Wizualizacja regeneracji naczyń krwionośnych i miąższu po 70% częściowej hepatektomii u zdrowych myszy

Wizualizacja regeneracji naczyniowej i miąższowej po 70% częściowej hepatektomii u prawidłowych myszy. Tradycyjnie regenerację wątroby ocenia się poprzez pomiar przyrostu masy i objętości wątroby, a także poprzez oznaczenie szybkości proliferacji hepatocytów. Obecnie interesuje nas naczyniowa regeneracja wątroby u myszy i chcemy zwizualizować oraz ilościowo ocenić wzrost naczyń.

W ten sposób ustalamy schemat postępowania dla obrazowania regeneracji naczyniowej. Schemat ten składa się z czterech etapów: kontrastowania drzewa naczyniowego, wykonania skanów CT, rekonstrukcji 3D oraz ilościowej i jakościowej analizy uzyskanych obrazów. Procedura rozpoczyna się od kontrastowania drzewa naczyniowego.

Najpierw odsłaniamy wątrobę, prawidłową lub po resekcji, a następnie wstrzykujemy polimeryzujący silikonowy środek kontrastowy do żyły wrotnej lub żyły wątrobowej, w zależności od badanego układu naczyniowego. Następnie wyekstrahowane wątroby poddaje się skanowaniu w mikrotomografie komputerowym (MicroCT). Po skanowaniu przeprowadzamy trójwymiarową rekonstrukcję naczyniową przy użyciu oprogramowania przedklinicznego Imalytics.

Jeśli jakość techniczna uzyskanych obrazów jest wystarczająca, można przeprowadzić rekonstrukcję 3D przy użyciu programu HepaVision. Program ten jest stosowany w klinikach do planowania operacji hepatobiliarnych. Oprócz wizualizacji 3D drzewa naczyniowego, program ten umożliwia wizualizację i obliczenie objętości wątroby, zarówno całkowitej, jak i poszczególnych płatów, w oparciu o naczynia doprowadzające i odprowadzające.

Po rekonstrukcji, za pomocą technik obliczeniowych możemy wyznaczyć dodatkowe parametry świadczące o wzroście naczyń, takie jak długość i średnica konkretnego naczynia. Pozwoli to na ilościowy opis wzrostu naczyniowego. Z drugiej strony, próbki Microfil utrwalone w formalinie można pociąć na seryjne skrawki.

Przekroje seryjne można barwić i digitalizować za pomocą skanera całych preparatów. Po sztywnej i elastycznej rejestracji przekrojów seryjnych można zrekonstruować trójwymiarowe drzewa naczyniowe zarówno systemu żylnego wrotnego, jak i wątrobowego. W kolejnym kroku zamierzamy zbadać przestrzenną dystrybucję zdarzeń molekularnych.

Przykładem istotnego zdarzenia molekularnego w regeneracji wątroby jest pojawienie się markera proliferacji Ki-67 w jądrach hepatocytów oraz jego rozkład przestrzenny w trójwymiarowo zrekonstruowanych drzewach naczyniowych. W dalszej części przedstawimy szczegółowy opis przeprowadzania wtryskiwania preparatu Microfil. Przygotowanie odczynników.

Do przygotowania mieszaniny związku Microfil będziemy potrzebować rozcieńczalnika MV, związku MV (w naszym przypadku niebieskiego MV-120) oraz utwardzacza. Potrzebne będą również pipety, probówka i pipetor. Do jednej probówki o pojemności pięciu mililitrów należy przygotować dwa mililitry MV-120.

Następnie rozcieńczyć preparat, dodając 3 mL rozcieńczalnika MV. Wymieszać, delikatnie wstrząsając. W przypadku soli fizjologicznej z heparyną, dodać 1 mL heparyny do 10 mL soli fizjologicznej.

Przygotowanie stołu operacyjnego. Po pierwsze, potrzebny jest mikroskop, po drugie, niezbędny jest zestaw materiałów zużywalnych. Szwy jedwabne 6-0 oraz polipropylenowe 6-0, strzykawki o pojemności 5 ml i 1 ml, igły G30 i G21, przedłużacz do połączenia strzykawki z cewnikiem, cewnik G26 z igłą wprowadzającą, patyczki bawełniane i gaza.

