Name: Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Poznaj wydajną ekstrakcję kwasów nukleinowych z wymazów i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych. Ta metoda pozwala izolować wysokiej jakości DNA i RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Elizabeth Byrne, Davidowi Gootenbergowi i Christinie Gosmann za krytyczne opinie na temat protokołu; Megan Baldridge, Scott Handley, Cindy Monaco i Jason Norman za wskazówki dotyczące przygotowania próbek i demonstracje; Wendy Garrett, Curtisowi Huttenhowerowi, Skipowi Virgin i Bruce'owi Walkerowi za porady dotyczące protokołu i owocne dyskusje; oraz Jessica Hoisington-Lopez za wsparcie w sekwencjonowaniu. Praca ta była wspierana przez Fundację Billa i Melindy Gatesów oraz NIAID (1R01AI111918). D.S.K. otrzymał dodatkowe wsparcie z Burroughs Wellcome Fund. M.N.A. była wspierana przez nagrodę numer T32GM007753 od NJMS oraz stypendium Paula i Daisy Sorosów. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIGMS lub NIH.

<ol><li>Huttenhower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486, 207-214 (2012).</li>
<li>O'Hanlon, D. E., Moench, T. R., Cone, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+pH+and+microbicidal+lactic+acid+when+lactobacilli+dominate+the+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Vaginal pH and microbicidal lactic acid when lactobacilli dominate the microbiota.</a> PloS one. 8, e80074(2013).</li>
<li>Aldunate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+concentrations+of+lactic+acid+potently+inactivate+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+antimicrobial+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Vaginal concentrations of lactic acid potently inactivate HIV.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68, 2015-2025 (2013).</li>
<li>Anahtar, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervicovaginal+bacteria+are+a+major+modulator+of+host+inflammatory+responses+in+the+female+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cervicovaginal bacteria are a major modulator of host inflammatory responses in the female genital tract.</a> Immunity. 42, 965-976 (2015).</li>
<li>Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnotobiotic+mouse+model+of+phage-bacterial+host+dynamics+in+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20236-20241 (2013).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Srinivasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variability+of+human+vaginal+bacteria+and+relationship+with+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Temporal variability of human vaginal bacteria and relationship with bacterial vaginosis.</a> PloS one. 5, e10197(2010).</li>
<li>Dols, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+identification+of+clinically+relevant+vaginal+bacteria+in+relation+to+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+obstetrics+and+gynecology%22%5BJournal%5D)">Microarray-based identification of clinically relevant vaginal bacteria in relation to bacterial vaginosis.</a> American journal of obstetrics and gynecology. 204, 301-307 (2011).</li>
<li>Segata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+microbial+community+profiling+using+unique+clade-specific+marker+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes.</a> Nature methods. 9, 811-814 (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4516-4522 (2011).</li>
<li>16S rRNA Amplification Protocol. Earthmicrobiome Project. , Available from: www.earthmicrobiome.org (2015).</li>
<li>Ravel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+microbiome+of+reproductive-age+women%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vaginal microbiome of reproductive-age women.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4680-4687 (2011).</li>
<li>Srinivasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+communities+in+women+with+bacterial+vaginosis%3A+high+resolution+phylogenetic+analyses+reveal+relationships+of+microbiota+to+clinical+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria.</a> PloS one. 7, e37818(2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature methods. 7, 335-336 (2010).</li>
<li>Werner, J. MacQIIME. , Available from: http://www.wernerlab.org/software/macqiime (2015).</li>
<li>Schloss, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+mothur%3A+open-source%2C+platform-independent%2C+community-supported+software+for+describing+and+comparing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities.</a> Applied and environmental microbiology. 75, 7537-7541 (2009).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPARSE%3A+highly+accurate+OTU+sequences+from+microbial+amplicon+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads.</a> Nature. 10, 996-998 (2013).</li>
<li>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer, V1.0 User Manual. Thermo Fisher Scientific. , Available at: http://www.thermoscientific.com/content/dam/tfs/ATG/CAD/CAD Documents/Product Manuals & Specifications/Molecular Spectroscopy/UV Visible Spectrophotometers/Spectrophotometer Systems/NanoDrop/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).</li>
<li>AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen. , Available from: https://http://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna-sample-technologies/dna-rna-protein/allprep-dnarna-mini-kit/ - orderinginformation (2015).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li>
<li>UltraClean PCR Clean-Up Kit Instruction Manual. MoBio. , Available from: http://www.mobio.com/images/custom/file/12500(1).pdf (2013).</li>
<li>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent. Invitrogen. , Available at: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp07581.pdf (2008).</li>
<li>Quality Scores for Next-Generation Sequencing. Illumina. , Available from: http://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_Q-Scores.pdf (2011).</li>
<li>split_libraries_fastq.py. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html (2015).</li>
<li>DeSantis, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greengenes%2C+a+chimera-checked+16S+rRNA+gene+database+and+workbench+compatible+with+ARB%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB.</a> Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).</li>
<li>pick_open_reference_otus.py. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/pick_open_reference_otus.html (2015).</li>
<li>summarize_taxa_otus.py. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/summarize_taxa.html (2015).</li>
<li>Vazquez-Baeza, Y., Pirrung, M., Gonzalez, A., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMPeror%3A+a+tool+for+visualizing+high-throughput+microbial+community+data%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">EMPeror: a tool for visualizing high-throughput microbial community data.</a> GigaScience. 2, 16(2013).</li>
<li>Comparing categories. QIIME. , Available from: http://qiime.org/tutorials/category_comparison.html (2015).</li>
<li>Eren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+diversity+of+Gardnerella+vaginalis+in+the+genitourinary+tract+microbiota+of+monogamous+couples+through+subtle+nucleotide+variation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Exploring the diversity of Gardnerella vaginalis in the genitourinary tract microbiota of monogamous couples through subtle nucleotide variation.</a> PloS one. 6, e26732(2011).</li>
<li>Diagnosing and preventing flow cell overclustering on the MiSeq system. Illumina. , Available from: http://support.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/other/miseq-overclustering-primer-770-2014-038.pdf (2015).</li>
