Name: Immobilizacja wielu biokatalizatorów w kulkach alginianowych w celu regeneracji kofaktora i poprawy możliwości ponownego użycia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj metodę ko-immobilizacji komórek Escherichia coli w kulkach alginianowych w celu regeneracji kofaktora i zwiększenia wydajności produkcji L-ksylulozy. Technika poprawia stabilność i możliwość ponownego użycia biokatalizatorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Program Badań Podstawowych za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii (NRF-2013R1A1A2012159 i NRF-2013R1A1A2007561), Uniwersytet Konkuk oraz Wydział Inżynierii Chemicznej i Program MCubed na Uniwersytecie Michigan.

1. Przygotowanie biokatalizatorów dla całych komórek 
UWAGA: Rekombinowane komórki E. coli zawierające pET28a-SpNox 31 lub pET28a-HjLAD 28 są dalej określane odpowiednio jako E. coliSpNox i E. coliHjLAD.
<ol>
	<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię E. coliHjLAD w 3 ml pożywki Luria-Bertani (LB) uzupełnionej kanamycyną (50 μg/ml) i inkubować w inkubatorze wytrząsarka O/N w temperaturze 37 oC, 250 obr./min.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę w stosunku 1:100 w 200 ml świeżego LB zawierającego 50 μg/ml kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 oC, 250 obr./min, aż OD600 osiągnie ~0,6.</li>
	<li>Indukować ekspresję białka HjLAD przez dodanie 0,1 mM izopropylo β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do pożywki hodowlanej i inkubować w temperaturze 16 oC, 180 obr./min przez 16 godzin.
	<ol>
		<li>Alternatywnie przeprowadzić indukcję w temperaturze 25 oC, 200 obr./min przez 6 godzin, jeśli biosynteza L-ksylulozy (krok 2 poniżej) jest przeprowadzana tego samego dnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać indukowane komórki HjLAD E. coli przez odwirowanie w stężeniu 3 200 x g przez 20 minut w temperaturze 4 oC. Odrzucić supernatant i przejść do etapu 2 w celu przetworzenia osadu komórkowego.</li>
	<li>Równolegle wykonaj kroki 1.1 - 1.4 dla E. coliSpNox.</li>
</ol>
2. Biosynteza L-ksylulozy przez sprzężenie E. coliHjLAD i E. coliSpNox w celu regeneracji kofaktora
<ol>
	<li>Zawiesić oddzielnie osady komórkowe E. coliHjLAD i E. coliSpNox w 50 mM buforze Tris-HCl (pH 8,0) przy gęstości komórek 5,0 g suchej masy komórek (gDCW)/L, 
	Uwaga: W celu ułatwienia eksperymentu można ustalić korelację między gDCW a gęstością optyczną zmierzoną przy 600 nm (OD600). Wzór używany w tym protokole to 1 gDCW/L=0,722*OD600 - 0,0965, który może się różnić w zależności od różnych spektrometrów.</li>
	<li>Wymieszaj 600 μl 5,0 gDCW/L E. coliHjLAD, 600 μl 5,0 gDCW/L E. coliSpNox, 100 μl 20 mM NAD+ i 150 μl 2 M L-arabinitolu w 14 ml probówce okrągłodennej i doprowadź objętość reakcji do 2 ml, dodając 550 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0). 
Uwaga: Stosunek ilości dwóch biokatalizatorów całokomórkowych można zoptymalizować w celu poprawy biosyntezy produktu. Dla opisanego systemu stwierdzono, że stosunek E. coliSpNox:E. coliHjLAD = 1:1 jest optymalny dla biosyntezy L-ksylulozy (ryc. 1B).</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 30 °C, 200 obr./min przez 8 godzin.</li>
	<li>Zebrać supernatant po odwirowaniu w temperaturze 4 oC, 3,200 x g przez 10 minut i przystąpić do ilościowego oznaczania produkcji L-ksylulozy, jak opisano w kroku 3 poniżej.</li>
</ol>
3. Test kolorymetryczny do oznaczania ilościowego L-ksylulozy
<ol>
	<li>Odessać 100 μl supernatantu reakcyjnego zebranego z kroku 2.4 do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 50 μl 1,5% cysteiny, 900 μl 70% kwasu siarkowego i 50 μl 0,1% karbazolu rozpuszczonego w etanolu i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę 3 razy.</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 oC, 200 obr./min przez 20 min.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję optyczną mieszaniny reakcyjnej przy długości fali 560 nm (A560) za pomocą spektrofotometru.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną, jeśli odczyt A560 jest wyższy niż 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Immobilizacja rekombinowanych katalizatorów całokomórkowych w kulkach alginianu wapnia
