TAŚMA: Biodegradowalny klej hemostatyczny inspirowany wszechobecnym związkiem w roślinach do zastosowań chirurgicznych
8 czerwca 2016
Opisujemy najprostszy protokół przygotowania biodegradowalnego kleju medycznego o skutecznej zdolności hemostatycznej. TAPE to niemieszający się z wodą agregat supramolekularny otrzymany przez zmieszanie kwasu garbnikowego, wszechobecnego związku występującego w roślinach, i glikolu poli(etylenowego), dającego 2,5 razy większą wodoodporną przyczepność w porównaniu z dostępnym na rynku klejem fibrynowym.
Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opracowanie biodegradacyjnego kleju hemostatycznego do zastosowań chirurgicznych, inspirowanego powszechnie występującym w roślinach związkiem. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu mechanizmu adhezji wodoodpornej biomimetyków, takich jak kleje tkankowe i uszczelniacze w zastosowaniach biomedycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że proces wytwarzania TAPE jest niezwykle prosty, skalowalny i przyjazny dla środowiska.
W pierwszej kolejności przygotuj roztwór kwasu taninowego w czteromililitrowej szklanej fiolce na mieszalniku magnetycznym. Dodaj 1 ml wody destylowanej oraz 1 g kwasu taninowego, mieszając przy prędkości 200 rpm. Po godzinie kwas taninowy zostanie całkowicie rozpuszczony w brązowym roztworze.
Następnie dodaj jeden mililitr wody destylowanej do jednego grama proszku PEG i wymieszaj je za pomocą wstrząsarki typu vortex, aż powstanie biała zawiesina. Przechowuj zawiesinę w temperaturze 60 °C przez 10 minut. Powinna ona stać się całkowicie przejrzysta.
Następnie pozostaw go w temperaturze pokojowej. Dalej, w probówce do mikrowirówki, wymieszaj 329 µL roztworu PEG z 671 µL roztworu kwasu taninowego. Pobieraj alikwoty powoli, ponieważ oba roztwory są dość lepkie.
Delikatnie wymieszaj roztwory wąską szpatułką, aż powstanie mieszanina o konsystencji miodu. Wirowarką z rotorem kątowym wiruj mieszaninę przy 12 300 ×g przez trzy minuty. Następnie ostrożnie odpipetuj jak największą ilość supernatantu, pozostawiając w pełni uformowany TAPE.
Przechowywać TAPE w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza przez kilka tygodni. Aby zmierzyć siłę adhezji TAPE, należy przygotować tkankę testową z wycinka skóry świni pobranego trepanem. Usunąć cały tłuszcz, a następnie przygotować dwie próbki tkanki testowej o średnicy sześciu milimetrów.
Nanieś komercyjny klej cyjanoakrylowy na zewnętrzną stronę każdej tkanki i przymocuj pręty lub podobny przedmiot, który zostanie uchwycony przez maszynę testową. Następnie nanieś kroplę TAPE na jedną stronę tkanki i rozprowadź ją równomiernie między wewnętrznymi stronami obu tkanek, tak aby zostały one połączone. Następnie kilkakrotnie dociskaj i odrywaj tkanki, aby uzyskać jednorodną mieszaninę w pełni pokrywającą powierzchnię styku.
Następnie przymocuj pręty do aparatury badawczej. Rozpocznij od przyłożenia siły 20 Newtons przez jedną minutę. Następnie rozsuwaj pręty z prędkością jednej milimetr na minutę, aż do całkowitego oddzielenia się tkanek.
Dane przedstawiono w formie krzywej siła-odległość. Aby zbadać siłę adhezji w obecności wody, należy dodać 20 µL wody do oddzielonego obszaru pomiędzy obiema tkankami, a następnie niezwłocznie połączyć zwilżone powierzchnie za pomocą TAPE. Powtórzyć test w ten sam sposób, bez wprowadzania innych zmian.
Najpierw odetnij kapturek o średnicy ośmiu milimetrów z probówki do mikrocentrifugi i zważ go. Następnie wypełnij kapturek 150 miligramami TAPE i zmierz całkowitą masę. Nie napełniaj kapturka powyżej krawędzi, która będzie pełnić rolę bariery.
Dodaj 50 mililitrów buforu PBS do kolby do hodowli komórek o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Załóż zakrętkę z obciążeniem do kolby i zanurz ją. Inkubuj kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsaczu orbitalnym ustawionym na 50 rpm, nie więcej.
W wyznaczonym czasie należy zdjąć zakrętkę i osuszyć ją strumieniem azotu. Następnie należy zważyć zakrętkę. Potem należy ponownie wlać PBS do kolby i kontynuować inkubację przy łagodnym wstrząsaniu aż do następnego punktu pomiarowego.
