Immobilizacja wielu biokatalizatorów w kulkach alginianowych w celu regeneracji kofaktora i poprawy możliwości ponownego użycia

Ogólnym celem tej procedury eksperymentalnej jest zademonstrowanie zastosowania sprzężonego systemu biokatalitycznego z całych komórek unieruchomionego w kulkach alginianowych w celu poprawy wydajności produkcji i możliwości ponownego wykorzystania. To jest mój temat, odpowiedziałem na kluczowe pytania w dziedzinie biokatalizy, takie jak unieruchamianie biokatalizatorów, stabilność, regeneracja kofaktora i biokatalizatory całych komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia proste, ale elastyczne podejście do poprawy produkcji wielu ważnych biomolekuł za pomocą szlaków zależnych od kofaktora.

W protokole tym stosuje się dwa rekombinowane szczepy E. coli. SpNOx E coli, która wyraża oksydazę NADH, i HjLAD E coli, która wyraża dehydrogenazę L-arabinitolu. Ponieważ procedura ta jest taka sama dla obu szczepów E. coli, zostanie ona zademonstrowana tylko w przypadku HjLAD E. coli.

Zaszczepić pojedynczą kolonię HjLAD E coli w trzech mililitrach pożywki LB, uzupełnionej 15 mikrogramami na mililitr Ket-A-My-Sin, i inkubować przez noc w shakerze inkubatora. Następnego dnia rozcieńczyć kulturę przez jeden do 100 w 200 mililitrach świeżego LB zawierającego 15 mikrogramów na mililitr Ket-A-My-Sin, a następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 250 obr./min, aż OD 600 osiągnie około 0,6. Indukuj ekspresję białka HjLAD, dodając 0,1 milimolowego IPTG do pożywki hodowlanej i inkubując w temperaturze 25 stopni Celsjusza, 200 obr./min, przez sześć godzin.

Zbierz indukowane komórki przez odwirowanie w temperaturze 3200 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Odrzucić supernatant i przystąpić do przetwarzania osadu komórkowego, jak pokazano w następnym segmencie. Aby rozpocząć tę procedurę, zawieszamy granulki komórek HjLAD E coli i SpNox E coli oddzielnie w 50 milimolach buforu Tris-Hcl, przy gęstości komórek wynoszącej pięć gramów suchej masy komórek na litr.

W 14-mililitrowej probówce z okrągłym dnem wymieszaj 600 mikrolitrów pięciogramowej masy suchych komórek na litr HjLAD E coli, 600 mikrolitrów pięciogramowej suchej masy komórek na litr SpNOx E coli, 100 mikrolitrów 20-milimolowej NAD plus i 150 mikrolitrów dwumolowej L-arybinitolu. Doprowadzić objętość reakcji do dwóch mililitrów, dodając 550 mikrolitrów 50-milimolowego Tris-HCl. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez osiem godzin.

Po ośmiu godzinach odwirować mieszaninę w temperaturze 3200 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut i zebrać supernatant reakcyjny. Aby określić ilościowo produkcję L-ksylulozy za pomocą testu kolorymetrycznego, należy odessać 100 mikrolitrów zebranego supernatantu do probówki o średnicy 1,5 militera. Dodaj 50 mikrolitrów 1,5% cysteiny, 900 mikrolitrów 70% kwasu siarkowego i 50 mikrolitrów 0,1% Kar-Piz-All rozpuszczonych w etanolu i delikatnie wymieszaj, trzykrotnie odwracając probówkę.

Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i prędkości 200 obr./min przez 20 minut. Zmierzyć absorbancję optyczną mieszaniny reakcyjnej przy 560 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Protokół unieruchomienia należy rozpocząć od przygotowania 4% roztworu alginianu.

Dodaj 0,8 grama alginianu sodu do 20 mililitrów wody destylowanej i podgrzej mieszaninę, aby rozpuścić alginian sodu. Dodaj 600 mikrolitrów pięciogramowej masy suchych komórek na litr HjLAD E coli i 600 mikrolitrów pięciogramowej masy suchej komórki na litr SpNOx E coli do 1,2 mililitra 4% roztworu alginianu. Wymieszaj komórki i alginian, delikatnie pipetując, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.

