Name: Wizualizacja regeneracji naczyń krwionośnych i miąższu po 70% częściowej hepatektomii u zdrowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji regeneracji naczyń krwionośnych wątroby u myszy po częściowej hepatektomii. Technika µCT i rekonstrukcja 3D umożliwiają ilościową analizę wzrostu naczyń w badaniach medycyny regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy potwierdzają finansowanie przez niemieckie Ministerstwo Edukacji i Badań (BMBF) za pośrednictwem sieci biologii systemowej "Wirtualna wątroba", numery grantów 0315743 (ExMI), 0315765 (Wielka Brytania Jena), 0315769 (MEVIS). Autorzy dziękują również Frankowi Schubertowi za wsparcie techniczne.

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz Abteilung Tiergesundheit und Tierschutz, Niemcy. Ponieważ układ żyły wrotnej był wizualizowany oddzielnie od układu żylnego wątroby, potrzebne były oddzielne zwierzęta dla różnych drzew naczyniowych.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Roztwór soli fizjologicznej heparyny
	<ol>
		<li>Dodać 0,1 ml heparyny do 10 ml soli fizjologicznej (5 j.m./ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mieszanina związków silikonowych
	<ol>
		<li>Dodaj 2 ml MV-120 do jednej probówki o pojemności 5 ml. Rozcieńczyć MV-120, dodając 3 ml rozcieńczalnika MV, dając 40% roztwór.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie silikonu do układu żylnego portalu
<ol>
	<li>laparotomia
	<ol>
		<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia i znieczul ją 2% izofluranem i 0,3 l/min tlenu.</li>
		<li>Przymocuj znieczuloną mysz na stole operacyjnym za pomocą taśmy z ciągłym wdychaniem 2% izofluranu i 0,3 l/min tlenu. Sprawdź odruch wycofania palca u myszy i rozpocznij pracę, jeśli odruch ten jest nieobecny.</li>
		<li>Wykonaj poprzeczne nacięcie na brzuchu za pomocą nożyczek do warstwy skóry i koagulatora elektrycznego do warstwy mięśniowej. Odsuń jelita na lewą stronę za pomocą bawełnianych końcówek i przykryj jelita gazą nasączoną solą fizjologiczną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadzenie cewnika
	<ol>
		<li>Wypreparuj żyłę wrotną pod mikroskopem za pomocą mikrokleszczy. Umieść jeden jedwabny szew 6-0 pod żyłą wrotną zewnątrzwątrobową, w odległości około 1 mm od jej rozwidlenia i zawiąż luźno do późniejszego użycia.</li>
		<li>Przygotowany roztwór heparyny i soli fizjologicznej wstrzyknąć przez żyłę prącia (męska) lub żyłę główną dolną (żeńska) w celu heparynizacji ogólnoustrojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Wprowadzić cewnik o rozmiarze 26 (26 G) z igłą do żyły wrotnej i zamocować go za pomocą zacisku</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór heparyny i soli fizjologicznej oraz perfuzja związków silikonowych
	<ol>
		<li>Załadować roztwór heparyny i soli fizjologicznej do strzykawki o pojemności 5 ml i włączyć urządzenie do perfuzji. Całkowicie napełnij cewnik roztworem soli fizjologicznej heparyny, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Podłącz rurkę przedłużającą do cewnika i mocno je zamocuj. Perfuzję heparyny z solą fizjologiczną należy rozpocząć z szybkością perfuzji 0,4 ml/min.</li>
		<li>Wstępnie założony szew jedwabny Ligate 6-0 do podwójnego mocowania cewnika i blokowania przepływu krwi z żyły śledziony i żyły krezkowej. Eutanazja myszy przez wykrwawienie przez perfuzję w znieczuleniu.</li>
		<li>Podczas całej procedury perfuzji płucz wątrobę solą fizjologiczną, aby była wilgotna.</li>
		<li>Dodaj 0,1 ml utwardzacza do probówki MV-120. Zmień strzykawkę z heparyną i solą fizjologiczną na strzykawkę silikonową.</li>
		<li>Rozpocznij perfuzję silikonową z szybkością perfuzji 0,2 ml/min przez około 1 minutę, aby wstępnie napełnić system cewnika i wypełnić system żył wrotnych. Zatrzymaj perfuzję silikonu, gdy naczynia na powierzchni zmienią kolor na niebieski.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pobieranie próbek
	<ol>
		<li>Utrzymuj wątrobę na miejscu, aż silikon zostanie w pełni spolimeryzowany po około 15 do 30 minutach. Wypreparuj więzadła łączące wątrobę i sąsiednie narządy, uważając, aby wątroba pozostała nienaruszona. Usuń wątrobę i włóż ją do formaliny w celu utrwalenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Iniekcja silikonu do układu żylnego wątroby
