Name: Protokół krok po kroku dla chirurgii podsiatkówkowej u królików (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Poznaj technikę chirurgii podsiatkówkowej u królików w celu transplantacji nabłonka barwnikowego siatkówki. Ta metoda umożliwia badanie terapii komórkowych w leczeniu zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez granty Fundacji Rüdiger w 2008 i 2010 roku (BVS), stypendium BONFOR/Gerok O-137.0015 (BVS), stypendium BONFOR/Gerok O-137.0019 (FT), Deutsche Forschungsgemeinschaft/ DFG (BVS) STA 1135/2-1, Chińską Radę Stypendialną nr 2008627116 (ZL) oraz nieograniczoną dotację Geuder AG, Heidelberg (Rys. 2). Członkowie laboratorium H. Skottmana, University of Tampere w Finlandii są wdzięczni za dostarczenie RPE pochodzącego z hES, pokazanego na ryc. 2.

Etyka obchodzenia się ze zwierzętami w badaniach okulistycznych: Uzyskaliśmy zgodę Komisji Etycznej Wydziału Medycznego Uniwersytetu w Bonn i przestrzegamy wytycznych określonych przez Stowarzyszenie Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO). Ponadto wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez krajowe organy regulacyjne Nadrenii Północnej-Westfalii. Zwierzęta przetrzymywano w pomieszczeniach zamkniętych w specjalistycznym obiekcie w klimatyzowanym pomieszczeniu o temperaturze od 18 do 20 °C, ekspozycji na regularne światło dzienne, w znormalizowanych indywidualnych klatkach ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.

Uwaga: Aby upewnić się, że zwierzęta mają powinowactwo operacyjne, stosuje się arkusz oceny zdrowia zwierząt, który zawiera następujące ostateczne kryteria wykluczenia zwierząt: utrata masy ciała o 20% w porównaniu z wagą przy przyjęciu; widoczna sinica zwierzęcia; zwierzę drży, ma skurcze lub nie może poruszać się w koordynacji; ataksja/parestezje, np. paraliże; apatia; ekstremalne okaleczenia automatyczne (rany skóry, odcięte kończyny).