<ol>
	<li>Rozpuścić 4 g alginianu sodu w 100 ml wody destylowanej. Przygotuj roztwór alginianu, dodając alginian sodu do wody, aby uniknąć tworzenia się grudek. W razie potrzeby podgrzej mieszaninę.</li>
	<li>Dodać 600 μl 5,0 gDCW/L E. coliHjLAD i 600 μl 5,0 gDCW/L E. coliSpNox w 1,2 ml 4% alginianu przygotowanego w kroku 4.1 i wymieszać komórki i alginian przez delikatne pipetowanie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.</li>
	<li>Odessać zawiesinę alginian/komórkową do strzykawki za pomocą igły i dodawać mieszaninę kroplami do 0,3 M roztworu chlorku wapnia (CaCl2) w zlewce o pojemności 100 ml, ciągle mieszając. 
	Uwaga: Objętość roztworu CaCl2 użytego do tworzenia kulek alginianowych powinna być wystarczająca, aby kropelki alginianu były całkowicie zanurzone. Dodatkowo odległość między igłą strzykawki a powierzchnią roztworu chlorku wapnia musi być zachowana w optymalnym zakresie, aby zapewnić tworzenie jednolicie kulistych kulek. Optymalny zakres odległości można określić doświadczalnie i zależy on od wewnętrznej średnicy igły. Szacunkowo stwierdzono, że odległość ~15 ± 5 cm jest optymalna dla igły strzykawkowej o średnicy 0,6 cm (średnica wewnętrzna).</li>
	<li>Pozostaw kulki w roztworze CaCl2 na 2 - 3 godziny w temperaturze pokojowej bez mieszania, aby umożliwić sieciowanie i tworzenie się kulek żelowych.</li>
	<li>Zdekantować roztwór CaCl2 bez naruszania kulek, ostrożnie wlewając roztwór CaCl2 do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przenieść pozostałe kulki z roztworu CaCl2 do innej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umyj kulki 10 ml trzykrotnie buforu 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), aby usunąć nadmiar CaCl2 i niekapsułkowane komórki. 
	UWAGA: Na żadnym etapie nie odwirowuj kulek, ponieważ spowoduje to ich pęknięcie. Aby oddzielić kulki od roztworu, pozostaw zawiesinę w spokoju na 3 - 5 minut. Koraliki osiądą na dnie, a bufor do płukania można zdekantować do innego pojemnika.
	<ol>
		<li>Nie wyrzucaj zużytego bufora do mycia. Połączyć zużyty bufor do przemywania Tris-HCl (30 ml) ze zużytym roztworem CaCl2 zebranym z kroku 4.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzać nieunieruchomione komórki E. coli przez odwirowanie zbiorczego roztworu CaCl2 i Tris-HCl zebranych z kroku 4.6 w temperaturze 3,200 x g przez 20 minut. Aby określić skuteczność immobilizacji, należy obliczyć gęstość granulowanych, niekapsułkowanych komórek w gDCW/L, jak opisano w kroku 2.1.</li>
	<li>Przenieś umyte koraliki z kroku 4.6 do tuby. Wykonaj kroki 2.2 - 3.4, aby ocenić biosyntezę L-ksylulozy przy użyciu wszystkich przemytych kulek zamiast granulek komórkowych.</li>
</ol>
5. Test stabilności immobilizowanych biokatalizatorów do produkcji L-ksylulozy
<ol>
	<li>Zebrać kulki z kroku 4.8 i przemyć dwukrotnie 10 ml 50 mM buforu Tris-HCl (pH 8,0) bez wirowania (jak opisano w kroku 4.6).</li>
	<li>Użyj wszystkich umytych kulek, aby przeprowadzić reakcję zgodnie z opisem w krokach 2.2 - 3.4.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 5.1 - 5.2 dla żądanej liczby cykli produkcyjnych i zmierzyć ilość L-ksylulozy wytwarzanej w supernatance reakcyjnej w każdym cyklu.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych. Artykuł ma na celu przedstawienie szczegółowej metodyki generowania sprzężonego całokomórkowego systemu biokatalitycznego unieruchomionego w kulkach alginianowych. Nowości naukowe zostały zgłoszone w poprzednim badaniu16.