Na podstawie pomiarów oblicz względną masę pozostałą. Rozpocznij od sześciotygodniowego samca myszy w pełnej narkozie, którego stan sprawdzono za pomocą testu ucisku palca u nogi. Przed rozpoczęciem operacji należy obowiązkowo nałożyć maść weterynaryjną na oczy.
Następnie odsłoń wątrobę, wykonując cięcie w linii środkowej brzucha, i umieść pod nią papier filtracyjny o znanej masie, aby ją unieruchomić. Następnie nakłuj wątrobę igłą 18G, aby wywołać krwawienie. Absorbując krew za pomocą sterylnej gazy, natychmiast nanieś 100 µL TAPE w miejscu nacięcia.
W przypadku kontroli pozytywnych należy użyć cyjanoakrylanu lub podobnego kleju, natomiast w przypadku kontroli negatywnych nie należy podejmować żadnych działań. Dalsze szycie nie jest wymagane. Po nałożeniu środka klejącego należy zebrać krew z miejsca uszkodzenia na papier.
Wymieniaj papier co 30 sekund przez dwie minuty. Zmierz masę zaabsorbowanej krwi na czterech papierach filtracyjnych. Zwierzę należy poddać eutanazji.
Przetestowano kilka proporcji TA i PEG, a idealną kombinacją do przygotowania TAPE okazał się stosunek objętości dwa do jednego. Tak przygotowany TAPE zastosowano pomiędzy dwiema skórkami wieprzowymi o średnicy sześciu milimetrów, a następnie poddano badaniu na maszynie do rozciągania zgodnie z opisem. Siła potrzebna do odseparowania dwóch skórek wieprzowych została początkowo zmierzona na poziomie 200 kilopascals i wzrosła do 250 kilopascals w kolejnych cyklach.
Kiedy próbki skóry były nawilżane po każdym cyklu przyłączania/odłączania, wytrzymałość na rozciąganie wiązania spadła początkowo do 90 kilopaskali i zmniejszyła się do 50 kilopaskali po 20 cyklach. Trwałość TAPE badano w małych objętościach rozcieńczonych w PBS z wstrząsaniem w fizjologicznych warunkach oświetlenia. Masa została zachowana przez 21 dni przy zastosowaniu formulacji w stosunku dwa do jednego.
Sformułowanie TAPE w stosunku jeden do jednego zachowało stabilność przez zaledwie 13 dni w tych warunkach. Następnie przeprowadzono in vivo test hemostatyczny. Wątrobę uszczelnioną preparatem TAPE porównano z komercyjnym klejem fibrynowym.
Wątroba uszczelniona za pomocą TAPE krwawiła znacznie mniej niż wątroba uszczelniona klejem fibrynowym. Po opanowaniu techniki, przygotowanie TAPE może zająć pięć minut, jeśli zostanie przeprowadzone prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie zoptymalizowanego stosunku kwasu taninowego do PEG, ponieważ może on drastycznie wpłynąć na siłę adhezji TAPE.
Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biomimetyki do eksploracji sposobów inspirowanych naturą w celu rozwiązania aktualnych problemów związanych z opracowywaniem wodoodpornych materiałów adhezyjnych. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat materiałów hemostatycznych, może ona zostać zastosowana również w innych systemach, takich jak uszczelniacze tkankowe do gojenia ran oraz implantowalne plastry do dostarczania leków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia prosty protokół wytwarzania biodegradowalnego kleju medycznego o skutecznych właściwościach hemostatycznych. Klej o nazwie TAPE, otrzymywany z kwasu tanowego i glikolu polietylenowego, wykazuje znacznie zwiększoną wodoodporną adhezję w porównaniu z tradycyjnym klejem fibrynowym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biomateriały
- Kleje chirurgiczne
- Hemostaza
Wstęp
- Materiały biodegradowalne stają się coraz ważniejsze w zastosowaniach medycznych.
- Kwas taninowy jest naturalnie występującym związkiem obecnym w różnych roślinach.
- Obecne kleje chirurgiczne często nie posiadają wystarczającej odporności na wodę.
- Poprawa właściwości adhezyjnych może usprawnić wyniki zabiegów chirurgicznych.
Cel badania
- Opracowanie prostego i skutecznego biodegradowalnego kleju hemostatycznego.
- Zbadanie mechanizmów adhezji biomateriałów.
- Zapewnienie ekologicznej alternatywy dla istniejących środków klejących.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworu kwasu taninowego w szklanej fiolce.
- Mieszanie kwasu taninowego z wodą destylowaną na mieszalce magnetycznej.