<ol>
	<li>Wykonaj laparotomię, jak w kroku 2.1 i całkowicie odsłonić pole operacyjne.</li>
	<li>Wprowadzenie cewnika
	<ol>
		<li>Wypreparuj żyłę wrotną pod mikroskopem za pomocą mikrokleszczy. Umieść jeden jedwabny szew 6-0 pod żyłą wrotną zewnątrzwątrobową, w odległości około 1 mm od jej rozwidlenia i zawiąż luźno do późniejszego użycia.</li>
		<li>Przygotowany roztwór heparyny i soli fizjologicznej wstrzyknąć przez żyłę prącia (męska) lub żyłę główną dolną (żeńska) w celu heparynizacji ogólnoustrojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Wprowadzić jeden cewnik 26 G (cewnik 1) z igłą do żyły wrotnej i zamocować go za pomocą zacisku. Wprowadzić kolejny cewnik 26 G (cewnik 2) z igłą do żyły głównej dolnej i przymocować go za pomocą zacisku.</li>
		<li>Podwiązywać gałęzie żyły głównej dolnej (w tym lewą i prawą żyłę nerkową) oraz jej dystalny koniec za pomocą syntetycznego, monofilamentowego, niewchłanialnego szwu polipropylenowego 6-0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór heparyny i soli fizjologicznej oraz perfuzja związków silikonowych
	<ol>
		<li>Załadować roztwór heparyny i soli fizjologicznej do strzykawki o pojemności 5 ml i włączyć urządzenie do perfuzji. Całkowicie napełnij cewnik 1 roztworem heparyny i soli fizjologicznej, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Podłącz rurkę przedłużającą do cewnika 1 i mocno ją zamocuj. Rozpocząć perfuzję heparyny z solą fizjologiczną z szybkością 0,4 ml/min.</li>
		<li>Wstępnie założony szew jedwabny Ligate 6-0 do podwójnego mocowania cewnika i blokowania przepływu krwi z żyły śledziony i żyły krezkowej. Eutanazja myszy przez wykrwawienie przez perfuzję w znieczuleniu.</li>
		<li>Podczas całej procedury perfuzji płucz wątrobę solą fizjologiczną, aby była wilgotna. Dodaj 0,1 ml utwardzacza do probówki MV-120. Zamień strzykawkę z heparyną i solą fizjologiczną na strzykawkę silikonową.</li>
		<li>Umieść zacisk na żyle głównej nadwątrobowej dolnej, aby zablokować odpływ wątroby.</li>
		<li>Podłączyć rurkę przedłużającą do cewnika 2 i rozpocząć perfuzję silikonową z szybkością perfuzji 0,2 ml/min przez około 2 minuty, aby osiągnąć obiektywną objętość naczyniową wątroby, zgodnie z podano. Zatrzymaj perfuzję silikonu, gdy naczynia na powierzchni zmienią kolor na niebieski.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pobieranie próbek
	<ol>
		<li>Przeciąć więzadła wątrobowe, unikając uszkodzenia wątroby. Usuń wątrobę i włóż ją do formaliny w celu utrwalenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Skanowanie mikro-CT (μCT)
Aby zeskanować pobraną próbkę wątroby za pomocą μCT, potrzebne są następujące kroki.
<ol>
	<li>Wyjąć próbkę wątroby z roztworu utrwalającego. Umieść wątrobę na łożu μCT. Umieścić złoże μCT z próbką wątroby w μCT.</li>
	<li>Uzyskaj topogram przed rozpoczęciem skanowania. Użyj jednego skanu cząstkowego dla małej próbki wątroby i dwóch podskanów dla dużych próbek.</li>
	<li>Wybierz protokół μCT o wysokiej rozdzielczości (np. HQD-6565-390-90). Protokół ten uzyskuje 720 projekcji o wymiarach 1 032 x 1 012 pikseli podczas jednego pełnego obrotu z czasem skanowania wynoszącym 90 sekund na skanowanie podrzędne. Rozpocznij skanowanie μCT.</li>
</ol>
5. Histologiczne odcinki seryjne
<ol>
	<li>Osadź próbkę wątroby w parafinie jako całości po skanowaniu μCT. Pokrój całą próbkę parafiny na sekcje 4 μm, uzyskując serię od 2 000 do 2 500 sekcji.</li>
	<li>Wybarwiaj skrawki odpowiednią techniką barwienia, aby uwidocznić zdarzenia molekularne będące przedmiotem zainteresowania, takie jak Ki-67 jako marker proliferacji i HMGB1 jako marker uszkodzenia niedokrwiennego. Określ kolejność barwienia w odniesieniu do pytania naukowego.</li>
	<li>Użyj całego skanera do slajdów, aby zdigitalizować poplamione sekcje.</li>
	<li>Wykonanie rekonstrukcji 3D drzewa (drzew) naczyniowego (już wykonalne) i wizualizacja rozkładu 3D zdarzeń molekularnych w odniesieniu do drzewa naczyniowego (badania w toku).</li>
</ol>

