Name: Mysia kończyna tylna Sekcja kości długich i izolacja szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Naucz się szybkiej sekcji kości długich i izolacji szpiku kostnego z mysich kończyn tylnych metodą wirowania. Technika zapewnia zachowanie integralności tkanki do analiz histologicznych i hodowli komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NCI nr U54CA143803, CA163124, CA093900 i CA143055 dla K.J.P. Autorzy dziękują obecnym i byłym członkom laboratorium Weilbaecher, zwłaszcza Katherine Weilbaecher, Michelle Hurchla i Hongju Deng, a także członkom Instytutu Urologicznego Brady'ego, zwłaszcza członkom laboratorium Pienta za krytyczną lekturę manuskryptu.

Wszystkie prace nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych National Institutes of Health.
1. Rozwarstwienie kości długiej kończyny tylnej
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
	<li>Ustaw mysz w pozycji leżącej na plecach i przymocuj, przypinając wszystkie cztery nogi przez poduszki łap myszy poniżej stawu skokowego.</li>
	<li>Spryskaj mysz 70% etanolem, dokładnie oblewając nogi.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie na prawo od linii środkowej w dolnej części brzucha, tuż nad biodrem.</li>
	<li>Przedłuż nacięcie w dół nogi i za staw skokowy.</li>
	<li>Odciągnij skórę i odetnij mięsień czworogłowy zakotwiczony w bliższym końcu kości udowej, aby odsłonić przednią stronę kości udowej i wysunąć ją z nogi, umieszczając szpilkę pod kątem 45 stopni od deski.</li>
	<li>Trzymając ostrze nożyczek przy tylnej stronie kości udowej, odetnij ścięgna podkolanowe od stawu kolanowego.</li>
	<li>Odciągnij skórę i mięśnie ścięgien podkolanowych zakotwiczone w bliższym końcu kości udowej, aby odsłonić tylną stronę kości udowej i wysunąć ją z nogi, umieszczając szpilkę pod kątem 45 stopni od deski.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przytrzymaj dystalny koniec kości udowej, tuż nad stawem kolanowym. Prowadź ostrza nożyczek po obu stronach trzonu kości udowej w kierunku stawu biodrowego, uważając, aby nie przeciąć samej kości udowej.</li>
	<li>Po dotarciu do głowy kości udowej, na co wskazują lekko otwierające się nożyczki, przekręć nożyczki górnym ostrzem nożyczek przesuwając się bezpośrednio nad głową kości udowej, aby zwichnąć kość udową, uważając, aby nie zatrzasnąć kości poniżej głowy kości udowej.</li>
	<li>Chwyć szczypce górną część trzonu kości udowej, odetnij tkankę miękką od głowy kości udowej, aby uwolnić ją z panewki.</li>
	<li>Pociągnij całą kość nogi, w tym kość udową, kolano i piszczel, do góry i od ciała, ostrożnie odcinając tkankę łączną i mięsień łączący nogę ze skórą.</li>
	<li>Nadmiernie rozciągnij staw skokowy i ponownie użyj nożyczek ruchem skręcającym, aby zwichnąć kość piszczelową.</li>
	<li>Chwytając dystalny koniec kości piszczelowej, uważając, aby nie zerwać ścięgien, pociągnij kość piszczelową do góry i odsuń ją od ciała i tablicy.</li>
	<li>Przetnij pozostałą tkankę łączną łączną łączącą kość długą z myszą w kolanie.</li>
	<li>Usuń wszelkie dodatkowe mięśnie lub tkankę łączną przyczepioną do kości udowej i piszczelowej.</li>
	<li>W przypadku wszelkich zastosowań, które wymagają, aby kość pozostała nienaruszona (histologia, histomorfometria, badania biomechaniczne itp.), postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami wewnętrznymi (jak w 4-7). Aby wyizolować szpik kostny, przejdź do sekcji 2.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kości długiej do izolacji szpiku kostnego
<ol>
	<li>Za pomocą kleszczy chwyć kość udową rzepką skierowaną na zewnątrz i bliższym końcem (głową kości udowej) w dół.</li>
	<li>Nadmiernie rozciągnij staw kolanowy i użyj nożyczek ruchem skręcającym, aby zwichnąć kość piszczelową i udową.</li>
	<li>Przetnij tkankę łączną trzymającą razem kość udową i piszczelową.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy chwyć kość udową przednią stroną skierowaną na zewnątrz i bliższym końcem (głową kości udowej) w dół.</li>
	<li>Poprowadź nożyczki w górę trzonu kości udowej do kłykci.</li>
	<li>Delikatnie obracaj nożyczki do przodu iz powrotem, aby usunąć kłykcie, rzepkę i nasadę, aby odsłonić przysadę.</li>
	<li>Usuń wszelkie dodatkowe mięśnie lub tkankę łączną przyczepioną do kości udowej za pomocą kleszczy, nożyczek i chusteczek Kimwipe.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy chwyć kość piszczelową przednią stroną skierowaną na zewnątrz i dystalnym końcem (końcem kostki) w dół.</li>
	<li>Jeśli nasada kości piszczelowej jest nienaruszona, poprowadź nożyczki w górę trzonu kości piszczelowej do kłykci.</li>
	<li>Delikatnie obracaj nożyczki do przodu iz powrotem, aby usunąć kłykcie i nasadę, aby odsłonić przysadę.</li>
	<li>Usuń wszelkie dodatkowe mięśnie lub tkankę łączną przyczepioną do kości piszczelowej za pomocą kleszczy, nożyczek i chusteczek Kimwipe.</li>
</ol>
3. Izolacja szpiku kostnego
<ol>
	<li>Przecisnąć igłę 18 G przez dno probówki do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml.</li>
	<li>Umieść kości długie (maksymalnie 2 kości udowe i 2 piszczele) w rurce, kolanem w dół, końcem do dołu i zamknij pokrywę.</li>
	<li>Umieść probówkę do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować zagnieżdżone probówki o ≥10 000 x g w mikrowirówce przez 15 sekund.</li>
	<li>Sprawdzić, czy szpik kostny został wydzielony z kości poprzez oględziny. Kości powinny wydawać się białe, a w większej rurce powinna znajdować się duża wizualna osadka.</li>
	<li>Wyrzucić probówkę mikrowirówki o pojemności 0,5 ml z kośćmi.</li>
	<li>Zawiesić szpik kostny w odpowiednim roztworze (np. PBS, pożywce hodowlanej, buforze FACS) i postępować zgodnie z protokołem eksperymentalnym (izolacja DNA, RNA lub białka, analiza FACS lub pierwotna hodowla komórkowa).</li>
</ol>