1. Sterylizacja narzędzi
<ol>
	<li>Umieść narzędzia wielokrotnego użytku w kąpieli ultradźwiękowej.</li>
	<li>Dodać 500 ml wody destylowanej i 2 ml płynu do dezynfekcji narzędzi.</li>
	<li>Czyść instrumenty za pomocą funkcji przemiatania przez 15 minut.</li>
	<li>Wyjąć narzędzia z kąpieli ultradźwiękowej i dokładnie spłukać wodą destylowaną przez 5 minut.</li>
	<li>Włóż narzędzia do autoklawu i użyj standardowego programu (sterylizacja narzędzi w temperaturze poniżej 121 ºC przez 20 minut).</li>
</ol>
2. Przygotowanie instrumentu
<ol>
	<li>Stwórz i utrzymuj sterylne pole, pracując w zamkniętym pomieszczeniu, nosząc fartuchy chirurgiczne, maskę i osłonę włosów. Zdezynfekuj ręce przed założeniem sterylnych rękawic chirurgicznych. Szczegółowe informacje na ten temat znajdują się w punkcie 28.</li>
	<li>Umieść wysterylizowane narzędzia na sterylnym serwecie.</li>
	<li>Umieścić 1 ml strzykawkę wypełnioną 40 mg triamcynolonu przymocowaną do igły 27 G do wstrzykiwań, 10 ml strzykawkę z roztworem soli Balance (BSS) i 5 ml strzykawkę z lubrykantem na serwie.</li>
	<li>Umieść 3-0 jedwabiu, 7-0 wikrylu, patyczki do oczu (aby zatrzymać krwawienie ze spojówek / twardówki), gąbki z gazy twister, paski do zamykania ran (do zamocowania rurki końcówki witrektomii) i drut z włókna do endooświetlenia żyrandola na zasłonie.</li>
	<li>Rozwiń endoiluminator żyrandola 25 G i podłącz do maszyny oświetleniowej przy użyciu sterylnych technik (patrz krok 2.1). Podłącz zestaw do witrektomii, w tym szybki witrektor i kasetę Venturiego, do urządzenia do witrektomii przy użyciu sterylnych technik (patrz krok 2.1).</li>
	<li>Otwórz butelkę BSS o pojemności 500 ml i podłącz roztwór do kasety Venturiego zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
3. Przygotowanie znieczulenia i ułożenie zwierzęcia
<ol>
	<li>Zważ zwierzę, aby zapewnić dokładne dawkowanie leków.</li>
	<li>Na początek przygotować znieczulenie domięśniowe (IM) za pomocą 1 strzykawki z igłą 27 G zawierającą 0,35 mg/kg ketaminy i 0,25 mg/kg medetomidyny. Odwrócić strzykawkę, aby wymieszać.</li>
	<li>Przygotuj 2 strzykawki z 1/3 dawek, aby utrzymać znieczulenie podczas operacji.</li>
	<li>Przygotować strzykawkę zawierającą 20 ml 5% roztworu glukozy i igłę 18 G do wstrzykiwań podskórnych jako alternatywę dla infuzji dożylnej.</li>
	<li>Podaj 3 x 1 krople rozszerzania źrenic przed witrektomią w celu rozszerzenia źrenicy.</li>
	<li>Przykryj królika kocem, aby uspokoić się przed wstrzyknięciem znieczulenia, wstrzyknij w tylną kończynę (mięsień pośladkowy) i masuj wokół miejsca wstrzyknięcia przez 30 sek. 
	Uwaga: Pierwszy zastrzyk znieczulenia domięśniowego trwa około 1 - 2 godzin, w zależności od wielkości królika, tolerancji leku, warstwy tłuszczu, stresu i temperatury ciała. Pierwszą oznaką ustąpienia znieczulenia jest oczopląs (musi być monitorowany przez chirurga), kolejne iniekcje trwają około 30 - 45 min.</li>
	<li>Potwierdź prawidłowe znieczulenie, weryfikując hipnozę, hiporefleksję, analgezję i rozluźnienie mięśni zwierzęcia.</li>
	<li>Wykonać wstrzyknięcie podskórne (pkt. 3.3) w fałd skórny szyi, gdy królik jest nieprzytomny.</li>
	<li>Dodawaj smar metylocelulozowy co 5 - 10 minut do operowanego oka, dodaj smar i zaklej pokrywki taśmą do nieoperowanego oka.</li>
	<li>Umieść przykrytego królika na stole operacyjnym obciągniętym pokrowcem, takim jak bawełniany koc, w optymalnej pozycji (nos lekko uniesiony przez formę koca, tak aby znajdował się na poziomie powierzchni oka) pod mikroskopem operacyjnym. Ustaw oko prostopadle do obiektywu mikroskopu.</li>
	<li>Zapewnić odpowiednią temperaturę ciała za pomocą termometru doodbytniczego (normothermia 39 ± 1 ºC)29.</li>
	<li>Obetnij rzęsy nożyczkami (trochę maści na ostrzu), aby zmniejszyć infekcje pooperacyjne.</li>
	<li>Zdezynfekuj oko za pomocą 2 - 3 kropli 0,1 g/ml Povidone-Jodine miejscowo przez 1 minutę i przepłucz sterylnym BSS.</li>
	<li>Przykryj oko sterylną serwetą z wyciętym otworem pośrodku na oko, a następnie przykryj (lepką) serwetą do nacięcia chirurgicznego o wymiarach 12 x 17 cm.</li>
</ol>
4. Witrektomia
<ol>
	<li>Wyrównaj i zabezpiecz oko jedwabiem 3-0 za pomocą odwróconej suwmiarki i wykonaj peritomię spojówek.
	<ol>
		<li>Naciąć spojówkę nożyczkami vannas blisko rąbka, ale wystarczająco daleko od naczyń krwionośnych (odległość ~1 mm).</li>
		<li>Wypreparuj spojówkę, tworząc "cięcie w kształcie litery T". Najpierw powiększ peritomię nożyczkami równolegle do rąbka, a następnie nacij spojówkę pionowo w kształcie litery "T" na około 6 - 7 mm. Ostrożnie tępo oddziel spojówkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj sklerotomię za pomocą ostrza mikrowitreoretinalnego (MVR) 23 G na godzinie 8 na prawym oku/OD (godzina 4 na lewym oku/OS), ostrożnie wkładając ostrą końcówkę ostrza w kierunku nerwu wzrokowego. Powoli ostrze w tym samym kierunku i unikaj powiększania sklerotomii.</li>
	<li>Włóż i zszyj niestandardową boczną kaniulę infuzyjną27 za pomocą jedwabnego szwu 7-0 i ustaw ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) na 24 mmHg.</li>
	<li>Wykonaj sklerotomię z trokarem płaskiej głowy 25 G o godzinie 2 na godzinie OD (godzina 10 na OS) podobnie jak w kroku 4.2.</li>
	<li>Włóż żyrandol 25 G do trokara z płaską głowicą, zamocuj taśmą klejącą i włącz źródło światła na ok. 30%.</li>
	<li>W razie potrzeby usuń obrzęknięty nabłonek rogówki za pomocą skalpela #20, aby uzyskać lepszą wizualizację wewnątrzgałkową.</li>
	<li>Wykonaj sklerotomię podobną do kroku 4.2 na godzinie 10 na godzinie OD (godzina 2 na OS), (pre-) umieść szwy 7-0 w kształcie litery U wokół sklerotomii bez wiązania węzła i włóż końcówkę noża do witrektomii.</li>
	<li>Rozpocznij witrektomię30 wokół portu wejściowego, a następnie kontynuuj przez tarczę nerwu wzrokowego i włókniste rdzenie za pomocą witrektora o dużej prędkości, tnąc ciało szkliste na małe kawałki z maksymalną prędkością 2.000 - 3.000 cięć/min, zasysając przy maksymalnej prędkości 200 mmHg przy użyciu podanej konfiguracji parametrów urządzenia do witrektomii (Tabela 1)</li>
	<li>Wykonaj tylne odwarstwienie ciała szklistego (PVD), oddzielając ciało szkliste od siatkówki, przytrzymując wolnoobrotowy wirektor nad tylnym biegunem i (jeśli to możliwe, delikatnie) nad dyskiem31, zasysając tylko przy maksymalnej prędkości 200 mmHg bez cięcia.</li>
	<li>Wstrzyknąć ok. 50 μl (20 mg) triamcynolonu lub rozcieńczonej fluoresceiny (ok. 0,1 mg/ml) doszklistkowo, aby uwidocznić i ułatwić (prawie całkowite) usunięcie pływającego ciała szklistego nad tylnym biegunem i środkowym obwodem podczas witrektomii. Unikaj przechodzenia pod obiektywem. Wgłębienie w celu golenia obwodowego ciała szklistego przez (wykwalifikowanego) asystenta jest zalecane, jeśli pożądana jest tamponada gazowa.</li>
	<li>Dodać 20 jednostek/ml heparyny i 0,5 mg epinefryny do końcowego stężenia 0,001 mg/ml do roztworu do infuzji BSS równolegle lub po kroku 4.10. 
	Uwaga: Ponieważ heparyna/epinefryna nie są wstrzykiwane do gałki ocznej, ich działanie jest opóźnione w zależności od szybkości przepływu infuzji.</li>
</ol>
5. Wczytywanie strzelanki
Uwaga: Praca opisana w niniejszym dokumencie nie podlega założeniom Deklaracji Helsińskiej; nie dotyczyła pacjentów. W tym przypadku standardowe komórki RPE zostały wyizolowane z płodowych oczu ludzkich, wyhodowane i zróżnicowane na niepowlekanych wkładkach poliestrowych (PET) o grubości 10 μm zgodnie z naszym wcześniej opublikowanym protokołem14. Pozwolenie na pracę z materiałem z ludzkiego płodu uzyskano od komisji etycznej Uniwersytetu w Bonn. Alternatywnie, hES-RPE zostały wysłane z laboratorium Skottmana (manuskrypt w przygotowaniu), gdzie zostały wyhodowane zgodnie z techniką opisaną przez Vaajasaari i wsp. Lokal mieszkalny 32; dla tych komórek uzyskano pozwolenie od Instytutu R. Kocha w Berlinie, Niemcy.
<ol>
	<li>Kulturę komórkową należy przepłukać przed przygotowaniem implantu 3x za pomocą BSS klasy okulistycznej.</li>
	<li>Napełnij standardowe naczynie do hodowli komórkowych (100 x 20 mm) 10 ml BSS klasy okulistycznej.</li>
	<li>Dodaj wkładkę do hodowli komórkowej do BSS i wyśrodkuj naczynie pod mikroskopem świetlnym.</li>
	<li>Wybij implant o wymiarach 2,4 x 1,1 mm, owalną, wykonaną na zamówienie igłą, aby uzyskać płaskie podłoże w kształcie fasoli z dwiema długimi krawędziami i dwiema okrągłymi krawędziami.</li>
	<li>Delikatnie przelej igłę przez drugi port za pomocą BSS, aby wypłukać implant do wypełnionej BSS niestandardowej stacji ładującej (rysunek 1).</li>
	<li>Opcjonalnie należy przyciąć jeden okrągły koniec implantu (<0,5 mm), aby uzyskać trzecią krawędź.</li>
	<li>Upewnij się, że implant jest we właściwej orientacji, upewniając się, że monowarstwa znajduje się do góry nogami na nośniku komórek. Aby ostrożnie zmienić pozycję, użyj dwóch skalpeli.</li>
	<li>Delikatnie i całkowicie wepchnij implant do narzędzia strzeleckiego za pomocą uchwytu na igłę, aż cały implant zostanie zamocowany wewnątrz końcówki. Tłok powinien pozostać wsunięty.</li>
	<li>Trzymaj "załadowaną" końcówkę strzelca w stacji załadowczej pod BSS do momentu implantacji.</li>
</ol>
6. Implantacja
<ol>
	<li>Zbliżyć się do siatkówki nerwowej za pomocą wysuwanej igły do wstrzykiwań podsiatkówkowych o gramaturze 41 G podłączonej do gazoszczelnej strzykawki (upewnij się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte z rurki!).</li>
	<li>Wstrzyknąć BSS (z wapniem i magnezem/ CM) podsiatkówkowo, tworząc w ten sposób odwarstwienie siatkówki pęcherzykowej (bRD) o średnicy około 2 - 3 średnicy tarczy (DD). Dwa bRD na oko można bezpiecznie podnieść.</li>
	<li>Powiększ retinotomię do 1,5 mm za pomocą pionowych nożyczek VR 23 G. Przestrzeń podsiatkówkowa jest teraz dostępna do implantacji lub dalszego manewrowania.</li>
	<li>Przedłuż sklerotomię (precyzyjnie) nożem do nacięcia 1,4 mm do podejścia 20 G.</li>
	<li>Spróbuj przejść przez sklerotomię za pomocą manekina strzelca 20 G, powiększ w razie potrzeby, aby zapewnić płynne, ale dokładne przejście załadowanego strzelca.</li>
	<li>Przejść z załadowanym strzelcem27 przez sklerotomię, najlepiej przy 24 mmHg.</li>
	<li>Zbliżyć się do krawędzi retinotomii i wysunąć implant podsiatkówkowo z pozycji nasiatkówkowej.</li>
	<li>Wyreguluj implant za pomocą na wpół zamkniętych nożyczek 23 G, kleszczyków lub igły 41 G, aby upewnić się, że jest umieszczony dobrze pod siatkówką - rozsądnie z dala od retinotomii.</li>
</ol>
7. Zakończenie operacji
<ol>
	<li>Wyjmij żyrandol 25 G i kaniulę infuzyjną.</li>
	<li>Zszyj wszystkie sklerotomie.</li>
	<li>Wstrzyknąć 25 μl (10 mg) triamcynolonu do sklerotomii na godzinie 8 (przed szyciem ostatniej sklerotomii).</li>
	<li>Sprawdzić/wyregulować ciśnienie wewnątrzgałkowe za pomocą badania palpacyjnego i w razie potrzeby wstrzyknąć BSS za pomocą igły/strzykawki 30 G.</li>
	<li>Zszyj spojówkę za pomocą vicrylu 7-0.</li>
	<li>Powoli zdejmuj jedwabną chustę proptosing 3-0 (unikaj głębokiego splotu żylnego oczodołu!).</li>
	<li>Dodaj deksametazon/maść z antybiotykiem pod pokrywką.</li>
	<li>Pozycja na 1 godzinę przykryta kocem z operacyjnym okiem skierowanym do góry (bez gazu) lub w dół (z powietrzem/gazem).</li>
	<li>Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.</li>
	<li>Nie należy transportować królika przed całkowitym ustąpieniem znieczulenia, można to przyspieszyć, wstrzykując środek odwracający działanie medetomidyny w ilości równej podanej medetomidynie.</li>
</ol>
8. Pooperacyjna opieka nad zwierzętami
<ol>
	<li>Trzymaj króliki w odpowiednich warunkach (temperatura, światło, jedzenie, woda, przestrzeń itp.) i ścisłe monitorowanie w specjalistycznym obiekcie.</li>
	<li>Upewnij się, że zwierzę jest dobrze wypoczęte, tj. nie ma dłuższych okresów braku jedzenia lub wody.</li>
	<li>Należy zwrócić uwagę na wszelkie rany lub urazy, zwłaszcza w miejscach wstrzyknięć.</li>
	<li>Utrzymuj rany w suchości, aby zapobiec infekcjom. Podaj antybiotyki w przypadku podejrzenia infekcji: deksametazon 1 mg/g, siarczan neomycyny 3 500 j.m./g, siarczan polimyksyny B 6 000 j.m./g maść nakładano dwa razy dziennie przez 1 tydzień po operacji na powierzchnię oka.</li>
	<li>Dodaj deksametazon/maść z antybiotykiem przez następne 7 dni po operacji dwa razy dziennie, aby uzyskać lepszą regenerację powierzchni oka i zmniejszyć ból pooperacyjny.</li>
	<li>Podawać ogólnoustrojowe leki przeciwbólowe (karprofen 4 mg/kg mc. dwa razy na dobę) przez początkowe 48 godzin.</li>
	<li>Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.</li>
	<li>Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.</li>
	<li>Nie narażaj zwierząt na niepotrzebny stres.</li>
</ol>
9. Wskazówki SLO/SD-OCT
<ol>
	<li>Na początek przygotować i wstrzyknąć znieczulenie domięśniowe za pomocą 1 strzykawki z igłą 27 G zawierającą 0,175 mg/kg ketaminy i 0,125 mg/kg medetomidyny. Odwrócić strzykawkę, aby wymieszać.</li>
	<li>Dodawaj lubrykant co najmniej co 5 minut, aby nawilżyć oko i utrzymać wyraźne obrazowanie SD-OCT, opcjonalnie można użyć niestandardowych soczewek kontaktowych.</li>
	<li>Przymocuj stalową platformę do zagłówka, aby ustabilizować zwierzę w wymaganej pozycji.</li>
	<li>Umieść królika na stalowej platformie, ustawiając jego oko prostopadle do sondy.</li>
	<li>Trzymaj głowę królika z dolnej części kości policzkowej (żuchwy), omijając tchawicę.</li>
	<li>Przechyl głowę zwierzęcia o około 45º w kierunku sondy SD-OCT, aby zoptymalizować kąt widzenia na implancie.</li>
	<li>Użyj obiektywu 30 stopni i następujących parametrów dla optymalnego obrazowania OCT [HS]: ustawienia 30 stopni dla skanów jednoliniowych z trybem ART ustawionym na 100 (uśrednianie) i ustawienia 20 x 20 stopni dla skanów objętościowych z trybem ART ustawionym na 15; tryb wysokiej rozdzielczości nie jest wymagany.</li>
	<li>Użyj obrazowania odbicia w podczerwieni SLO, aby znaleźć płaszczyznę ogniskową implantu (ryc. 2A); optymalna ostrość jest osiągana, gdy (wszystkie) krawędzie implantu są ostre14.</li>
	<li>Po zakończeniu dodać deksametazon 1 mg / g, siarczan neomycyny 3 500 j.m. / g, siarczan polimyksyny B 6 000 j.m./g maść pod pokrywką.</li>
</ol>