<li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature biotechnology. 31, 814-821 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opisujemy protokół identyfikacji i charakterystyki względnej liczebności bakterii w ludzkim wymazie z pochwy. Protokół ten można łatwo dostosować do innych typów próbek, takich jak kał i wymazy z innych miejsc ciała, a także do próbek pobieranych z wielu różnych źródeł. Ekstrakcja kwasu nukleinowego poprzez ubijanie kulek w buforowym roztworze fenolu i chloroformu pozwala na izolację zarówno DNA, jak i RNA, co jest szczególnie ważne podczas pracy z cennymi próbkami pobranymi w ramach badań klinicznych. Wyizolowane bakteryjne DNA doskonale nadaje się do identyfikacji taksonomicznej bakterii i składania genomu, podczas gdy jednoczesne zbieranie RNA daje możliwość określenia funkcjonalnego wkładu bakterii, gospodarza i wirusa poprzez sekwencję RNA. Opisany protokół wykorzystuje zwalidowany jednoetapowy zestaw starterów, który został z powodzeniem wdrożony na szerokim zakresie typów próbek, w tym na próbkach ludzkich, psich i środowiskowych10. Dostępność tysięcy starterów z kodami kreskowymi umożliwia multipleksowanie próbek i ogromne oszczędności na kosztach sekwencjonowania. Całkowity koszt (w tym wszystkie odczynniki, pojedynczy przebieg sekwencjonowania i startery, ale nie sprzęt) wynosi około 20 USD za próbkę, gdy 200 próbek jest multipleksowanych. Ponadto istnieje bardzo wysoka odtwarzalność, gdy wiele wymazów z tego samego miejsca próbki jest przetwarzanych niezależnie przez cały rurociąg. Ogólnie rzecz biorąc, protokół jest opłacalny, elastyczny, niezawodny i powtarzalny.
Część tego protokołu dotycząca ekstrakcji kwasów nukleinowych jest ograniczona przez środki ostrożności wymagane podczas pracy z fenolem i chloroformem oraz wyzwania związane z automatyzacją rurociągu do wysokowydajnego, 96-dołkowego formatu płytki. Dodatkowo energiczne bicie kulek używane do mechanicznej lizy przycina bakteryjne DNA do około 6 kilofragmentów zasady; jeśli do dalszych zastosowań wymagane są dłuższe fragmenty DNA, czas ubijania kulek powinien zostać skrócony. Ograniczenia części tego protokołu dotyczącej identyfikacji bakterii są nieodłącznie związane z każdą metodą, która opiera się na sekwencjonowaniu genu 16S rRNA. Sekwencjonowanie 16S rRNA jest idealne do identyfikacji bakterii na poziomie rodzaju, a nawet gatunku, ale rzadko zapewnia identyfikację na poziomie szczepu. Podczas gdy zmienny region V4 genu 16S rRNA zapewnia solidną dyskryminację wśród większości gatunków bakterii11, może być konieczne zastosowanie dodatkowych metod obliczeniowych, takich jak oligotypowanie31 , w celu precyzyjnej identyfikacji niektórych gatunków, takich jak Lactobacillus crispatus. Wreszcie, informacji o dokładnych zdolnościach funkcjonalnych bakterii w danej próbce nie można określić za pomocą samego sekwencjonowania genu 16S rRNA, chociaż protokół ten umożliwia ekstrakcję całego genomu DNA i RNA, które można wykorzystać w tym celu.
Najważniejszym krokiem do zapewnienia sukcesu tego protokołu jest zachowanie szczególnej ostrożności, aby zapobiec zanieczyszczeniu podczas pobierania próbek, ekstrakcji kwasów nukleinowych i amplifikacji PCR. Zapewnij sterylność w momencie pobierania próbki, zakładając czyste rękawice i używając sterylnych wacików, probówek i nożyczek. Aby ocenić zanieczyszczenie materiałów do pobierania, należy pobrać wymazy z kontroli ujemnej, umieszczając dodatkowe niewykorzystane wymazówki bezpośrednio w probówkach transportowych w momencie pobierania próbek. W laboratorium wykonaj wszystkie etapy wstępnej amplifikacji w wysterylizowanym okapie zawierającym tylko odkażone materiały eksploatacyjne i używając wyłącznie odczynników molekularnych, wolnych od DNA. Podczas ekstrakcji kwasów nukleinowych należy zapobiegać zanieczyszczeniu krzyżowemu, używając nowych sterylnych kleszczyków i świeżych rękawiczek do każdej próbki oraz trzymając wszystkie probówki zamknięte, chyba że są używane. Równoległe przetwarzanie niewykorzystanych wymazówek zapewnia sterylność zarówno pobrania próbki, jak i ekstrakcji kwasów nukleinowych; Niewykorzystane waciki nie powinny dawać osadu po wytrąceniu izopropanolu i umyciu etanolem. Jeśli pojawi się osad, należy przeprowadzić amplifikację genu 16S rRNA, aby określić możliwe źródło zanieczyszczenia (np. obecność Streptococcus lub Staphylococcus wskazywałaby na zanieczyszczenie skóry). Dodatkowo należy równolegle wykonywać amplifikacje PCR bez reakcji kontrolnych matrycy, aby upewnić się, że odczynniki i reakcje PCR nie zostały zanieczyszczone. Jeśli w kontrolce bez szablonu pojawi się prążek, wyrzuć odczynniki i powtórz amplifikację ze świeżymi odczynnikami. Podjęcie tych środków ostrożności zapewni pomyślne sekwencjonowanie interesujących nas bakterii.
Etap amplifikacji PCR zwykle wymaga najwięcej rozwiązywania problemów. Amplifikacja w zestawach po dwanaście próbek zapewnia równowagę między wydajnością a spójnością. Całkowity brak pasm na wszystkich próbkach w danym zestawie amplifikacyjnym wskazuje na systematyczną awarię, np . zapomnienie o dodaniu odczynnika lub nieprawidłowe zaprogramowanie termocyklera. Brak pasma w kilku próbkach jest zwykle spowodowany błędem ludzkim, a wzmocnienia powinny być ponownie uruchamiane z tym samym parowaniem próbki i odwróconego startera. W przypadku dalszego braku pasma, próbka może być ponownie amplifikowana za pomocą odwróconego startera z innym kodem kreskowym. Powtarzające się niepowodzenia amplifikacji z wieloma odwróconymi starterami mogą wskazywać na obecność inhibitora w próbce. W takim przypadku czyszczenie DNA za pomocą kolumny często usuwa inhibitory bez znaczącej zmiany względnej liczebności bakterii. Jeśli po amplifikacji powstaje wiele prążków, ponownie amplifikuj próbkę innym kodem kreskowym odwróconego startera.
Oprócz zapobiegania skażeniu środowiska i zapewnienia amplifikacji pojedynczego konkretnego produktu, skuteczne sekwencjonowanie zależy od staranności podczas przygotowywania puli bibliotecznej. Celem jest połączenie równomolowych ilości amplikonów każdej próbki, aby zapewnić w przybliżeniu taką samą liczbę odczytów sekwencjonowania na próbkę. Jeśli stężenia kwasów nukleinowych przed amplifikacją są porównywalne, wystarczy dodać równe objętości amplikonów każdej próbki podczas tworzenia puli bibliotecznej. Jeśli jednak stężenia kwasów nukleinowych są znacznie różne i dodane w równej objętości, próbka o niskim stężeniu kwasu nukleinowego będzie słabo reprezentowana przy małej liczbie odczytów. W takim przypadku możliwe jest dodanie większej objętości amplikonów z próbki o niskim stężeniu w oparciu o względną intensywność pasma żelowego. Alternatywnie możliwe jest bardziej rygorystyczne usuwanie starterów z poszczególnych amplikonów, ilościowe określenie stężenia amplikonów w poszczególnych próbkach za pomocą zestawu do kwantyfikacji fluorometrycznej dsDNA i precyzyjne łączenie równomolowych ilości każdej próbki.
Po wygenerowaniu dobrze zbilansowanej puli amplikonów krytyczne staje się dokładne zmierzenie stężenia w puli. Późniejsze staranne rozcieńczanie i zwiększanie za pomocą PhiX w celu zwiększenia złożoności odczytu ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia optymalnych wyników sekwencjonowania. Sekwencery o wysokiej przepustowości, które wykorzystują sekwencjonowanie przez syntezę, są bardzo wrażliwe na gęstość klastra w komórce przepływowej. Załadowanie puli bibliotek, która jest zbyt skoncentrowana, spowoduje nadmierne grupowanie, z niższymi wynikami jakości, niższymi danymi wyjściowymi i niedokładną demultipleksacją32. Załadowanie puli bibliotek, która jest zbyt rozcieńczona, również spowoduje niską wydajność danych. Staranne określenie ilościowe puli bibliotecznej przed sekwencjonowaniem zapewni optymalne wyniki.
Sekwencjonowanie genu 16S rRNA zapewnia kompleksową ocenę bakterii obecnych w danej próbce i jest absolutnie krytycznym pierwszym krokiem w generowaniu hipotez. Obecność bogatego zestawu metadanych umożliwia badaczowi testowanie powiązań między poszczególnymi gatunkami bakterii a ważnymi czynnikami biologicznymi. Co więcej, te same informacje 16S można wykorzystać do wywnioskowania funkcji bakterii za pomocą narzędzi takich jak PICRUSt33. Ostatecznym celem jest wykorzystanie charakterystyki 16S do zidentyfikowania nowych powiązań, które mogą być dalej testowane i walidowane w systemach modelowych, przyczyniając się do naszego rosnącego zrozumienia wpływu mikrobiomu bakteryjnego na zdrowie i choroby ludzkie.

