Mysia kończyna tylna Sekcja kości długich i izolacja szpiku kostnego

Ogólnym celem tej procedury wycięcia kości długiej i izolacji szpiku kostnego jest szybkie i systematyczne usunięcie kości długich oraz pobranie szpiku kostnego do dalszej analizy. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z biologią szpiku kostnego, przerzutami raka i immunologią. Główną zaletą tej techniki jest to, że proces preparacji jest szybki i ustandaryzowany, procedura izolacji szpiku kostnego jest dość sterylna, Zacznij od ustawienia myszy w pozycji leżącej.

Następnie przypnij wszystkie cztery opuszki łap poniżej stawu skokowego i spryskaj mysz 70% etanolem, dokładnie oblewając nogi. Następnie wykonaj małe nacięcie po prawej stronie linii środkowej w dolnej części brzucha tuż nad biodrem i przedłuż nacięcie w dół nogi i obok stawu skokowego. Odciągnij skórę.

Następnie przetnij mięsień czworogłowy uda zakotwiczony w bliższym końcu kości udowej, aby odsłonić przednią stronę kości udowej i przygwoźdź mięsień od nogi szpilką pod kątem 45 stopni od deski. Trzymając nożyczki przy tylnej stronie kości udowej, odetnij ścięgna podkolanowe od stawu kolanowego. Następnie odciągnij skórę i mięśnie ścięgien podkolanowych zakotwiczone w bliższym końcu kości udowej, aby odsłonić tylną stronę kości i przypnij mięśnie ścięgien podkolanowych od nogi, umieszczając szpilkę pod kątem 45 stopni.

Kleszczami chwyć dystalny koniec kości udowej tuż nad stawem kolanowym. Następnie poprowadź ostrza nożyc po obu stronach trzonu kości udowej w kierunku stawu biodrowego. Po dotarciu do głowy kości udowej przekręć nożyczki, przesuwając górne ostrze bezpośrednio nad głową kości udowej, aby zwichnąć kość udową.

Teraz chwyć szczypce górną część trzonu kości udowej i odetnij tkankę miękką od głowy kości udowej, aby uwolnić kość udową z panewki. Następnie pociągnij całą kość nogi, w tym kość udową, kolano i piszczel, do góry i od ciała, a następnie ostrożnie odetnij tkankę łączną i mięsień mocujący nogę do skóry. Kiedy cała tkanka łączna zostanie usunięta, nadmiernie rozciągnij staw skokowy i przekręć nożyczki, jak właśnie pokazano, aby zwichnąć kość piszczelową.

Chwytając dystalny koniec kości piszczelowej i uważając, aby nie zerwać ścięgien, pociągnij kość piszczelową do góry i odsuń ją od ciała i tablicy pinowej. Następnie usuń pozostałą tkankę łączną przyczepioną do kości długiej w kolanie oraz wszelkie dodatkowe mięśnie lub tkankę łączną przyczepioną do kości udowej i piszczelowej. Aby przygotować kość długą do izolacji szpiku, chwyć kość udową rzepką skierowaną na zewnątrz i głową kości udowej skierowaną w dół.

Nadmiernie rozciągnij staw kolanowy i przekręć nożyczki, aby zwichnąć kość piszczelową z kości udowej. Następnie usuń tkankę łączną trzymającą kość udową i piszczelową razem. Następnie chwyć kość udową przednią stroną skierowaną na zewnątrz i głową kości udowej skierowaną w dół i poprowadź nożyczki w górę trzonu kości udowej do kłykci.

Delikatnie obracaj nożyczki do przodu iz powrotem, aby usunąć kłykcie, rzepkę i nasadę, odsłaniając przysadę. Następnie użyj kleszczy, nożyczek i chusteczek Kimwipes, aby usunąć wszelkie dodatkowe mięśnie lub tkankę łączną przyczepioną do kości udowej. Następnie chwyć kość piszczelową przednią stroną skierowaną na zewnątrz i końcem kostki skierowanym w dół.

Jeśli nasada piszczeli jest nienaruszona, poprowadź nożyczki w górę trzonu piszczeli do kłykci i delikatnie obracaj nożyczki do przodu iz powrotem, aby usunąć kłykcie i nasadę, odsłaniając przynasadę kości piszczelowej. Następnie usuń wszelkie dodatkowe mięśnie lub tkankę łączną przyczepioną do kości piszczelowej, jak właśnie pokazano. Aby pobrać szpik kostny, najpierw przebij igłę o rozmiarze 18 G przez dno probówki mikrowirówki o pojemności 0,5 mililitra.

Następnie umieść kości długie w probówce, kolanem w dół i zamknij pokrywę. Zagnieżdż probówkę mikrowirówki o pojemności 0,5 mililitra w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj probówki z prędkością większą lub równą 10 000 razy g w mikrowirówce przez 15 sekund. Sprawdzić, czy szpik kostny został wydzielony z kości poprzez oględziny.

Kości powinny wydawać się białe, a w większej tubie powinna być widoczna duża osadka. Następnie wyrzuć kości do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 mililitra i zawieś szpik kostny w odpowiednim roztworze do pożądanej dalszej analizy. Ta technika szybkiej analizy nadaje się do wielu dalszych analiz, w tym histomorfometrii i histologii.

Rzeczywiście, jak wykazano w tej reprezentatywnej histomorfometrycznej rekonstrukcji 3D mikro-CT, zarówno kość gąbczasta, jak i powłoka korowa są zachowane, co pozwala na dokładne ilościowe określenie standaryzowanych parametrów strukturalnych dla histomorfometrii kości. W tym reprezentatywnym przekroju histologicznym formalnej oraz utrwalonej i odwapnionej kości piszczelowej barwionej H i E można zaobserwować zachowanie integralności zarówno zwapniałej kości, jak i komórkowego szpiku kostnego do analizy histologicznej. Co więcej, szpik kostny wyizolowany za pomocą tej procedury nadaje się do wielu dalszych zastosowań, w tym do pierwotnej hodowli komórkowej osteoklastów lub osteoblastów.

Po opanowaniu techniki można ją ukończyć w ciągu około siedmiu minut, od długiego wycięcia kości do izolacji szpiku kostnego, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania procedury ważne jest, aby pamiętać o ustawieniu myszy w celu ułatwienia sekcji. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak FACS lub inne procesy jednokomórkowe, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian w populacjach komórek szpiku kostnego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak szybko wypreparować kości długie myszy i wyizolować szpik kostny przez wirowanie.