<ol><li>Fine, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Earliest+symptoms+caused+by+neovascular+membranes+in+the+macula%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Earliest symptoms caused by neovascular membranes in the macula.</a> Arch Ophthalmol. 104, 513-514 (1986).</li>
<li>Lim, L. S., Mitchell, P., Seddon, J. M., Holz, F. G., Wong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> Lancet. 379, 1728-1738 (2012).</li>
<li>Holz, F. G., Strauss, E. C., Schmitz-Valckenberg, S., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+Atrophy%3A+Clinical+Features+and+Potential+Therapeutic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Geographic Atrophy: Clinical Features and Potential Therapeutic Approaches.</a> Ophthalmology. 121, 1079-1091 (2014).</li>
<li>Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+the+RPE+in+AMD.+Prog+Retin+Eye+Res%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Transplantation of the RPE in AMD. Prog Retin Eye Res.</a> Prog Retin Eye Res. 26, 516-554 (2007).</li>
<li>da Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE+transplantation+and+its+role+in+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">RPE transplantation and its role in retinal disease.</a> Prog Retin Eye Res. 26, 598-635 (2007).</li>
<li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maculoplasty+for+age-related+macular+degeneration%3A+reengineering+Bruch%27s+membrane+and+the+human+macula%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Maculoplasty for age-related macular degeneration: reengineering Bruch's membrane and the human macula.</a> Prog Retin Eye Res. 25, 539-562 (2006).</li>
<li>Gouras, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGouras%2C+P+%22The+retinal+pigment+epithelium%22">The retinal pigment epithelium</a>. Marmor, M. F., Wolfensberger, T. J. , University Press. Oxford. 492-507 (1998).</li>
<li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transplantation+as+a+treatment+for+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Cell transplantation as a treatment for retinal disease.</a> Prog Retin Eye Res. 20, 415-449 (2001).</li>
<li>Blenkinsop, T. A., Corneo, B., Temple, S., Stern, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ophthalmologic+stem+cell+transplantation+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Ophthalmologic stem cell transplantation therapies.</a> Regen Med. 7, 32-39 (2012).</li>
<li>Hirami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+cells+from+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells.</a> Neurosci Lett. 458, 126-131 (2009).</li>
<li>Carr, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+human+embryonic+stem+cell+therapies+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration.</a> Trends in neurosciences. 36, 385-395 (2013).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+Stargardt%27s+macular+dystrophy%3A+follow-up+of+two+open-label+phase+1%2F2+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies.</a> Lancet. 385, 509-516 (2015).</li>
<li>Jha, B. S., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+to+Cure+Blindness%3A+A+Road+Towards+Personalized+Artificial+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Regenerating Retinal Pigment Epithelial Cells to Cure Blindness: A Road Towards Personalized Artificial Tissue.</a> Curr Stem Cell Rep. , 1-13 (2015).</li>
<li>Stanzel, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RPE+Stem+Cells+Grown+into+Polarized+RPE+Monolayers+on+a+Polyester+Matrix+Are+Maintained+after+Grafting+into+Rabbit+Subretinal+Space%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space.</a> Stem Cell Reports. 2, 64-77 (2014).</li>
<li>Hynes, S. R., Lavik, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-engineered+approach+towards+retinal+repair%3A+scaffolds+for+cell+transplantation+to+the+subretinal+space%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A tissue-engineered approach towards retinal repair: scaffolds for cell transplantation to the subretinal space.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248, 763-778 (2010).</li>
<li>Szurman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+implantation+and+long-term+testing+of+an+intraocular+vision+aid+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Experimental implantation and long-term testing of an intraocular vision aid in rabbits.</a> Arch Ophthalmol. 123, 964-969 (2005).</li>
<li>Bhatt, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+transplantation+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+on+collagen+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Experimental transplantation of human retinal pigment epithelial cells on collagen substrates.</a> Am J Ophthalmol. 117, 214-221 (1994).</li>
<li>Nicolini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anterior+lens+capsule+used+as+support+material+in+RPE+cell-transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol+Scand%22%5BJournal%5D)">The anterior lens capsule used as support material in RPE cell-transplantation.</a> Acta Ophthalmol Scand. 78, 527-531 (2000).</li>
<li>Thumann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+and+in+vivo+behaviour+of+retinal+pigment+epithelial+cells+cultured+on+ultrathin+collagen+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The in vitro and in vivo behaviour of retinal pigment epithelial cells cultured on ultrathin collagen membranes.</a> Biomaterials. 30, 287-294 (2009).</li>
<li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+allogeneic+porcine+retinal+pigment+epithelial+sheets+after+subretinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Survival of allogeneic porcine retinal pigment epithelial sheets after subretinal transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 985-992 (2004).</li>
<li>Pritchard, C. D., Arner, K. M., Langer, R. S., Ghosh, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+transplantation+using+surface+modified+poly%28glycerol-co-sebacic+acid%29+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Retinal transplantation using surface modified poly(glycerol-co-sebacic acid) membranes.</a> Biomaterials. 31, 7978-7984 (2010).</li>
<li>Montezuma, S. R., Loewenstein, J., Scholz, C., Rizzo, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+Materials+Implanted+into+the+Subretinal+Space+of+Yucatan+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of Materials Implanted into the Subretinal Space of Yucatan Pigs.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).</li>
<li>Brantfernandes, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+study+in+Mini+Pigs+of+transplanted+Human+Embryonic+Stem+Cell+Derived+Retinal+Pigment+Epithelium+%28hESC-RPE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Safety study in Mini Pigs of transplanted Human Embryonic Stem Cell Derived Retinal Pigment Epithelium (hESC-RPE).</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 312(2012).</li>
<li>Lu, B., Zhu, D., Hinton, D., Humayun, M. S., Tai, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesh-supported+submicron+parylene-C+membranes+for+culturing+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Mesh-supported submicron parylene-C membranes for culturing retinal pigment epithelial cells.</a> Biomed Microdevices. 14, 659-667 (2012).</li>
<li>Boochoon, K. S., Manarang, J. C., Davis, J. T., McDermott, A. M., Foster, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+substrate+elastic+modulus+on+retinal+pigment+epithelial+cell+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanics%22%5BJournal%5D)">The influence of substrate elastic modulus on retinal pigment epithelial cell phagocytosis.</a> Journal of biomechanics. 47, 3237-3240 (2014).</li>
<li>Liu, Z., Yu, N., Holz, F. G., Yang, F., Stanzel, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+retinal+pigment+epithelial+culture+characteristics+and+subretinal+space+tolerance+of+scaffolds+with+200+nm+fiber+topography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhancement of retinal pigment epithelial culture characteristics and subretinal space tolerance of scaffolds with 200 nm fiber topography.</a> Biomaterials. 35, 2837-2850 (2014).</li>
<li>Stanzel, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+delivery+of+ultrathin+rigid-elastic+cell+carriers+using+a+metallic+shooter+instrument+and+biodegradable+hydrogel+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Subretinal delivery of ultrathin rigid-elastic cell carriers using a metallic shooter instrument and biodegradable hydrogel encapsulation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 490-500 (2012).</li>
<li>AORN Recommended Practices Committee. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommended+practices+for+maintaining+a+sterile+field%5BTitle%5D)+AND+%22AORN+J%22%5BJournal%5D)">Recommended practices for maintaining a sterile field.</a> AORN J. 83 (2), 402(2006).</li>
<li>Hong, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic+characteristics+of+cold+perfluorocarbon-induced+hypothermia+during+partial+liquid+ventilation+in+normal+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Physiologic characteristics of cold perfluorocarbon-induced hypothermia during partial liquid ventilation in normal rabbits.</a> Anesth Analg. 94, 157-162 (2002).</li>
<li>Machemer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+pars+plana+vitrectomy%3A+a+personal+account%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The development of pars plana vitrectomy: a personal account.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233, 453-468 (1995).</li>
<li>Los, L. I., van Luyn, M. J., Nieuwenhuis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+rabbit+vitreous+body%3A+lamellae%2C+Cloquet%27s+channel+and+a+novel+structure%2C+the+%27alae+canalis+Cloqueti%27%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Organization of the rabbit vitreous body: lamellae, Cloquet's channel and a novel structure, the 'alae canalis Cloqueti'.</a> Exp Eye Res. 69, 343-350 (1999).</li>
<li>Vaajasaari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+defined+and+xeno-free+differentiation+of+functional+human+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Mol Vis. 17, 558-575 (2011).</li>
<li>Iverson, D. A., Katsura, H., Hartzer, M. K., Blumenkranz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intraocular+fibrin+formation+following+infusion+of+low-molecular-weight+heparin+during+vitrectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intraocular fibrin formation following infusion of low-molecular-weight heparin during vitrectomy.</a> Arch Ophthalmol. 109, 405-409 (1991).</li>
<li>Thieltges, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+implantation+of+human+embryonic+stem+cell+derived+RPE+on+ultrathin+polyester+carriers+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Subretinal implantation of human embryonic stem cell derived RPE on ultrathin polyester carriers in rabbits.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, 1824(2015).</li>
<li>Kamao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+sheets+aiming+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application.</a> Stem Cell Reports. 2, 205-218 (2014).</li>
<li>Seiler, M. J., Aramant, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+sheets+of+fetal+retina+transplanted+to+restore+damaged+rat+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Intact sheets of fetal retina transplanted to restore damaged rat retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 39, 2121-2131 (1998).</li>
<li>Stanzel, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SD-OCT+Complements+Histology+in+Evaluation+of+Potential+Bruch%27s+Membrane+Prosthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">SD-OCT Complements Histology in Evaluation of Potential Bruch's Membrane Prosthetics.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 5241(2010).</li>
<li>Marmor, M. F., Abdul-Rahim, A. S., Cohen, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+metabolic+inhibitors+on+retinal+adhesion+and+subretinal+fluid+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of metabolic inhibitors on retinal adhesion and subretinal fluid resorption.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 19, 893-903 (1980).</li>
<li>Frambach, D. A., Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+and+route+of+fluid+resorption+from+the+subretinal+space+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The rate and route of fluid resorption from the subretinal space of the rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 22, 292-302 (1982).</li>
<li>Kita, M., Negi, A., Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lowering+the+calcium+concentration+in+the+subretinal+space+in+vivo+loosens+retinal+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lowering the calcium concentration in the subretinal space in vivo loosens retinal adhesion.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 33, 23-29 (1992).</li>
<li>Marmor, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+subretinal+fluid%3A+experimental+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Control of subretinal fluid: experimental and clinical studies.</a> Eye. 4 (Pt 2), 340-344 (1990).</li>
<li>Faude, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+artificial+retinal+detachment+for+macular+translocation+surgery+tested+in+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 1328-1337 (2001).</li>
<li>Szurman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+Changes+after+Artificial+Retinal+Detachment+with+Modified+Retinal+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural Changes after Artificial Retinal Detachment with Modified Retinal Adhesion.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 4983-4989 (2006).</li>
<li>Fang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Ca%282%2B%29-free+and+Mg%282%2B%29-free+BSS+Plus+solution+on+the+retinal+pigment+epithelium+and+retina+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Effect of Ca(2+)-free and Mg(2+)-free BSS Plus solution on the retinal pigment epithelium and retina in rabbits.</a> Am.J.Ophthalmol. 131, 481-488 (2001).</li>
<li>Ivert, L., Kjeldbye, H., Gouras, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+short-term+retinal+bleb+detachments+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.Clin.Exp.Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of short-term retinal bleb detachments in rabbits.</a> Graefes Arch.Clin.Exp.Ophthalmol. 240, 232-237 (2002).</li>
</ol>