<ol><li>Bearden, S. E., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+alignment+in+adult+mouse+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neurovascular alignment in adult mouse skeletal muscles.</a> Microcirculation. 12 (2), 161-167 (2005).</li>
<li>Brown, R. P., Delp, M. D., Lindstedt, S. L., Rhomberg, L. R., Beliles, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+parameter+values+for+physiologically+based+pharmacokinetic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.Ind.Health%22%5BJournal%5D)">Physiological parameter values for physiologically based pharmacokinetic models.</a> Toxicol.Ind.Health. 13 (4), 407-484 (1997).</li>
<li>Dai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase-Induced+Intracranial+Dolichoectasia+Model+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Elastase-Induced Intracranial Dolichoectasia Model in Mice.</a> Neurosurgery. , (2015).</li>
<li>Ding, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+angiocrine+signals+from+sinusoidal+endothelium+are+required+for+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration.</a> Nature. 468 (7321), 310-315 (2010).</li>
<li>Downey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+ex-vivo+micro-computed+tomographic+imaging+of+blood+vessels+and+necrotic+regions+within+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Quantitative ex-vivo micro-computed tomographic imaging of blood vessels and necrotic regions within tumors.</a> PLoS.One. 7 (7), 41685(2012).</li>
<li>Ehling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2-dependent+infiltrating+macrophages+promote+angiogenesis+in+progressive+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis.</a> Gut. , (2014).</li>
<li>Ehling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+imaging+of+tumor+angiogenesis%3A+quantitative+measures+describing+micromorphology+and+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Pathol%22%5BJournal%5D)">Micro-CT imaging of tumor angiogenesis: quantitative measures describing micromorphology and vascularization.</a> Am.J.Pathol. 184 (2), 431-441 (2014).</li>
<li>Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+procedure+for+imaging+of+the+mouse+cerebral+vasculature+by+X-ray+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci.Methods%22%5BJournal%5D)">A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT.</a> J.Neurosci.Methods. 221, 70-77 (2014).</li>
<li>Gremse, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+microCT-FMT+imaging+and+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Hybrid microCT-FMT imaging and image analysis.</a> J.Vis.Exp. (100), (2015).</li>
<li>Jing, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiomorphometric+quantitative+analysis+of+vasculature+utilizing+micro-computed+tomography+and+vessel+perfusion+in+the+murine+mandible%5BTitle%5D)+AND+%22Craniomaxillofac.Trauma+Reconstr%22%5BJournal%5D)">Radiomorphometric quantitative analysis of vasculature utilizing micro-computed tomography and vessel perfusion in the murine mandible.</a> Craniomaxillofac.Trauma Reconstr. 5 (4), 223-230 (2012).</li>
<li>Melloul, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+magnetic+resonance+imaging%3A+an+efficient+tool+to+assess+liver+volume+and+intrahepatic+vascular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J.Surg.Res%22%5BJournal%5D)">Small animal magnetic resonance imaging: an efficient tool to assess liver volume and intrahepatic vascular anatomy.</a> J.Surg.Res. 187 (2), 458-465 (2014).</li>
<li>Schwier, M., Bohler, T., Hahn, H. K., Dahmen, U., Dirsch, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registration+of+histological+whole+slide+images+guided+by+vessel+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.Pathol.Inform%22%5BJournal%5D)">Registration of histological whole slide images guided by vessel structures.</a> J.Pathol.Inform. 4 ((Suppl)), 10(2013).</li>
<li>Selle, D., Preim, B., Schenk, A., Peitgen, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+vasculature+for+liver+surgical+planning%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.Med.Imaging%22%5BJournal%5D)">Analysis of vasculature for liver surgical planning.</a> IEEE Trans.Med.Imaging. 21 (11), 1344-1357 (2002).</li>
<li>Shergill, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+of+VEGF-+and+NO-dependent+angiogenesis+does+not+impair+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Regul.Integr.Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of of VEGF- and NO-dependent angiogenesis does not impair liver regeneration.</a> Am.J.Physiol Regul.Integr.Comp Physiol. 298 (5), 1279-1287 (2010).</li>
<li>Sueyoshi, R., Ralls, M. W., Teitelbaum, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide+2+increases+efficacy+of+distraction+enterogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Surg.Res%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide 2 increases efficacy of distraction enterogenesis.</a> J.Surg.Res. 184 (1), 365-373 (2013).</li>
<li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+and+imaging+techniques+to+study+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.Surg.Res%22%5BJournal%5D)">Rodent models and imaging techniques to study liver regeneration.</a> Eur.Surg.Res. 54 (3-4), 97-113 (2015).</li>
<li>Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+systemic+and+hepatic+hemodynamic+parameters+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice.</a> J.Vis.Exp. (92), e51955(2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Kontrastowanie drzewa naczyniowego za pomocą iniekcji silikonu i skanowania μCT zostało często wprowadzone w modelach nowotworów i modelach chorób neurologicznych w celu zbadania progresji angiogennej5,7,8,10. W niniejszym badaniu dokonano ulepszeń w metodologii wstrzykiwania silikonu w celu wizualizacji i ilościowego określenia wzrostu naczyń krwionośnych po częściowej hepatektomii u myszy.
Istnieje kilka krytycznych etapów, na które należy zwrócić uwagę, aby osiągnąć dobrą jakość ...

