Izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o charakterystyce komórek macierzystych

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie nowotworowych komórek macierzystych z raka płaskonabłonkowego głowy i szyi lub linii komórkowych HNSCC. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie leczenia nowotworów dotyczące tego, jak stosować chemioterapię w celu przezwyciężenia oporności guza na radioterapię. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona kombinację markerów w celu osiągnięcia wysokiej swoistości w nowotworowych komórkach macierzystych z linii komórkowych HNSCC.

Procedurę zademonstruje Prescillia Battiston-Montagne, nasz technik, oraz Marion Gilormini, doktor z mojego laboratorium. Aby wybrać boczną populację nowotworowych komórek macierzystych za pomocą testu wypływu barwnika Hoechsta, najpierw oznacz jedną stożkową rurkę Hoechst i jedną Hoechst i Werapamil. Następnie przemyj hodowlę komórkową HNSCC sterylnym PBS, a następnie dodaj jeden mililitr Tripsyn EDTA.

Po trzech minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza przerwij reakcję ze świeżą pożywką do hodowli komórkowych i policz komórki. Rozcieńczyć kulturę do ilości 10 do siedmiu komórek na mililitr i uzyskać kompletną pożywkę dla rodzicielskiej linii komórkowej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów do probówki Hoechst i Verapamil oraz cztery mililitry komórek do probówki Hoechst.

Następnie delikatnie wymieszaj 10 mikrolitrów pięciomilimolowego roztworu chlorowodorku Verapamil z próbką Hoechst i Verapamil, a następnie pięć mikrolitrów Hoechst na jeden razy 10 do szóstych komórek do obu probówek. Następnie przykryj próbki folią aluminiową i umieść je w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 90 minutach z delikatnym mieszaniem co 15 minut odwirować probówki i ponownie zawiesić granulki w dwóch mililitrach PBS.

Po centralnym odwirowaniu ponownie zawiesić granulki Hoechst i Verapamil w 500 mikrolitrach jodku propidyny w PBS, a granulki Hoechst w czterech mililitrach tego samego. Teraz przefiltruj próbki przez sitka o średnicy 70 mikronów do probówek FACS, aby usunąć wszelkie osady i umieść próbki na lodzie chronionym przed światłem. Następnie załaduj próbkę Hoechst do cytometru przepływowego i otwórz okno Globalny arkusz roboczy w oprogramowaniu cytometru przepływowego.

Kliknij Wykres punktowy, aby utworzyć wykres w Arkuszu globalnym i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać parametry rozproszenia do przodu i z boku. Utwórz w ten sam sposób boczny wykres punktowy o szerokości rozrzutu za pomocą bocznego wykresu punktowego o wysokości rozproszenia, a następnie kliknij bramę wielokątną, aby utworzyć region P1 na drugim wykresie, aby zaznaczyć pojedyncze komórki i rozróżnić dublety. Następnie utwórz czerwony obszar Hoechsta za pomocą niebieskiego wykresu kropkowego obszaru Hoechsta i kliknij prawym przyciskiem myszy komórki, aby podświetlić populację P1.

Następnie utwórz region P2, aby wybrać ujemną populację komórek po stronie barwnika Hoechsta, która pojawia się jako ramię boczne po lewej stronie głównej populacji komórek i zbierz 10 000 zdarzeń próbki Hoechsta. Aby potwierdzić, że bramka P2 reprezentująca populację boczną jest prawidłowo umieszczona, zbierz również 10 000 próbek Hoechst i Verapamil. Populacja boczna powinna zniknąć.

Następnie posortuj boczną populację komórek ujemnych barwnika Hoechsta do 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej jeden mililitr kompletnej pożywki z komórek macierzystych raka. Pod koniec sortowania odwiruj komórki i ponownie zawieś osad populacji bocznej w jednym mililitrze świeżej, kompletnej pożywki z komórek macierzystych podobnych do raka. Następnie policz komórki i wysiewaj je w odpowiedniej liczbie do nowej kolby do hodowli komórkowych.

Aby wybrać podzbiór CD44-high/ALDH-high z posortowanych komórek populacyjnych po stronie, najpierw oznacz siedem sterylnych 15-mililitrowych stożkowych probówek, jak wskazano. Następnie rozcieńczyć posortowane komórki do jednego razy 10 do siedmiu komórek na mililitr w pożywce dla komórek macierzystych i podwielokrotność 100 mikrolitrów komórek do niebarwionych probówek CD44-APC i IGG1-APC oraz czterech mililitrów komórek do probówki ALDH i CD44-APC, wszystko na lodzie. Zakręć ogniwa i ponownie zawieś niebarwione granulki CD44-APC i IGG1-APC w 100 mikrolitrach buforu pierwszego z zestawu ALDEFLUOR.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów inhibitora ALDH DEAB do probówek ALDH i DEAB oraz ALDH DEAB i CD44-APC. Ponownie zawiesić komórki w probówce ALDH i CD44-APC w czterech mililitrach odczynnika C zawierającego cztery mililitry buforu jeden i 20 mikrolitrów odczynnika z zestawu i natychmiast przenieść 100 mikrolitrów tych komórek do probówek ALDH, ALDH i DEAB oraz ALDH DEAB i CD44-APC. Następnie umieść wszystkie probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, chroniąc przed światłem, mieszając próbki po 15 minutach przez delikatne wirowanie.