RB, BVS, ZL, NE i Geuder AG złożyły europejski wniosek patentowy na strzelca. NB jest pracownikiem firmy Geuder AG. Opłaty za publikację tego artykułu zostały opłacone przez Geuder AG.

Na przykładzie modelu królika przedstawiono bezpieczną i powtarzalną metodę transmorficznego dostarczania hodowanego RPE na nośnikach komórkowych do przestrzeni podsiatkówkowej za pomocą specjalnie zaprojektowanego narzędzia strzeleckiego. Opisana metoda oferuje krótką/zoptymalizowaną technikę chirurgiczną ułatwiającą naukę, ponieważ obejmuje standardowe techniki witrektomii z manewrami podsiatkówkowymi. Wynik jest znacznie ułatwiony dzięki czystemu interfejsowi witreoretinalnemu i wlewowi wewnątrzgałkowemu, który pozwala uniknąć turbulencji płynu w miejscu implantacji, wywołując odwarstwienie siatkówki powiekowej (bRD) przy niskim IOP, zapobiegając uszkodzeniom siatkówki i twardówki poprzez suchość oraz odpowiednie ułożenie królika.
Ostrzegamy jednak, ponieważ w każdej chwili może wystąpić kilka powikłań śródoperacyjnych, utrudniających powodzenie implantacji, na przykład krwawienia wewnątrzgałkowe, zanikanie znieczulenia podczas ważnych etapów, takich jak implantacja, zapadnięcie się bRD z powodu manipulacji instrumentem lub hipotonia oka, śmierć królika z powodu nadmiernych dawek znieczulenia, niskie ciśnienie krwi podczas długiej operacji powodujące niedotlenienie mózgu, lub hipertermia. Jednak powikłania te zmniejszają się z czasem, ponieważ są szybko rozwiązywane i rozwiązywane dzięki rosnącemu doświadczeniu zespołu chirurgicznego.
Niektóre komplikacje można zmniejszyć, wykonując kilka prostych, ale kluczowych kroków. Lubrykant należy dodawać co 5 - 10 minut, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki, twardówki i spojówki podczas operacji oraz aby utrzymać czyste podłoże wewnątrzgałkowe, ponieważ wysuszona/poczerniała twardówka może być przyczyną rozejścia się rany, co z kolei prowadzi do hipotonii gałki ocznej i/lub śródoperacyjnego wycieku z powodu sklerotomii. Heparyna powinna być dodawana, aby zapobiec tworzeniu się filmu fibrynowego, który utrudnia szczególnie implantację podsiatkówkową, a jednocześnie dodawać epinefrynę w celu zmniejszenia krwawienia pod wpływem heparyny16. Należy unikać zbyt długiego czasu ekspozycji na heparynę/epinefrynę (>1 godzina), aby zapobiec obrzękowi rogówki w wyniku dekompensacji śródbłonka33, przełomu nadciśnieniowego lub zgonu śródoperacyjnego. Skrupulatne usuwanie ciała szklistego powinno być wykonywane w porcie (wejściowym) instrumentu, aby uniknąć odwarstwienia siatkówki i/lub naczyniówki. Instrumenty wewnątrzgałkowe powinny być skierowane w stronę tylnego bieguna, aby uniknąć dotyku soczewki (powoduje powstawanie zaćmy jatrogennej) lub uszkodzenia siatkówki (w miejscu wejścia). Należy zastosować kaniulę infuzyjną do infuzji wewnątrzgałkowej z bocznym portem, ponieważ tłumi ona strumień strumieniowy wokół obszaru implantacji, zapobiegając w ten sposób niekontrolowanemu rozerwaniu retinotomii i zapadnięciu się bRD. Należy unikać indukcji bRD w linii środkowej (oś pionowa od nerwu wzrokowego) lub w pobliżu włókien rdzenia wzrokowego, aby zapobiec rozległym jatrogennym odwarstwieniom siatkówki. Wreszcie, co nie mniej ważne, bRD powinien być indukowany przy niskich ciśnieniach wewnątrzgałkowych, aby uniknąć iniekcji BSS podsiatkówkowej przy nadmiernych prędkościach przepływu, które mogą prowadzić do uszkodzenia siatkówki (np. przez rozciąganie).
Można zbadać wiele zmiennych badawczych, takich jak warianty nośników komórkowych, źródła komórek RPE pochodzących od płodu, dorosłych lub komórek macierzystych, wybór leków immunosupresyjnych itp. 14,26,27,34. Dalsze udoskonalenia, takie jak metody hodowli RPE bez surowicy, charakterystyka ksenoRPE w przestrzeni podsiatkówkowej, usunięcie warstwy14 RPE gospodarza lub strategie zakotwiczenia implantu, są obecnie w toku.
Do tej pory opisane techniki zostały wykorzystane na 5 różnych szczepach królików, w tym szynszyli, hybrydach Chinchilla bastard/KBL, nowozelandzkiej biało-czerwonej krzyżowej, nowozelandzkiej białej (albinos) i holenderskiej pasiastej. Operowano zarówno samce, jak i samice królików, przy czym króliki ważyły co najmniej 1,5 kg lub były w wieku 2 miesięcy (w zależności od gatunku). Większość operacji przeprowadzono na pigmentowanych królikach (hybrydy szynszyli lub szynszyli) o wadze od 2,5 do 3 kg.
Wszystkie szczepy królików, z którymi mieliśmy okazję pracować, wydają się mieć pewne cechy szczególne. Biorąc pod uwagę wyłączną dostępność pigmentowanych królików odmiany szynszyli w Niemczech w latach 2009-13, zebraliśmy najwięcej doświadczeń z tymi zwierzętami. Niestety nie jest już dostępny, ponieważ hodowla została przerwana, ale bardzo dobrze wypada w porównaniu z nowozelandzkim biało-czerwonym krzyżem, z wyjątkiem korzystniejszej grubszej twardówki i większej objętości oczu w tym ostatnim. Hybrydy szynszyli mają znaczne śródoperacyjne tworzenie fibryny i wymagają użycia heparyny / epinefryny, jak opisano powyżej, aby zapewnić udane manewry podsiatkówkowe. Protokół ten został również przeprowadzony u niepigmentowanych królików albinosów (nowozelandzkich białych), jednak szczególnie tworzenie bRD i implantacja podsiatkówkowa są trudniejsze ze względu na zmniejszone docenianie kontrastu. Możliwość wywołania tylnego odwarstwienia ciała szklistego nie wydawała się zależna od szczepu królika w naszych rękach.
Poród przezszklistkowy podsiatkówkowy jest prawdopodobnie przyszłą strategią chirurgiczną z wyboru, biorąc pod uwagę, że jest to obecnie najczęstsza droga klinicznego dostępu do siatkówki. W rezultacie, wiele innych grup zaprezentowało takie techniki hodowli RPE na nośnikach w pracy ze zwierzętami11,15,23,35. Aramant i wsp. 36 z nich ma instrument, który umieszcza, a nie wpycha ich miękki implant w kapsułkach hydrożelowych do miejsca docelowego podsiatkówkowego. Konstrukcja Thumanna i wsp. wykorzystuje pustą szpatułkę, która uwalnia przeszczep oparty na nośniku, unosząc go przez wstrzyknięcie płynu 19. Obie pierwsze strategie wymagają podsiatkówkowego wprowadzenia instrumentu, który naszym zdaniem jest bardziej podatny na powikłania w porównaniu z instrumentem aplikowanym nasiatkówkowo. Montezuma i wsp. 22 opisało instrument do wprowadzania podsiatkówkowego do dostarczania podsiatkówkowych implantów chipowych u świń, ale według naszej najlepszej wiedzy od tego czasu nie opublikowano żadnych dalszych prac. Udało nam się rozszerzyć opisaną technikę z pewną modyfikacją na świnię.
Preferowanymi przez nas nośnikami komórek są membrany z politereftalanu poliestru (PET) o grubości 10 mikronów. Z chirurgicznego punktu widzenia materiał ten charakteryzuje się korzystnymi parametrami sztywności i elastyczności, a także dużą uniwersalnością podczas eksperymentów z hodowlami komórkowymi. Podobne doświadczenia znaleźliśmy z ekspandowanym tetrafluoroetylenem (ePTFE) 37 lub membranami z nanowłókien elektroprzędzonymi z PET, kwasu polimlekowego/kapronomlekowego (PLCL) lub kwasu poli-mlekowo-ko-glikolowego (PLGA), a także kompozytowych nanowłókien (PLGA lub PET) i ultracienkiego PET 26. Kiedy membrany PET są używane z naszym metalowym instrumentem strzeleckim, mają one okazjonalną tendencję do wykazywania ładunku elektrostatycznego, co utrudnia ich wyrzucenie z pistoletu 27. Ultracienkie membrany poliimidowe nie mogłyby być w naszych rękach wszczepiane w przestrzeń podsiatkówkową zgodnie z protokołem opisanym powyżej (rękopis w przygotowaniu).
Marmor i wsp. systematycznie badali spontaniczną resorpcję płynu podsiatkówkowego w jatrogennych zlokalizowanych odwarstwieniach siatkówki38-41. Nawet po manipulacji w przestrzeni podsiatkówkowej stwierdzono, że są one ponownie wchłaniane do 4 dnia po operacji w spokojnych operacjach. Retinopeksja laserowa nie jest wykonywana w celu zabezpieczenia krawędzi retinotomii. Chociaż jest to sprzeczne z intuicją w porównaniu z chirurgią u ludzi, tamponada powietrzna/gazowa nie jest wymagana. Jeśli nie uda się uzyskać skrupulatnego usunięcia obwodowego ciała szklistego, szczególnie w górnym kwadrancie, może to w rzeczywistości spowodować gigantyczne rozdarcia siatkówki pochodzące z miejsca retinotomii. Zaleca się jedynie wymianę płynu z późniejszą tamponadą gazem 20% SF6 w celu uratowania śródoperacyjnego jatrogennych odwarstwień siatkówki lub w przypadku, gdy konieczne jest zabezpieczenie określonej pozycji implantu.
Chociaż mechanicznie indukowana ablacja siatkówki nerwowej może powodować uszkodzenie RPE i fotoreceptorów u królików42,43, jej zakres różni się znacznie (nawet przy zwykłym BSS) w zależności od takich czynników, jak IOP, rodzaj użytej strzykawki, objętość wstrzyknięcia z tym indukowanym rozciąganiem siatkówki itp. Przetestowaliśmy również często zalecane odwarstwienie BSS bez Ca / Mg, ale stwierdziliśmy, że powoduje ono śródoperacyjne zmętnienie soczewek (szczególnie przy podwyższonej temperaturze) i znacznie opóźnia lub nawet upośledza ponowne przyczepienie siatkówki 27. Dlatego zaleca się powolne wstrzykiwanie podsiatkówkowe o objętości 20 - 30 μl zwykłego BSS za pomocą strzykawki o pojemności 100 μl; ruchy igły iniekcyjnej powinny być minimalne, aby retinotomia uszczelniła się wokół niej i zapobiegła uszkodzeniu błony Brucha. Niektóre z jatrogennych uszkodzeń mogą zostać rozwiązane przez gojenie się ran RPE, a obserwowane względne zachowanie grubości ONL po ponownym przyczepieniu sugeruje, że kompleks RPE / fotoreceptor może tolerować to upośledzenie, jak opisali również inni45.
Terapie oparte na komórkach lub protezy siatkówki wymagają przedklinicznych badań na zwierzętach przed zatwierdzeniem przez organy regulacyjne i rozpoczęciem badań bezpieczeństwa u ludzi. Te pierwsze różnią się w zależności od kraju. Opisany tutaj model królika może służyć jako opłacalna i mniej wymagająca platforma do ustanawiania lub nawet realizacji wszystkich wymagań organów regulacyjnych. Co więcej, może on następnie służyć do szkolenia chirurgów w ewentualnych wieloośrodkowych badaniach klinicznych lub dalszych ulepszeń techniki w przyszłości.

Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest najczęstszą przyczyną zaburzeń widzenia u dorosłych w wieku 50 lat lub starszych w krajach rozwiniętych przemysłowo, ponieważ powoduje utratę widzenia centralnego. Około 15% tych pacjentów cierpi na "mokrą" postać choroby, w której neowaskularyzacja wywodzi się z naczyniówki i zaburza funkcję siatkówki1. Wariant ten można leczyć za pomocą wysoce skutecznej terapii z powtarzającymi się iniekcjami doszklistkowymi leków antyangiogennych2. Jednak zdecydowana większość pacjentów (~85%) cierpi na postać suchą, która charakteryzuje się odkładaniem się złogów zewnątrzkomórkowych (np. druz) pod nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE). Złogi te powodują dysfunkcję RPE prowadzącą do zaniku siatkówki w plamce żółtej. Ze względu na brak jakichkolwiek leczniczych opcji terapeutycznych, AMD przekształciło się w intensywnie rozwijającą się dziedzinę badań, w której testowanych jest wiele różnych metod terapeutycznych. Chirurgiczna wymiana RPE jest jedną z atrakcyjnych przyszłych możliwości pokonania tej wyniszczającej choroby3.
Autologiczny przeszczep RPE podsiatkówkowego zastępuje dysfunkcyjne lub utracone RPE w plamce żółtej i ma potencjał do przywrócenia jej fizjologicznej funkcji4-9. Ta technika chirurgiczna doprowadziła do przełomu wraz z opracowaniem protokołów różnicowania RPE z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), dając naukowcowi nieograniczone źródło komórkowe RPE do przeszczepu10. Przeszczep RPE jest obecnie uznawany za atrakcyjne, pierwsze zastosowanie u ludzi w terapiach pochodzących z komórek macierzystych. Oko oferuje doskonały dostęp chirurgiczny i zaawansowane narzędzia do monitorowania in vivo 11-13.
Aby przeszczepić RPE, jednym ze sposobów jest minimalnie inwazyjne dostarczenie za pomocą zawiesiny komórek, alternatywnie, aby lepiej zachować cechy RPE i funkcję przeszczepu, rozważane są sztuczne podłoża nośnikowe (rusztowania) do wymiany RPE4,14,15. Do walidacji przedklinicznej wymagane są duże modele zwierzęce, ale do tej pory brakuje szczegółowych informacji technicznych na temat obchodzenia się ze zwierzętami i technik chirurgicznych.
My i inni11,24 pomimo pewnych dowodów przeciwnych25, sugerujemy użycie sztywnego, ale elastycznego podłoża nośnego, ponieważ zapewnia ono bezpieczniejszą obsługę, zachowuje integralność i funkcjonalność monowarstwy. Z biegiem czasu przetestowaliśmy kilka specjalnie zaprojektowanych instrumentów i technik pomocniczych do implantacji przeszczepów RPE wspomaganych nośnikami komórkowymi do przestrzeni podsiatkówkowej (SRS). Wykorzystaliśmy śródoperacyjne nagrania wideo, skaningową oftalmoskopię laserową in vivo połączoną z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej (SLO/ SD-OCT) oraz histologię w celu oceny powodzenia implantacji14,26,27. W tym miejscu przedstawiamy nasze aktualne zalecenia dotyczące podsiatkówkowych implantów RPE u królików, które zostały przetestowane na 5 różnych szczepach królików, 7 materiałach nośników komórkowych i 4 źródłach komórek RPE w ponad 150 procedurach.