Regeneracja wątroby jest często określana poprzez pomiar wzrostu masy i objętości wątroby oraz poprzez ocenę szybkości proliferacji hepatocytów16. Jednak regeneracja wątroby to nie tylko regeneracja miąższu, ale także regeneracja naczyńkrwionośnych 6. W związku z tym wzrost naczyń krwionośnych powinien być dalej badany pod kątem jego roli w postępie regeneracji wątroby. Wizualizacja układu naczyniowego wątroby ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat regeneracji naczyń krwionośnych. Opracowano wiele metod pośrednich w celu zbadania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw regeneracji naczyń krwionośnych wątroby. Tradycyjnie, wykrywanie cytokin (czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, VEGF)14, chemokin i ich receptorów (CXCR4/CXCR7/CXCL12)4 było podstawą badania regeneracji naczyń krwionośnych. Jednak model 3D wraz z analizą ilościową układu naczyniowego dodałby krytycznych informacji anatomicznych, aby lepiej zrozumieć ważny związek między regeneracją miąższu wątroby a regeneracją naczyń.
Aby zobrazować układ naczyniowy wątroby, który wymaga kontrastowania drzew naczyniowych, myszom wstrzyknięto środek kontrastowy z kauczuku silikonowego nieprzepuszczającego promieniowania rentgenowskiego bezpośrednio do portalu lub drzewa naczyniowego żyły wątrobowej. Po polimeryzacji silikonu i eksplantacji narządu, próbki wątroby poddano skanowaniu μCT za pomocą tomografu komputerowego. Skany zaowocowały reprezentacjami obrazu woksela próbek do wstrzykiwania silikonu9.
Dla kontroli jakości, układ naczyniowy został najpierw zobrazowany w 3D za pomocą oprogramowania przedklinicznego. Segmentację przeprowadzono poprzez ustawienie progu między intensywnością tkanek miękkich a intensywnością naczynia. Powstała maska naczynia została zobrazowana za pomocą renderingu powierzchniowego. Oprogramowanie pozwoliło również na ręczne wyznaczenie dwóch parametrów wzrostu naczyń krwionośnych: maksymalnej długości naczynia i promienia.
Przedkliniczne oprogramowanie zostało następnie użyte do rekonstrukcji 3D drzew naczyniowych i późniejszego obliczenia obszarów naczyniowych zasilających lub odprowadzających wodę13. Ponadto oprogramowanie to automatycznie określało pewne parametry wzrostu naczyń krwionośnych, takie jak całkowita długość wszystkich widocznych struktur naczyniowych, znana również jako całkowita długość krawędzi lub całkowita objętość naczynia.
Procedura perfuzji silikonu została przeprowadzona u myszy wcześniej nieleczonych oraz u myszy, które przeszły 70% częściowej hepatektomii (PH). Wątroby pobrano w różnych punktach obserwacyjnych po resekcji w celu analizy regeneracji wątroby naczyniowej i miąższowej przy użyciu wspomnianej techniki wizualizacji i kwantyfikacji.
Główne cele tego filmu to: (1) zademonstrowanie delikatnej techniki iniekcji wymaganej do uzyskania optymalnego kontrastu oraz (2) pokazanie potencjalnych korzyści wynikających ze szczegółowej analizy otrzymanej próbki za pomocą μCT i histologicznych odcinków seryjnych. Po obejrzeniu tego filmu czytelnik powinien lepiej zrozumieć, jak wstrzykiwać związek silikonowy do określonego układu naczyniowego oraz o użyteczności i możliwości zastosowania tej techniki.

<table><tbody><tr><td>PERFUSOR&reg; VI</td><td>B.BRAUN</td><td>87 222/0</td><td></td></tr><tr><td>Pipetus&reg;-akku</td><td>Hirschmann</td><td>9907200</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>mikronożyczki</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej (F&middot; S&middot; L)</td> <td>No. 14058-09</td><td></td></tr><tr><td>micro serrefine</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td> <td>No.18055-05</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator mikrozacisków</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td> <td>No. 18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Proste mikrokleszcze</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td> <td>No. 00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione mikrokleszcze</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td> <td>Nr 00649-11</td><td></td></tr><tr><td>uchwyt na igłę</td><td>Fine Science Tools (F&middot; S&middot; L)</td><td>No. 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>B.Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml</td><td>B.Braun</td><td>4606051V</td><td></td></tr><tr><td>przedłużacze i przewody połączeniowe</td><td>B.Braun</td><td>4256000</td><td>30 cm, wewnętrzna i ukośnik; 1,2 mm</td></tr><tr><td>6-0 jedwab (Perma-Hand Seide)</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>6-0 prolene</td><td>Ethicon</td><td>8711H</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplik&reg; Rozcieńczalnik MV</td><td>FLOW TECH, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfil&reg; MV - 120</td><td>FLOW TECH, INC</td><td>MV - 120 (niebieski)</td><td></td></tr><tr><td>Utwardzacz MV</td><td>FLOW TECH, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparyna 2500 I.E./5 ml</td><td>Rotexmedica</td><td>ETI3L318-15</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td>E15117/D DE</td><td></td></tr><tr><td>Imalytics Oprogramowanie przedkliniczne</td><td>Eksperymentalne obrazowanie molekularne, Uniwersytet RWTH w Akwizgranie, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepaVision</td><td>Fraunhofer MEVIS, Brema, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0-HT&nbsp; Cyfrowy skaner slajdów</td><td>Hamamatsu Electronic Press, Japonia&nbsp;</td><td>Tomoskop C9600</td><td></td></tr><tr><td>Duo CT&nbsp;</td><td>CT Imaging GmbH, Erlangen, Niemcy</td><td>TomoScope&reg; &nbsp; Synergia</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja regeneracji naczyń krwionośnych i miąższu po 70% częściowej hepatektomii u zdrowych myszy

