Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie wysokiej jakości DNA i RNA z wymazów, a następnie określenie ich składu bakteryjnego za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA. Metoda ta może pomóc badaczowi zidentyfikować, które bakterie znajdują się w danej próbce ludzkiej i określić powiązania między poszczególnymi bakteriami a cechami gospodarza lub statusem choroby. Chociaż metoda ta została zaprojektowana, aby zapewnić wgląd w ludzkie społeczności bakteryjne pochwy, metoda może być również stosowana do badania społeczności bakteryjnych z innych miejsc ciała, takich jak nozdrza, usta, skóra i odbytnica oraz z innych organizmów.

Należy pamiętać, że ten film podkreśla trudniejsze części protokołu i nie obejmuje części sekwencjonowania ani analizy sekwencjonowania. Brittany Bowman, technik z mojego laboratorium, zademonstruje. Procedurę tę należy rozpocząć od pobrania wymazów z szyjki macicy i przechowywania ich na mokrym lodzie, jak opisano w dokumencie towarzyszącym.

Przygotowując się do ekstrakcji kwasów nukleinowych, wyczyść wszystkie powierzchnie okapu i wszystkie przedmioty wniesione do okapu wybielaczem, a następnie odkażaj, który usuwa RNazy, DNazy i DNA. W kapturze umieść jedną rurkę do koralików na próbkę. Do każdej probówki dodaj 500 mikrolitrów buforu NaCl-Tris-EDTA, 210 mikrolitrów 20% SDS i 500 mikrolitrów fenolowo-chloroformowego alkoholu izoamylowego.

Ostrożne obchodzenie się z wymazówkami ma kluczowe znaczenie dla uzyskania jasnych wyników za pomocą tego protokołu. Przeniesienie wacika bez upuszczania go wymaga trochę praktyki i jest łatwiejsze, jeśli użyjesz wacika z wydrążonym wałkiem, takiego jak ten. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś wacik z fiolki transportowej do probówki do perełek.

Dokładnie pocieraj główkę wacika o wewnętrzne ścianki probówki przez co najmniej 30 sekund. Umieść rurkę na lodzie. Następnie zmień rękawiczki i powtórz procedurę pobierania wymazu z następną próbką.

Po energicznym przetarciu wszystkich próbek pozwól im schłodzić się na lodzie przez co najmniej 10 minut. Po upływie 10 minut na wyjęcie wacika chwyć uchwyt sterylną pęsetą i za pomocą czystej końcówki P200 dociśnij głowicę do wewnętrznej strony ścianki tuby. Proces ten polega na uwolnieniu cieczy z wacika, zwiększając odzysk kwasów nukleinowych.

Umieścić rurkę do perełkowania koralików w koraliku i homogenizować próbkę przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwiruj rurkę do perełkowania kulek o masie 6 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty, aby osadzać zanieczyszczenia i oddzielać fazę wodną i fenolową. Po wirowaniu zwykle można zobaczyć trzy fazy.

Górna warstwa to faza wodna, zawierająca DNA i RNA. Dolna warstwa to faza organiczna, zawierająca lipidy i zanieczyszczenia z komórek i wymazów. Cienka biała warstwa środkowa, zwana interfazą, zawiera białko.

Przenieś fazę wodną, około 500 do 600 mikrolitrów, do sterylnej 1,5-mililitrowej probówki. Dodać równą objętość fenolowo-chloroformowego alkoholu izoamylowego. Wymieszaj przez odwrócenie i krótkie wirowanie.

Odwirowywać probówkę przez pięć minut. Po wirowaniu przenieś fazę wodną do nowej sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Należy uważać, aby nie przenosić materiału z fazy interfazy lub podstawowej fazy fenolowej.

Zanotuj przenoszoną objętość i zachowaj fazę fenolową do przyszłej izolacji białka. Następnie dodaj 0,8 objętości izopropanolu i 0,1 objętości trzech molowych octanu sodu. Dokładnie wymieszaj przez odwrócenie i krótkie wirowanie.

Wytrącić kwas nukleinowy, schładzając probówkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny i tak długo, jak przez noc. Po wytrąceniu należy odwirować probówkę przez 30 minut. Po odwirowaniu ostrożnie użyj pipety, aby usunąć supernatant, pozostawiając osad w stanie nienaruszonym.

Dodaj 500 mikrolitrów 100% etanolu. Usunąć osad za pomocą delikatnego wirowania lub pipetowania, nie dotykając osadu. Wirować przez pięć minut.

Za pomocą pipety P10 usuń i wyrzuć jak najwięcej etanolu, nie naruszając osadu. Suszyć pelety na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Zawiesić osad w 20 mikrolitrach buforu UltraPure 0,1X-Tris-EDTA.

Pozostawić próbkę do schłodzenia na lodzie przez 10 minut i kilkakrotnie pipetować, aby zapewnić pełne ponowne wymieszanie. Zmierz stężenie kwasu nukleinowego za pomocą spektrofotometru. W razie potrzeby oddziel DNA od RNA za pomocą zestawu do czyszczenia kolumny zgodnie z protokołem producenta.

Konfiguracja PCR jest krytycznym krokiem w tej procedurze. Bardzo ważne jest, aby zminimalizować zanieczyszczenie poprzez zapewnienie sterylności odczynników, kaptura PCR i rękawiczek. Pracuj szybko, ale ostrożnie i stosuj odpowiednią technikę podczas wkładania i wyjmowania przedmiotów z maski.