<table><tbody><tr><td>myjka ultradźwiękowa s30</td><td>Elmasonic</td><td>100 4631</td><td>2,75 L</td></tr><tr><td>DE-23&nbsp; autoklaw</td><td>Systec</td><td>C 2209</td><td>23 L</td></tr><tr><td>Strzykawka&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td>300013 300995&nbsp; 301285 300294 300330&nbsp;</td><td>1 ml x3 2 ml x3 5 ml x1 10 ml x1 20 ml x1</td></tr><tr><td>Igła&nbsp;</td><td>BD</td><td>305196 305136</td><td>18 G x1&nbsp; 27 G x5</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Pióro</td><td>2975#20</td><td>ostrze#20 x3</td></tr><tr><td>Serweta chirurgiczna</td><td>HARTMANN LOHMANN & RAUSCHER</td><td>277 502 25 440</td><td>60 x 40 cm x2 12 x 17 cm</td></tr><tr><td>Kije do okularów</td><td>LOHMANN & RAUSCHER</td><td>16 516</td><td>66 x 5 mm</td></tr><tr><td>Gąbki do gazy Twister</td><td>HARTMANN</td><td>481 274</td><td>x2</td></tr><tr><td>Paski zamykające</td><td>HARTMANN</td><td>540 686</td><td>x4</td></tr><tr><td>Opmi Visu CS Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>N/a</td><td>z systemem obrazowania dna oka BIOM II</td></tr><tr><td>Żyrandol endoillumination</td><td>Geuder</td><td>G-S03503 + G-S03504</td><td>25 G z trokarem</td></tr><tr><td>Lekka maszyna</td><td>Geuder</td><td>G-26033</td><td>Xenotron III</td></tr><tr><td>Maszyna do witrektomii</td><td>Geuder</td><td>G-60000</td><td>MegaTRON S4 S4/ HPS</td></tr><tr><td>Vitrector</td><td>Geuder</td><td>G-46301</td><td>MACH2 frez do ciała szklistego 23 G</td></tr><tr><td>Kaseta Venturiego&nbsp;</td><td>Geuder</td><td>G-60700</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula infuzyjna do infuzji bocznej</td><td>Geuder</td><td>custom&nbsp;</td><td>23 G x1</td></tr><tr><td>Szew jedwabny 3-0</td><td>ETHICON</td><td>V546G</td><td>x1</td></tr><tr><td>Suwmiarka</td><td>Geuder</td><td>G-19135</td><td>x2</td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas</td><td>Geuder</td><td>G-19777</td><td>x1</td></tr><tr><td>Ostrze do sklerotomii</td><td>Ziemer</td><td>21-2301</td><td>1x 23 G 1x 20 G</td></tr><tr><td>7-0 szew jedwabny</td><td>ETHICON</td><td>EH6162H</td><td>x1</td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę</td><td>Geuder</td><td>G-32320</td><td>x2</td></tr><tr><td>Kleszczyki do tęczówki</td><td>Geuder</td><td>G-18910</td><td>x1</td></tr><tr><td>Kleszczyki Colibri</td><td>Geuder</td><td>G-18950</td><td>x1</td></tr><tr><td>Wysuwana igła do iniekcji podsiatkówkowej</td><td>DORC</td><td>1270.EXT</td><td>41 G</td></tr><tr><td>VR Nożyczki</td><td>Geuder</td><td>G-36542</td><td>25 G</td></tr><tr><td>Uchwyt do kleszczyków Grieshaber</td><td>Alcon</td><td>712.00.41</td><td>23 G</td></tr><tr><td>Zakrzywione końcówki do kleszczyków nożycowych</td><td>Alcon</td><td>723.52</td><td>23 G</td></tr><tr><td>Stacja ładowania implantów</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td></tr><tr><td>owalny implant trepanacja&nbsp;</td><td>Geuder</td><td>na zamówienie&nbsp;</td><td>2,4 x 1,1 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Manekin strzelecki</td><td>Geuder</td><td>G-32227</td><td>x1</td></tr><tr><td>Shooter</td><td>Geuder</td><td>G-S03443</td><td>x1</td></tr><tr><td>Igła do fletu</td><td>DORC</td><td>1281.SD</td><td>20 G (próżniowa)</td></tr><tr><td>Ręczna strzykawka mikrolitrowa</td><td>Hamilton</td><td>24535</td><td>100 &micro; l</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych</td><td>Greiner bio-one</td><td>&nbsp; 664160</td><td>100 x 20 mm</td></tr><tr><td>Spectralis Multi-Modality System obrazowania</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>N/A</td><td>Spectralis HRA &nbsp;+ OCT</td></tr><tr><td>Leki i roztwory</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Substancja czynna</td><td><silny> Uwagi</td></tr><tr><td>Mucadont-IS</td><td>Merz Hygiene</td><td>wirusobójczy środek do dezynfekcji narzędzi&nbsp;</td><td>2 L</td></tr><tr><td>Śluz&nbsp; T</td><td>Merz Hygiene</td><td>Bezaldehydowy środek do dezynfekcji narzędzi</td><td>2 L</td></tr><tr><td>Ketamin 10%</td><td>WDT</td><td>Ketamina&nbsp;</td><td>10 ml (100 mg/ml)</td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Orion Pharma</td><td>Chlorowodorek medetymidyny</td><td>10 ml (1 mg/ml)</td></tr><tr><td>Antisedan</td><td>Orion Pharma</td><td>Chlorowodorek atypamezolu</td><td>10 ml (5 mg/ml)</td></tr><tr><td>Neosynefryna POS 10%</td><td>URSAPHARM</td><td>Fenylefryna HCl</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Mydriacyl</td><td>Alcon</td><td>Tropicamid</td><td>10 ml (5 mg/ml)</td></tr><tr><td>Methocel 2%</td><td>Omni Vision</td><td>hydroksypropylometyloceluloza</td><td>10 g</td></tr><tr><td>PURI CLEAR</td><td>ZEISS</td><td>Balance roztwór soli (BSS)&nbsp;</td><td>Pojemność 500 ml</td></tr><tr><td>Glukoza 5%&nbsp; &nbsp;</td><td>B.Braun</td><td>Glukoza 5%&nbsp; roztwór</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Heparyna-Natrium-25 000</td><td>Ratiopharm</td><td>Heparyna</td><td>5 ml (2 500 jednostek/ml)</td></tr><tr><td>Suprarenin</td><td>SANOFI</td><td>Epinefryna</td><td>1 ml (1 mg/ml)</td></tr><tr><td>Triamcynolon</td><td>Uniwersytet w Bonn farmacja</td><td>bez konserwantów Triamcynolon&nbsp;</td><td>1 ml (40 mg/ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoptomax maść do oczu</td><td>Alcon</td><td>deksametazon 1 mg/g siarczan neomycyny 3 500 j.m./g siarczan polimyksyny B 6 000 j.m./g</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Betaisodona</td><td>Mundipharma</td><td>Povidon-Jod</td><td>30 ml (1 g/10 ml)</td></tr><tr><td>Optive</td><td>ALLERGAN</td><td>sól sodowa karboksymetylocelulozy glicerol</td><td>10 ml</td></tr></tbody></table>

protokół krok po kroku dla chirurgii podsiatkówkowej u królików

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), barwnikowe zwyrodnienie siatkówki i inne choroby związane z RPE są najczęstszymi przyczynami nieodwracalnej utraty wzroku u dorosłych w krajach rozwiniętych przemysłowo. Przeszczep RPE wydaje się być obiecującą terapią, ponieważ może zastąpić dysfunkcyjne RPE, przywrócić jego funkcję, a tym samym wzrok.
Tutaj opisujemy metodę przeszczepiania monowarstwy z hodowli RPE na rusztowaniu do przestrzeni podsiatkówkowej (SRS) królików. Po witrektomii ksenotransplantacje były dostarczane do SRS za pomocą specjalnie wykonanej wyrzutni składającej się z metalowej dyszy o rozmiarze 20 mm z tłokiem pokrytym politetrafluoroetylenem (PTFE). Obecna technika rozwinęła się w ponad 150 operacjach na królikach w ciągu 6 lat. Obserwację pooperacyjną można uzyskać za pomocą nieinwazyjnego i powtarzalnego obrazowania in vivo, takiego jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej (SD-OCT), a następnie histologia z utrwaloną perfuzją.
Metoda ma dobrze zdefiniowane kroki dla łatwej nauki i wysokiego wskaźnika sukcesu. Króliki są uważane za model zwierzęcy o dużym oku, przydatny w badaniach przedklinicznych do tłumaczenia klinicznego. W tym kontekście króliki są opłacalną i być może wygodną alternatywą dla innych modeli zwierząt o dużych oczach.