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Zmodyfikowana procedura wstrzykiwania silikonu została użyta do wizualizacji drzewa naczyniowego wątroby. Procedura ta polegała na wstrzyknięciu in vivo związku silikonowego za pomocą cewnika 26 G do żyły wrotnej lub wątrobowej. Po wstrzyknięciu silikonu narządy poddano eksplantacji i przygotowano do badania ex vivo mikro-CT (μCT). Procedura wstrzykiwania silikonu jest technicznie trudna. Osiągnięcie pomyślnego wyniku wymaga dużego doświadczenia mikrochirurgicznego ze strony chirurga. Jednym z wyzwań tej procedury jest określenie odpowiedniej szybkości perfuzji dla związku silikonowego. Szybkość perfuzji związku silikonowego należy określić na podstawie hemodynamiki układu naczyniowego, który jest przedmiotem zainteresowania. Niewłaściwa szybkość perfuzji może prowadzić do niepełnej perfuzji, sztucznego rozszerzenia i pękania drzew naczyniowych.
Rekonstrukcja 3D układu naczyniowego opierała się na skanach tomografii komputerowej i została zrealizowana przy użyciu oprogramowania przedklinicznego, takiego jak HepaVision. Jakość zrekonstruowanego drzewa naczyniowego była bezpośrednio związana z jakością perfuzji silikonu. Następnie obliczono parametry naczyniowe wskazujące na wzrost naczyń, takie jak całkowita objętość naczyń, na podstawie rekonstrukcji naczyniowych. Kontrastowanie drzewa naczyniowego z silikonem pozwoliło na późniejsze badanie histologiczne próbki po skanowaniu μCT. Próbka może być poddana seryjnemu cięciu, analizie histologicznej i skanowaniu całego preparatu, a następnie rekonstrukcji 3D drzew naczyniowych na podstawie obrazów histologicznych. Jest to warunek wstępny do wykrycia zdarzeń molekularnych i ich rozkładu względem drzewa naczyniowego. Ta zmodyfikowana procedura wstrzykiwania silikonu może być również wykorzystana do wizualizacji i rekonstrukcji układów naczyniowych innych narządów. Technika ta może być szeroko stosowana w badaniach dotyczących anatomii i wzrostu naczyń krwionośnych w różnych modelach zwierzęcych i chorobowych.

Kryteria jakości
Jakość wtrysku silikonu można ocenić gołym okiem w trakcie procedury. Małe naczynia na powierzchni wątroby stopniowo wypełniają się niebieskim związkiem. Jeśli na powierzchni wątroby zaobserwowano prawidłową strukturę naczyniową, jakość wtrysku gumy silikonowej była dobra. W przypadku niewystarczającej objętości perfuzji małe naczynia na powierzchni wątroby nie zostały w pełni wypełnione. Z kole...

Narzędzia używane do wizualizacji regeneracji naczyń krwionośnych wymagają metod kontrastowania drzew naczyniowych. Film ten zademonstrował delikatną technikę iniekcji zastosowaną w celu uzyskania optymalnego kontrastu drzew naczyniowych i zilustrował potencjalne korzyści wynikające ze szczegółowej analizy otrzymanej próbki za pomocą μCT i histologicznych odcinków seryjnych.

Wizualizacja regeneracji naczyń krwionośnych i miąższu po 70% częściowej hepatektomii u zdrowych myszy

