika na odpady.

Nie przenoś żadnych płynów do rzędów G i H. Na koniec dodaj 100 mikrolitrów CRPMI do każdego dołka płytki za pomocą pipety wielokanałowej, aby doprowadzić końcową objętość do 200 mikrolitrów. Dodać 200 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do świeżej, sterylnej, 96-dołkowej płytki, która zawiera studzienki o wymiarach identycznych z wymiarami płytki inicjującej biofilm. Następnie wyjmij plastikową torbę i folię parafinową z inkubowanej płytki inicjującej biofilm.

Podnieś pokrywkę prosto do góry, unikając kontaktu kołków z dnem płytki, ponieważ może to spowodować uszkodzenie biofilmu. Zachowaj dolną część do późniejszej analizy OD600. Spłukać komórki planktonu, umieszczając wieczko kołka na płytce zawierającej PBS.

Zanurz kołki na pięć sekund. Wyjmij je z PBS i zanurz jeszcze raz, uważając, aby nie uderzyć kołkami o boki studni. Umieść wypłukaną pokrywkę kołka w talerzu wyzwania.

Unikaj niepotrzebnego kontaktu kołków z dolną płytą, ponieważ spowoduje to uszkodzenie biofilmu, prowadząc do niespójnych wyników. Uszczelnij płytkę folią parafinową i umieść w zamykanej plastikowej torbie, tak jak poprzednio. Inkubować płytkę, bez wstrząsania, przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.

Weź dolną część płytki inicjującej biofilm i ponownie zawiesić bakterie w każdym dołku za pomocą pipety wielokanałowej. Zmierzyć zawartość OD600 za pomocą odpowiedniego czytnika mikropłytek, aby potwierdzić wzrost zachodzący we wszystkich studzienkach z wyjątkiem kontroli sterylności w rzędzie H. Użyć czytnika płytek wyposażonego w komorę inkubacyjną i zdolnego do wykonywania odczytów fluorescencji kinetycznej w celu wykrycia konwersji rezazuryny. Ustaw 24-godzinny pomiar fluorescencji kinetycznej przy użyciu wzbudzenia 530 nanometrów i emisji 590 nanometrów.

Ustaw temperaturę komory na 37 stopni Celsjusza i odczytuj tabliczkę co 20 minut. Ustaw czytnik płytek tak, aby mierzył od spodu płytki zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować się do umycia płytki, dodając 200 mikrolitrów PBS do każdego dołka sterylnej płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej.

Następnie przygotuj pożywkę do odzyskiwania biofilmu, dodając 400 mikrolitrów 0,8 miligrama na mililitr roztworu podstawowego rezazuryny do 20 mililitrów pożywki CRPMI, do końcowego stężenia 16 mikrogramów na mililitr rezazuryny. Następnie dodaj 150 mikrolitrów pożywki do odzyskiwania biofilmu za pomocą pipety wielokanałowej do każdego dołka świeżej 96-dołkowej płytki. Przenieś płytkę prowokacyjną z inkubatora do szafki bezpieczeństwa biologicznego i ostrożnie wyjmij plastikową torbę i folię uszczelniającą.

Zdjąć pokrywkę kołka z płytki prowokacyjnej i spłukać komórki planktonowe w PBS, tak jak poprzednio, zachowując spód płytki prowokacyjnej do późniejszej analizy OD600. Po spłukaniu umieść pokrywkę kołka w dnie płytki zawierającej pożywkę do odzyskiwania biofilmu. Owiń bok płyty folią parafinową, uważając, aby nie zasłaniać dna studzienek obwodowych.

Natychmiast po owinięciu płytki należy umieścić ją na czytniku płytek i rozpocząć odczyt kinetyczny w ciągu 24 godzin, inicjując wcześniej wykonany protokół reazurynowo-kinetyczny. Aby określić ilościowo wzrost komórek planktonowych, który może, ale nie musi wystąpić podczas prowokacji, odczytaj OD600 z całego dna płytki prowokacyjnej za pomocą czytnika mikropłytek. Pokazany tutaj jest przykładowy układ płytki prowokacyjnej, wykorzystujący dwa pełne rozcieńczenia do miareczkowania stężeń związków.

Wyhodowane biofilmy potraktowano neokuproiną lub jej kompleksem miedziowym. Odczyty OD600 na dnie płytki prowokacyjnej po 24 godzinach wykazały, że kompleks miedziowy neomiedzi, ale nie sama neocuproina, zapobiegał wydalaniu, a następnie wzrostowi żywotnych komórek z traktowanych biofilmów w stężeniach 1,25 mikromola lub wyższych. Odpowiednie biofilmy zostały następnie przetestowane za pomocą testu rezazuryny.

Kontrola wzrokowa po 24 godzinach pozwala na szybką odpowiedź "tak" lub "nie", jeśli wiele płyt jest uruchamianych równolegle. Rezazuryna zmienia kolor na różowy w studzienkach z żywotnymi biofilmami, ale pozostaje niebieska, gdy biofilm zostanie wyeliminowany. Odczyt kinetyczny konwersji resazuryny może ujawnić zależny od stężenia wpływ na żywotność biofilmu, jak pokazano w przypadku gentamycyny.

Zależne od stężenia opóźnienie w rozpoczęciu przemiany barwnika wskazuje na spadek żywotności biofilmu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie uderzać kołkami o bok studzienek.