- Mieszanie przy 200 rpm do całkowitego rozpuszczenia substancji.
- Ocena właściwości adhezyjnych w porównaniu z produktami komercyjnymi.
Główne wyniki
- TAPE wykazuje 2,5-krotnie większą odporną na wodę adhezję niż klej fibrynowy.
- Metoda przygotowania jest prosta i skalowalna.
- Klej jest przyjazny dla środowiska i biodegradowalny.
- Wskazano potencjalne zastosowania w warunkach chirurgicznych.
Wnioski
- TAPE stanowi obiecujący postęp w dziedzinie klejów chirurgicznych.
- Zastosowanie kwasu taninowego oferuje naturalne i skuteczne rozwiązanie.
- Dalsze badania mogłyby rozszerzyć zakres jego zastosowań w medycynie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Biodegradowalne kleje hemostatyczne, takie jak TAPE, rozwiązują trwały problem uzyskania silnej, wodoodpornej adhezji tkanek w chirurgii i pielęgnacji ran. Wykorzystując związek pochodzenia roślinnego oraz biopolimer, niniejszy protokół umożliwia szybkie i skalowalne przygotowanie klejów o doskonałej adhezji w środowisku wilgotnym i wysokiej biodegradowalności, co wspiera ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do oceny przedklinicznej. Podejście to ma strategiczną wartość dla zespołów badawczo-rozwojowych w sektorze biofarmaceutycznym, dążących do zmniejszenia ryzyka związanego z opracowywaniem biomateriałów oraz rozszerzenia zestawu narzędzi stosowanych w chirurgii i aplikacjach dostarczania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów adhezji tkankowej i hemostazy w biomateriałach pochodzenia roślinnego.
- Wspiera funkcjonalną walidację właściwości adhezyjnych w warunkach fizjologicznych i mokrych.
- Ułatwia przewidywanie skuteczności w wyborze materiałów do dalszego rozwoju translacyjnego.
Przesiewy i rozwój testów
- Zapewnia powtarzalny protokół przygotowania i testowania wytrzymałości adhezyjnej w tkankach biologicznych.
- Standaryzuje ilościowy pomiar siły adhezji i trwałości w środowiskach wilgotnych.
- Umożliwia porównawcze zestawienie z klejami komercyjnymi w celu oceny gotowości do wdrożenia.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje właściwości adhezyjne do modeli istotnych dla przebiegu choroby, takich jak hemostaza in vivo w modelu uszkodzenia wątroby myszy.
- Zapewnia ciągłość procesu – od przygotowania materiałów w skali laboratoryjnej po przedkliniczne badania skuteczności.
- Minimalizuje ryzyko decyzji o dalszym rozwoju projektu poprzez wykazanie biodegradowalności oraz funkcjonalnej hemostazy in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół sytuuje TAPE w kontinuum obejmującym proces od odkrywania biomateriału po walidację przedkliniczną, umożliwiając iteracyjną optymalizację i benchmarking w zastosowaniach chirurgicznych oraz w dostarczaniu leków.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia mechanizm adhezji związków pochodzenia roślinnego i biopolimerów w środowisku mokrych tkanek.
- Przesiewanie: Dostarcza standaryzowanych, ilościowych wskaźników adhezji i trwałości w celu oceny kandydatów.
- Analityka: Zapewnia krzywe siła-odległość oraz dane o retencji masy do porównania formulacji adhezyjnych.
- Badania translacyjne: Wykazuje skuteczność hemostatyczną in vivo i biodegradowalność w odpowiednich modelach zwierzęcych.
- Ponowne wykorzystanie w przemyśle: Oferuje skalowalny, przyjazny dla środowiska protokół, który można dostosować do różnorodnych linii technologicznych biomateriałów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wydajności adhezyjnej i biokompatybilności materiałów.
- Wartość operacyjna: Upraszcza przygotowanie, standaryzuje testowanie i wspiera powtarzalność wyników między zespołami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub zaprzestaniu prac (go/no-go) w obszarze rozwoju biomateriałów i rozszerzania portfolio.
- Wpływ na portfolio: Redukuje ryzyko na późniejszych etapach poprzez wczesną walidację funkcji adhezyjnej i biodegradowalności w procesie rozwoju.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie przygotowywania biomateriałów oraz ilościowych testów adhezji tkanek.
- Wymagany jest dostęp do standardowej aparatury laboratoryjnej do mieszania, wirowania oraz testów rozciągania.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowywania tkanek i pomiaru siły pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych modeli tkanek i formulacji adhezyjnych w celu szerszego zastosowania.
- Wydajność jest zależna od precyzyjnych stosunków TA:PEG oraz warunków środowiskowych, co wykazano w protokole.