Dolny drogi rodne, układ pokarmowy, drogi oddechowe i skóra człowieka są skolonizowane przez złożone społeczności bakteryjne, które są kluczowe dla utrzymania homeostazy tkanek i wspierania zdrowia gospodarza1. Na przykład niektóre pałeczki kwasu mlekowego tworzą nieprzyjazne środowisko dla patogenów, zakwaszając sklepienie pochwy, wytwarzając efektory przeciwdrobnoustrojowe i modulując lokalną odporność gospodarza2-4. Rosnące uznanie dla znaczenia mikrobiomu bakteryjnego spowodowało również wzrost zainteresowania charakteryzowaniem społeczności bakteryjnych w wielu kontekstach klinicznych. W tym miejscu opisujemy metodę określania składu mikrobiomu bakteryjnego na podstawie wymazów z narządów płciowych. Protokół można łatwo zmodyfikować w przypadku próbek kału i wymazów pobranych z innych lokalizacji anatomicznych i innych gatunków gospodarzy.
Ze względu na nieodłączne ograniczenia w liczbie próbek, które mogą być pobrane i przechowywane od danego uczestnika badania, protokół ten został zaprojektowany tak, aby ekstrahować DNA, RNA, a potencjalnie nawet białko z pojedynczego wymazu przy użyciu zaadaptowanej metody ubijania koralików opartej na fenolu i chloroformie5,6. Połączenie fizycznego rozerwania ścian komórkowych bakterii z biciem kulek i rozerwaniem chemicznym za pomocą detergentów umożliwia szybką lizę bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych i kwasoodpornych bez dodatkowych etapów trawienia enzymatycznego. W celu uzyskania wysokiej jakości RNA zaleca się stosowanie suchych wacików, które były przechowywane w temperaturze 4 °C lub niższej bezpośrednio po pobraniu i podczas transportu do laboratorium (jeśli dotyczy) oraz przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C.
Aby określić mikrobiom bakteryjny w danej próbce, procedura ta wykorzystuje sekwencjonowanie amplikonów genu 16S rRNA, które jest obecnie najbardziej opłacalnym sposobem kompleksowego przypisywania taksonomii bakterii i przeprowadzania względnej kwantyfikacji. Alternatywne metody obejmują celowany qPCR7, niestandardowe mikromacierze8 i sekwencjonowanie całego genomu9. Gen 16S rRNA zawiera dziewięć hiperzmiennych regionów i nie ma zgody co do optymalnego regionu V do sekwencjonowania w badaniach mikrobiomu pochwy. Tutaj używamy zestawu starterów 515F/806R i budujemy na rurociągu zaprojektowanym przez Caporaso i wsp.10-12. Caporaso i wsp.Zestaw starterów 515F/806R umożliwia multipleksowanie setek próbek w jednym cyklu sekwencjonowania dzięki dostępności tysięcy zweryfikowanych starterów z kodami kreskowymi i kompatybilności z platformami sekwencjonowania Illumina. W przeciwieństwie do zestawu starterów 27F/338R13 opracowanego przez Human Microbiome Project, 515F/806R skutecznie wzmacnia również Bifidobacteriaceae, a tym samym dokładnie wychwytuje Gardnerella vaginalis, ważnego członka społeczności mikrobiologicznej pochwy u niektórych kobiet. Alternatywnie, para starterów 338F/806R została z powodzeniem wykorzystana do pirosekwencjonowania próbek pochwy14, a para starterów 515F/926R stała się niedawno dostępna do sekwencjonowania nowej generacji12.
Na koniec, ten protokół dostarcza podstawowych instrukcji do przeprowadzenia analizy amplikonów 16S przy użyciu pakietu oprogramowania Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME)15. Pomyślna implementacja opisanych tutaj poleceń QIIME daje tabelę zawierającą liczebność taksonomicznej bakterii dla każdej próbki. Do analizy można włączyć wiele dodatkowych etapów kontroli jakości, metod klasyfikacji taksonomicznej i etapów analizy, zgodnie ze szczegółowym opisem na stronie internetowej QIIME (http://qiime.org/index.html). Jeśli analiza będzie wykonywana na komputerze Apple, pakiet MacQIIME16 zapewnia łatwą instalację QIIME i jego zależności. Alternatywne pakiety oprogramowania do analizy sekwencji genów 16S rRNA obejmują Mothur17 i UPARSE18.