Niedawny postęp technologiczny umożliwił gwałtowny wzrost komercjalizacji rekombinowanych bioterapeutyków, co spowodowało stopniowy wzrost ich wartości rynkowej w branży biotechnologicznej. Jednym z takich postępów jest pojawienie się inżynierii metabolicznej w rekombinowanych mikroorganizmach, która okazała się bardzo obiecująca w tworzeniu skalowalnych systemów przemysłowych38. Podobnie jak w przypadku większości procesów, udana komercjalizacja rekombinowanych biomolekuł wytwarzanych przez genetycznie modyfi...

Redukcyjna biotransformacja całych komórek przy użyciu mikroorganizmów stała się powszechną metodą chemoenzymatycznej syntezy komercyjnie i terapeutycznie ważnych biomolekuł 1-3. Ma to kilka zalet w porównaniu ze stosowaniem izolowanych enzymów, w szczególności eliminację kosztownych procesów oczyszczania i wykazanie wydłużonej żywotności 4-7. W przypadku szlaków biokatalitycznych, w których kofaktory są wymagane do tworzenia produktu, systemy całokomórkowe mają potencjał, aby zapewnić regenerację kofaktora in situ poprzez dodanie niedrogich kosubstratów oddanych elektronom5,8,9. Jednak zdolność ta jest zmniejszona w przypadku reakcji, które wymagają stechiometrycznego stężenia rzadkich lub drogich kosubstratów10-13. W połączeniu ze słabą możliwością ponownego wykorzystania całych ogniw utrudnia to stworzenie skalowalnego i ciągłego systemu produkcji. Aby przezwyciężyć wyżej wymienione ograniczenia, konieczne są strategiczne modyfikacje systemów całokomórkowych dla tych zależnych od kofaktora biotransformacji. W szczególności wykazano, że połączenie biokatalizatorów całokomórkowych, które współpracują ze sobą, znacznie zwiększa produktywność i stabilność enzymówzawierających 14. Czynniki te, które często mają kluczowe znaczenie dla umożliwienia produkcji na dużą skalę komercyjnie opłacalnych produktów, można dodatkowo zoptymalizować poprzez współimmobilizację mikroorganizmów biokatalitycznych15. Niedawno opracowaliśmy prosty i wielokrotnego użytku system biokatalityczny dla całych komórek, który umożliwia zarówno regenerację kofaktora, jak i immobilizację biokatalizatora do produkcji L-ksylulozy16. W tym badaniu system ten został wykorzystany jako przykład do zilustrowania eksperymentalnych procedur stosowania tych dwóch strategii w celu poprawy wydajności produkcji biotransformacji i możliwości ponownego użycia biokatalizatorów.
L-ksyluloza należy do klasy biologicznie użytecznych cząsteczek zwanych rzadkimi cukrami. Cukry rzadkie to unikalne cukrów prostych lub pochodne cukrów, które występują bardzo rzadko w przyrodzie, ale odgrywają kluczową rolę jako pierwiastki rozpoznające w cząsteczkach bioaktywnych17,18. Mają one różnorodne zastosowania, począwszy od słodzików, żywności funkcjonalnej, a skończywszy na potencjalnych terapiach19. L-ksyluloza może być stosowana jako potencjalny inhibitor wielu α-glukozydaz, a także może być stosowana jako wskaźnik zapalenia wątroby lub marskości wątroby17,20. Wysoka skuteczność konwersji ksylitolu do L-ksyluliozy w układach całokomórkowych została wcześniej opisana w Pantoea ananatis21,22, Alcaligenes sp. 701B23, Bacillus pallidus Y2524,25 i Escherichia coli26. Jednak u E. coli osiągnięto to tylko przy użyciu niskich (<67 mM) stężeń ksylitolu26 ze względu na potencjalne hamujące działanie początkowego stężenia ksylitolu wyższego niż 100 mM na aktywność dehydrogenazy ksylitol-421,26. Wykazano, że równowaga termodynamiczna między ksylulozą a ksylitolem silnie sprzyja tworzeniu się ksylitolu25,27. Ponadto uzysk ksylulozy jest ograniczony przez ilość drogich kofaktorów, które muszą być dostarczane w przypadku braku systemu regeneracji kofaktorów in situ. Łącznie czynniki te ograniczają potencjał skalowania do zrównoważonych systemów biosyntezy L-ksylulozy.