Protokół krok po kroku dla chirurgii podsiatkówkowej u królików

Ogólnym celem tej interwencji chirurgicznej jest zastąpienie dysfunkcyjnego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) w celu znalezienia możliwego lekarstwa na choroby związane z RPE, takie jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie optometrii dotyczące terapii komórkowej i zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona zapewnić modalność transportu substratu zastępującego komórki lub urządzeń dostarczających leki do przestrzeni podsiatkówkowej.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat witrektomii i chirurgii podsiatkówkowej u królików, może być również stosowana na innych organizmach modelowych, takich jak świnie, małpy lub ludzie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ nie tylko chirurgia wewnątrzgałkowa jest złożona, ale także personel, organizacja i technologia tej procedury muszą być dobrze zsynchronizowane. Procedurę ładowania narzędzi zademonstrują Fabian Thieltges, doktor habilitowany, i Ralf Brinken, pielęgniarz chirurgiczny, obaj z mojego laboratorium.

Przed przystąpieniem do zabiegu należy potwierdzić odpowiedni poziom znieczulenia i nałożyć maść na drugie nieoperowane oko zwierzęcia. Następnie umieść królika pod mikroskopem chirurgicznym po jego lewej stronie, z prawym okiem skierowanym do góry i nosem lekko uniesionym przez fałd koca. Dezynfekuj oko przez minutę kilkoma kroplami jodu powidonu.

Następnie przepłucz oko sterylnym BSS i przykryj głowę zwierzęcia sterylną serwetą z wyciętym otworem na oko. Umieść na oku kawałek lepkiej serwety do nacięcia chirurgicznego o wymiarach 12 na 17 centymetrów i użyj nożyczek, aby odsłonić oko z poziomym nacięciem w linii środkowej. Za pomocą odwróconych suwmiarki przesuń oko do pozycji wyprostowanej i zabezpiecz tkankę jedwabnym szwem 3-0.

Następnie użyj nożyczek Vannas, aby naciąć spojówkę w pobliżu rąbka, około jednego milimetra od sąsiednich naczyń krwionośnych i powiększyć peritomię równolegle do rąbka. Dosadnie oddziel spojówkę, a następnie prostopadłe pionowe nacięcie o długości od sześciu do siedmiu milimetrów, aby utworzyć T"w spojówce. Wykonaj kolejną małą peritomię wokół godziny 2

Następnie ostrożnie przełóż końcówkę ostrza mikrowitreoretinalnego o rozmiarze 23 przez twardówkę, kierując się w stronę tylnego bieguna oka w odległości 3,5 milimetra od rąbka w pozycji godziny 8. Aby uniknąć powiększenia nacięcia, powoli cofnij ostrze w tym samym kierunku i wstępnie umieść szew 7-0 Vicryl. Następnie włóż niestandardową boczną kaniulę infuzyjną do otworu twardówki i użyj wstępnie założonego szwu, aby zabezpieczyć kaniulę.

Ustaw ciśnienie wewnątrzgałkowe na 20 do 24 milimetrów słupa rtęci. Następnie użyj trokaru z płaską głowicą o rozmiarze 25, aby przebić twardówkę w pozycji godziny 2 i włóż żyrandol o rozmiarze 25 do portu. Zabezpiecz światło taśmą i ustaw je na około 30% mocy, a następnie dostosuj indywidualnie.

Użyj skalpela 20, aby usunąć obrzęknięty nabłonek rogówki, aby ułatwić lepszą wizualizację wewnątrzgałkową. Teraz wykonaj kolejną sklerotomię za pomocą ostrza mikrowitreoretinalnego o rozmiarze 23 na godzinie 10 i umieść szew Vicryl 7-0 w kształcie litery U wokół naciętej twardówki bez całkowitego wiązania węzła. Włóż końcówkę witrektora o dużej prędkości do nacięcia i rozpocznij witrektomię wokół portu wejściowego.

Pokrój ciało szkliste na małe kawałki z maksymalną szybkością od 2 000 do 3 000 cięć na minutę, kontynuując witrektomię nad tarczą nerwu wzrokowego i włóknistymi rdzeniami i odsysając maksymalnie 200 milimetrów słupa rtęci. Aby delikatnie oddzielić ciało szkliste od siatkówki, przytrzymaj wirektor nad tylnym biegunem i dolną częścią dysku i kontynuuj aspirację bez cięcia. Po zakończeniu tylnego odwarstwienia ciała szklistego należy wstrzyknąć około 50 mikrolitrów interesującego nas związku, aby uwidocznić pływające ciało szkliste podczas jego prawie całkowitego usunięcia.

Po przygotowaniu oka należy trzykrotnie przepłukać hodowlę komórek implantacyjnych nieuzupełnionym BSS klasy okulistycznej. Następnie napełnij naczynie do hodowli komórkowych o wymiarach 100 na 20 milimetrów 10 mililitrami BSS klasy okulistycznej i dodaj wkładkę do hodowli komórkowej do naczynia. Wyśrodkuj naczynie pod mikroskopem świetlnym i użyj ostrej, owalnej, wykonanej na zamówienie pustej igły, aby wybić płaskie podłoże w kształcie fasoli o wymiarach 2,4 na 1,1 milimetra z dwiema długimi krawędziami i dwiema okrągłymi krawędziami z hodowli komórkowej.