<table><tbody><tr><td>Sprzęt:</td><td></td><td></td><td></td></tr> stacja robocza <tr><td></td><td></td><td></td> do PCR Mini-Beadbeater-16 BioSpec 607 <td></td></tr><tr><td>Można użyć dowolnego kaptura do PCR, np. AirClean 600.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td>Można użyć dowolnego termocyklera z podgrzewaną pokrywą, np. MJ Research PTC-200.</td></tr><tr><td>System elektroforezy</td><td></td><td></td><td>Można zastosować dowolny system elektroforezy, np. system do elektroforezy żelowej Thermo Scientific Owl EasyCast B1</td></tr>.<tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td>Każda inna metoda kwantyfikacji DNA będzie wystarczająca</td></tr><tr><td>Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Alternatywą jest instrument Agilent 2200 TapeStation. Nie jest to absolutnie konieczne, ale bardzo pomocne.</td></tr><tr><td>MiSeq lub HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Materiały:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wacik do pobierania próbek Catch-All</td><td>Epibio</td><td>QEC89100</td><td>Można użyć innych wacików, ale wacik Catch-All jest zalecany przez Human Microbiome Project.</td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Fisher</td><td>04-355-31</td><td></td></tr><tr><td>SteriFlip 50 ml urządzenie filtrujące (0,22 &mikro; m)</td> Koraliki szklane <td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>0,1 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>2 ml rurki z nakrętką</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td>Do bicia koralików</td></tr><tr><td>UltraPure 5M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740-011</td><td>Biologia molekularna klasy</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl</td><td>Ambion (Invitrogen)</td><td>AM9856</td><td>Biologia molekularna Klasa</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Ambion (Invitrogen)</td><td>AM9260G</td><td>Biologia molekularna Klasa</td></tr><tr><td>Dodecyl siarczan sodu, 20% roztwór</td><td>Fisher</td><td>BP1311-200</td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>Klasa UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz / RNaz</td><td>Ambion</td><td>10977-015</td><td>Klasa biologii molekularnej, do przygotowania buforu</td></tr><tr><td>BioReagent 2-Propanol, do biologii molekularnej, &ge; 99,5%</td> <td>Sigma</td><td>I9516-500ML</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Fenol: Chloroform: IAA, 25: 24: 1</td><td>Invitrogen</td><td>AM9730</td><td>Ostrzeżenie: Toksyczny</td></tr><tr><td>3 M octan sodu, pH 5,5</td><td>Life Technologies</td><td>AM9740</td><td>Biologia molekularna klasy</td></tr><tr><td>Jednorazowe sterylne kleszcze polistyrenowe, PS</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06443-20</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml, przezroczyste, czyste probówki do PCR</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>22364120</tr><tr><td>Woda klasy PCR</td><td>MoBio</td><td>17000-11</td><td>Do PCR</td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Sigma</td><td>D7295-0,5 ml</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml 8-tubka PCR z dołączonymi przezroczystymi płaskimi nakrętkami, naturalna</td><td>USA Scientific</td><td>1492-3900</td><td>Wszelkie paski z 8 probówkami, które są inhibitorami DNazy, RNazy, DNA i PCR praca</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioExpress</td><td>E-3121-25</td><td></td></tr><tr><td>50x bufor TAE</td><td>Lonza</td><td>51216</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik żelowy DNA</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>6x Barwnik ładujący DNA</td><td>Thermo (Fisher)</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>50 pz GeneRuler Ladder</td><td>Thermo (Fisher)</td><td>SM0373</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNA/RNA AllPrep</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia UltraClean PCR</td><td>MoBio</td><td>12500-100</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Zestaw do oznaczania DNA PicoGreen dsDNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P11496</td><td>Alternatywą jest kwantyfikacja fluorometryczna Qubit (Life Technologies)</td></tr> <tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Primers:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>515F (starter do przodu) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'Zamów</td><td></td><td></td> <td>przy 100 nmole; Oczyszczanie: Standardowe odsalanie. Zawiesić ponownie w temperaturze 100 &mikro;M. **Critical: startery muszą być ponownie zawieszone w wodzie MoBio PCR Grade Water (patrz wyżej) w kapturze, aby uniknąć zanieczyszczenia.**</td></tr><tr><td>Reverse starters, patrz Plik kodu uzupełniającego i: Zalecany</td><td></td><td></td> <td>jest ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt IDTW przypadku zamawiania dużych zestawów starterów należy zamówić płytkę 96-dołkową w skali 100 nmol. Zawiesić ponownie w temperaturze 100 &mu;M. Pełne wskazówki dotyczące zamawiania podkładu i ponownego przygotowania do spożycia http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc.&nbsp; **Critical: podkłady muszą być ponownie zawieszone w wodzie MoBio PCR Grade (patrz wyżej) w kapturze, aby uniknąć zanieczyszczenia.**</td></tr><tr><td>Read 1 Podkład sekwencjonujący 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3'25</td><td></td><td></td> <td>nmole; Oczyszczanie: Standardowe odsalanie. Zawiesić ponownie przy 100 &mikrom.</td></tr><tr><td>Odczyt 2 Podkład sekwencjonowania 5'-AGT, CAG, TCA, GCC, GGA, CCA, CHV, GGG, TWT, CTA AT-3'26</td><td></td><td></td> <td>nmole; Oczyszczanie: Standardowe odsalanie. Zawiesić ponownie przy 100 &mikrom.</td></tr><tr><td>Indeks: Sekwencjonowanie Elementarz: 5'-ATT, AGA, WAC, CCB, DGT, AGT, CGT, GCT, GAC, TGA, CT-3'27</td><td></td><td></td>, <td>nmole; Oczyszczanie: Standardowe odsalanie. Zawiesić ponownie przy 100 &mikrom.</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td>Wymagane w przypadku wykonywania sekwencjonowania we własnym zakresie. Jeśli sekwencjonowanie będzie wykonywane przez centrum sekwencjonowania innej firmy, będzie ono już miało PhiX.</td></tr></tbody></table>

wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16s rrna w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Rośnie uznanie dla roli społeczności mikrobiologicznych jako krytycznych modulatorów ludzkiego zdrowia i chorób. Technologie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości pozwoliły na szybką i wydajną charakterystykę społeczności bakteryjnych przy użyciu sekwencjonowania genu 16S rRNA z różnych źródeł. Chociaż łatwo dostępne narzędzia do analizy sekwencji 16S rRNA mają ustandaryzowane przepływy pracy obliczeniowej, przetwarzanie próbek do ekstrakcji DNA pozostaje ciągłym źródłem zmienności między badaniami. Tutaj opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wacików. Opisujemy również dalsze metody sekwencjonowania genów 16S rRNA, w tym generowanie bibliotek sekwencjonowania, kontrolę jakości danych i analizę sekwencji. Przepływ pracy może pomieścić wiele typów próbek, w tym kał i wymazy pobrane z różnych lokalizacji anatomicznych i gatunków gospodarzy. Ponadto odzyskane DNA i RNA można rozdzielić i wykorzystać do innych zastosowań, w tym sekwencjonowania całego genomu lub sekwencjonowania RNA. Opisana metoda pozwala na wspólne podejście do przetwarzania dla wielu typów próbek i umożliwia dalszą analizę informacji genomicznych, metagenomicznych i transkrypcyjnych.