Wyniki opisanej metody implantacji podsiatkówkowej przedstawiono w Tabeli 2. Skuteczność wszczepienia pod siatkówkę wynosiła ok. 61% w przypadku wykonania witrektomii rdzeniowej i wzrosła do 76%, gdy wywołano odwarstwienie ciała szklistego tylnego. Liczby te obejmują ok. 21% zwierząt, które padły albo w trakcie operacji, albo w ciągu pierwszych 3 dni po zabiegu. Technika ta może być wykorzystana do jednoczesnej implantacji dwóch rusztowań w różnych obszarach siatkówki jednego oka.
Króliczki poddano pooperacyjnej obserwacji in vivo z wykorzystaniem SD-OCT oraz obróbce histologicznej zgodnie z opisem Stanzela et al.27 (Rycina 2). Ryc. 2A przedstawia obraz odblasku w podczerwieni uzyskany za pomocą skaningowego laserowego oftalmoskopu, ukazujący zaimplantowany hodowany RPE na membranie poliestrowej (PET) po niepowikłanym przeszczepieniu. Aureola wokół implantu odpowiada zanikowi fotoreceptorów. Ryc. 2B pokazuje odpowiadający temu obraz SD-OCT; widoczne jest pocienienie siatkówki, głównie zewnętrznej warstwy jądrowej (ONL), oraz pasmo hiperrefleksyjne w SD-OCT nad implantem, podczas gdy siatkówka neuronowa sąsiadująca z implantem wykazuje niemal prawidłowe pasma odbicia. Wyniki te sugerują atraumatyczne wprowadzenie implantu. Ryc. 2C przedstawia barwienie hematoksyliną i eozyną (H/E) implantu, które wykazuje bliznowacenie podsiatkówkowe oraz zanik ONL wokół miejsca retinotomii, prawdopodobnie w wyniku manipulacji jatrogennej, a także ciągłą, lecz nieregularną warstwę pigmentową nad PET. Błona Brucha pod implantem również wydawała się być ciągła, a choriocapillaris zawiera niektóre rozproszone erytrocyty. Te wyniki morfologiczne są porównywalne z SD-OCT i wzmacniają tezę o atraumatycznym wprowadzeniu.
<img alt="Proces odbudowy zęba kompozytem, zdjęcia w zbliżeniu, demonstracja procedury stomatologicznej, technika kliniczna." src="/files/ftp_upload/53927/53927fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ładowanie aplikatora ludzkimi iPSC-RPE hodowanymi na nośniku komórkowym PET. A) Przedstawia wycinanie implantu za pomocą specjalnie wykonanej igły. B) Fasolkowaty implant wycięty z hodowli komórkowej. C) Pozycjonowanie implantu przed załadowaniem. D) Ładowanie aplikatora implantem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza tkanki oka; obrazy mikroskopowe pokazujące strukturę w przekroju poprzecznym; szczegóły histologiczne." src="/files/ftp_upload/53927/53927fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Kultury ludzkich hES-RPE na nośniku komórkowym PET przez 4 tygodnie w przestrzeni podsiatkówkowej królika. A) Przedstawia obraz odbiciowy w podczerwieni SLO, zielona linia wyznacza przekrój poprzeczny pokazany na Rys. 2B. B) Odpowiadający obraz SD-OCT. C) Barwienie H/E, szczegóły opisane w tekście lub w źródłach26,27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<colgroup>
		<col>
		<col>
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:97px;">Parametr</td>
			<td style="width:131px;">Zastosowane ustawienia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Witrektomia</td>
			<td>6,000 cuts/min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Próżnia</td>
			<td>200 mmHg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Czas narastania</td>
			<td>1 sec</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"> Powietrze</td>
			<td>24 mmHg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Irygacja </td>
			<td>24 cmH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diatermia</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Ustawienia parametrów urządzenia do witrektomii.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Witrektomia</td>
			<td>Implant</td>
			<td>Królicze zwierzęta operowane</td>
			<td>Udany implant</td>
			<td>Nieudany implant</td>
			<td>Śmierć</td>
			<td>Wskaźnik sukcesu%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Witrektomia centralna</td>
			<td>PET</td>
			<td>30</td>
			<td>19</td>
			<td>4</td>
			<td>7</td>
			<td>63.33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PET + RPE</td>
			<td>70</td>
			<td>42</td>
			<td>12</td>
			<td>16</td>
			<td>60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVD, ± plazmina z PPV</td>
			<td>PET</td>
			<td>28</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>5</td>
			<td>75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PET + RPE</td>
			<td>22</td>
			<td>17</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>77.27</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Podsumowanie ostatnich 150 operacji, w tym zastosowana metoda i rodzaj implantu.

Strategie wymiany nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i terapia oparta na genach są brane pod uwagę w przypadku kilku stanów zwyrodnieniowych siatkówki. Do translacji klinicznej wymagane są modele zwierzęce z dużymi oczami do badania technik chirurgicznych stosowanych u pacjentów. W tym miejscu przedstawiamy model królika do chirurgii podsiatkówkowej ukierunkowany na przeszczep RPE, który jest wszechstronny i opłacalny.