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia i zwiększyć wydajność biotransformacji L-ksylulozy, najpierw zastosowano strategię regeneracji kofaktora, tworząc sprzężony system biokatalityczny dla całej komórki. W szczególności wybrano 4-dehydrogenazę L-arabinitolu (EC 1.1.1.12) z Hypocrea jecorina (HjLAD), enzymu w szlaku katabolicznym grzybów L-arabinozy, w celu katalizowania przemiany L-arabinitolu w L-ksylulozę28,29. Podobnie jak wiele enzymów biosyntetycznych, głównym ograniczeniem HjLAD jest to, że wymaga stechiometrycznej ilości drogiego kofaktora dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD+, utleniona forma NADH) do przeprowadzenia tej konwersji. Wykazano, że oksydaza NADH znajdująca się w Streptococcus pyogenes (SpNox) wykazuje wysoką aktywność regeneracyjną kofaktora30,31. Wykorzystując tę cechę SpNox, komórki E. coli eksprymujące HjLAD do produkcji L-ksylulozy sprzężono z komórkami E. coli eksprymującymi SpNox w celu regeneracji NAD + w celu zwiększenia produkcji L-ksylulozy przedstawionej przez sprzężoną reakcję pokazaną na rysunku 1A. W optymalnych warunkach i przy zastosowaniu początkowego stężenia 150 mM L-arabinitolu maksymalny uzysk L-ksylulozy osiągnął 96%, co czyni ten system znacznie bardziej wydajnym niż te opisywane w literaturze.
Strategia immobilizacji całych komórek została zastosowana w celu dalszego zwiększenia możliwości ponownego użycia sprzężonego systemu biokatalitycznego. Powszechnie stosowane metody immobilizacji całych komórek obejmują adsorpcję/kowalencyjne łączenie z matrycami stałymi, sieciowanie/uwięzienie i enkapsulację w sieciach polimerowych32. Wśród tych podejść najbardziej odpowiednią metodą immobilizacji komórek jest enkapsulacja w kulkach alginianu wapnia. Ich łagodne właściwości żelowania, obojętna wodna matryca i wysoka porowatość pomagają zachować właściwości fizjologiczne i funkcjonalność kapsułkowanych substancji biologicznych33. W związku z tym sprzężony układ biokatalizatora zawierający obie komórki E. coli zawierające HjLAD lub SpNox został unieruchomiony w kulkach alginianu wapnia, aby umożliwić wiele cykli produkcji L-ksylulozy (ryc. 2). Unieruchomiony układ biokatalizatora wykazał dobrą stabilność operacyjną, utrzymując 65% wydajności konwersji z pierwszego cyklu po 7 cyklach kolejnego ponownego użycia, podczas gdy układ wolnych komórek prawie całkowicie utracił swoją aktywność katalityczną.

<table><tbody><tr><td>Rosół LB&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-6X1KG</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>B-hydrat dinukleotydu nikotynamidoadeninowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N7004-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3506-10G</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320501-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Karbazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5132</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Alginian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W201502</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką Excella E24</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary 60 Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Wirówka Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5810R</td><td>Eppendrof</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zlewki</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pioneer Waga analityczna i precyzyjna</td><td>Ohaus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immobilizacja wielu biokatalizatorów w kulkach alginianowych w celu regeneracji kofaktora i poprawy możliwości ponownego użycia