Pod koniec inkubacji odwirować wszystkie próbki i odrzucić supernatanty. Następnie umieść wszystkie probówki na lodzie i ponownie zawieś granulki ALDH i CD44-APC w czterech mililitrach buforu A, granulki CD44-APC i ALDH DEAB i CD44-APC w 100 mikrolitrach tego samego. Zawiesić osad IGG1-APC w 100 mikrolitrach buforu B, a niebarwione probówki ALDH i ALDH i DEAB w 100 mikrolitrach buforu pierwszego.

Po 10 minutach ponownie odwirować wszystkie próbki, a następnie przemyć 1 mililitr pierwszego buforu dla wszystkich próbek z wyjątkiem próbki ALDH i CD44-APC, którą przemywa się w czterech mililitrach buforu pierwszego. Po drugim odwirowaniu ponownie zawieś wszystkie granulki w jednym mililitrze świeżego buforu pierwszego, z wyjątkiem próbki ALDH i CD44-APC, którą zawiesza się w czterech mililitrach buforu pierwszego. Teraz załaduj probówkę ALDH i CD44-APC do cytometru przepływowego i utwórz APC za pomocą wykresu punktowego, aby zwizualizować podwójnie zabarwioną populację.

Następnie załaduj rurkę ALDH, aby utworzyć bramkę dla komórek o wysokiej wysokości ALDH. Komórki dodatnie powinny zniknąć po załadowaniu rurki ALDH i DEAB. Na tym samym wykresie utwórz drugą bramkę za pomocą probówek CD44-APC i IGG1-APC, aby wybrać komórki o wysokości CD44.

Komórki dodatnie znikną po załadowaniu rurki IGG1-APC. Następnie załaduj probówki ALDH i CD44-APC oraz ALDH DEAB i CD44-APC, aby utworzyć trzecią bramkę, która zawiera komórki CD44-high/ALDH-high. Użyj podwójnie barwionej probówki ALDH-CD44, aby ustawić ostatnią bramkę na podwójnie dodatnich komórkach.

Następnie posortuj komórki o wysokiej zawartości CD44 / ALDH w 15-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej jeden mililitr kompletnej pożywki z komórek macierzystych raka i zbierając komórki CD44 o niskiej / niskiej zawartości ALDH w jednym mililitrze kompletnej pożywki do hodowli komórkowej zgodnie z potrzebami. Po drugim sortowaniu umieść komórki o wysokiej zawartości CD44 / ALDH w odpowiedniej kolbie do hodowli komórkowej z kompletną pożywką dla komórek macierzystych raka w inkubatorze do hodowli komórkowych na 18 do 24 godzin. Gdy komórki przyczepią się do dna kolby, należy zmienić pożywkę hodowlaną i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze.

Aby potwierdzić potencjał nowotworowy komórek CD44-high / ALDH-high, trypsynizuj monowarstwę podobną do rakowej łodygi, jak wykazano, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki i przenieść jeden razy 10 do sześciu komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Po odwirowaniu komórek ponownie zawieś osad w pożywce o niskiej zawartości surowicy uzupełnionej rekombinowanym ludzkim naskórkowym czynnikiem wzrostu heparyną i witaminą B27 i inkubuj komórki na szalce Petriego o niskim zakotwiczeniu w inkubatorze do hodowli komórkowych, aż kulki nowotworowe zostaną zaobserwowane za pomocą mikroskopii optycznej. Gdy sortowanie jest przeprowadzane po raz pierwszy na nowej linii komórkowej, konieczne jest potwierdzenie potencjału nowotworowego linii komórkowej, o czym świadczy jej zdolność do tworzenia sfer nowotworowych w podłożu wolnym od surowicy in vitro.

Co więcej, QPCR powinien wykazywać wysoką ekspresję beta-kateniny i innych markerów komórek macierzystych przez komórki CD44-high/ALDH-high. Komórki o wysokim poziomie CD44 / ALDH powinny być również w stanie tworzyć guzy in situ po wstrzyknięciu w małych ilościach w porównaniu z komórkami CD44 o niskiej / ALDH. Po opanowaniu każde sortowanie komórek powinno być możliwe do zakończenia w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ochronie próbek znakowanych fluorochromem przed bezpośrednim naświetleniem. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak testy migracji inwazji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące udziału rakowych komórek macierzystych w procesie przerzutów. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rakiem do zbadania mechanizmów ucieczki guza w raku HNSCC.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować rakowe komórki macierzyste z linii komórkowych HNSCC za pomocą analizy wieloparametrycznej, cytometrii przepływowej i sortowania komórek. Nie zapominaj, że praca z komórkami nowotworowymi i interkalującymi agentami DNA może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.