<ol><li>McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+80%5BTitle%5D)+AND+%22Primer+on+the+Metabolic+Bone+Diseases+and+Disorders+of+Mineral+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ch. 80.</a> Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , American Socieyt for Bone and Mineral Research. 379-381 (2008).</li>
<li>Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+to+bone%3A+a+fatal+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer to bone: a fatal attraction.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).</li>
<li>Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostate+cancer+bone+marrow+niche%3A+more+than+just+%27fertile+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The prostate cancer bone marrow niche: more than just 'fertile soil.</a> Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).</li>
<li>Amend, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin-1+regulates+bone+homeostasis+through+effects+on+bone+matrix+integrity+and+nitric+oxide+signaling+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).</li>
<li>Hurchla, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epoxyketone-based+proteasome+inhibitors+carfilzomib+and+orally+bioavailable+oprozomib+have+anti-resorptive+and+bone-anabolic+activity+in+addition+to+anti-myeloma+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects.</a> Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).</li>
<li>Rauch, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARF+tumor+suppressor+regulates+bone+remodeling+and+osteosarcoma+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice.</a> PLoS One. 5 (12), e15755(2010).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ADP+receptor+P2RY12+regulates+osteoclast+function+and+pathologic+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling.</a> J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).</li>
<li>Dempster, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units+for+bone+histomorphometry%3A+a+2012+update+of+the+report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).</li>
<li>Festing, M. F., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+design+and+statistical+analysis+of+experiments+using+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals.</a> ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy prostą i skuteczną metodę usuwania tylnych kości długich myszy i późniejszej izolacji szpiku kostnego. Metoda ta utrzymuje wysoką integralność strukturalną i komórkową kości i szpiku kostnego oraz skraca czas obsługi, minimalizując prawdopodobieństwo złamań lub nacięć kostnych wywołanych przez użytkownika, które mogą mieć wpływ na dalsze analizy. Ponadto metoda wirowania do izolowania szpiku kostnego nie wymaga cięcia kości w celu odsłonięcia przestrzeni szpiku kostnego lub płynu w celu przepłukania szpiku kostnego, zmniejszając potencjalne punkty zanieczyszczenia. Co więcej, technika wirówki charakteryzuje się stosunkowo wysoką przepustowością i krótszym czasem pracy niż inne metody, co skraca czas przetwarzania.
Wysoka zmienność jest nieodłącznym elementem badań in vivo na myszach ze względu na dużą zmienność fenotypową między myszami. Aby zmaksymalizować wpływ kosztownych i pracochłonnych badań na myszach, kluczowe znaczenie ma zminimalizowanie technicznego błędu eksperymentalnego9,10. Czas od złożenia zwierzęcia w uśmierceniu do dalszej analizy lub utrwalenia tkanek wprowadza eksperymentalną zmienność, która może przezwyciężyć subtelne zmiany i zmniejszyć duże różnice między grupami. Dlatego szybkie przetwarzanie próbek jest niezbędne do dokładnej analizy danych. Opisane tutaj techniki rozwarstwiania długich kości i izolacji szpiku kostnego są zoptymalizowane pod kątem szybkiego przetwarzania zwierząt i próbek w celu zmniejszenia zmienności technicznej.
Protokół ten może być szeroko stosowany w wielu dziedzinach badań, w tym w badaniu samej tkanki kostnej lub badaniu komórek szpiku kostnego. Ponadto to proste podejście do sekcji długich kości umożliwi naukowcom z pokrewnych dziedzin bezpośrednie badanie wkładu kostnego w celu poszerzenia naszej wiedzy na temat dysfunkcji szpiku kostnego w niedostatecznie zbadanych patologiach.