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

Niedawno opracowaliśmy prosty, wielorazowy i sprzężony system biokatalityczny dla całych komórek z możliwością regeneracji kofaktora i immobilizacji biokatalizatora w celu zwiększenia wydajności produkcji i trwałej syntezy. Poniżej opisano eksperymentalną procedurę rozwoju takiego systemu składającego się z dwóch szczepów E. coli, które eksprymują funkcjonalnie komplementarne enzymy. Razem te dwa enzymy mogą działać wspólnie, pośrednicząc w regeneracji drogich kofaktorów w celu poprawy wydajności produktu bioreakcji. Ponadto przedstawiono metodę syntezy unieruchomionej formy sprzężonego układu biokatalitycznego poprzez enkapsulację całych komórek w kulkach alginianu wapnia. Jako przykład przedstawiamy ulepszoną biosyntezę L-ksylulozy z L-arabinitolu poprzez sprzęganie komórek E. coli wykazujących ekspresję enzymów dehydrogenazy L-arabinitolu lub oksydazy NADH. W optymalnych warunkach i przy początkowym stężeniu 150 mM L-arabinitolu maksymalny uzysk L-ksylulozy osiągnął 96%, czyli więcej niż podawano w literaturze. Unieruchomiona forma sprzężonych biokatalizatorów całokomórkowych wykazała dobrą stabilność operacyjną, utrzymując 65% wydajności uzyskanej w pierwszym cyklu po 7 cyklach kolejnego ponownego użycia, podczas gdy wolny układ komórkowy prawie całkowicie utracił aktywność katalityczną. W związku z tym przedstawione tutaj metody zapewniają dwie strategie, które mogą pomóc w poprawie przemysłowej produkcji L-ksylulozy, a także innych związków o wartości dodanej wymagających ogólnego stosowania kofaktorów.

Aby umożliwić regenerację kofaktora, syntezę L-ksylulozy przeprowadzono w sprzężonym biokatalitycznym systemie całokomórkowym zawierającym komórki E. coliHjLAD oraz E. coliSpNox. Po optymalizacji różnych parametrów poprawiono możliwość ponownego wykorzystania tego systemu poprzez jego unieruchomienie w kuleczkach alginianu wapnia (Rysunek 2).
Prod...

Przedstawiono protokół komobilizacji biokatalizatorów całych komórek w celu regeneracji kofaktora i poprawy możliwości ponownego wykorzystania, na przykładzie produkcji L-ksylulozy. Regenerację kofaktora uzyskuje się poprzez sprzężenie dwóch szczepów Escherichia coli wykazujących ekspresję funkcjonalnie uzupełniających się enzymów; Immobilizacja biokatalizatora całej komórki odbywa się poprzez enkapsulację komórek w kulkach alginianu wapnia.

Immobilizacja wielu biokatalizatorów w kulkach alginianowych w celu regeneracji kofaktora i poprawy możliwości ponownego użycia