Delikatnie przelej igłę przez drugi port za pomocą BSS, aby przepłukać implant do naczynia do hodowli komórkowej wypełnionej BSS. Aby uzyskać trzecią krawędź, należy wykonać nacięcie o grubości 0,5 mililitra w jednym z okrągłych końców implantu i użyć kleszczyków do peelingu membrany o rozmiarze 23, aby przenieść implant do specjalnie przygotowanej stacji ładowania. Upewnij się, że implant jest w pozycji pionowej, a następnie użyj kleszczy, aby delikatnie wepchnąć implant całkowicie w instrument strzelecki, aż cała tkanka zostanie zabezpieczona wewnątrz końcówki i umieść końcówkę strzelca w stacji ładującej pod BSS, aż komórki zostaną wszczepione.

Aby umożliwić implantację komórek pod siatkówką, należy zbliżyć się do siatkówki nerwowej za pomocą wysuwanej igły do wstrzykiwań podsiatkówkowych o rozmiarze 41 rozmiarów podłączonej do gazoszczelnej strzykawki i wstrzyknąć podsiatkówkowo BSS, aby utworzyć odwarstwienie siatkówki pęcherzykowej. Gdy pęcherzyk ma około 2 do 3 średnic dysku, użyj pionowych nożyczek VR o rozmiarze 23, aby powiększyć retinotomię do 1,5 milimetra i użyj noża do nacięcia 1,4 milimetra, aby precyzyjnie przedłużyć sklerotomię na godzinie 10 do podejścia o rozmiarze 20. Następnie spróbuj przepuścić manekina strzelca kalibru 20 przez sklerotomię, powiększając nacięcie w razie potrzeby, aby zapewnić płynne, ale dokładne przejście załadowanego strzelca.

Następnie przełóż załadowanego strzelca przez nacięcie twardówki na 20 do 24 milimetrach rtęci do krawędzi retinotomii i wstrzyknij implant podsiatkówkowo z pozycji nasiatkówkowej. Strzelec powinien szybko przejść przez twardówkę za pierwszym razem, więc upewnij się, że sklerotomia jest optymalnego rozmiaru. Komórki RPE należy następnie wszczepić podsiatkówkowo pod płytkim kątem, aby uniknąć uwięzienia krawędzi czołowej implantu w błonie Brucha.

Wyreguluj implant tak, aby znajdował się pod siatkówką w rozsądnej odległości od retinotomii. Następnie usuń port ze sklerotomii i wstrzyknij 25 mikrolitrów triamcynolonu przez port żyrandola. Za pomocą szwów 7-0 zamknij sklerotomię na godzinie 2 i 10 i sprawdź, czy nie ma wycieku.

Wyjmij kaniulę infuzyjną i natychmiast zamknij ostatnią sklerotomię za pomocą wstępnie założonego szwu 7-0 Vicryl. Za pomocą igły o rozmiarze 30 wstrzyknąć BSS, aby w razie potrzeby wyregulować ciśnienie wewnątrzgałkowe, jednocześnie dotykając palca. Na koniec zszyj spojówkę 7-0 Vicryl i usuń jedwab proptozyjny, uważając, aby uniknąć głębokiego splotu żylnego oczodołu.

Wszczepienie pod siatkówkę ma wskaźnik powodzenia chirurgicznego wynoszący około 60% po wykonaniu witrektomii grubogłowej, który wzrasta do ponad 75% po wywołaniu tylnego odwarstwienia ciała szklistego. Pokazano tu skaningowy obraz refleksyjny w podczerwieni oftalmoskopu ksenotransplantowanego nabłonka barwnikowego siatkówki z hodowli na membranie poliestrowej po nieskomplikowanym zabiegu, z atrofią fotoreceptora wynikającą z reakcji immunologicznej pojawiającą się jako aureola wokół implantu. Na tym odpowiednim obrazie optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej można zaobserwować ścieńczenie zewnętrznej warstwy jądrowej w odpowiedzi na ksenotransplantację RPE, głównie w siatkówce z widocznym pasmem hiperrefleksyjnym nad implantem.

Siatkówka nerwowa przylegająca do implantu wykazuje jednak prawie normalne pasma odbicia, co sugeruje atraumatyczne dostarczenie implantu. Jak zaobserwowano w barwieniu H/E, bliznowacenie podsiatkówkowe i atrofia zewnętrznej warstwy jądrowej występują u ksenoprzeszczepionych królików bez immunosupresji. Błona Brucha pod implantem również wydaje się być przyległa, a naczyniówka włosowata zawiera rozproszone erytrocyty, co dodatkowo potwierdza brak urazu powstałego podczas dostarczania implantu.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli nie wystąpią żadne komplikacje. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wytworzeniu pęcherzyka siatkówki i retinotomii na tyle dużej, aby zmieścić się na implantie. Ponadto szybsza interwencja chirurgiczna zazwyczaj przynosi lepsze wyniki.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak optyczna koherentna tomografia lub histologia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak powodzenie przeszczepu, biokompatybilność podsiatkówkowa i przeżycie przeszczepionych komórek. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek macierzystych i biomateriałami do zbadania podsiatkówkowego dostarczania pochodnych komórek macierzystych i/lub biofunkcjonalizowanych substratów nośnikowych w chorobach siatkówki, w szczególności RPE. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać witrektomię i operację implantacji podsiatkówkowej u królików.

Nie zapominaj, że praca z soczewką, interfejsem szklistkowo-siatkówkowym i podsiatkówkowym może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak prawidłowe ułożenie dłoni, dobra wizualizacja, stabilne ciśnienie wewnątrzgałkowe.