Wizualizacja regeneracji naczyń krwionośnych i miąższu po 70% częściowej hepatektomii u zdrowych myszy

Wizualizacja regeneracji naczyń krwionośnych i miąższu po 70% częściowej hepatektomii u zdrowych myszy. Tradycyjnie regenerację wątroby ocenia się, mierząc wzrost masy i objętości wątroby, a także określając szybkość proliferacji hepatocytów. Obecnie interesujemy się regeneracją naczyniową wątroby u myszy i chcemy uwidocznić i określić ilościowo wzrost naczyń.

W ten sposób ustalamy przebieg pracy dla obrazowania regeneracji naczyń krwionośnych. Przebieg pracy składa się z czterech etapów: kontrastowania drzewa naczyniowego, akwizycji tomografii komputerowej, rekonstrukcji 3D oraz analizy ilościowej i jakościowej uzyskanych obrazów. Przepływ pracy rozpoczyna się od skontrastowania drzewa naczyniowego.

Najpierw odsłaniamy wątrobę, normalną lub wyciętą, a następnie wstrzykujemy polimeryzujący silikonowy związek kontrastowy do żyły wrotnej lub żyły wątrobowej, w zależności od interesującego nas układu naczyniowego. Następnie eksplantowane wątroby poddawane są skanowaniu w mikrotomografii komputerowej. Po skanowaniu wykonujemy rekonstrukcję naczyń krwionośnych 3D za pomocą oprogramowania przedklinicznego Imalytics.

Jeśli jakość techniczna uzyskanych obrazów jest wystarczająco dobra, rekonstrukcję 3D można wykonać za pomocą HepaVision. Program ten jest stosowany w klinikach do planowania operacji wątroby i dróg żółciowych. Oprócz wizualizacji 3D drzewa naczyniowego, program ten umożliwia wizualizację i obliczanie objętości wątroby, całkowitej wątroby i każdego płata, w oparciu o naczynia zasilające i drenujące.

Po rekonstrukcji za pomocą technik obliczeniowych możemy określić dodatkowe parametry wskazujące na wzrost naczyń krwionośnych, takie jak długość i średnica konkretnego naczynia. Pozwoli to na ilościowy opis wzrostu naczyń krwionośnych. Z drugiej strony, próbki mikrofilu z utrwalonym formaliną można ciąć na sekcje szeregowe.

Sekcje seryjne mogą być barwione i digitalizowane za pomocą całego skanera slajdów. Po sztywnej i elastycznej rejestracji odcinków seryjnych można zrekonstruować 3D drzewa naczyniowe zarówno żyły wrotnej, jak i żyły wątrobowej. W jednym z kolejnych etapów chcemy zbadać rozkład przestrzenny zdarzeń molekularnych.

Jednym z przykładów zdarzenia molekularnego interesującego w regeneracji wątroby jest pojawienie się markera proliferacji Ki-67 w jądrach hepatocytów i jego rozmieszczenie przestrzenne w zrekonstruowanych 3D drzewach naczyniowych. Następnie przedstawimy szczegółowe wprowadzenie, jak wykonać iniekcję Microfil. Przygotowanie odczynników.

Do mieszaniny związków Microfil potrzebujemy rozcieńczalnika MV, związku MV, w naszym przypadku niebieskiego MV-120 i utwardzacza. Potrzebne są nam również pipety, rurka i pipetor. Przygotuj dwa mililitry MV-120 w jednej pięciomililitrowej tubce.

Następnie rozcieńczyć go, dodając trzy mililitry rozcieńczalnika MV. Wymieszaj je, delikatnie wstrząsając. W przypadku roztworu soli fizjologicznej heparyny dodaj 1 mililitr heparyny do 10 mililitrów soli fizjologicznej.