Badanie kości długich i komórek szpiku kostnego jest kluczowe dla niezliczonych dyscyplin badawczych, w tym, ale nie tylko, biologii kości, biologii raka, immunologii, hematologii i biomechaniki. Kość jest bardzo dynamicznym narządem, który wraz z chrząstką tworzy szkielet, zapewniając mechaniczne wsparcie przed obciążeniem i ochronę narządów wewnętrznych. Ponadto składniki mineralne kości są pochłaniaczem dla krytycznych cząsteczek sygnałowych wapnia i fosforu, a także innych czynników1. Wreszcie, w kościach znajduje się szpik kostny i wraz z metabolicznie czynnymi osteoblastami tworzącymi kości i osteoklastami resorbującymi kość, zapewniają niszę komórek macierzystych niezbędną do utrzymania populacji komórek krwiotwórczych i limfatycznych.
Kość i szpik kostny są dotknięte wieloma zaburzeniami, często prowadząc do dysfunkcji szpiku kostnego, silnego bólu kości i patologicznych złamań. Kość jest częstym miejscem przerzutów w wielu guzach litych, w szczególności w raku piersi i raku prostaty, gdzie komórki nowotworowe bezpośrednio angażują się w niszę szpiku kostnego, aby zainicjować błędne koło przerzutów do kości i wyprzeć krwiotwórcze komórki macierzyste2,3. Nowotwory układu krwiotwórczego, w tym szpiczak i białaczka, charakteryzują się dysfunkcją szpiku kostnego, a także deregulacją zdrowej przebudowy kości1. Inne niezłośliwe zaburzenia układu kostnego są również aktywnymi obszarami badań, takimi jak choroba zwyrodnieniowa stawów, osteoporoza, skolioza i krzywica. Nawet u skądinąd zdrowej osoby, awaria biomechaniczna kości prowadzi do bolesnego złamania. Wszystkie te zaburzenia stanowią aktywne obszary badań, których celem jest zidentyfikowanie nowych środków zapobiegawczych i schematów leczenia w celu zmniejszenia zachorowalności i śmiertelności.
Aby zbadać mnogość ról kości i szpiku kostnego, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych, kluczowe dla badaczy jest posiadanie prostej i efektywnej ustandaryzowanej metody preparowania kości długich myszy w celu szybkiego przetwarzania dużych eksperymentów in vivo. Przedstawiony tutaj protokół preparacji jest odpowiedni dla wszystkich analiz kości długich, w tym między innymi obrazowania ex vivo, histologii, histomorfometrii i testów wytrzymałościowych. Podobnie, standaryzowana metoda izolacji szpiku kostnego z wysoką regeneracją komórek szpiku kostnego i niską zmiennością między użytkownikami jest ważna dla analiz eksperymentalnych, takich jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) lub ilościowy PCR (qPCR), a także dla dalszych zastosowań, takich jak pierwotna hodowla komórkowa komórek szpiku kostnego.

