Immobilizacja wielu biokatalizatorów w kulkach alginianowych w celu regeneracji kofaktora i poprawy możliwości ponownego użycia

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest zademonstrowanie zastosowania sprzężonego biokatalitycznego układu całokomórkowego unieruchomionego w kuleczkach alginianowych w celu zwiększenia wydajności produkcji oraz możliwości ponownego wykorzystania. Jest to przedmiot moich badań, w ramach których odpowiedziałem na kluczowe pytania z dziedziny biokatalizy, takie jak unieruchamianie biokatalizatorów, stabilność, regeneracja kofaktorów oraz biokatalizatory całokomórkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona proste, a zarazem elastyczne podejście do zwiększenia produkcji wielu istotnych biomolekuł za pomocą szlaków zależnych od kofaktorów.

W niniejszym protokole wykorzystuje się dwa rekombinowane szczepy E coli: SpNOx E coli, który wykazuje ekspresję oksydazy NADH, oraz HjLAD E coli, który wykazuje ekspresję dehydrogenazy L-arabinitolu. Ponieważ procedura jest identyczna dla obu szczepów E coli, zostanie ona zaprezentowana wyłącznie dla HjLAD E coli.

Zaszczep pojedynczą kolonię E coli HjLAD w trzech mililitrach pożywki LB uzupełnionej o 15 µg/mL Ket-A-My-Sinu i inkubuj przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem. Następnego dnia rozcieńcz kulturę 1:100 w 200 mililitrach świeżej pożywki LB zawierającej 15 µg/mL Ket-A-My-Sinu i inkubuj w temperaturze 37 °C przy 250 RPM, aż OD 600 osiągnie wartość około 0,6. Indukuj ekspresję białka HjLAD poprzez dodanie do pożywki 0,1 mM IPTG i inkubację w temperaturze 25 °C przy 200 RPM przez sześć godzin.

Zbierz indukowane komórki poprzez wirowanie przy 3200 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Odlej nadsącz i przystąp do przetwarzania osadu komórkowego, zgodnie z instrukcją w następnym fragmencie. Aby rozpocząć tę procedurę, zawieszamy osady komórkowe HjLAD E coli oraz SpNox E coli osobno w 50 mM buforze Tris-Hcl, przy gęstości komórek wynoszącej 5 g suchej masy komórkowej na litr.

W probówce z okrągłym dnem o pojemności 14 ml zmieszać 600 µl komórek E coli HjLAD o suchej masie 5 g/l, 600 µl komórek E coli SpNOx o suchej masie 5 g/l, 100 µl NAD+ o stężeniu 20 mM oraz 150 µl L-aribinitolu o stężeniu 2 M. Objętość reakcyjną uzupełnić do 2 ml, dodając 550 µl Tris-HCl o stężeniu 50 mM. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 30 °C przy 200 RPM przez osiem godzin.

Po ośmiu godzinach odwiruj mieszaninę z prędkością 3200 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i zbierz nadsącz z reakcji. Aby określić ilość wyprodukowanej L-ksylulozy za pomocą testu kolorymetrycznego, pobierz 100 µL zebranego nadsączu do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodaj 50 µL 1,5% cysteiny, 900 µL 70% kwasu siarkowego oraz 50 µL 0,1% Kar-Piz-All rozpuszczonego w etanolu, a następnie wymieszaj delikatnie, odwracając probówkę trzy razy.

Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przy 200 RPM przez 20 minut. Zmierzyć absorbancję optyczną mieszaniny reakcyjnej przy 560 nm za pomocą spektrofotometru. Rozpocząć protokół immobilizacji od przygotowania 4% roztworu alginianu.

Do 20 ml wody destylowanej dodać 0,8 g alginianu sodu, a następnie podgrzać mieszaninę do rozpuszczenia alginianu sodu. Do 1,2 ml 4% roztworu alginianu dodać 600 µl komórek E coli HjLAD (o suchej masie komórkowej 5 g/L) oraz 600 µl komórek E coli SpNOx (o suchej masie komórkowej 5 g/L). Komórki i alginian wymieszać poprzez delikatne pipetowanie, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.

Aby zapewnić powstanie kulek alginianowych o jednolitym rozmiarze, morfologii i sztywności, kluczowe jest powolne, kroplowe dodawanie zawiesiny komórek w alginianie z optymalnej odległości do wystarczającej objętości roztworu chlorku wapnia, tak aby wszystkie kulki zostały przykryte. Należy pobrać zawiesinę komórek w alginianie do strzykawki za pomocą igły, a następnie dodawać mieszaninę kroplami do 0,3 M roztworu chlorku wapnia w zlewce o pojemności 100 ml przy ciągłym mieszaniu. Kulki należy pozostawić w roztworze chlorku wapnia na dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej bez mieszania, aby umożliwić zajście procesu sieciowania.