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest zademonstrowanie zastosowania sprzężonego biokatalitycznego układu całokomórkowego unieruchomionego w kuleczkach alginianowych w celu zwiększenia wydajności produkcji oraz możliwości ponownego wykorzystania. Jest to przedmiot moich badań, w ramach których odpowiedziałem na kluczowe pytania z dziedziny biokatalizy, takie jak unieruchamianie biokatalizatorów, stabilność, regeneracja kofaktorów oraz biokatalizatory całokomórkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona proste, a zarazem elastyczne podejście do zwiększenia produkcji wielu istotnych biomolekuł za pomocą szlaków zależnych od kofaktorów.W niniejszym protokole wykorzystuje się dwa rekombinowane szczepy E coli: SpNOx E coli, który wykazuje ekspresję oksydazy NADH, oraz HjLAD E coli, który wykazuje ekspresję dehydrogenazy L-arabinitolu. Ponieważ procedura jest identyczna dla obu szczepów E coli, zostanie ona zaprezentowana wyłącznie dla HjLAD E coli.Zaszczep pojedynczą kolonię E coli HjLAD w trzech mililitrach pożywki LB uzupełnionej o 15 µg/mL Ket-A-My-Sinu i inkubuj przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem. Następnego dnia rozcieńcz kulturę 1:100 w 200 mililitrach świeżej pożywki LB zawierającej 15 µg/mL Ket-A-My-Sinu i inkubuj w temperaturze 37 °C przy 250 RPM, aż OD 600 osiągnie wartość około 0,6. Indukuj ekspresję białka HjLAD poprzez dodanie do pożywki 0,1 mM IPTG i inkubację w temperaturze 25 °C przy 200 RPM przez sześć godzin.Zbierz indukowane komórki poprzez wirowanie przy 3200 ×g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Odlej nadsącz i przystąp do przetwarzania osadu komórkowego, zgodnie z instrukcją w następnym fragmencie. Aby rozpocząć tę procedurę, zawieszamy osady komórkowe HjLAD E coli oraz SpNox E coli osobno w 50 mM buforze Tris-Hcl, przy gęstości komórek wynoszącej 5 g suchej masy komórkowej na litr.W probówce z okrągłym dnem o pojemności 14 ml zmieszać 600 µl komórek E coli HjLAD o suchej masie 5 g/l, 600 µl komórek E coli SpNOx o suchej masie 5 g/l, 100 µl NAD+ o stężeniu 20 mM oraz 150 µl L-aribinitolu o stężeniu 2 M. Objętość reakcyjną uzupełnić do 2 ml, dodając 550 µl Tris-HCl o stężeniu 50 mM. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 30 °C przy 200 RPM przez osiem godzin.Po ośmiu godzinach odwiruj mieszaninę z prędkością 3200 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i zbierz nadsącz z reakcji. Aby określić ilość wyprodukowanej L-ksylulozy za pomocą testu kolorymetrycznego, pobierz 100 µL zebranego nadsączu do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodaj 50 µL 1,5% cysteiny, 900 µL 70% kwasu siarkowego oraz 50 µL 0,1% Kar-Piz-All rozpuszczonego w etanolu, a następnie wymieszaj delikatnie, odwracając probówkę trzy razy.Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przy 200 RPM przez 20 minut. Zmierzyć absorbancję optyczną mieszaniny reakcyjnej przy 560 nm za pomocą spektrofotometru. Rozpocząć protokół immobilizacji od przygotowania 4% roztworu alginianu.Do 20 ml wody destylowanej dodać 0,8 g alginianu sodu, a następnie podgrzać mieszaninę do rozpuszczenia alginianu sodu. Do 1,2 ml 4% roztworu alginianu dodać 600 µl komórek E coli HjLAD (o suchej masie komórkowej 5 g/L) oraz 600 µl komórek E coli SpNOx (o suchej masie komórkowej 5 g/L). Komórki i alginian wymieszać poprzez delikatne pipetowanie, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.Aby zapewnić powstanie kulek alginianowych o jednolitym rozmiarze, morfologii i sztywności, kluczowe jest powolne, kroplowe dodawanie zawiesiny komórek w alginianie z optymalnej odległości do wystarczającej objętości roztworu chlorku wapnia, tak aby wszystkie kulki zostały przykryte. Należy pobrać zawiesinę komórek w alginianie do strzykawki za pomocą igły, a