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Wizualizacja regeneracji naczyniowej i miąższowej po 70% częściowej hepatektomii u prawidłowych myszy. Tradycyjnie regenerację wątroby ocenia się poprzez pomiar przyrostu masy i objętości wątroby, a także poprzez oznaczenie szybkości proliferacji hepatocytów. Obecnie interesuje nas naczyniowa regeneracja wątroby u myszy i chcemy zwizualizować oraz ilościowo ocenić wzrost naczyń.W ten sposób ustalamy schemat postępowania dla obrazowania regeneracji naczyniowej. Schemat ten składa się z czterech etapów: kontrastowania drzewa naczyniowego, wykonania skanów CT, rekonstrukcji 3D oraz ilościowej i jakościowej analizy uzyskanych obrazów. Procedura rozpoczyna się od kontrastowania drzewa naczyniowego.Najpierw odsłaniamy wątrobę, prawidłową lub po resekcji, a następnie wstrzykujemy polimeryzujący silikonowy środek kontrastowy do żyły wrotnej lub żyły wątrobowej, w zależności od badanego układu naczyniowego. Następnie wyekstrahowane wątroby poddaje się skanowaniu w mikrotomografie komputerowym (MicroCT). Po skanowaniu przeprowadzamy trójwymiarową rekonstrukcję naczyniową przy użyciu oprogramowania przedklinicznego Imalytics.Jeśli jakość techniczna uzyskanych obrazów jest wystarczająca, można przeprowadzić rekonstrukcję 3D przy użyciu programu HepaVision. Program ten jest stosowany w klinikach do planowania operacji hepatobiliarnych. Oprócz wizualizacji 3D drzewa naczyniowego, program ten umożliwia wizualizację i obliczenie objętości wątroby, zarówno całkowitej, jak i poszczególnych płatów, w oparciu o naczynia doprowadzające i odprowadzające.Po rekonstrukcji, za pomocą technik obliczeniowych możemy wyznaczyć dodatkowe parametry świadczące o wzroście naczyń, takie jak długość i średnica konkretnego naczynia. Pozwoli to na ilościowy opis wzrostu naczyniowego. Z drugiej strony, próbki Microfil utrwalone w formalinie można pociąć na seryjne skrawki.Przekroje seryjne można barwić i digitalizować za pomocą skanera całych preparatów. Po sztywnej i elastycznej rejestracji przekrojów seryjnych można zrekonstruować trójwymiarowe drzewa naczyniowe zarówno systemu żylnego wrotnego, jak i wątrobowego. W kolejnym kroku zamierzamy zbadać przestrzenną dystrybucję zdarzeń molekularnych.Przykładem istotnego zdarzenia molekularnego w regeneracji wątroby jest pojawienie się markera proliferacji Ki-67 w jądrach hepatocytów oraz jego rozkład przestrzenny w trójwymiarowo zrekonstruowanych drzewach naczyniowych. W dalszej części przedstawimy szczegółowy opis przeprowadzania wtryskiwania preparatu Microfil. Przygotowanie odczynników.Do przygotowania mieszaniny związku Microfil będziemy potrzebować rozcieńczalnika MV, związku MV (w naszym przypadku niebieskiego MV-120) oraz utwardzacza. Potrzebne będą również pipety, probówka i pipetor. Do jednej probówki o pojemności pięciu mililitrów należy przygotować dwa mililitry MV-120.Następnie rozcieńczyć preparat, dodając 3 mL rozcieńczalnika MV. Wymieszać, delikatnie wstrząsając. W przypadku soli fizjologicznej z heparyną, dodać 1 mL heparyny do 10 mL soli fizjologicznej.Przygotowanie stołu operacyjnego. Po pierwsze, potrzebny jest mikroskop, po drugie, niezbędny jest zestaw materiałów zużywalnych. Szwy jedwabne 6-0 oraz polipropylenowe 6-0, strzykawki o pojemności 5 ml i 1 ml, igły G30 i G21, przedłużacz do połączenia strzykawki z cewnikiem, cewnik G26 z igłą wprowadzającą, patyczki bawełniane i gaza.Po trzecie, niezbędne są narzędzia chirurgiczne. Instrumenty mikrochirurgiczne, klamry oraz koagulator elektryczny. Po czwarte, wymagana jest pompa perfuzyjna.Przygotowanie zwierzęcia. Umieść mysz w komorze do indukcji znieczulenia i znieczul ją przy użyciu 2% izofluranu oraz tlenu z przepływem 0,3 ml/min. Przymocuj znieczuloną mysz do stołu operacyjnego za pomocą taśm, zapewniając ciągłą inhalację 2% izofluranu i tlenu z przepływem 0,3 ml/min.Iniekcja Microfil, w układzie żylnym wrotnej. Wykonać cięcie poprzeczne na brzuchu, używając nożyczek do warstwy skóry oraz koagulatora elektrycznego do warstwy mięśniowej. Przesunąć jelita na lewą stronę za pomocą patyczków watnych i przykryć je gazą nasączoną solą fizjologiczną.Przeprowadź dysekcję żyły wrotnej pod mikroskopem. Umieść szew jedwabny 6-0 pod pozawątrobowym odcinkiem żyły wrotnej w odległości około jednego milimetra od jej rozwidlenia. Zawiąż go luźno do późniejszego użycia.Wstrzyknij roztwór soli fizjologicznej z heparyną do żyły prącia w celu systemowej heparynizacji przez pięć minut. Ta animacja zaprezentuje procedurę wprowadzania cewnika. Najpierw umieść szew jedwabny 6-0 pod żyłą wrotną pozawątrobową, następnie wprowadź cewnik 26G do żyły wrotnej i utrwal go za pomocą zacisku.Przewiązać wcześniej założoną szsuturę w celu ustalenia cewnika i zablokowania przepływu krwi z żyły śledzionowej oraz żyły krezkowej. Poniżej