Protokół krok po kroku dla chirurgii podsiatkówkowej u królików

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Ogólnym celem tej interwencji chirurgicznej jest zastąpienie dysfunkcyjnego nabłonka barzówkowego siatkówki (RPE), aby znaleźć potencjalną metodę leczenia chorób związanych z RPE, takich jak związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie optometrii dotyczące terapii komórkowych oraz związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona zapewnić sposób transportu podłoża do wymiany komórek lub urządzeń do dostarczania leków do przestrzeni podsiatkowej.Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat witrektomii i chirurgii podsiatkówkowej u królików, można ją również zastosować u innych organizmów modelowych, takich jak świnie, małpy lub ludzie. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ nie tylko chirurgia wewnątrzgałkowa jest skomplikowana, ale także personel, organizacja i technologia niezbędne do przeprowadzenia tego zabiegu muszą być dobrze zsynchronizowane. Procedurę ładowania instrumentów zaprezentują Fabian Thieltges, post-doc, oraz Ralf Brinken, pielęgniarz instrumentacyjny, obaj z mojego laboratorium.Przed rozpoczęciem operacji należy potwierdzić odpowiedni poziom znieczulenia i nałożyć maść do oczu na drugie, nieoperowane oko zwierzęcia. Następnie umieść królika pod mikroskopem chirurgicznym na lewym boku, tak aby prawe oko było skierowane ku górze, a nos lekko uniesiony dzięki fałdzie koca. Zdezynfekuj oko przez jedną minutę, stosując kilka kropli powidonu jodowego.Następnie opłucz oko sterylnym BSS i przykryj głowę zwierzęcia sterylną draperią z gotowym otworem na oko. Na oko nałóż fragment lepkiej draperii chirurgicznej do nacięć o wymiarach 12 na 17 centymetrów i za pomocą nożyczek odsłoń oko, wykonując poziome nacięcie w linii środkowej. Używając odwróconego cyrkla, przemieść oko do pozycji wyproptozowanej i zabezpiecz tkankę szwem jedwabnym 3-0.Następnie, używając nożyczek Vanna, wykonaj nacięcie spojówki blisko limbusa, w odległości około jednego milimetra od przyległych naczyń krwionośnych, i poszerz peritomię równolegle do limbusa. Rozdziel spojówkę tępym sposobem, a następnie wykonaj prostopadłe nacięcie pionowe o długości od sześciu do siedmiu milimetrów, aby utworzyć kształt litery T w spojówce. Wykonaj kolejną małą peritomię w pozycji godziny 2.Następnie należy ostrożnie wprowadzić końcówkę noża mikrowitretinalnego o rozmiarze 23G przez twardówkę, kierując go w stronę bieguna tylnego oka w odległości 3,5 mm od limesu na godzinie 8. Aby uniknąć powiększenia nacięcia, należy powoli wycofać nóż w tym samym kierunku i wcześniej umieścić szew Vicryl 7-0. Następnie należy wprowadzić do otworu w twardówce specjalnie przygotowaną kaniulę infuzyjną portu bocznego i zabezpieczyć kaniulę za pomocą wcześniej umieszczonego szwu.Ustaw ciśnienie wewnątrzgałkowe w zakresie od 20 do 24 mmHg. Następnie, używając trokara o rozmiarze 25G z płaską głowicą, przebij twardówkę na pozycji godziny 2 i wprowadź przez port światłowód typu chandelier o rozmiarze 25G. Zabeziecz światłowód taśmą i ustaw jego moc na około 30%, a następnie dostosuj ją indywidualnie.Użyj skalpela 20 do usunięcia obrzękniętego nabłonka rogówki w celu ułatwienia lepszej wizualizacji wewnątrzgałkowej. Następnie wykonaj kolejną sklerotomię za pomocą mikroostrza witreoretinalnego 23G na godzinie 10 i załóż szew w kształcie litery U z nici Vicryl 7-0 wokół naciętej twardówki, nie zawiązując całkowicie węzła. Wprowadź końcówkę szybkowirującego witrektoma do nacięcia i rozpocznij witrektomię wokół portu wejściowego.Przetnij ciało szkliste na małe fragmenty przy częstotliwości maksymalnie 2 000 do 3 000 cięć na minutę, kontynuując witrektomię nad tarczką optyczną i włóknami rdzeniowymi (fibrae medullares), przy aspiracji wynoszącej maksymalnie 200 mmHg. Aby delikatnie oddzielić ciało szkliste od siatkówki, utrzymaj witrektor nad biegunem tylnym i poniżej tarczki, kontynuując aspirację bez cięcia. Po całkowitym odwarstwieniu tylnego szklistego, wstrzyknij do wnętrza ciała szklistego około 50 µL badanego związku, aby umożliwić wizualizację pływającego ciała szklistego podczas jego niemal całkowitego usunięcia.Po przygotowaniu oka, trzykrotnie wypłucz kulturę komórkową do implantacji nieuzupełnionym roztworem BSS klasy okulistycznej. Następnie napełnij naczynie do hodowli komórkowej o wymiarach 100 na 20 milimetrów 10 mililitrami BSS klasy okulistycznej i umieść w nim wkład do hodowli komórkowej. Ustaw naczynie centralnie pod mikroskopem świetlnym i za pomocą ostrej, owalnej, wykonanej na zamówienie igły pustej wytnij z hodowli komórkowej płaski, fasolkowaty fragment podłoża o wymiarach 2,4 na 1,1 milimetra, posiadający dwie długie i dwie zaokrąglone krawędzie.Powoli przepłucz igłę przez drugi port za pomocą BSS, aby wypłukać implant do wypełnionej BSS szalki hodowlanej. Aby uzyskać trzecią krawędź, wykonaj nacięcie o objętości 0,5 ml w jednym z zaokrąglonych końców implantu i użyj pęsety do odwarstwiania błon o rozmiarze 23G, aby przenieść implant do specjalnie przygotowanej stacji ładowania. Upewnij się, że implant znajduje się w pozycji pionowej, a następnie za pomocą pęsety delikatnie wsuń implant całkowicie do urządzenia wstrzykującego, aż cała tkanka zostanie zabezpieczona wewnątrz końcówki. Umieść końcówkę urządzenia w stacji ładowania w BSS do momentu implantacji komórek.Aby umożliwić implantację komórek pod siatkówkę, należy zbliżyć się do siatkówki nerwowej za pomocą rozszerzalnej igły do wstrzykiwań podsiatkówkowych o rozmiarze 41G, podłączonej do strzykawki szczelnej dla gazów, a następnie wstrzyknąć BSS podsiatkówkowo, aby wywołać odwarstwienie siatkówki w formie pęcherza. Gdy pęcherz osiągnie wielkość około 2 do 3 średnic tarczy, należy użyć pionowych nożyczek VR o rozmiarze 23G, aby powiększyć retinotomię do 1,5 mm, oraz noża do nacięć o szerokości 1,4 mm, aby precyzyjnie rozszerzyć sklerotomię na godzinie 10 do podejścia 20G. Następnie należy spróbować przełożyć przez sklerotomię atraktor (dummy) urządzenia do wstrzykiwania 20G, powiększając nacięcie w razie potrzeby, aby zapewnić płynne, ale ściśnięte przejście załadowanego urządzenia.Następnie wprowadź załadowany aplikator przez nacięcie twardówki pod ciśnieniem od 20 do 24 mmHg do krawędzi retinotomii i wstrzyknij implant podsiatkówkowo z pozycji epiretinalnej. Aplikator powinien sprawnie przejść przez twardówkę przy pierwszej próbie, dlatego należy zapewnić optymalną wielkość sklerotomii. Komórki RPE powinny zostać następnie wszczepione podsiatkówkowo pod niewielkim kątem, aby zapobiec zakleszczeniu przedniej krawędzi implantu w błonie Brucha.Dostosuj położenie implantu tak, aby znajdował się pod siatkówką w odpowiedniej odległości od miejsca retinotomii. Następnie wyjmij port ze sklerotomii i wstrzyknij 25 µL triamcynolonu przez port żyrandolowy. Za pomocą szwów 7-0 zamknij sklerotomie na godzinie 2 i 10, a następnie sprawdź, czy nie występują wycieki.Usuń kaniulę infuzyjną i natychmiast zamknij ostatnią sklerotomię za pomocą wcześniej umieszczonego szwu Vicryl 7-0. Używając igły 30G, wstrzyknij BSS w celu dostosowania ciśnienia wewnątrzgałkowego w razie potrzeby, jednocześnie badając oko palpacyjnie. Na koniec zaszyj spojówkę szwem Vicryl 7-0 i usuń wyprowadzony jedwab, uważając, aby nie uszkodzić głębokiego splotu żylnego orbity.Wskaźnik sukcesu chirurgicznego przeszczepu pod siatkówkę wynosi około 60% przy wykonaniu witrektomii centralnej, a wzrasta do ponad 75%, gdy wywołane zostanie odwarstwienie tylne ciała szklistego. Tutaj przedstawiono obraz odbicia podczerwieni z poziomu skaningowego oftalmoskopu laserowego dla ksenotransplantowanych hodowlanych nabłonków barwnikowych siatkówki na membranie poliestrowej po niepowikłanym zabiegu, gdzie zanik fotoreceptorów wynikający z reakcji immunologicznej objawia się jako halo wokół implantu. Na odpowiadającym mu obrazie optycznej koherentnej tomografii w domenie widmowej można zaobserwować cieńczenie zewnętrznej warstwy jądrowej jako odpowiedź na ksenotransplantację RPE, głównie w siatkówce z widocznym hiperrefleksyjnym pasmem nad implantem.Siatkówka neuronalna sąsiadująca z implantem wykazuje jednak niemal prawidłowe pasma odbicia, co sugeruje atraumatyczne wprowadzenie implantu. Jak zaobserwowano w barwieniu H/E, u królików po ksenotransplantacji bez immunosupresji występuje bliznowacenie podsiatkówkowe oraz zanik zewnętrznej warstwy jądrowej. Błona Brucha pod implantem wydaje się również ciągła, a w choriocapillaris widoczne są pojedyncze erytrocyty, co dodatkowo potwierdza brak urazu powstałego podczas wprowadzania implantu.Po opanowaniu tej techniki zabieg można przeprowadzić w ciągu godziny, o ile nie wystąpią żadne komplikacje. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby stworzyć pęcherzyk siatkówkowy oraz retinotomię o rozmiarze wystarczającym jedynie do umieszczenia implantu. Ponadto szybsza interwencja chirurgiczna zazwyczaj pozwala na uzyskanie lepszych wyników.Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak optyczna tomografia kohereńcyjna lub histologia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, dotyczące na przykład sukcesu transplantacji, biokompatybilności podsiatkówkowej oraz przeżywalności przeszczepionych komórek. Po opracowaniu technika ta utorowała drogą badaczom z dziedziny biologii komórek macierzystych i biomateriałów do badania podsiatkówkowego dostarczania pochodnych komórek macierzystych i/lub biofunkcjonalizowanych podłoży nośnych w chorobach siatkówki, w szczególności RPE. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić witrektomię i operację implantacji podsiatkówkowej u królików.Należy pamiętać, że praca z soczewką, powierzchnią witreoretinalną oraz przestrzenią podsiatkówkową może być niezwykle ryzykowna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak prawidłowe ułożenie dłoni, dobra wizualizacja oraz stabilne ciśnienie wewnątrzgałkowe.

a-step-by-step-protocol-for-subretinal-surgery-in-rabbits

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Pokazujemy wpływ sieciowania twardówki z ryboflawiną i UVA na osiowo wydłużone oko królika. Wydłużenie osiowe wywołano u 13-dniowych królików nowozelandzkich (samca i samicy) poprzez zszycie ich prawych powiek (tarsorrhaphy).

Sieciowanie twardówki za pomocą ryboflawiny i promieniowania ultrafioletowego-A w celu zapobiegania krótkowzroczności osiowej w modelu królika

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych terapii zastępczej komórkami macierzystymi w przypadku zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. W tym zwizualizowanym artykule opisujemy mniej ryzykowną, powtarzalną i precyzyjnie zmodyfikowaną technikę wstrzykiwania podsiatkówkowego za pomocą podejścia przeztwardówkowego w celu dostarczenia komórek do oczu szczura.

Opracowanie udoskonalonego protokołu przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Przedstawiono nowatorskie podejście do wywoływania przewlekłej choroby suchego oka u królików poprzez chirurgiczne usunięcie wszystkich gruczołów łzowych oczodołu. Ta metoda, odmienna od wcześniej opisanych, daje stabilny, powtarzalny model suchego oka z niedoborem wody wodnistej, dobrze nadający się do badania fizjologii i patofizjologii łez oraz terapii okulistycznej.

Opracowanie modelu ciężkiego zespołu suchego oka za pomocą całkowitej dacryoadenektomii u królików

Prezentowana tutaj jest chirurgiczna technika przeszczepiania tkanki siatkówki pochodzącej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do przestrzeni podsiatkówkowej dużego modelu zwierzęcego.

Podsiatkówkowy przeszczep ludzkiej embrionalnej tkanki siatkówki pochodzącej z komórek macierzystych w modelu dużego zwierzęcia kota

Implantacja podsiatkówkowa pigmentowego nabłonka siatkówki (RPE) jest jednym z najbardziej obiecujących podejść do leczenia chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Jednak wyniki badań przedklinicznych na modelach zwierzęcych z dużymi oczami pozostają wyzwaniem. W niniejszym raporcie przedstawiono wytyczne dotyczące podsiatkówkowego przeszczepiania RPE na nośniku komórkowym do świnek miniaturowych.

Podsiatkówkowa implantacja RPE na nośniku u świnek miniaturowych: wytyczne dotyczące przygotowań przedoperacyjnych, technik chirurgicznych i opieki pooperacyjnej

Ten protokół przedstawia przezźrenicowe, sterowane widzeniem podejście przeztwardówkowe do bezpiecznego i precyzyjnego dostarczania przeszczepów komórkowych podsiatkówkowych, z niskim wskaźnikiem powikłań chirurgicznych, u myszy, biorców ze zwyrodnieniem siatkówki lub bez.

Przezźrenicowe przeszczepienie przeztwardówkowe przeszczepów podsiatkówkowych w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki

Ten artykuł przedstawia szczegółowe instrukcje dotyczące wykonywania zmiażdżenia nerwu wzrokowego w modelu królika przy użyciu standardowych technik chirurgii okulistycznej.

Chirurgiczne podejście do zmiażdżenia nerwu wzrokowego w modelu królika

Ten artykuł opisuje metody iniekcji podsiatkówkowej u szczurów, wykorzystując śródoperacyjną wizualizację do kontrolowania zarówno miejsca wstrzyknięcia, jak i obszaru odwarstwienia siatkówki.

Śródoperacyjna wizualizacja wstrzyknięcia podsiatkówkowego i odwarstwienia siatkówki u szczurów

Poznaj technikę chirurgii podsiatkówkowej u królików w celu transplantacji nabłonka barwnikowego siatkówki. Ta metoda umożliwia badanie terapii komórkowych w leczeniu zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem.

Protokół krok po kroku dla chirurgii podsiatkówkowej u królików

Przeglądaj więcej filmów