następnie dodawać mieszaninę kroplami do 0,3 M roztworu chlorku wapnia w zlewce o pojemności 100 ml przy ciągłym mieszaniu. Kulki należy pozostawić w roztworze chlorku wapnia na dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej bez mieszania, aby umożliwić zajście procesu sieciowania.Zdekantuj roztwór chlorku wapnia, nie naruszając kulek, ostrożnie przelewając go do probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Pozostałe kulki przenieś do drugiej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Aby usunąć nadmiar chlorku wapnia oraz nieenkapsulowane komórki, przemyj kulki buforem Tris-HCl o stężeniu 50 mM.Dodaj 10 ml buforu do kulek i pozostaw zawiesinę w spokoju na od trzech do pięciu minut. Po opadnięciu kulek na dno, odlej bufor do innego naczynia. W ten sposób przemyj kulki trzykrotnie.Nie wiruj kulek na żadnym z etapów, ponieważ ulegną one rozerwaniu. Nie wylewaj zużytego buforu płuczącego Tris-HCl. Odessij 30 mililitrów zużytego buforu płuczącego wraz z wcześniej zebranym zużytym roztworem chlorku wapnia.Odwirować nieunieruchomione komórki E coli poprzez centryfugowanie pobranego roztworu chlorku wapnia i Tris-HCl przy 3200 ×g przez 20 minut. Przenieść wypłukane kulek do probówki. Następnie ocenić biosyntezę L-ksylulozy zgodnie z procedurą zaprezentowaną dla osadu komórkowego, stosując wszystkie wypłukane kulki zamiast osadu komórkowego.Aby ocenić stabilność unieruchomionych biokatalizatorów w produkcji L-ksylulozy, należy zebrać powstałe kuleczki. Następnie należy je dwukrotnie przemyć 10 ml 50 mM buforu Tris-HCl bez wirowania, zgodnie z wcześniejszym opisem. Wszystkie przemyte kuleczki należy wykorzystać do przeprowadzenia reakcji produkcji L-ksylulozy w sposób zaprezentowany wcześniej.Ilość wyprodukowanej L-ksylulozy należy określić za pomocą testu kolorymetrycznego, zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Reakcję produkcji L-ksylulozy należy powtórzyć dla pożądanej liczby cykli produkcyjnych, a następnie zmierzyć ilość L-ksylulozy wytworzonej w nadsączu reakcyjnym w każdym cyklu. Produkcja L-ksylulozy jest zwiększona dzięki temu sprzężonemu biokatalitycznemu systemowi z wykorzystaniem całych komórek.Zaczynając od początkowego stężenia 150 millimolar L-aribinitolu, zastosowanie samego biokatalizatora HjLAD E coli pozwoliło uzyskać wydajność 79% L-ksylulozy. W porównaniu z tym, zastosowanie komórek HjLAD E coli i SpNOx E coli w stosunku jeden do jednego pozwoliło uzyskać wydajność 96% L-ksylulozy. Ocena parametrów wpływających na efektywność immobilizacji biokatalizatora wykazała, że efektywność wzrasta wraz ze wzrostem stężenia alginianu sodu w zakresie od jednego do trzech procent.Jednakże stężenia alginianu sodu przekraczające 2% prowadzą do zmniejszenia wydajności L-ksylulozy. Przy zastosowaniu stężenia alginianu sodu wynoszącego 2%, optymalne stężenie chlorku wapnia dla immobilizacji i wydajności L-ksylulozy określono jako 0,3 M. Oceniono możliwość ponownego wykorzystania biokatalizatora.Na tym wykresie produkcja L-ksylulozy dla siedmiu kolejnych cykli ponownego wykorzystania unieruchomionych oraz wolnych sprzężonych biokatalizatorów całokomórkowych przedstawiona jest odpowiednio w kolorze ciemnoszarym i jasnoszarym. Chociaż maksymalna wydajność L-ksylulozy otrzymywanej za pomocą unieruchomionych sprzężonych biokatalizatorów całokomórkowych jest niższa niż w przypadku wolnego systemu sprzężonych całych komórek, unieruchomienie poprawia możliwość ponownego wykorzystania. Po siedmiu cyklach kolejnego użycia unieruchomione biokatalizatory zachowały stabilność i utrzymały 65% pierwotnej wydajności L-ksylulozy.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biokatalizy do badania wydajności pełnych wielokomórkowych biokatalizatorów oraz głównych reakcji wymagających kofaktorów.

immobilization-multi-biocatalysts-alginate-beads-for-cofactor

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

W następnych sekcjach przedstawiamy procedury przygotowania mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych. W szczególności ilustrujemy technikę tworzenia wielowarstwowych mikrosfer alginianowych w celu jednoczesnej enkapsulacji komórek i białek jako potencjalnej metody leczenia cukrzycy typu 1.

Wytwarzanie mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych

Ten film pokazuje metodę wytwarzania mikrogranulek polimerowych, które otaczają neurotoksyczne komórki wydzielające beta-amyloid. Zawiesina komórka-polimer jest przetwarzana przez urządzenie do wytwarzania mikrogranulek, przy czym żelowanie polimeru uzyskuje się poprzez sieciowanie wapnia, tworząc kuliste mikrokulki wokół komórek. Polimer umożliwia proliferację komórek, umożliwiając jednocześnie kontrolowane, długotrwałe uwalnianie beta-amyloidu, symulując jego akumulację w chorobie Alzheimera.

Wytwarzanie mikrogranulek polimerowych uwalniających beta-amyloid do modelowania choroby Alzheimera

Prezentujemy metodę szybkiego, odwracalnego unieruchamiania małych cząsteczek i funkcjonalizowanych zespołów nanocząstek do badań powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR), wykorzystując sekwencyjną bioortogonalną chemię cykloaddycji na chipie i wychwytywanie przeciwciała-antygen.

Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach

Tutaj prezentujemy protokół enkapsulacji komórek katabolicznych, które zużywają lipidy do produkcji ciepła w tkance tłuszczowej w jamie brzusznej i zwiększają rozpraszanie energii u otyłych myszy.

Enkapsulacja termogenicznych preadipocytów do przeszczepu do magazynów tkanki tłuszczowej

Ustaliliśmy metodę kapsułkowania pluripotencjalnych komórek macierzystych (komórek PS) w kapsułkach hydrożelowych alginianowych za pomocą dyszy współosiowej.  Zapobiega to nadmiernej agregacji komórek i ogranicza naprężenia ścinające doświadczane przez komórki w hodowli zawiesinowej.  Technika ta ma zastosowanie do masowej produkcji komórek PS, a także do badań nad niszą komórek macierzystych.

Enkapsulacja alginianowa pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą dyszy współosiowej

Samoorganizujące się kompleksy polielektrolitowe (PEC) wykonane z heparyny i protaminy zostały osadzone na kulkach alginianowych, aby uwięzić i regulować uwalnianie osteogennych czynników wzrostu. Ta strategia dostarczania umożliwia 20-krotne zmniejszenie dawki BMP-2 w zastosowaniach związanych z usztywnieniem kręgosłupa. Niniejszy artykuł ilustruje korzyści płynące z zastosowania PEC i jego wytwarzanie.

Kompleks polielektrolitowy do dostarczania osteogennego czynnika wzrostu w domenie wiążącej heparynę

Inżynieria i analiza tkanek nośnych z heterogenicznymi populacjami komórek nadal stanowią wyzwanie. W tym miejscu opisujemy metodę tworzenia dwuwarstwowych krążków hydrożelu alginianowego jako platformy do wspólnej hodowli różnych populacji komórek w ramach jednego konstruktu.

Warstwowe konstrukty alginianowe: platforma do wspólnej hodowli heterogenicznych populacji komórek

Ten film i rękopis opisują metodę opartą na emulsji do kapsułkowania komórek ssaków w kulkach alginianowych od 0,5% do 10%, które mogą być produkowane w dużych partiach za pomocą prostego mieszanego naczynia. Zamknięte w kapsułkach komórki mogą być hodowane in vitro lub przeszczepiane do zastosowań w terapii komórkowej.

Enkapsulacja komórek ssaków w kulkach alginianowych za pomocą prostego naczynia z mieszadłem

Ten protokół ilustruje metodę enkapsulacji komórek poprzez szybkie fizyczne żelowanie alginianu w celu unieruchomienia komórek. Uzyskane mikrogranulki umożliwiają kontrolowane i trwałe wydzielanie β amyloidu w czasie i mogą być wykorzystywane do badania skutków wydzielania β amyloidu w modelach in vitro i in vivo.

Wytwarzanie mikrogranulek alginianu wydzielających β amyloid do wykorzystania w modelowaniu choroby Alzheimera

Przedstawione tutaj są dwa protokoły enkapsulacji oocytów świń w warunkach hodowli 3D. W pierwszym kompleksy wzgórko-oocyty (COC) są zamknięte w kulkach fibrynowo-alginianowych. W drugim są one otoczone cząstkami fluorowanego proszku etylenu i propylenu (mikrobioreaktory). Oba systemy zapewniają optymalne warunki do utrzymania ich organizacji 3D.

Hydrożele alginianowe zdegradowane proteolitycznie i mikrobioreaktory hydrofobowe do enkapsulacji oocytów świń

Poznaj metodę ko-immobilizacji komórek Escherichia coli w kulkach alginianowych w celu regeneracji kofaktora i zwiększenia wydajności produkcji L-ksylulozy. Technika poprawia stabilność i możliwość ponownego użycia biokatalizatorów.

Immobilizacja wielu biokatalizatorów w kulkach alginianowych w celu regeneracji kofaktora i poprawy możliwości ponownego użycia

Przeglądaj więcej filmów