Po trzecie, niezbędne są narzędzia chirurgiczne. Instrumenty mikrochirurgiczne, klamry oraz koagulator elektryczny. Po czwarte, wymagana jest pompa perfuzyjna.

Przygotowanie zwierzęcia. Umieść mysz w komorze do indukcji znieczulenia i znieczul ją przy użyciu 2% izofluranu oraz tlenu z przepływem 0,3 ml/min. Przymocuj znieczuloną mysz do stołu operacyjnego za pomocą taśm, zapewniając ciągłą inhalację 2% izofluranu i tlenu z przepływem 0,3 ml/min.

Iniekcja Microfil, w układzie żylnym wrotnej. Wykonać cięcie poprzeczne na brzuchu, używając nożyczek do warstwy skóry oraz koagulatora elektrycznego do warstwy mięśniowej. Przesunąć jelita na lewą stronę za pomocą patyczków watnych i przykryć je gazą nasączoną solą fizjologiczną.

Przeprowadź dysekcję żyły wrotnej pod mikroskopem. Umieść szew jedwabny 6-0 pod pozawątrobowym odcinkiem żyły wrotnej w odległości około jednego milimetra od jej rozwidlenia. Zawiąż go luźno do późniejszego użycia.

Wstrzyknij roztwór soli fizjologicznej z heparyną do żyły prącia w celu systemowej heparynizacji przez pięć minut. Ta animacja zaprezentuje procedurę wprowadzania cewnika. Najpierw umieść szew jedwabny 6-0 pod żyłą wrotną pozawątrobową, następnie wprowadź cewnik 26G do żyły wrotnej i utrwal go za pomocą zacisku.

Przewiązać wcześniej założoną szsuturę w celu ustalenia cewnika i zablokowania przepływu krwi z żyły śledzionowej oraz żyły krezkowej. Poniżej zaprezentujemy procedurę chirurgiczną. Wprowadzić cewnik 26G wraz z igłą.

Wprowadzić cewnik głębiej, jednocześnie powoli wysuwając igłę. Przymocować cewnik za pomocą zacisku. Całkowicie wypełnić cewnik roztworem soli fizjologicznej z heparyną, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.

Podłącz rurkę przedłużającą do cewnika i mocno je zabezpiecz. Włącz pompę perfuzyjną. Rozpocznij perfuzję solą fizjologiczną z heparyną z prędkością przepływu 0,4 ml/min.

Zaobserwuj, że prawe płaty stają się blade bezpośrednio po perfuzji. Płucz wątrobę solą fizjologiczną, aby utrzymać jej wilgotność przez cały czas trwania procedury perfuzji. Uśmierć mysz poprzez wykrwawienie podczas perfuzji w znieczuleniu.

Kontynuuj perfuzję heparyną przez kilka minut, aż cała wątroba stanie się blada. Przed perfuzją Microfil dodaj 0,1 mililitra utwardzacza do przygotowanego związku Microfil, aby przyspieszyć proces polimeryzacji. Napełnij strzykawkę pięciomililitrową i przedłużoną rurkę związkiem Microfil.

Usuń pęcherzyki powietrza, wstrzykując roztwór soli fizjologicznej z heparyną do cewnika, analogicznie jak poprzednio. Połącz rurkę z cewnikiem i mocno ją zabezpiecz. Rozpocznij wtryskiwanie Microfil z prędkością przepływu 0,2 ml/min przez około jedną do dwóch minut.

Obserwuj powolne rozprzestrzenianie się niebieskiego związku w gałęziach żyły wrotnej. Przerwij perfuzję, gdy niebieska struktura naczyń pojawi się na powierzchni każdego płata wątroby, co zaznaczono czerwonym okręgiem. Pozostaw wątroby na co najmniej 15 minut w celu polimeryzacji związku Microfil.