Ogólny przegląd protokołu, który umożliwia oznaczenie względnej liczebności bakterii z wymazu przy użyciu sekwencjonowania genu 16S rRNA, przedstawiono na Rysunku 1. Protokół został zoptymalizowany dla wymazów z pochwy u ludzi, ale można go łatwo dostosować do większości miejsc pobierania próbek z błon śluzowych oraz innych gospodarzy. Rysunek 2 demonstruje wysoką jakość DNA i RNA, które można wyizolować przy użyciu protokołu z homogenizacją za pomocą kulek (bead-beating). Rysunek 3 ilustruje pomyślną amplifikację PCR 12 próbek, gdzie każda amplifikacja z próbką dała pojedynczy, wyraźny prążek o prawidłowej wielkości, a każda kontrola z wodą nie dała prążka. Rysunek 4 ilustruje kwantyfikację końcowej puli bibliotek przed sekwencjonowaniem. Rysunek 5 przedstawia typowy profil jakości sekwencji po przebiegu MiSeq z odczytem jednostronnym (single-end) 300 bp.
<img alt="Schemat metody PCR do izolacji DNA: sekwencjonowanie genu 16S rRNA; łączenie amplikonów; analiza danych." src="/files/ftp_upload/53939/53939fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczny przegląd protokołu. W pierwszej kolejności kwasy nukleinowe są ekstrahowane z wymazu poprzez rozbijanie kuleczkami w roztworze buforowym zawierającym fenol, chloroform i alkohol izoamylkowy. Następnie z otrzymanych kwasów nukleinowych, przy użyciu metody PCR, amplifikowany jest region zmienny 4 genu 16S rRNA. Amplikony PCR z nawet kilkuset próbek są następnie łączone i sekwencjonowane w jednym przebiegu. Uzyskane sekwencje są dopasowywane do bazy referencyjnej w celu określenia względnej liczebności bakterii. Cały protokół można przeprowadzić w ciągu około trzech dni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza integralności RNA; A260/A280, RIN, piki fluorescencji; absorpcja, wykres porównawczy jakości." src="/files/ftp_upload/53939/53939fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wysokiej jakości kwasy nukleinowe wyekstrahowane metodą rozbijania kuleczkami z użyciem fenolu i chloroformu. (A) Jakość DNA oceniona za pomocą spektrofotometru. Stosunek A260/A280 w przedziale od 1,8 do 2,0 wskazuje na czyste kwasy nukleinowe, które nie są zanieczyszczone fenolem ani białkiem. (B) Po oczyszczaniu kolumnowym protokół ten może przynieść wysokiej jakości RNA, na co wskazują wyraźne piki rRNA 16S i 23S. (C) Degradacja RNA może nastąpić, jeśli próbka nie będzie przechowywana w niskiej temperaturze po pobraniu (podczas transportu i przechowywania) lub jeśli podczas przetwarzania obecne będą RNazy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat elektroforezy żelowej pokazujący prążki DNA dla rozmiaru, drabinki oraz kontroli negatywnej bez matrycy." src="/files/ftp_upload/53939/53939fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Potwierdzenie pomyślnej amplifikacji genu 16S rRNA przy użyciu zestawu starterów 515F i zkodowanej kreską 806R. Góra) Elektroforeza żelowa służy do potwierdzenia obecności pojedynczego prążka o wielkości około 380 par zasad w każdej próbce, która została poddana amplifikacji z matrycą. Brak prążka wskazuje na nieudaną amplifikację; wynika to zazwyczaj z błędu ludzkiego i reakcja PCR dla tej próbki powinna zostać powtórzona. Dół) Kontrole bez matrycy (woda), prowadzone równolegle z tą samą parą starterów, nie powinny wykazywać obecności prążka. Obecność prążka w kontroli wodnej wskazuje na zanieczyszczenie odczynników; należy zutylizować potencjalnie zanieczyszczone odczynniki i powtórzyć amplifikację PCR zarówno dla matrycy, jak i kontroli wodnej dla tej pary starterów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres biblioteki amplikonów, fluorescencja względem par zasad, analiza DNA, wyniki PCR, elektroforeza." src="/files/ftp_upload/53939/53939fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Ilościowe oznaczenie stężenia końcowej puli biblioteki oraz walidacja wielkości biblioteki.Po połączeniu amplikonów z poszczególnych próbek należy oznaczyć stężenie końcowej puli biblioteki. Następnie pulę biblioteki należy rozcieńczyć tak, aby uzyskać stężenie 2 nM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rozkład wyników jakości w odczycie sekwencjonowania; wykres pudełkowy dla analizy pozycji zasad." src="/files/ftp_upload/53939/53939fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Reprezentatywny wykres słupkowy wyników jakości sekwencji w każdej pozycji odczytu. Spadek jakości sekwencji po 200 parach zasad jest zjawiskiem normalnym, jednak średni wynik jakości powinien pozostać powyżej 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#IdPróbki</td>
			<td colspan="2">Kod kreskowy 
			Sekwencja</td>
			<td colspan="3">Starter łącznika 
			Sekwencja</td>
			<td>starterrcbc</td>
			<td>Typ próbki</td>
			<td>Ekstrakcja 
			Partia</td>
			<td>Amplifikacja 
			Płytka</td>
			<td>Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#Przykładowy plik mapowania znajduje się pod adresem: http://qiime.org/_static/Examples/File_ 
			Formaty/ 
			Przykład 
			Mapowanie 
			Proszę dostarczyć treść pliku File.txt, którą należy przetłumaczyć.</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="3"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG2350</td>
			<td colspan="2">TCCCTTGTCTCC</td>
			<td colspan="3">CCGGACTACHVGGGTWTCTAAT</td>
			<td>rcbc000</td>
			<td>Szyjkowa 
			Wymaz</td>
			<td>1</td>
			<td>A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Szablon pliku mapowania. Utworzenie dokładnego i szczegółowego pliku mapowania jest kluczowe dla pomyślnego wykonania protokołu. Plik mapowania jest niezbędny nie tylko do uruchomienia QIIME, ale umożliwia również badaczowi utrzymanie powiązania między kodem kreskowym próbki a metadanymi, analizę danych pod kątem systematycznych błędów (np. zmienności między partiami) oraz określenie istotnych korelacji między metadanymi a populacjami bakteryjnymi. Przedstawiono podstawowy plik mapowania, jednak użytkownicy są zachęcani do dodania jak największej liczby kolumn zawierających metadane. Przykłady dodatkowych metadanych dla wymazu z pochwy obejmują wiek uczestnika, datę/godzinę pobrania wymazu, rodzaj antykoncepcji hormonalnej (jeśli dotyczy), wyniki testów w kierunku infekcji przenoszonych drogą płciową itp.
<img alt="Tabela sekwencjonowania DNA; sekwencje kodów kreskowych, primery łączące, primery indeksujące; dane badań genomicznych." src="/files/ftp_upload/53939/53939suppliment.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Suplement 1"> 
Plik uzupełniający 1. Lista sekwencji kodowanych primerów rewersyjnych10. Pierwsze trzy kolumny mogą zostać wykorzystane do uzupełnienia pliku mapowania, a ostatnia kolumna zawiera pełną sekwencję primera do celów zamawiania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/Supplemental_Code_File.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie wysokiej jakości DNA i RNA z wymazów, a następnie określenie ich składu bakteryjnego przy użyciu sekwencjonowania genu 16S rRNA. Metoda ta może pomóc badaczowi zidentyfikować, jakie bakterie znajdują się w danej próbce ludzkiej oraz określić powiązania między konkretnymi bakteriami a cechami gospodarza lub stanem chorobowym. Chociaż metoda ta została opracowana w celu uzyskania wglądu w bakteryjne społeczności pochwy u ludzi, można ją również zastosować do badania społeczności bakteryjnych z innych miejsc w organizmie, takich jak nozdrza, jama ustna, skóra i odbytnica, a także z innych organizmów.Należy zauważyć, że ten film podkreśla trudniejsze etapy protokołu i nie obejmuje części związanej z sekwencjonowaniem ani analizą sekwencyjną. Demonstrację przeprowadzi Brittany Bowman, technik z mojego laboratorium. Procedurę należy rozpocząć od wymazów z egzocervix, które zostały pobrane i przechowywane w lodu kruszonym, zgodnie z opisem w załączonym dokumencie.W ramach przygotowania do ekstrakcji kwasów nukleinowych, należy oczyścić wszystkie powierzchnie dygestorium oraz wszystkie przedmioty wprowadzone do środka za pomocą wybielacza, a następnie odkażacza usuwającego RNazy, DNazy oraz DNA. W dygestorium należy umieścić po jednej probówce z koralikami dla każdej próbki. Do każdej probówki należy dodać 500 µL buforu NaCl-Tris-EDTA, 210 µL 20% SDS oraz 500 µL fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylího.Staranne obchodzenie się z wymazami ma kluczowe znaczenie dla uzyskania jednoznacznych