Przygotowanie stołu operacyjnego. Po pierwsze potrzebujemy mikroskopu, po drugie potrzebny jest zestaw materiałów eksploatacyjnych. Nici jedwabne 6-0 i polipropylenowe 6-0, strzykawki pięciomililitrowe i jednomililitrowe, igły 30 i 21, rurka przedłużająca do połączenia strzykawki i cewnika, cewnik o rozmiarze 26 z wprowadzeniem igły, bawełniane końcówki i gaza.

Po trzecie, potrzebne są narzędzia chirurgiczne. Mikroinstrumenty, zaciski i koagulator elektryczny. Po czwarte, potrzebna jest pompa perfuzyjna.

Przygotowanie zwierzęcia. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia i znieczul mysz 2% izofluranem i 0,3 mililitra tlenu na minutę. Zamocuj znieczuloną mysz na stole operacyjnym za pomocą taśm, z ciągłym wdychaniem 2% izofluranu i 0,3 mililitra tlenu na minutę.

Iniekcja mikrofilu, układ żyły wrotnej. Wykonaj poprzeczne nacięcie na brzuchu za pomocą nożyczek do warstwy skóry i koagulatora elektrycznego do warstwy mięśniowej. Odsuń jelita na lewą stronę za pomocą bawełnianych końcówek i przykryj jelita gazą nasączoną solą fizjologiczną.

Wypreparuj żyłę wrotną pod mikroskopem. Umieść szew jedwabny 6-0 pod dodatkową żyłą wrotną wątroby w odległości około jednego milimetra do jej rozwidlenia. Zawiąż go luźno do późniejszego wykorzystania.

Wstrzyknąć roztwór soli fizjologicznej heparyny przez żyłę prącia w celu heparynizacji ogólnoustrojowej przez pięć minut. Ta animacja zademonstruje procedurę wprowadzania cewnika. Najpierw umieść jedwabny szew 6-0 pod dodatkową żyłą wrotną wątroby, a następnie włóż cewnik o rozmiarze 26 do żyły wrotnej i przymocuj go za pomocą zacisku.

Podwiązać wstępnie założony szew do mocowania cewnika i blokowania przepływu krwi z żyły śledziony i żyły krezkowej. Tutaj pokażemy procedurę chirurgiczną. Wprowadzić cewnik o rozmiarze 26 z igłą.

Wprowadzić cewnik dalej i jednocześnie powoli wysunąć igłę. Zamocuj cewnik za pomocą zacisku. Całkowicie napełnij cewnik roztworem soli fizjologicznej heparyny, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.

Podłącz rurkę przedłużającą do cewnika i mocno je zamocuj. Włącz pompę perfuzyjną. Rozpocznij perfuzję soli fizjologicznej heparyny z szybkością przepływu 0,4 mililitra na minutę.

Obserwuj, jak prawe płaty bledną natychmiast po perfuzji. Opłucz wątrobę solą fizjologiczną, aby była wilgotna podczas całej procedury perfuzji. Poddaj mysz eutanazji przez wykrwawienie przez perfuzję w znieczuleniu.

Kontynuuj perfuzję heparyny przez kilka minut, aż cała wątroba stanie się blada. Przed perfuzją Microfil dodaj 0,1 mililitra utwardzacza do przygotowanego związku Microfil, aby przyspieszyć procedurę polimeryzacji. Załaduj związek Microfil do pięciomililitrowej strzykawki i rurki przedłużającej.

Pozbądź się pęcherzyków powietrza, wstrzykując roztwór soli fizjologicznej heparyny do cewnika, tak samo jak poprzednio. Połącz rurkę z cewnikiem i mocno ją zamocuj. Rozpocznij wstrzykiwanie mikrofilu z natężeniem przepływu 0,2 mililitra na minutę przez około jedną do dwóch minut.

Obserwuj, jak niebieski czynnik powoli rozprzestrzenia się w gałęziach żyły wrotnej. Zatrzymaj perfuzję, gdy niebieska struktura naczynia pojawi się na powierzchni każdego płata wątroby, jak wskazano czerwonym kółkiem. Pozostaw wątrobę na co najmniej 15 minut w celu polimeryzacji związków Microfil.