<table><tbody><tr><td>Szpilki do tablicy</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>korkowej</td></tr><tr><td>70% nożyczki</td> do rozwarstwiania etanolu<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td>preparacyjne</tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>16 G igła</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka</td><td></td><td></td><td></td>do mikrowirówek</tr><tr><td>0,5 ml Probówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> do mikrowirówek</tbody></table>

mysia kończyna tylna sekcja kości długich i izolacja szpiku kostnego

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Badania kości i szpiku kostnego są kluczowe w wielu dziedzinach badawczych, w tym w podstawowej biologii kości, immunologii, hematologii, przerzutach raka, biomechanice i biologii komórek macierzystych. Pomimo znaczenia kości w stanach zdrowych i patologicznych, jest to jednak narząd w dużej mierze niedostatecznie zbadany ze względu na brak specjalistycznej wiedzy na temat rozwarstwiania kości i izolacji szpiku kostnego. Myszy są powszechnym organizmem modelowym do badania wpływu na kość i szpik kostny, co wymaga standaryzowanej i wydajnej metody rozwarstwiania długich kości i izolacji szpiku kostnego do przetwarzania dużych kohort eksperymentalnych. Opisujemy prostą procedurę preparacji w celu usunięcia kości udowej i piszczelowej, która jest odpowiednia do dalszych zastosowań, w tym między innymi do analizy histomorfologicznej i testów wytrzymałościowych. Ponadto przedstawiamy szybką procedurę izolacji szpiku kostnego z kości długich poprzez wirowanie z ograniczonym czasem obsługi, idealną do sortowania komórek, pierwotnej hodowli komórek lub ekstrakcji DNA, RNA i białek. Protokół został usprawniony pod kątem szybkiego przetwarzania próbek w celu ograniczenia błędów eksperymentalnych i jest ustandaryzowany w celu zminimalizowania zmienności między użytkownikami.

Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany pod kątem szybkiej sekcji kości udowej i piszczelowej myszy przy minimalnym uszkodzeniu tkanki kostnej. Technika ta jest odpowiednia do szeregu analiz następczych, w tym do badań biomechanicznych, histomorfometrii (Rysunek 1A - B) oraz histologii (Rysunek 1C)4,7. Reprezentatywna trójwymiarowa rekonstrukcja mikroCT w badaniu histomorfometrycznym (Rysunek 1A - B) pokazuje, że zachowana została zarówno kość gąbczasta, jak i skorupa korowa, co umożliwia dokładne ilościowe oznaczenie znormalizowanych parametrów strukturalnych dla histomorfometrii kości, w tym liczby, grubości i odstępów między beleczkami, objętości kości oraz grubości kory, spośród innych miar8. Reprezentatywny przekrój histologiczny przedstawia utrwaloną w formalinie i odwapnioną kość piszczelową barwioną H&amp;E (Rysunek 1C). Obraz ten demonstruje integralność zarówno zwapniałej kości, jak i komórkowego szpiku kostnego do analizy histologicznej.
Procedura izolacji szpiku kostnego zachowuje sterylność przestrzeni szpiku, charakteryzuje się minimalną manipulacją w celu ograniczenia kontaminacji i nie wymaga przecinania kości długiej, co zmniejsza utratę uzysku szpiku. Tak otrzymany szpik kostny nadaje się do wielu dalszych zastosowań, w tym do cytometrii przepływowej5 oraz analiz PCR. Ponadto procedura ta może być wykorzystana do izolacji szpiku kostnego w celu pierwotnej hodowli komórek szpiku, w tym osteoklastów i osteoblastów (Rycina 2A - B)4,6.
<img alt="Skanowanie CT kości i obraz histologiczny; analiza strukturalna i obserwacja szczegółów komórkowych." src="/files/ftp_upload/53936/53936fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Analizy histomorfologiczne i histologiczne długich kości myszy. Trójwymiarowa rekonstrukcja microCT kości piszczelowej myszy przedstawiająca (A) zewnętrzną warstwę korową oraz (B) kość beleczkową (pasek skali = 0.5 mm). (C) Barwienie histologiczne H&amp;E odwapnionej i przekrojonej kości piszczelowej (4x). Obrazy dzięki uprzejmości Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przekrój histologiczny i analiza kultur komórkowych, obrazy mikroskopowe, morfologia tkanek, badanie próbek." src="/files/ftp_upload/53936/53936fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Pierwotna kultura komórek szpiku kostnego do różnicowania osteoklastów i osteoblastów. (A) Barwienie TRAP na wielojądrowe osteoklasty po 7 dniach w pożywce osteoklastogennej (4x). (B) Barwienie na fosfatazę alkaliczną (kolor fioletowy) dla osteoblastów oraz alizaryną czerwienią (kolor czerwony) na mineralizację po 21 dniach w pożywce osteogennej. Obrazy courtesy of Katherine Weilbaecher, Washington University School of Medicine, USA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53936/53936fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji kości długich kończyn tylnych (kości udowych i piszczelowych) od myszy laboratoryjnej. Dalej opisujemy szybką technikę izolacji szpiku kostnego od tych kości, która wykorzystuje wirowanie do usuwania szpiku kostnego z przestrzeni szpiku kostnego.