wyników w tym protokole. Przeniesienie wymazu bez jego upuszczenia wymaga pewnej wprawy; proces ten jest łatwiejszy przy zastosowaniu wymazu z pustym trzonkiem, takiego jak ten. Używając sterylnej pęsety, przenieś wymaz z probówki transportowej do probówki z kuleczkami do homogenizacji.Dokładnie pocieraj głowicę wymazu o wewnętrzne ścianki probówki przez co najmniej 30 sekund. Umieść probówkę na lodzie. Następnie zmień rękawiczki i powtórz procedurę pobierania wymazu dla kolejnej próbki.Po energicznym potarciu wszystkich próbek należy schłodzić je na lodzie przez co najmniej 10 minut. Po upływie 10 minut, aby wyjąć wymaz, należy chwycić jego trzonek sterylną pincetą i, używając czystego tipa P200, docisnąć główkę wymazu do wewnętrznej ścianki probówki. Proces ten uwolni ciecz z wymazu, zwiększając odzysk kwasów nukleinowych.Umieść probówkę z kuleczkami w homogenizatorze kulkowym i homogenizuj próbkę przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza. Następnie wiruj probówkę z kuleczkami z prędkością 6 000 gs w temperaturze czterech stopni Celsiusza przez trzy minuty, aby osadzić zanieczyszczenia i rozdzielić fazę wodną od fazy fenolowej. Po wirowaniu zazwyczaj można zaobserwować trzy fazy.Górna warstwa to faza wodna, zawierająca DNA i RNA. Dolna warstwa to faza organiczna, zawierająca lipidy oraz szczątki komórkowe i materiał z wymazów. Cienka biała warstwa środkowa, nazywana interfazą, zawiera białka.Przenieś fazę wodną, około 500 do 600 µL, do sterylnej probówki 1,5 ml. Dodaj równą objętość fenolo-chloroformu z alkoholem izoamylowym. Wymieszaj poprzez odwracanie probówki i krótkie wstrząsanie w vorteksie.Wirowarkuj probówkę przez pięć minut. Po wirowaniu przenieś fazę wodną do nowej sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Należy uważać, aby nie przenieść materiału z interfazy lub znajdującej się poniżej fazy fenolowej.Zanotuj przeniesioną objętość i zachowaj fazę fenolową do przyszłej izolacji białek. Następnie dodaj 0,8 objętości izopropanolu i 0,1 objętości trzymolowego octanu sodu. Wymieszaj dokładnie poprzez odwracanie probówki i krótkie wstrząsanie w wortexie.Wytrąć kwasy nukleinowe, chłodząc probówkę w temperaturze 20 °C przez co najmniej dwie godziny, a najlepiej przez całą noc. Po wytrąceniu wiruj probówkę przez 30 minut. Po wirowaniu ostrożnie odessij nadsącz za pomocą pipety, pozostawiając osad nienaruszony.Dodaj 500 µL 100% ethanolu. Rozbij osad poprzez delikatne mieszanie na wirówce vortex lub pipetowanie, unikając dotykania osadu. Centryfuguj przez pięć minut.Używając pipety P10, usuń i wylej jak najwięcej etanolu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Susz osad na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Resuspenduj osad w 20 microliters buforu UltraPure 0.1X-Tris-EDTA.Próbkę należy chłodzić na lodzie przez 10 minut, wielokrotnie pipetując ją w celu zapewnienia pełnej resuspensji. Stężenie kwasów nukleinowych należy zmierzyć za pomocą spektrofotometru. W razie potrzeby DNA można oddzielić od RNA, stosując zestaw do oczyszczania kolumnowego zgodnie z protokołem producenta.Przygotowanie reakcji PCR jest krytycznym etapem tej procedury. Bardzo ważne jest zminimalizowanie ryzyka kontaminacji poprzez zapewnienie sterylności odczynników, komory PCR oraz rękawiczek. Pracuj szybko, lecz ostrożnie, stosując właściwą technikę podczas przenoszenia przedmiotów do komory i z niej.Umieścić w dygestorium czysty statyw chłodzący na blat do probówek do mikrowirówki oraz chłodziarkę do płytek PCR. Oznakować probówki paskowe 8-dołkowe z oddzielnymi zakrętkami i umieścić je w chłodziarce PCR. Amplifikację należy przeprowadzić w trzech powtórzeniach, a dla każdej pary starterów należy uwzględnić kontrolę negatywną z wodą zamiast matrycy.Umieść probówkę do mikrowirówki w chłodni dla mieszaniny głównej (master mix). Następnie, dla każdej próbki, połącz wodę UltraPure, bufor 5X HF, dNTP, starter forward 515F oraz 3% DMSO zgodnie z opisem w załączonym dokumencie. Następnie dodaj polimerazę do mieszaniny głównej i wymieszaj, pipetując.Do pierwszej studzienki dodać 90 µL master mixu i dwa µL startera odwrotnego, a następnie dokładnie wymieszać. Następnie do czwartej studzienki, która służy jako kontrola bez matrycy, dodać 23 µL master mixu oraz dwa µL wody i wymieszać. Następnie do pierwszej studzienki dodać sześć µL odpowiedniej próbki.Dokładnie wymieszać i przenieść 25 µL do drugiej studzienki. Zmienić końcówki, a następnie przenieść kolejne 25 µL z pierwszej studzienki do trzeciej studzienki. Mocno zakręcić każdą studzienkę.Należy uważać, aby nie dotykać wnętrza studzienek ani zakrętki. Następnie należy powtórzyć ten proces dla każdej próbki. Po przygotowaniu wszystkich próbek należy szybko odwirować probówki paskowe, przenieść je do termocyklera i uruchomić program.Po zakończeniu cyklu szybko odwiruj probówki, aby zebrać ciecz ze ścianek. Następnie, na czystym blacie laboratoryjnym, połącz reakcje PCR wykonane w trzech powtórzeniach dla każdej próbki w opisanej, sterylnej probówce do mikrocentryfugi. Przenieś 25 µL każdej kontroli bez matrycy do oddzielnej sterylnej probówki.Nie łącz jeszcze amplikonów z różnych próbek. Aby potwierdzić poprawną amplifikację PCR, nanieś pięć mikrolitrów każdej próbki na żel agarozowy 1,5% i przeprowadź elektroforezę przy napięciu 120 V przez 30 do 60 minut. Obejrzyj żel w świetle UV.Zweryfikuj poprawność amplifikacji każdej próbki, zwracając uwagę na pojedynczy, wyraźny prążek o wielkości około 380 par zasad. W przypadku wystąpienia podwójnego prążka należy ponownie przeprowadzić amplifikację próbki, stosując inny kod kreskowy rewersyjny (reverse barcode). W przypadku braku prążka należy powtórzyć amplifikację próbki, używając tego samego kodu kreskowego rewersyjnego lub startera z nowym kodem kreskowym rewersyjnym.Jeśli ponowna amplifikacja nie powiedzie się, w próbce mogą znajdować się inhibitory PCR; w takim przypadku należy przeprowadzić oczyszczanie DNA metodą kolumnową w celu usunięcia inhibitorów PCR. Pozostałe 70 µL amplikonu należy przechowywać w temperaturze 20 °C. Pozostałe 20 µL kontroli negatywnej (NTC) należy zutylizować, zakładając, że nie pojawił się w niej prążek.Aby utworzyć pulę amplikonów, należy połączyć od dwóch do pięciu µL każdego amplikonu w jednej sterylnej probówce. Jeśli prążek z danej próbki jest słaby, należy dodać dwukrotną objętość w stosunku do pozostałych próbek. Następnie należy usunąć startery PCR za pomocą zestawu.Jeśli jest to wymagane, połącz puły amplikonów bez starterów w celu przygotowania końcowej biblioteki. Wyznacz stężenie DNA w bibliotece za pomocą spektrofotometru lub systemu fluorometrycznego. Na koniec rozcieńcz próbki do stężenia dwóch nanomolar i przekaż je do sekwencjonowania.Szczegółowe informacje na temat analizy sekwencji znajdują się w dołączonym dokumencie. Wyizolowano wysokiej jakości DNA i RNA, a DNA posłużyło jako matryca do amplifikacji PCR regionu V4 genu 16S rRNA, zgodnie z opisem w niniejszym filmie. W celu potwierdzenia obecności pojedynczego prążka o wielkości około 380 par zasad w każdej próbce amplifikowanej z matrycą zastosowano elektroforezę żelową.W kontrolach bez matrycy, przeprowadzonych równolegle z użyciem tej samej pary starterów, nie pojawił się żaden prążek. Następnie amplikony PCR połączono w jednej probówce, określono ich ilość i dodatkowo rozcieńczono przed sekwencjonowaniem. Przedstawiono tutaj reprezentatywny wykres słupkowy wyników jakości sekwencjonowania dla każdej pozycji odczytu.Spadek jakości sekwencji po 200 parach zasad jest zjawiskiem normalnym. Jednak średnia wartość wskaźnika jakości powinna pozostać powyżej 30. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak izolować DNA i RNA z wymazów za pomocą ekstrakcji opartej na fenolu i chloroformie, amplifikować region V4 genu 16S rRNA oraz przygotować bibliotekę do sekwencjonowania wysokoprzepustowego.Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu dwóch dni, o ile zostanie wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec kontaminacji podczas pobierania próbek, ekstrakcji kwasów nukleinowych oraz amplifikacji PCR. Należy pamiętać, że praca z fenolo-chloroformem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w dygestorium oraz noszenie nieprzepuszczalnych rękawic, okularów ochronnych z osłonami bocznymi i fartucha laboratoryjnego.