zaprezentujemy procedurę chirurgiczną. Wprowadzić cewnik 26G wraz z igłą.Wprowadzić cewnik głębiej, jednocześnie powoli wysuwając igłę. Przymocować cewnik za pomocą zacisku. Całkowicie wypełnić cewnik roztworem soli fizjologicznej z heparyną, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.Podłącz rurkę przedłużającą do cewnika i mocno je zabezpiecz. Włącz pompę perfuzyjną. Rozpocznij perfuzję solą fizjologiczną z heparyną z prędkością przepływu 0,4 ml/min.Zaobserwuj, że prawe płaty stają się blade bezpośrednio po perfuzji. Płucz wątrobę solą fizjologiczną, aby utrzymać jej wilgotność przez cały czas trwania procedury perfuzji. Uśmierć mysz poprzez wykrwawienie podczas perfuzji w znieczuleniu.Kontynuuj perfuzję heparyną przez kilka minut, aż cała wątroba stanie się blada. Przed perfuzją Microfil dodaj 0,1 mililitra utwardzacza do przygotowanego związku Microfil, aby przyspieszyć proces polimeryzacji. Napełnij strzykawkę pięciomililitrową i przedłużoną rurkę związkiem Microfil.Usuń pęcherzyki powietrza, wstrzykując roztwór soli fizjologicznej z heparyną do cewnika, analogicznie jak poprzednio. Połącz rurkę z cewnikiem i mocno ją zabezpiecz. Rozpocznij wtryskiwanie Microfil z prędkością przepływu 0,2 ml/min przez około jedną do dwóch minut.Obserwuj powolne rozprzestrzenianie się niebieskiego związku w gałęziach żyły wrotnej. Przerwij perfuzję, gdy niebieska struktura naczyń pojawi się na powierzchni każdego płata wątroby, co zaznaczono czerwonym okręgiem. Pozostaw wątroby na co najmniej 15 minut w celu polimeryzacji związku Microfil.Wtryskiwanie Microfil, żylny system wątrobowy. Procedura w zasadzie przebiega według tych samych etapów, co w przypadku wtryskiwania do żylnego systemu wrotnego. Umieść szew jedwabny 6-0 pod pozawątrobową żyłą wrotną, w odległości około jednego milimetra od jej rozwidlenia.Następnie wprowadź cewnik do żyły wrotnej i zamocuj go za pomocą zacisku. Wprowadź kolejny cewnik do żyły głównej dolnej i również zamocuj go zaciskiem. Podwiąż wcześniej umieszczoną sznurówkę służącą do mocowania cewnika oraz blokowania przepływu krwi z żyły śledzionowej i żyły krezkowej.Załóż zacisk na nadwątrobowy odcinek żyły głównej dolnej, aby zablokować odpływ z wątroby. Podwiąż odgałęzienia żyły głównej dolnej, w tym obie żyły nerkowe oraz dystalny koniec żyły głównej dolnej. Przepłucz wątrobę roztworem soli fizjologicznej z heparyną za pomocą cewnika pierwszego.Przeprowadź perfuzję układu żył wątrobowych związkiem Microfil poprzez drugi cewnik. Wyniki: rekonstrukcja Micro CT. Otrzymaliśmy trójwymiarowe rekonstrukcje naczyniowe przy użyciu oprogramowania preklinicznego Imalytics po skanowaniu Micro CT.Regeneracja naczyniowa zarówno w obrębie układu wrotnego, jak i żylnego wątroby przejawiała się wydłużeniem i poszerzeniem głównych struktur naczyniowych w połączeniu z rozgałęzianiem się mniejszych naczyń. W drugim dniu po operacji drzewa naczyniowe pozostałych płatów uległy wydłużeniu. Do siódmego dnia po operacji widoczne stały się dodatkowe małe odgałęzienia wychodzące z tej samej głównej żyły wrotnej oraz żyły wątrobowej.Wyniki, trójwymiarowa rekonstrukcja z kodowaniem kolorystycznym drzewa naczyniowego wątroby oraz zależnych obszarów wątrobowych. Każdy płat wątroby został łatwo zwizualizowany w trzech wymiarach po rekonstrukcji z kodowaniem kolorystycznym za pomocą systemu HepaVision. Zgodnie z informacjami w tabeli, określono objętości wątrobowe całej wątroby oraz każdego płata, co przedstawiono tutaj dla systemu żylnego prawidłowej wątroby.Wyniki, seryjne cięcia i rekonstrukcja. Z drugiej strony, próbkę Microfil utrwaloną w formalinie poddano seryjnemu cięciu. Barwione przekroje seryjne zostały zdigitalizowane przy użyciu skanera całych preparatów i wykorzystane do rekonstrukcji drzewa naczyniowego obu układów.Są to przekroje stosu seryjnych cięć wątroby myszy przed i po sztywnej oraz elastycznej rejestracji. Po rejestracji komputerowej systemy żyły wrotnej i żyły wątrobowej mogą zostać zrekonstruowane w pojedynczym modelu 3D. Ten etap, czasochłonny pod względem manualnym i obliczeniowym, wymaga dalszej optymalizacji.Kolejny etap, mianowicie wizualizacja przestrzennego rozkładu zdarzeń molekularnych w odniesieniu do drzew naczyniowych, jest obecnie w fazie opracowywania. Krok ten można zdefiniować jako fuzję informacji z mikro-CT pochodzących z kontrastowanego drzewa naczyniowego z informacjami histologicznymi lub jako wizualizację 3D wyłącznie informacji histologicznych. W takim przypadku informacje z mikro-CT służyłyby jako kontrola jakości dla wymagającej rekonstrukcji 3D opartej na histologii.Po osiągnięciu tego celu dysponujemy narzędziem pozwalającym na lepsze badanie regeneracji wątroby, w szczególności przestrzennego rozkładu zdarzeń molekularnych oraz miąższu wątroby w odniesieniu do regeneracji naczyń krwionośnych.