Aby zapewnić tworzenie się kulek alginianowych o jednolitym rozmiarze, morfologii i sztywności, ważne jest, aby dodać zawiesinę alginianu komórkowego w celu uzyskania optymalnej odległości w powolny, kroplowy sposób, do wystarczającej objętości roztworu chlorku wapnia, aby pokryć wszystkie kulki. Odessać zawiesinę komórek alginianowych do strzykawki za pomocą igły, a następnie dodać mieszaninę kroplami do 0,3 molowego roztworu chlorku wapnia w 100-mililitrowej zlewce, ciągle mieszając. Pozostaw kulki w roztworze chlorku wapnia na dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej bez mieszania, aby umożliwić sieciowanie.

Zdekantować roztwór chlorku wapnia bez naruszania kulek, ostrożnie wlewając roztwór chlorku wapnia do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Przenieś pozostałe koraliki do innej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Aby usunąć nadmiar chlorku wapnia i niekapsułkowane komórki, przemyj kulki 50-milimolowym buforem Tris-HCl.

Dodaj 10 mililitrów buforu do kulek i pozostaw zawiesinę w spokoju przez trzy do pięciu minut. Gdy kulki osiądą na dnie, zdekantuj bufor do innego pojemnika. W ten sposób umyj koraliki trzy razy.

Nie odwirowuj kulek na żadnym etapie, ponieważ pękną. Nie wyrzucaj zużytego buforu do płukania Tris-HCl. Wyciągnąć 30 mililitrów zużytego buforu do przemywania ze zużytym roztworem chlorku wapnia zebranym wcześniej.

Nieunieruchomione komórki E. coli osadzać przez odwirowanie wyciągniętego roztworu chlorku wapnia i Tris-HCl w proporcji 3200 razy G przez 20 minut. Przenieś umyte koraliki do tuby. Następnie należy ocenić biosyntezę L-ksylulozy zgodnie z procedurą przedstawioną dla osadów komórkowych, ale przy użyciu wszystkich przemytych kulek zamiast osadów komórkowych.

Aby ocenić stabilność unieruchomionych biokatalizatorów do produkcji L-ksylulozy, należy zebrać kulki po ich uformowaniu. I przemyć dwukrotnie 10 mililitrami 50-milimolowego buforu Tris-HCl bez wirowania, jak pokazano wcześniej. Użyj wszystkich umytych kulek, aby przeprowadzić reakcję produkcji L-ksylulozy, jak pokazano wcześniej.

Określić ilościowo produkcję L-ksylulozy za pomocą testu kolorymetrycznego, również jak wykazano wcześniej. Powtórzyć reakcję produkcji L-ksylulozy dla żądanej liczby cykli produkcyjnych i zmierzyć ilość L-ksylulozy wytworzonej w supernatance reakcji w każdym cyklu. Produkcja L-ksylulozy jest zwiększona przez ten sprzężony system biokatalityczny całych komórek.

Zaczynając od początkowego stężenia 150 milimolowych L-arybinitolu, zastosowanie samego biokatalizatora HjLAD E. coli dało wydajność 79% L-ksyluliozy. Dla porównania, zastosowanie komórek HjLAD E. coli i SpNOx E coli w stosunku jeden do jednego dało wydajność 96% L-ksylulozy. Ocena parametrów wpływających na skuteczność immobilizacji biokatalizatora wykazała, że skuteczność wzrasta wraz ze wzrostem stężenia alginianu sodu w zakresie od jednego do trzech procent.

Jednak stężenie alginianu sodu większe niż 2% powoduje zmniejszenie wydajności L-ksylulozy. Stosując stężenie alginianu sodu wynoszące 2%, optymalne stężenie chlorku wapnia do immobilizacji i wydajności L-ksylulozy określono na 0,3 mola. Oceniono możliwość ponownego użycia biokatalizatorów.

Na tym wykresie produkcja L-ksylulozy w siedmiu kolejnych cyklach ponownego użycia unieruchomionych i swobodnie sprzężonych biokatalizatorów całych komórek jest pokazana odpowiednio w kolorze ciemnoszarym i jasnoszarym. Chociaż maksymalny uzysk L-ksylulozy przez unieruchomione sprzężone biokatalizatory całych komórek jest niższy niż w przypadku swobodnie sprzężonego systemu całych komórek, możliwość ponownego użycia poprawia się dzięki immobilizacji. Pod koniec siedmiu cykli kolejnego ponownego użycia, unieruchomione biokatalizatory zachowały swoją stabilność i zachowały 65% pierwotnej wydajności L-ksylulozy.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biokatalizą do zbadania wydajności pełnych biokatalizatorów wielokomórkowych oraz głównych reakcji z udziałem kofaktorów.