Iniekcja mikrofilu, wątrobowy układ żylny. Procedura zasadniczo przebiega tak samo, jak wstrzyknięcie do układu żyły wrotnej. Umieść jedwabny szew 6-0 pod dodatkową żyłą wrotną wątroby w odległości około jednego milimetra do jej rozwidlenia.

Następnie włóż cewnik do żyły wrotnej i przymocuj go za pomocą zacisku. Wprowadź kolejny cewnik do żyły głównej dolnej i również zamocuj go za pomocą zacisku. Podwiązać wstępnie założony szew do mocowania cewnika i blokowania przepływu krwi z żyły śledziony i żyły krezkowej.

Umieść zacisk na żyle głównej nadwątrobowej dolnej, aby zablokować odpływ wątroby. Podwiązane gałęzie żyły głównej dolnej, w tym obie żyły nerkowe i dystalny koniec żyły głównej dolnej. Przepłukać wątrobę roztworem soli fizjologicznej heparyny przez cewnik.

Perfuzja wątrobowego układu żylnego za pomocą związku Microfil za pomocą cewnika drugiego. Wyniki, rekonstrukcja mikro tomografii komputerowej. Uzyskaliśmy rekonstrukcje naczyń krwionośnych 3D za pomocą oprogramowania przedklinicznego Imalytics po skanowaniu Micro CT.

Regeneracja naczyń krwionośnych zarówno w układzie wrotnym, jak i żylnym wątrobowym objawiała się wydłużeniem i poszerzeniem głównych struktur naczyniowych w połączeniu z rozgałęzieniem mniejszych naczyń. W drugiej dobie pooperacyjnej drzewa naczyniowe pozostałych płatów wydłużyły się. W siódmej dobie po operacji uwidoczniły się dodatkowe małe gałęzie z tej samej głównej żyły wrotnej i żyły wątrobowej.

Wyniki, oznaczona kolorami rekonstrukcja drzewa naczyniowego wątroby i zależnych terytoriów wątroby. Każdy płat wątroby został łatwo zobrazowany we wszystkich trzech wymiarach po rekonstrukcji oznaczonej kolorami przez HepaVision. Jak wskazano w tabeli, objętości wątroby w całej wątrobie i każdym płacie oznaczono, jak pokazano tutaj, dla wątrobowego układu żylnego prawidłowej wątroby.

Wyniki, przekroje seryjne i rekonstrukcja. Z drugiej strony, próbkę Microfil utrwaloną w formalinie poddano seryjnemu cięciu. Wybarwione skrawki seryjne zostały zdigitalizowane za pomocą skanera do slajdów i wykorzystane do rekonstrukcji drzew naczyniowych obu systemów.

Są to przekroje stosu szeregowych odcinków wątroby myszy przed i po rejestracji sztywnej i elastycznej. Po rejestracji komputerowej można zrekonstruować wrotne układy żylne i wątrobowe w jednym modelu 3D. Ten ręczny i czasochłonny obliczeniowo krok wymaga dalszej optymalizacji.

Kolejny krok, a mianowicie wizualizacja przestrzennego rozkładu zdarzeń molekularnych w odniesieniu do drzew naczyniowych, jest obecnie opracowywany. Etap ten można sobie wyobrazić jako połączenie informacji z mikrotomografii komputerowej pochodzących z kontrastowego drzewa naczyniowego z informacjami histologicznymi lub jako wizualizację 3D informacji czysto histologicznych. W takim przypadku informacje z mikrotomografii komputerowej posłużą jako kontrola jakości dla wymagającej, opartej na histologii rekonstrukcji 3D.

Po osiągnięciu tego celu mamy narzędzie do lepszego badania regeneracji wątroby. Zwłaszcza rozkład przestrzenny zdarzeń molekularnych i miąższu wątroby w odniesieniu do regeneracji naczyń krwionośnych.