Umieść czysty stojak na chłodziarkę stołową na probówki do mikrowirówek i chłodziarkę płytkową PCR w okapie. Oznacz 8-dołkowe probówki paskowe indywidualnymi nakrętkami i umieść je w chłodziarce do PCR. Amplifikację należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach, a dla każdej pary starterów należy dołączyć kontrolę wody bez matrycy.

Umieść probówkę mikrowirówki w chłodnicy dla mieszanki głównej. Następnie dla każdej próbki połącz wodę ultraczystą, bufor 5X HF, DNTP, starter 515F i 3% DMSO, jak opisano w dołączonym dokumencie. Następnie dodać polimerazę do mieszanki wzorcowej i wymieszać pipetując.

Do pierwszego dołka dodaj 90 mikrolitrów mieszanki głównej i dwa mikrolitry odwróconego podkładu, dobrze wymieszaj. Następnie do czwartej studzienki, która służy jako kontrola bez szablonu, dodaj 23 mikrolitry mistrza i dwa mikrolitry wody i wymieszaj. Następnie dodaj sześć mikrolitrów odpowiedniej próbki do pierwszego dołka.

Dokładnie wymieszaj i przenieś 25 mikrolitrów do drugiej studzienki. Zmień końcówki, a następnie przenieś kolejne 25 mikrolitrów z pierwszej studzienki do trzeciej studzienki. Mocno zakryj każdą studzienkę.

Uważaj, aby nie dotknąć wnętrza studzienek ani nasadki. Następnie powtórz ten proces dla każdej próbki. Po przygotowaniu wszystkich próbek szybko obróć probówki paskowe, przenieś je do termocyklera i uruchom program.

Po zakończeniu biegu szybko obróć rurki, aby zebrać płyn ze ścianek. Następnie, na czystym stole laboratoryjnym, połącz potrójne reakcje PCR z każdej próbki w oznakowanej sterylnej probówce do mikrowirówki. Przenieść 25 mikrolitrów każdej kontroli bez matrycy do oddzielnej sterylnej probówki.

Nie należy jeszcze łączyć amplikonów z różnych próbek. Aby potwierdzić pomyślną amplifikację PCR, załaduj pięć mikrolitrów każdej próbki na 1,5% żel agarozowy i wykonuj elektroforezę przy napięciu 120 woltów przez 30 do 60 minut. Zobacz żel w świetle UV.

Sprawdź pomyślne wzmocnienie każdej próbki, zwracając uwagę na pojedyncze silne pasmo wokół 380 par zasad. Jeśli występuje podwójne pasmo, ponownie wzmocnij próbkę innym odwróconym kodem kreskowym. Jeśli w ogóle nie ma pasma, ponownie wzmocnij próbkę, używając tego samego odwróconego kodu kreskowego lub startera z nowym odwróconym kodem kreskowym.

Jeśli ponowna amplifikacja nie powiedzie się, w próbce mogą być obecne inhibitory PCR, w takim przypadku należy przeprowadzić czyszczenie DNA na podstawie kolumny w celu usunięcia inhibitorów PCR. Przechowuj pozostałe 70 mikrolitrów amplikonu w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Wyrzuć pozostałe 20 mikrolitrów kontroli bez szablonu, zakładając, że nie dała ona pasma.

Aby stworzyć pulę amplikonów, połącz od dwóch do pięciu mikrolitrów każdego amplikonu w jednej sterylnej probówce. Jeśli prążek z próbki jest słaby, dodać dwukrotność objętości w stosunku do reszty próbek. Następnie usuń startery PCR za pomocą zestawu.

W razie potrzeby połącz pule amplikonów bez podkładów, aby utworzyć ostateczną bibliotekę. Określ stężenie DNA w bibliotece za pomocą spektrofotometru lub systemu fluorometrycznego. Na koniec rozcieńczyć próbki do dwóch nanomolowców i wysłać je do sekwencjonowania.

Szczegółowe informacje na temat analizy sekwencji znajdują się w dokumencie towarzyszącym. Wyizolowano wysokiej jakości DNA i RNA, a DNA wykorzystano jako matrycę do amplifikacji PCR regionu V4 genu 16S rRNA, jak opisano w tym filmie. Elektroforezę żelową zastosowano w celu potwierdzenia obecności pojedynczego pasma około 380 par zasad w każdej próbce, która została amplifikowana matrycą.

Kontrolki bez szablonu uruchamiane równolegle z tą samą parą starterów nie miały obecnego pasma. Amplikony PCR połączono następnie w pojedynczą probówkę, oznaczono ilościowo i dalej rozcieńczono przed sekwencjonowaniem. Pokazany tutaj jest reprezentatywny wykres słupkowy wyników jakości sekwencji dla każdej pozycji odczytu.

To normalne, że jakość sekwencji spada po 200 parach zasad. Ale średni wynik jakości powinien pozostać powyżej 30. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować DNA i RNA z wymazów za pomocą ekstrakcji na bazie chloroformu fenolowego, amplifikować region V4 genu rybosomalnego RNA 16SR i przygotować bibliotekę do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu podczas pobierania próbki, ekstrakcji kwasów nukleinowych i amplifikacji PCR. Nie zapominaj, że praca z chloroformem fenolowym może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zadbać o środki ostrożności, takie jak praca w wentylowanym kapturze i noszenie nieprzepuszczalnych rękawic, okularów ochronnych z bocznymi osłonami i fartucha laboratoryjnego.