visualization-vascular-parenchymal-regeneration-after-70-partial

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisaliśmy protokół wykonywania częściowej hepatektomii (PHx) i przeszczepu komórek przez śledzionę w NOD. SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J) myszy. W tym protokole wykonuje się nacięcie w celu odsłonięcia i wycięcia lewego płata wątroby, a następnie kolejne nacięcie w celu dośledziony przeszczepu komórek.

Wewnątrzśledzionowe przeszczepienia hepatocytów po częściowej hepatektomii w NOD. Myszy SCID

Tutaj prezentujemy nową metodę częściowej resekcji lewego płata wątroby u noworodków (dzień 0) myszy. Ten nowy protokół jest odpowiedni do badania ostrego uszkodzenia wątroby i reakcji na uraz u noworodków.

Hepatektomia zrazikowa częściowa: chirurgiczny model morfologicznej regeneracji wątroby

Ustanawiamy nowatorską technikę chirurgiczną dla modelu perfuzji pojedynczego płata wątroby in vivo u szczurów jako warunek wstępny do dalszych badań in vivo częściowej inżynierii wątroby w przyszłości.

Nowatorska technika chirurgiczna jako podstawa częściowej inżynierii wątroby in vivo u szczurów

Ten protokół opisuje procedurę usuwania brzusznego płata wątroby u dorosłego danio pręgowanego, aby umożliwić badanie regeneracji wątroby.

Częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego

Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.

Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

W tym protokole omawiamy implementację modelu udanego ortotopowego przeszczepu wątroby (OLT) u myszy. Dodatkowo omówiono adiuwanty do dalszej analizy drożności przeszczepu allogenicznego po udanym OLT u myszy, w szczególności z wykorzystaniem skanów tomografii mikrokomputerowej (microCT).

Udany ortotopowy przeszczep wątroby u myszy z wykorzystaniem angiografii tomografii mikrokomputerowej

Wykazano, że powiązanie podziału wątroby i podwiązania żyły wrotnej w przypadku etapowej hepatektomii (ALPPS) powoduje niezwykłą regenerację wątroby po kilku tygodniach od operacji pierwszego etapu. Modele zwierzęce, które przeszły ALPPS, zostały opracowane w celu zbadania potencjalnej zdolności regeneracji wątroby i osiągnięcia korzystnych wyników klinicznych.

Mysi model skojarzonej partycji wątroby i podwiązania żyły wrotnej do etapowego zabiegu hepatektomii wspomaganego mikroskopią

Ten protokół dostarcza informacji technicznych dotyczących rekonstrukcji naczyń krwionośnych przy użyciu techniki mankietowej w ortotopowym przeszczepie wątroby u myszy.

Rekonstrukcja naczyń krwionośnych techniką mankietową w ortotopowym przeszczepie wątroby u myszy

Organoidy generowane z guzów pacjenta są ortotopowo wstrzykiwane do wątroby myszy. Resekcja nienowotworowej tkanki wątroby prowadzi do środowiska regeneracyjnego w tkance wątroby, w której znajduje się guz.

Model ksenoprzeszczepu organoidalnego uzyskany od pacjenta z rakiem wątrobowokomórkowym w celu zbadania wpływu regeneracji wątroby na wzrost guza

Mysi model częściowej 2/3 (66%) hepatektomii jest dobrze opisany w literaturze, ale rzadko stosowano bardziej rozbudowane hepatektomie naśladujące zespół małego dla rozmiaru po przeszczepie wątroby. Opisujemy rozszerzoną 78% procedurę hepatektomii w modelu mysim, która powoduje około 50% śmiertelności pooperacyjnej u zdrowych myszy.

Rozszerzona 78% hepatektomia w mysim modelu chirurgicznym

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne fibroblastów z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość.

Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Poznaj metodę wizualizacji regeneracji naczyń krwionośnych wątroby u myszy po częściowej hepatektomii. Technika µCT i rekonstrukcja 3D umożliwiają ilościową analizę wzrostu naczyń w badaniach medycyny regeneracyjnej.

Wizualizacja regeneracji naczyń krwionośnych i miąższu po 70% częściowej hepatektomii u zdrowych myszy

Przeglądaj więcej filmów