Wtryskiwanie Microfil, żylny system wątrobowy. Procedura w zasadzie przebiega według tych samych etapów, co w przypadku wtryskiwania do żylnego systemu wrotnego. Umieść szew jedwabny 6-0 pod pozawątrobową żyłą wrotną, w odległości około jednego milimetra od jej rozwidlenia.

Następnie wprowadź cewnik do żyły wrotnej i zamocuj go za pomocą zacisku. Wprowadź kolejny cewnik do żyły głównej dolnej i również zamocuj go zaciskiem. Podwiąż wcześniej umieszczoną sznurówkę służącą do mocowania cewnika oraz blokowania przepływu krwi z żyły śledzionowej i żyły krezkowej.

Załóż zacisk na nadwątrobowy odcinek żyły głównej dolnej, aby zablokować odpływ z wątroby. Podwiąż odgałęzienia żyły głównej dolnej, w tym obie żyły nerkowe oraz dystalny koniec żyły głównej dolnej. Przepłucz wątrobę roztworem soli fizjologicznej z heparyną za pomocą cewnika pierwszego.

Przeprowadź perfuzję układu żył wątrobowych związkiem Microfil poprzez drugi cewnik. Wyniki: rekonstrukcja Micro CT. Otrzymaliśmy trójwymiarowe rekonstrukcje naczyniowe przy użyciu oprogramowania preklinicznego Imalytics po skanowaniu Micro CT.

Regeneracja naczyniowa zarówno w obrębie układu wrotnego, jak i żylnego wątroby przejawiała się wydłużeniem i poszerzeniem głównych struktur naczyniowych w połączeniu z rozgałęzianiem się mniejszych naczyń. W drugim dniu po operacji drzewa naczyniowe pozostałych płatów uległy wydłużeniu. Do siódmego dnia po operacji widoczne stały się dodatkowe małe odgałęzienia wychodzące z tej samej głównej żyły wrotnej oraz żyły wątrobowej.

Wyniki, trójwymiarowa rekonstrukcja z kodowaniem kolorystycznym drzewa naczyniowego wątroby oraz zależnych obszarów wątrobowych. Każdy płat wątroby został łatwo zwizualizowany w trzech wymiarach po rekonstrukcji z kodowaniem kolorystycznym za pomocą systemu HepaVision. Zgodnie z informacjami w tabeli, określono objętości wątrobowe całej wątroby oraz każdego płata, co przedstawiono tutaj dla systemu żylnego prawidłowej wątroby.

Wyniki, seryjne cięcia i rekonstrukcja. Z drugiej strony, próbkę Microfil utrwaloną w formalinie poddano seryjnemu cięciu. Barwione przekroje seryjne zostały zdigitalizowane przy użyciu skanera całych preparatów i wykorzystane do rekonstrukcji drzewa naczyniowego obu układów.

Są to przekroje stosu seryjnych cięć wątroby myszy przed i po sztywnej oraz elastycznej rejestracji. Po rejestracji komputerowej systemy żyły wrotnej i żyły wątrobowej mogą zostać zrekonstruowane w pojedynczym modelu 3D. Ten etap, czasochłonny pod względem manualnym i obliczeniowym, wymaga dalszej optymalizacji.

Kolejny etap, mianowicie wizualizacja przestrzennego rozkładu zdarzeń molekularnych w odniesieniu do drzew naczyniowych, jest obecnie w fazie opracowywania. Krok ten można zdefiniować jako fuzję informacji z mikro-CT pochodzących z kontrastowanego drzewa naczyniowego z informacjami histologicznymi lub jako wizualizację 3D wyłącznie informacji histologicznych. W takim przypadku informacje z mikro-CT służyłyby jako kontrola jakości dla wymagającej rekonstrukcji 3D opartej na histologii.

Po osiągnięciu tego celu dysponujemy narzędziem pozwalającym na lepsze badanie regeneracji wątroby, w szczególności przestrzennego rozkładu zdarzeń molekularnych oraz miąższu wątroby w odniesieniu do regeneracji naczyń krwionośnych.