Zdekantuj roztwór chlorku wapnia, nie naruszając kulek, ostrożnie przelewając go do probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Pozostałe kulki przenieś do drugiej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Aby usunąć nadmiar chlorku wapnia oraz nieenkapsulowane komórki, przemyj kulki buforem Tris-HCl o stężeniu 50 mM.

Dodaj 10 ml buforu do kulek i pozostaw zawiesinę w spokoju na od trzech do pięciu minut. Po opadnięciu kulek na dno, odlej bufor do innego naczynia. W ten sposób przemyj kulki trzykrotnie.

Nie wiruj kulek na żadnym z etapów, ponieważ ulegną one rozerwaniu. Nie wylewaj zużytego buforu płuczącego Tris-HCl. Odessij 30 mililitrów zużytego buforu płuczącego wraz z wcześniej zebranym zużytym roztworem chlorku wapnia.

Odwirować nieunieruchomione komórki E coli poprzez centryfugowanie pobranego roztworu chlorku wapnia i Tris-HCl przy 3200 ×g przez 20 minut. Przenieść wypłukane kulek do probówki. Następnie ocenić biosyntezę L-ksylulozy zgodnie z procedurą zaprezentowaną dla osadu komórkowego, stosując wszystkie wypłukane kulki zamiast osadu komórkowego.

Aby ocenić stabilność unieruchomionych biokatalizatorów w produkcji L-ksylulozy, należy zebrać powstałe kuleczki. Następnie należy je dwukrotnie przemyć 10 ml 50 mM buforu Tris-HCl bez wirowania, zgodnie z wcześniejszym opisem. Wszystkie przemyte kuleczki należy wykorzystać do przeprowadzenia reakcji produkcji L-ksylulozy w sposób zaprezentowany wcześniej.

Ilość wyprodukowanej L-ksylulozy należy określić za pomocą testu kolorymetrycznego, zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Reakcję produkcji L-ksylulozy należy powtórzyć dla pożądanej liczby cykli produkcyjnych, a następnie zmierzyć ilość L-ksylulozy wytworzonej w nadsączu reakcyjnym w każdym cyklu. Produkcja L-ksylulozy jest zwiększona dzięki temu sprzężonemu biokatalitycznemu systemowi z wykorzystaniem całych komórek.

Zaczynając od początkowego stężenia 150 millimolar L-aribinitolu, zastosowanie samego biokatalizatora HjLAD E coli pozwoliło uzyskać wydajność 79% L-ksylulozy. W porównaniu z tym, zastosowanie komórek HjLAD E coli i SpNOx E coli w stosunku jeden do jednego pozwoliło uzyskać wydajność 96% L-ksylulozy. Ocena parametrów wpływających na efektywność immobilizacji biokatalizatora wykazała, że efektywność wzrasta wraz ze wzrostem stężenia alginianu sodu w zakresie od jednego do trzech procent.

Jednakże stężenia alginianu sodu przekraczające 2% prowadzą do zmniejszenia wydajności L-ksylulozy. Przy zastosowaniu stężenia alginianu sodu wynoszącego 2%, optymalne stężenie chlorku wapnia dla immobilizacji i wydajności L-ksylulozy określono jako 0,3 M. Oceniono możliwość ponownego wykorzystania biokatalizatora.

Na tym wykresie produkcja L-ksylulozy dla siedmiu kolejnych cykli ponownego wykorzystania unieruchomionych oraz wolnych sprzężonych biokatalizatorów całokomórkowych przedstawiona jest odpowiednio w kolorze ciemnoszarym i jasnoszarym. Chociaż maksymalna wydajność L-ksylulozy otrzymywanej za pomocą unieruchomionych sprzężonych biokatalizatorów całokomórkowych jest niższa niż w przypadku wolnego systemu sprzężonych całych komórek, unieruchomienie poprawia możliwość ponownego wykorzystania. Po siedmiu cyklach kolejnego użycia unieruchomione biokatalizatory zachowały stabilność i utrzymały 65% pierwotnej wydajności L-ksylulozy.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biokatalizy do badania wydajności pełnych wielokomórkowych biokatalizatorów oraz głównych reakcji wymagających kofaktorów.