Mysia kończyna tylna Sekcja kości długich i izolacja szpiku kostnego

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Ogólnym celem tej procedury sekcji kości długich i izolacji szpiku kostnego jest szybkie i systematyczne usunięcie kości długich oraz pobranie szpiku kostnego do dalszych analiz. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania związane z biologią szpiku kostnego, przerzutami nowotworowymi i immunologią. Główną zaletą tej techniki jest szybki i zestandaryzowany proces sekcji oraz dość sterylny przebieg izolacji szpiku kostnego. Rozpocznij od ułożenia myszy w pozycji grzbietowej.Następnie przypnij wszystkie cztery poduszki łap poniżej stawu skokowego i spryskaj mysz 70% ethanol, dokładnie nasączając nogi. W kolejnym kroku wykonaj niewielkie nacięcie na prawo od linii środkowej w dolnej części brzucha, tuż nad biodrem, a następnie przedłuż nacięcie w dół nogi, poza staw skokowy. Odciągnij skórę.Następnie przetnij mięsień czworogłowy uda przyczepiony do proksymalnego końca kości udowej, aby odsłonić przednią stronę kości udowej, i przypnij mięsień do podkładki, wbijając szpilkę pod kątem 45 stopni względem podkładki. Przystawiając nożyczki do tylnej strony kości udowej, odetnij mięśnie kulszowo-goleniowe od stawu kolanowego. Następnie odsun na bok skórę i mięśnie kulszowo-goleniowe przyczepione do proksymalnego końca kości udowej, aby odsłonić tylną stronę kości, i przypnij mięśnie kulszowo-goleniowe do podkładki, wbijając szpilkę pod kątem 45 stopni.Za pomocą pęsety chwyć dystalny koniec kości udowej tuż powyżej stawu kolanowego. Następnie skieruj ostrza nożyczek po obu stronach trzonu kości udowej w stronę stawu biodrowego. Po dotarciu do głowy kości udowej obróć nożyczki, przesuwając górne ostrze bezpośrednio nad głowę kości udowej, aby zwichnąć kość udową.Teraz chwyć kleszczami górną część trzonu kości udowej i odetnij tkankę miękką od głowy kości udowej, aby uwolnić kość udową z panewki stawu biodrowego. Następnie pociągnij całą kość kończyny, w tym kość udową, kolano i piszczel, do góry i z dala od ciała, a następnie ostrożnie odetnij tkankę łączną i mięśnie łączące nogę ze skórą. Po usunięciu całej tkanki łącznej doprowadź do przeprostu stawu skokowego i przekręć nożyczki w sposób, który został właśnie zademonstrowany, aby zwichnąć piszczel.Chwytając dystalny koniec kości piszczelowej i uważając, aby nie przeciąć ścięgien, pociągnij kość piszczelową do góry, oddalając ją od ciała i tablicy z pinami. Następnie usuń wszelką pozostałą tkankę łączną przyczepioną do kości długiej w okolicy kolana oraz wszelkie dodatkowe mięśnie lub tkankę łączną przyczepioną do kości udowej i piszczelowej. Aby przygotować kość długą do izolacji szpiku, chwyć kość udową tak, aby rzepka była skierowana na zewnątrz, a głowa kości udowej była skierowana w dół.Przedłuż zgięcie stawu kolanowego i przekręć nożyczki, aby zwichnąć kość piszczelową względem kości udowej. Następnie usuń wszelką tkankę łączną utrzymującą kość udową i piszczelową razem. Dalej, chwyć kość udową stroną przednią od siebie, a głową kości udowej skierowaną w dół, i prowadź nożyczki wzdłuż trzonu kości udowej w kierunku kłykci.Delikatnie obracaj nożyczkami w przód i w tył, aby usunąć kłykcie, rzepkę oraz nasadę kostną, odsłaniając metafizę. Następnie za pomocą pęsety, nożyczek i chusteczek Kimwipes usuń wszelkie dodatkowe mięśnie lub tkankę łączną przyczepioną do kości udowej. Następnie chwyć kość piszczelową stroną przednią skierowaną na zewnątrz, a końcem kostki skierowanym w dół.Jeśli nasada piszczeli jest nienaruszona, prowadź nożyczki wzdłuż trzonu piszczeli w kierunku kłykci i delikatnie obracaj nimi w przód i w tył, aby usunąć kłykcie oraz nasadę, odsłaniającstrefę metafizy piszczeli. Następnie usuń wszelkie dodatkowe mięśnie lub tkankę łączną przytwierdzoną do piszczeli, zgodnie z przeprowadzoną demonstracją. Aby pobrać szpik kostny, najpierw przełóż igłę o rozmiarze 18 G przez dno probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 ml.Następnie umieść kości długie w probówce, końcem kolanowym skierowanym w dół, i zamknij pokrywkę. Włóż probówkę do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml do probówki o pojemności 1,5 ml i wiruj w mikrowirówce z prędkością ≥ 10 000 ×g przez 15 sekund. Poprzez kontrolę wizualną upewnij się, że szpik kostny został całkowicie usunięty z kości.Kości powinny mieć biały kolor, a w większej probówce powinien być widoczny duży osad. Następnie należy usunąć kości z probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 ml i zawiesić szpik kostny w odpowiednim roztworze do planowanej dalszej analizy. Ta szybka technika sekcji nadaje się do wielu analiz następczych, w tym do histomorfometrii i histologii.Rzeczywiście, jak pokazano na tej reprezentatywnej trójwymiarowej rekonstrukcji mikro-CT histomorfometrycznej, zachowane zostały zarówno kość gąbczasta, jak i skorupa korowa, co pozwala na dokładne ilościowe oznaczenie znormalizowanych parametrów strukturalnych dla histomorfometrii kości. Na tym reprezentatywnym przekroju histologicznym kości piszczeli utrwalonej w formalinie, odwapnionej i barwionej H i E, można zaobserwować zachowanie integralności zarówno zwapniałej tkanki kostnej, jak i komórkowego szpiku kostnego do analizy histologicznej. Ponadto szpik kostny wyizolowany tą procedurą nadaje się do wielu dalszych zastosowań, w tym do pierwotnej hodowli komórkowej osteoklastów lub osteoblastów.Po opanowaniu techniki, cały proces – od preparacji kości długiej po izolację szpiku kostnego – może zająć około siedmiu minut, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas przeprowadzania procedury ważne jest, aby odpowiednio ułożyć mysz, co ułatwi preparację. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak FACS lub inne procesy analizy pojedynczych komórek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian w populacjach komórek szpiku kostnego.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak szybko przeprowadzić sekcję kości długich myszy oraz jak wyizolować szpik kostny metodą wirowania.