efficient-nucleic-acid-extraction-16s-rrna-gene-sequencing-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

Dostępny jest protokół do ilościowego oznaczania genów bakteryjnych 16S rRNA i transkryptów z osadów przybrzeżnych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Metodologia obejmuje jednoczesną ekstrakcję DNA i RNA; przygotowanie RNA wolnego od DNA; oraz kwantyfikacja genu 16S rRNA i transkryptu za pomocą RT-q-PCR, w tym konstrukcja krzywej standardowej.

Jednoczesna ekstrakcja DNA-RNA z osadów przybrzeżnych i kwantyfikacja genów i transkryptów 16S rRNA metodą Real-time PCR

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Tutaj prezentujemy protokół sekwencjonowania nowej generacji dla sekwencjonowania 16S rRNA, który umożliwia identyfikację i charakterystykę społeczności mikrobiologicznych w wektorach. Metoda ta obejmuje ekstrakcję DNA, amplifikację i kodowanie kreskowe próbek za pomocą PCR, sekwencjonowanie na komórce przepływowej oraz bioinformatykę w celu dopasowania danych sekwencji do informacji filogenetycznej.

Charakterystyka mikrobiomu kleszczowego za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA nowej generacji

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Ten protokół szczegółowo opisuje kompleksowe podejście do hodowli, sekwencjonowania i hybrydowego składania genomu de novo bakterii moczowych. Zapewnia powtarzalną procedurę generowania kompletnych, kolistych sekwencji genomu przydatnych w badaniu zarówno chromosomalnych, jak i pozachromosomalnych elementów genetycznych przyczyniających się do kolonizacji dróg moczowych, patogenezy i rozprzestrzeniania się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Hybrydowe składanie genomu de novo w celu generowania kompletnych genomów bakterii moczowych przy użyciu technologii sekwencjonowania krótkiego i długiego odczytu

Przedstawiamy proces izolacji, rozmnażania i charakteryzowania bakterii rozkładających węglowodory z siedlisk wodnych. W protokole opisano izolację bakterii, identyfikację metodą 16S rRNA oraz badanie ich potencjału degradacji węglowodorów. Ten artykuł pomoże naukowcom w scharakteryzowaniu różnorodności biologicznej drobnoustrojów w próbkach środowiskowych, a w szczególności w badaniach przesiewowych pod kątem drobnoustrojów o potencjale bioremediacji.

Izolacja, rozmnażanie i identyfikacja gatunków bakterii o właściwościach metabolizowania węglowodorów z siedlisk wodnych

Opisano narzędzie oraz odczynniki do sekwencyjnej izolacji kwasów nukleinowych, a następnie białek z próbki, bez konieczności użycia energii elektrycznej. Narzędzie składa się z sorbentu umieszczonego w pipecie transferowej, natomiast odczynniki do izolacji opierają się na zasadach ekstrakcji do fazy stałej. Izolowane makrocząsteczki mogą być analizowane za pomocą testów immunologicznych oraz PCR.

Sekwencyjna izolacja kwasów nukleinowych i białek bez użycia energii elektrycznej

Poznaj wydajną ekstrakcję kwasów nukleinowych z wymazów i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych. Ta metoda pozwala izolować wysokiej jakości DNA i RNA.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Przeglądaj więcej filmów