murine-hind-limb-long-bone-dissection-and-bone-marrow-isolation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja i transplantacja hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC)

Ten film opisuje szczegółowy protokół izolowania świeżego całego szpiku kostnego z tylnych kończyn myszy w celu zbadania całych wad BM u pacjentów z chorobami krwi, takimi jak białaczka.

Pobieranie szpiku kostnego z tylnej kończyny myszy

Ten protokół opisuje procedurę seryjnego pobierania próbek szpiku kostnego kości udowej (BM) bez konieczności poświęcania myszy. Procedura ta ułatwia badania podłużne składu BM myszy w czasie i zapewnia szeregowy dostęp do komórek w BM do badań ex vivo i transplantacji.

Aspiracja szpiku kostnego kości udowej u żywych myszy

Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.

Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Tutaj prezentujemy protokół, który generuje duże ilości mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego do zastosowań translacyjnych. W porównaniu z innymi, ta nowa metoda pomaga zmniejszyć liczbę uśmierconych zwierząt i obniżyć koszty, unikając kosztownych metod, takich jak magnetyczna separacja komórek o wysokim gradimencie (MACS).

Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Komórki szpiku kostnego hodowane za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) generują heterogeniczną hodowlę zawierającą makrofagi i komórki dendrytyczne (DC). Metoda ta kładzie nacisk na wykorzystanie wiązania MHCII i hialuronianu (HA) w celu odróżnienia makrofagów od DC w kulturze GM-CSF. Makrofagi w tej kulturze mają wiele podobieństw do makrofagów pęcherzykowych.

Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF

W tym artykule prezentujemy metody izolowania i różnicowania komórek zrębu szpiku kostnego i hematopoetycznych komórek macierzystych od kości długich myszy. Przedstawiono dwa różne protokoły dające różne populacje komórek odpowiednie do ekspansji i różnicowania w osteoblasty, adipocyty i osteoklasty.

Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

Opisujemy trzy metody przeszczepu szpiku kostnego (BMT): BMT z napromienianiem całego ciała, BMT z napromienianiem ekranowanym oraz metoda BMT bez wstępnego kondycjonowania (adoptywna BMT) do badania hematopoezy klonalnej w modelach mysich.

Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

W tym miejscu opisano metodę opartą na cytometrii fosfoprzepływowej do analizy sygnalizacji za szlakami mTORC1, JAK / STAT5 i MAPK w ostrych ludzkich komórkach białaczki szpikowej ksenoprzeszczepowanych myszom i uzyskanych z aspiratów szpiku kostnego. Poziomy p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 i p-ERK1/2 są jednocześnie mierzone za pomocą spektralnego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości.

Wewnątrzkomórkowa cytometria fosfoflowa ostrej białaczki szpikowej Ksenotransplantacje pochodzące od pacjentów

Naucz się szybkiej sekcji kości długich i izolacji szpiku kostnego z mysich kończyn tylnych metodą wirowania. Technika zapewnia zachowanie integralności tkanki do analiz histologicznych i hodowli komórkowej.

Mysia kończyna tylna Sekcja kości długich i izolacja szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów