Name: Izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o charakterystyce komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Poznaj izolację komórek macierzystych raka z linii komórkowych HNSCC przy użyciu cytometrii przepływowej i markerów CD44/ALDH. Ta metoda pozwala badać oporność na chemioterapię i biologię nowotworów głowy oraz szyi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Thibault Andrieu i Sebastienowi Dussurgey'emu z Platformy Cytometrii Przepływowej UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) za ich rady i pomoc podczas naszego sortowania. Prace te zostały zrealizowane w ramach naukowych ETOILE i Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).

Wszystkie zabiegi na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Wszystkie szczegóły tego badania zostały zatwierdzone przez CECCAPP, francuską komisję etyczną.
1. Wybór populacji bocznej (SP) za pomocą testu wypływu barwnika Hoechst
<ol>
	<li>Barwienie 50 milionów komórek barwnikiem Hoechst 33342.
	<ol>
		<li>Przygotuj dwie sterylne probówki o pojemności 15 ml ze stożkowym dnem: jedną probówkę oznaczoną "Hoechst" i jedną oznaczoną "Hoechst i Werapamil". Przygotować 10 ml 5 mM roztworu chlorowodorku werapamilu w sterylnej wodzie. Przygotuj pożywkę hodowlaną (CM) dla komórek macierzystych.
		<ol>
			<li>Aby przygotować CM dla CSC (CM-CSC), połącz następujące elementy: zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) firmy Dulbecco: F12 (1:3, v:v), 5% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 0,04 mg/l hydrokortyzonu, 100 U/ml penicyliny, 0,1 g/l streptomycyny i 20 μg/l naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pod okapem z przepływem laminarnym trypsynizuj komórki. Usunąć pożywkę, przemyć sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodać 1 ml trypsyny-EDTA (0,5 g/l) do kolby o powierzchni 75 cm². Inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję przez dodanie pożywki używanej do macierzystej linii komórkowej. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek.
		<ol>
			<li>Aby przygotować CM dla rodzicielskiej linii komórkowej (CM-P), należy uzupełnić DMEM 10% FCS, 0,4 mg/L hydrokortyzonu, 100 U/ml penicyliny i 0,1 g/L streptomycyny).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórek otrzymaną w kroku 1.1.2 w celu uzyskania10-7 komórek/ml w CM-P. Podziel zawiesinę komórek w 2 przygotowanych probówkach: umieść 100 μl (106 komórek) w probówce "Hoechst i Werapamil" i 4 ml (4 x 107 komórek) w probówce "Hoechst".</li>
		<li>Do próbki "Hoechst i Werapamil" dodać 10 μl 5 mM roztworu chlorowodorku werapamilu (stężenie końcowe: 0,5 mM) i delikatnie wymieszać. Dodać 5 μl 1 g/l roztworu Hoechsta (końcowe stężenie: 0,1 g/l). Do próbki "Hoechst" dodać 5 μl 1 g/l roztworu Hoechsta na 10-6 komórek (łącznie 200 μl). Odtąd należy chronić próbki przed bezpośrednim narażeniem na działanie światła za pomocą folii aluminiowej.</li>
		<li>Inkubować wszystkie probówki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę 30 min. Mieszać delikatnie co 15 minut, aby zapobiec osadzaniu się komórek.</li>
		<li>Probówki wirówkowe o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę z 2 ml 1x PBS.</li>
		<li>Probówki wirować o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. Zawiesić osad "Hoechst i Werapamil" w 500 μl 5 mg/l jodku propidyny (PI) rozcieńczonego w buforze PBS, a osad "Hoechst" w 4 ml 5 mg/l PI rozcieńczonego w buforze PBS.</li>
		<li>Przenieść roztwory próbek przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm w celu usunięcia agregatów i zebrania pojedynczych komórek w probówkach w celu pobrania próbki na cytometr przepływowy. Próbki należy przechowywać na lodzie i chronić przed bezpośrednim nasłonecznieniem za pomocą folii aluminiowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja populacji bocznej z wyłączeniem barwnika Hoechst przez sortowanie komórek.
	<ol>
		<li>Przeprowadzić ujemną separację komórek Hoechsta na sortowniku cytometrii przepływowej o następujących parametrach: laser UV (355 nm), 2 detektory na ścieżce lasera UV z niebieskimi filtrami Hoechsta (450/50 BP) i czerwonym filtrem Hoechsta (610/20 BP) oraz 2 kolektory.
		<ol>
			<li>Najpierw przeanalizuj próbkę "Hoechst", która służy jako kontrola pozytywna do barwienia i ustawienia cytometru przepływowego.</li>
			<li>Korzystając z oprogramowania cytometru, w oknie "Arkusz globalny" kliknij "Wykres punktowy" (piąty obrazek w prawym górnym rogu) i utwórz wykres w arkuszu globalnym. Na rzędnej, za pomocą prawego przycisku myszy, wybierz FSC-A (rozproszenie do przodu), a na odciętych, SSC-A (rozproszenie boczne) (Rysunek 1A). W ten sam sposób utwórz wykres punktowy SSC-W i SCC-H. Na tym drugim wykresie kropkowym, aby utworzyć region P1, kliknij "Brama wielokątna" (czternaste zdjęcie w prawym górnym rogu) (Rysunek 1B)33. 
			Uwaga: Region P1 będzie obejmował pojedyncze komórki i dyskryminujące dublety.</li>
			<li>Opcjonalnie: Wyklucz komórki PI dodatnie, tworząc FSC-A i PI bramkowane na P1. Na tym wykresie kropkowym wybierz populację dodatnich komórek PI (P2), aby wykluczyć martwe komórki dodatnie PI.</li>
			<li>Korzystając z oprogramowania cytometru, w oknie "Arkusz globalny" kliknij "Wykres kropkowy" i utwórz wykres w globalnym arkuszu. Na rzędnej, za pomocą prawego przycisku myszy, wybierz niebieski Hoechst-A, a na odciętych, czerwony Hoechst-A. Klikając prawym przyciskiem myszy na populację, wybierz "Pokaż populację" i P1. Na tym wykresie kropkowym utwórz region (P2), aby wybrać ujemne komórki populacji po stronie barwnika Hoechsta (SP), które pojawiają się jako boczne ramię po lewej stronie głównej populacji komórek (Rysunek 1C).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeanalizuj próbkę "Hoechst" i zbierz 10 000 zdarzeń. Aby upewnić się, że bramka P2, która reprezentuje populację SP, jest dobrze ustawiona, przeanalizuj próbkę "Hoechst i Verapamil" (10 000 zdarzeń), aby zaobserwować zanik populacji SP (Figura 1D).</li>
		<li>Zebrać ujemne komórki barwnika SP Hoechst w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml CM-CSC przygotowanej w ppkt 1.1.1.1.</li>
		<li>Pod koniec sortowania komórek odwirować zawiesinę komórek o sile 250 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 1 ml CM-CSC. Policzyć liczbę posortowanych komórek za pomocą licznika komórek i przenieść odpowiednią liczbę komórek do kolby hodowlanej (patrz tabela 1). Dodać CM-CSC i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% atmosferze CO2 .</li>
		<li>Utrzymywać komórki w hodowli w tych samych warunkach przez maksymalnie 2 pasaże, aż do uzyskania minimalnych 5 x 107 komórek (patrz krok 3, "Metoda hodowli komórkowej").</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wybór subpopulacjiCD44 wysokiej/ALDHwysokiej w populacji bocznej posortowanej
<ol>
	<li>Barwienie 50 milionów komórek SP za pomocą zestawu do wykrywania ALDH i przeciwciała CD44.
	<ol>
		<li>Przygotuj siedem sterylnych probówek o pojemności 15 ml oznaczonych w następujący sposób: "Niebarwiona" (Probówka a), "CD44-APC" (Probówka b), "IgG1-APC" (Probówka c), "ALDH" (Probówka d), "ALDH i DEAB" (Probówka e), "ALDH i CD44-APC" (Probówka f), "ALDH, DEAB i CD44-APC" (Probówka g). Podczas barwienia wszystkie probówki i odczynniki należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować bufor A z 4,5 ml buforu 1 (zawartego w zestawie) i 45 μl przeciwciała CD44-APC (allofikocyjaniny) (rozcieńczenie 1:100). Przygotować bufor B ze 100 μl buforu 1 i 1 μl przeciwciała IgG1-APC (rozcieńczenie 1:100). Przygotować bufor C z 4 ml buforu 1 i 20 μl odczynnika z zestawu.</li>
		<li>Przygotować zawiesinę komórek z uprzednio posortowanych komórek (etap 1.2.5) w stężeniu 10-7 komórek/ml. Dodać 100 μl (10-6 komórek) zawiesiny komórek do probówek a, b i c, a następnie 4 ml (4 x 107 komórek) do probówki f. Na razie nie wkładaj komórek do probówek d, e i g.</li>
		<li>Odwirować probówki zawierające komórki o masie 250 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki w probówkach a, b i c w 100 μl buforu 1. Dodać 5 μl aldehydu dietyloaminobenzynowego (DEAB), inhibitora ALDH do probówek e i g.
		<ol>
			<li>Zawiesić komórki w probówce f z 4 ml odczynnika C i natychmiast przenieść 100 μl do probówek d, e i g. Inkubować wszystkie probówki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 minut i chronić przed bezpośrednim nasłonecznieniem za pomocą folii aluminiowej. Po 15 minutach delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową, wirując, aby zapobiec osadzaniu się komórek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Od tego momentu trzymaj rurki na lodzie i chroń przed bezpośrednim działaniem światła za pomocą folii aluminiowej. Odwirować wszystkie probówki o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
		<li>Zawiesić probówkę f w 4 ml oraz probówki b i g ze 100 μl buforu A. Zawiesić probówkę c ze 100 μl buforu B. Do pozostałych probówek dodać 100 μl buforu 1. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odwirować wszystkie probówki o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Przepłukać raz 1 ml buforu 1 (4 ml dla probówki f) i ponownie odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. Zawiesić probówkę f w granulkach w 4 ml, a wszystkie inne probówki w 1 ml buforu 1.</li>
		<li>Przenieść roztwory próbek przez sitka do komórek o wielkości 70 μm w celu usunięcia agregatów i zebrać pojedyncze komórki w odpowiednich probówkach w celu pobrania próbki na cytometrze przepływowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja populacji komóreko wysokim poziomie CD44 / ALDH przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. 
	<ol>
		<li>Sortowanie wysokokomórkowe CD44high/ALDH należy wykonać na sortowniku cytometrii przepływowej o następujących parametrach: laser niebieski (488 nm) i laser czerwony (633 nm), 1 detektor na ścieżce lasera niebieskiego z filtrem FITC (530/30), 1 detektor na ścieżce lasera czerwonego z filtrem APC (660/20) i 2 kolektory.</li>
		<li>Korzystając z oprogramowania cytometru, kliknij "Wykres punktowy" (piąty obrazek w prawym górnym rogu), aby utworzyć wykres punktowy FSC-A w porównaniu z SSC-A, jak opisano w sekcji 1.2.1.2, aby sprawdzić morfologię komórek i wybrać populację złożoną z pojedynczych komórek z wykresem kropkowym SSC-W w i SSC-H.</li>
		<li>Korzystając z oprogramowania cytometru, w oknie "Arkusz globalny" kliknij "Wykres kropkowy" i utwórz wykres w globalnym arkuszu. Na rzędnej, za pomocą prawego przycisku myszy, wybierz APC-A, a na odciętych, FITC-A, aby wybrać podwójnie zabarwioną populację. Utwórz bramkę za pomocą rurek d i e, aby wybraćwysokie komórki ALDH (rysunek 2A). Uwaga: Komórki dodatnie znikają w probówce e potraktowanej DEAB (ryc. 2B).
		<ol>
			<li>Na tym samym wykresie utwórz drugą bramkę za pomocą rurek b i c, aby wybraćwysokie komórki CD44 (rysunek 2C i 2D). Komórki dodatnie znikają w probówce zawierającej IgG1-APC. Przeanalizuj probówki f i g i utwórz trzecią bramkę, którazawiera wysokie komórki CD44/ ALDH (rysunek 2E i 2F). 
			Uwaga: Jeśli w probówce zawierającej IgG1-APC (Figura 2D) obecne są komórki dodatnie, interakcja między komórkami a przeciwciałem barwionym APC nie jest specyficzna.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zebrać komórkio wysokim poziomie CD44/ALDH do 15 ml probówki zawierającej 1 ml CM-CSC. Zebrać również CD44low/ALDHlow do 15 ml probówki zawierającej 1 ml CM19. Uwaga: Przygotuj CM-CSC zgodnie z opisem w kroku 1.1.1.1.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad 1 ml CM-CSC. Policz liczbę posortowanych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Metoda hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Po dwukrotnym sortowaniu komórek, jak opisano powyżej, należy umieścić posortowane komórki w odpowiedniej kolbie hodowlanej (tabela 1) z CM-CSC w temperaturze 37 °C przy 5 % CO2 . Po 18-24 godzinach sprawdź, czy komórki się przykleiły i zmień pożywkę hodowlaną. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 3 dni, aż rozszerzające się kolonie będą większe niż 50% zlewania się.</li>
	<li>Użyj odpowiedniej objętości trypsyny 0,5 g/L - EDTA (Tabela 1) do trypsynizacji komórek z kolby hodowlanej. Inkubować komórki przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać odpowiednią objętość CM-CSC (Tabela 1), aby zatrzymać działanie trypsyny.</li>
	<li>Policz liczbę otrzymanych komórek i umieść 4 x 105 komórek w kolbie hodowlanej o powierzchni 175 cm² za pomocą CM-CSC. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 . Przy tym stężeniu komórki o czasie podwojenia wynoszącym 24 godziny będą w 70% zlewać się w ciągu 7 dni.</li>
	<li>Do eksperymentów in vitro lub in vivo należy stosować CSC przed poddaniem ich 3 pasażom.</li>
</ol>
4. Potwierdzenie potencjału nowotworowego i charakterystyki CSC
<ol>
	<li>Tworzenie kuli nowotworowej w celu potwierdzenia potencjału nowotworowego komórek owysokim poziomie CD44 / ALDH.
	<ol>
		<li>Trypsynizuj komórki zgodnie z opisem w 3.2. Dodać 1 x 106 komórek do probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 250 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w podłożu DMEM:F12 (3:1) wolnym od FCS, 20 ng/ml rhEGF, 4 mg/l heparyny i 1x B27. Inkubować komórki w 6-dołkowej kolbie hodowlanej z niskimi płytkami kotwiczącymi w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
		Uwaga: Użyj pożywki DMEM: F12 (3:1) zawierającej 5% FCS, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / L heparyny i 1x B27, jeśli komórka nie rośnie bez FCS.</li>
		<li>Obserwuj tworzenie się kuli guza za pomocą mikroskopu optycznego od 4 do 10 dni po wysiewie (ryc. 3A). 
		Uwaga: Średnica kuli guza powinna być większa niż 35 μm. Wysokie komórki CD44 / wysokie ALDH będą wykazywać szybsze i bardziej wzmocnione tworzenie kuli nowotworowej pod względem liczby i wielkości w porównaniu do CD44o niskim / niskim ALDH.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena rakotwórczości in vivo po podskórnym wstrzyknięciu komóreko wysokim poziomie CD44 / ALDH u myszy NOD-SCID.
	<ol>
		<li>Po posortowaniu ponownie zawiesić komórki w PBS w trzech różnych stężeniach (10,4 komórki/ml, 10,5 komórek/ml i 10,6 komórek/ml). Wstrzyknąć podskórnie 100 μl 104 komórek/ml (103 komórek) w obszar prawego boku 6 myszy. Zrób to samo dla 105 komórek/ml (104 komórek) i 106 komórek/ml (105 komórek). 
		Uwaga: Można przetestować mniejsze rozcieńczenie niż 103 komórek.</li>
		<li>Wstrzyknąć to samo stężeniekomórek CD44 o niskim poziomie /ALDH w obszarze lewej flanki. Monitoruj myszy, którym wstrzyknięto do 10 tygodni, aby zobaczyć progresję guza19.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li>
<li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).</li>
<li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).</li>
<li>Dalerba, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+human+colorectal+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).</li>
<li>Hermann, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+cancer+stem+cells+determine+tumor+growth+and+metastatic+activity+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).</li>
<li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+CD90+cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li>
<li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tumorigenic+subpopulation+with+stem+cell+properties+in+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas.</a> Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).</li>
<li>Prince, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+subpopulation+of+cells+with+cancer+stem+cell+properties+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).</li>
<li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+--+Perspectives+on+current+status+and+future+directions%3A+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li>
<li>Soltanian, S., Matin, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and cancer therapy.</a> Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).</li>
<li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li>
<li>Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+--+Normal+stem+cells+%27Jedi%27+that+went+over+to+the+%27dark+side.%27%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'.</a> Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+and+chemoresistance+of+CD133%2B+cancer+stem+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma.</a> Mol Cancer. 5, 67(2006).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance%3A+Cancer+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li>
<li>Bertrand, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Head+and+Neck+Cancer+Stem+Cells+to+Overcome+Resistance+to+Photon+and+Carbon+Ion+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+tumor+stemness+by+increasing+the+invasive+and+tumorigenic+side+population+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction.</a> Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).</li>
<li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li>
<li>Chen, Z. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+concept+in+progression+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oncol%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer.</a> J Oncol. 2009, 894064(2009).</li>
<li>Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+oral+squamous+cell+carcinoma+possesses+tumor+stem+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes.</a> Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subpopulation+of+CD133%28%2B%29+cancer+stem-like+cells+characterized+in+human+oral+squamous+cell+carcinoma+confer+resistance+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy.</a> Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).</li>
<li>Sun, S., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Head+neck+squamous+cell+carcinoma+c-Met%E2%81%BA+cells+display+cancer+stem+cell+properties+and+are+responsible+for+cisplatin-resistance+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis.</a> Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+putative+marker+for+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).</li>
<li>Lim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+traits+in+squamospheres+derived+from+primary+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas.</a> Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).</li>
<li>Yu, Q., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface-localized+matrix+metalloproteinase-9+proteolytically+activates+TGF-beta+and+promotes+tumor+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis.</a> Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).</li>
<li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-initiated+signaling+promotes+the+survival+and+self-renewal+of+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells.</a> Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).</li>
<li>Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+properties+of+CD44%2B+cancer+stem-like+cells+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).</li>
<li>Chen, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cucurbitacin+I+suppressed+stem-like+property+and+enhanced+radiation-induced+apoptosis+in+head+and+neck+squamous+carcinoma--derived+CD44%28%2B%29ALDH1%28%2B%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells.</a> Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).</li>
<li>Clay, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-marker+identification+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+with+aldehyde+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase.</a> Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).</li>
<li>Meinelt, E., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeinelt%2C+E+%22Technical+Bulletin%3A+Standardizing+Application+Setup+Across+Multiple+Flow+Cytometers+Using+BD+FACSDiva+Version+6+Software%22">Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software</a>. , BD Biosciences. (2012).</li>
<li>Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2C+one+of+the+markers+of+cancer+stem+cells+in+Hep-2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line.</a> Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).</li>
<li>Fukusumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD10+as+a+novel+marker+of+therapeutic+resistance+and+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).</li>
<li>Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+as+a+molecular+marker+to+screen+cancer+stem+cells+in+hypopharyngeal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer.</a> Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).</li>
<li>Kanojia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+cancer+stem+cells+derived+from+primary+tumors+of+HER2%2FNeu+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice.</a> Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).</li>
<li>Higgins, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cell+multipotency+correlates+with+nanog+expression+and+extent+of+passaging+in+human+glioblastoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts.</a> Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje niezawodną metodę udanej izolacji CSC z określonej linii komórkowej, która ma zastosowanie do innych linii komórkowych HNSCC. Izolowane CSC głowy i szyi nadają się następnie do dalszej charakterystyki molekularnej in vitro i walidacji funkcjonalnej poprzez przeszczepienie u myszy z niedoborem odporności19. Jednak niektóre modyfikacje można przetestować w zależności od populacji bocznej lubwysokiego procentu CD44/ ALDH obecnego w rodzicielskiej linii komórkowe...

Rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC) jest powszechnym nowotworem złośliwym na całym świecie i pomimo postępu w obecnych terapiach, pacjenci z zaawansowaną chorobą mają złe rokowania. Całkowity 5-letni wskaźnik przeżycia pacjenta wynosi około 30%, pomimo połączenia podejść terapeutycznych, w tym chirurgii, chemioradioterapii i terapii celowanych. Ostatnie badania przypisują miejscowy nawrót i odległe przerzuty przeżyciu nowotworowych komórek macierzystych (CSC) po terapiach przeciwnowotworowych1. Istnieje coraz więcej dowodów potwierdzających istnienie komórek wykazujących właściwości komórek macierzystych (niezróżnicowany status, zdolności do samoodnawiania się i różnicowania oraz aktywność telomerazy) w różnych guzach litych, w tym piersi, mózgu, prostaty, płuc, jelita grubego, trzustki, wątroby i skóry2-10. Pochodzenie CSC pozostaje jednak niejasne11,12. Mogą one wynikać ze złośliwej transformacji prawidłowych komórek macierzystych3,13 lub odróżnicowania komórek nowotworowych, które nabywają cechy podobne do CSCs14,15. W związku z tym zrozumienie charakterystycznych szlaków związanych z CSC zapewni wgląd we wczesną diagnostykę i leczenie opornego HNSCC.
Zaproponowano, że CSC posiadają również odporne fenotypy, które unikają standardowej chemioterapii i radioterapii, co powoduje nawrót nowotworu w porównaniu do większości komórek nowotworowych16-19 i są zlokalizowane w niszach niedotlenienia20. Zaproponowano wiele czynników wyjaśniających tę oporność CSC, takich jak skłonność do spoczynku, zwiększona naprawa DNA, regulowane w górę mechanizmy kontroli cyklu komórkowego i wymiatanie wolnych rodników21. Co więcej, kilka onkogennych szlaków molekularnych może być specyficznie aktywowanych w CSCs17. Aby poszerzyć wiedzę na temat CSC dla dalszych terapii celowanych, potrzebujemy wiarygodnych metod identyfikacji i izolacji CSC, ze względu na niejednorodność markerów związanych z komórkami macierzystymi w różnych typach nowotworów22.
W HNSCC, komórki inicjujące guz macierzysty zostały wyizolowane z pierwotnych guzów pacjenta poprzez sortowanie komórek wyrażających różne biomarkery CSC (takie jak ekspresja transporterów wypływu leku23, CD44wysoka, CD24niska CD133wysoka, fenotyp c-Met+ 10,24,25, lub ALDHwysoka aktywność26) lub hodowla pierwotnego guza pacjenta w celu utworzenia łuskowatych sfer o właściwościach CSC. Niemniej jednak liczba łuskowatych zmniejsza się dramatycznie po dwóch przejściach, co daje niewielką liczebność próby do dalszych badań charakteryzacyjnych27. W związku z tym testy in vitro rozpoczynające się od dobrze ugruntowanych linii komórkowych są łatwiejszym rozwiązaniem do projektowania eksperymentów w celu poszerzenia wiedzy na temat CSC.
Celem tego artykułu jest zaproponowanie metody izolowania CSC z linii komórkowych HNSCC za pomocą wieloparametrycznej analizy cytometrycznej przepływu i sortowania komórek. Ekspresja CD44 w korelacji z kilkoma właściwościami CSC, w tym aktywnością ALDH, fenotypem populacji bocznej (SP), zdolnością do tworzenia sferoidów i rakotwórczością, wykorzystuje się do wyizolowania i scharakteryzowania tej subpopulacji CSC. CD44, glikoproteina na powierzchni komórki, bierze udział w adhezji i migracji komórek. CD44 ulega silnej ekspresji w wielu guzach litych CSCs28, w tym w modelach raka głowy i szyi29-31. Co więcej,wysokie komórki CD44 mogą generować in vivo heterogenny guz, podczas gdyniskie komórki CD44 nie mogą10. Test SP opiera się na zróżnicowanym potencjale komórek do wypływu barwnikaHoechst 22 przez rodzinę białek transportowych wiążących ATP (ABC) z nadekspresją w błonie CSC. Test ten obejmuje zastosowanie inhibitorów transportera ABC, takich jak werapamil w próbkach kontrolnych. Dehydrogenaza aldehydowa (ALDH) jest enzymem wewnątrzkomórkowym, który bierze udział w przekształcaniu retinolu w kwas retinowy podczas wczesnego różnicowania komórek macierzystych25,26. Komórki, które wykazują wysoką aktywność ALDH, wykazują zachowanie podobne do komórek macierzystych w HNSCC26, a bardzo niewielka liczba komóreko wysokiej zawartości ALDH jest w stanie generować guzy in vivo26,32.
Kombinacja tych markerów i właściwości została z powodzeniem wykorzystana przez Bertrand et al. do zbadania odporności in vitro i in vivo tych CSC na promieniowanie fotonowe i jony węgla19. Ich wyniki wyraźnie pokazały, że połączenie różnych markerów i właściwości komórek jest bardziej selektywne dla użytecznych badań na populacjach CSC HNSCC niż podejścia oparte na pojedynczych markerach.

<table><tbody><tr><td>Surowica płodu cielęcego Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon rozpuszczalny w wodzie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 100x</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>Roztwór należy przygotować tuż przed użyciem, ponieważ jest bardzo niestabilny</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>StemcellTM Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement (50x), bez witaminy A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>, ostra toksyczność (doustna, skórna, wziewna) kategoria 4</td></tr><tr><td>Chlorowodorek</td> <td>werapamiluSigma-Aldrich</td><td>V-4629</td><td>Toksyczność ostra (doustna, skórna, wziewna) kategoria 3</td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Toksyczność ostra (doustna, skórna, inhalacyjna) kategoria 4</td></tr><tr><td>Zestaw ALDEFLUOR</td><td>Komórka macierzysta</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>CD44-APC, przeciwciało ludzkie</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-177</td><td></td></tr><tr><td>IgG1-APC, przeciwciało ludzkie</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-189</td><td></td></tr><tr><td>Cząstka redlicy Z1</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny</td><td>Olympus&nbsp;</td>Linia komórkowa <td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B</td><td>Prezent od Johna Little' s</td> <td>Laboratorium-FaDu</td><td></td></tr> <tr><td>linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>HTB-43</td><td></td></tr><tr><td>Płyty o niskim zakotwiczeniu</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>145383</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie BD FACSDiva v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o charakterystyce komórek macierzystych

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Pomimo postępów w zrozumieniu progresji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC), pięcioletni wskaźnik przeżycia pozostaje niski z powodu miejscowego nawrotu i odległych przerzutów. Jedną z hipotez wyjaśniających ten nawrót jest obecność nowotworowych komórek macierzystych (CSC), które wykazują wrodzoną oporność na chemo- i radioaktywność. W celu opracowania nowych strategii terapeutycznych konieczne jest posiadanie modeli eksperymentalnych, które potwierdzają skuteczność terapii celowanych, a tym samym posiadanie wiarygodnych metod identyfikacji i izolacji CSC. W tym celu przedstawiamy protokół izolacji CSC z ludzkich linii komórkowych HNSCC, który opiera się na połączeniu dwóch kolejnych sortowań komórek przeprowadzanych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Pierwsza z nich opiera się na właściwości CSC do nadekspresji białek transportowych kasety wiążącej ATP (ABC), a tym samym wykluczania m.in. ważnych barwników DNA, takich jak Hoechst 33342. Komórki posortowane tą metodą są identyfikowane jako "populacja boczna" (SP). Ponieważ komórki SP stanowią niewielki procent (<5%) komórek rodzicielskich, konieczna jest faza wzrostu, aby zwiększyć ich liczbę przed drugim sortowaniem komórek. Kolejny krok pozwala na selekcję komórek, które posiadają dwie inne cechy komórek macierzystych HNSCC, tj. wysoki poziom ekspresji markera powierzchniowego komórki CD44 (wysoki poziom CD44) oraz nadekspresję dehydrogenazy aldehydowej (wysoki ALDH). Ponieważ zastosowanie pojedynczego markera wiąże się z licznymi ograniczeniami i pułapkami w izolacji CSC, połączenie markerów SP, CD44 i ALDH zapewni użyteczne narzędzie do izolowania CSC do dalszych testów analitycznych i funkcjonalnych wymagających żywych komórek. Podobne do łodygi cechy CSC zostały ostatecznie potwierdzone in vitro poprzez tworzenie się nowotworów i ekspresję β-kateniny.

Izolacja CSC z linii komórkowych HNSCC wymagała dwóch następujących po sobie etapów sortowania ze względu na bardzo niski procent CSC w wyjściowej linii komórkowej. Pierwsze sortowanie oparto na zdolności CSC do wykluczania barwnika Hoechst dzięki transporterom eflluksu leków. Skutkowało to pozyskaniem 1-5% całkowitej sortowanej populacji komórek (Rycina 1). Podczas sortowania komórek negatywnych pod kątem barwnika Hoechst należy sprawdzić wielkość i ziarnistość sortowany...

Zrozumienie roli nowotworowych komórek macierzystych w nawrotach nowotworów i oporności na terapie stało się tematem wielkiego zainteresowania w ostatniej dekadzie. W artykule opisano izolację i charakterystykę subpopulacji nowotworowych komórek macierzystych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC).

Izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o charakterystyce komórek macierzystych

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja komórek macierzystych nowotworu z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC). Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie leczenia nowotworów dotyczące wykorzystania chemioterapii w celu przezwyciężenia radiooporności guza. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie kombinacji markerów w celu uzyskania wysokiej specyficzności w izolacji komórek macierzystych nowotworu z linii komórkowych HNSCC.Procedurę zademonstrują Prescillia Battiston-Montagne, nasza technik, oraz Marion Gilormini, doktor z mojego laboratorium. Aby wyselekcjonować populację boczną komórek macierzystych nowotworu za pomocą testu wypływu barwnika Hoechst, najpierw należy oznakować jedną probówkę stożkową jako Hoechst, a drugą jako Hoechst i Verapamil. Następnie kulturę komórek HNSCC należy przemyć sterylnym PBS, po czym dodać 1 ml Trypsyny EDTA.Po trzech minutach w temperaturze 37°C zatrzymać reakcję świeżą pożywką do hodowli komórkowych i policzyć komórki. Rozcieńczyć hodowlę do stężenia 1×10⁷ komórek/ml w pełnej pożywce dla linii komórkowej rodzicielskiej. Następnie dodać 100 µl do probówki z Hoechst i Verapamilem oraz 4 ml komórek do probówki z Hoechst.Następnie delikatnie wymieszaj 10 µL roztworu chlorowodorku werapamilu o stężeniu 5 mM w próbce z Hoechst i werapamilem, a następnie dodaj 5 µL Hoechst na 1×10⁶ komórek do obu probówek. Następnie osłoń próbki folią aluminiową i umieść je w temperaturze 37 °C. Po 90 minutach, delikatnie mieszając co 15 minut, odwiruj zawartość probówek i zresuspenduj osady w 2 mL PBS.Po wirowaniu do odśrodkowania, resuspenduj osad Hoechst i Verapamil w 500 µl jodku propidyny w PBS, a osad Hoechst w czterech mililitrach tego samego roztworu. Następnie przefiltruj próbki przez sita do komórek o oczkach 70 µm do probówek FACS, aby usunąć wszelkie agregaty, i umieść próbki w lodzie, chroniąc je przed światłem. Następnie wprowadź próbkę Hoechst do cytometru przepływowego i otwórz okno Global Worksheet w oprogramowaniu cytometru.Kliknij Dot Plot, aby utworzyć wykres w Global Worksheet, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać parametry forward and side scatter. W ten sam sposób utwórz wykres kropkowy side scatter wide względem side scatter height, a następnie kliknij polygon gate, aby utworzyć obszar P1 na drugim wykresie w celu wybrania pojedynczych komórek i odróżnienia dubletów. Następnie utwórz wykres kropkowy red Hoechst area względem blue Hoechst area i kliknij prawym przyciskiem myszy na komórkach, aby zaznaczyć populację P1.Następnie należy utworzyć obszar P2 w celu wyboru negatywnej populacji bocznej komórek barwionych barwnikiem Hoechst, która pojawia się jako odgałęzienie po lewej stronie głównej populacji komórek, i zebrać 10 000 zdarzeń z próbki Hoechst. Aby potwierdzić, że bramka P2 reprezentująca populację boczną jest ustawiona prawidłowo, należy zebrać również 10 000 zdarzeń z próbki Hoechst i Verapamilu. Populacja boczna powinna zniknąć.Następnie posortuj populację boczną (side population) komórek niebarwiących się barwnikiem Hoechst do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej jeden mililitr pełnej pożywki dla komórek macierzystych nowotworu. Po zakończeniu sortowania odwiruj komórki i resuspenduj osad populacji bocznej w jednym mililitrze świeżej pełnej pożywki dla komórek macierzystych nowotworu. Następnie policz komórki i zasiać odpowiednią liczbę z nich do nowej kolby hodowlanej.Aby wyodrębnić podgrupę CD44-high/ALDH-high z posortowanych komórek populacji bocznej (side population), należy najpierw opisać siedem sterylnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml zgodnie z instrukcją. Następnie należy rozcieńczyć posortowane komórki do stężenia 1 × 10⁷ komórek/ml w pożywce dla komórek macierzystych i nanieść 100 µl komórek do probówek „unstained CD44-APC” oraz „IGG1-APC”, a 4 ml komórek do probówki „ALDH” i „CD44-APC”, wykonując wszystkie czynności w lodzie. Komórki należy odwirować, a osady z probówek „unstained CD44-APC” i „IGG1-APC” zawiesić ponownie w 100 µl buforu 1 z zestawu ALDEFLUOR.Następnie dodaj pięć mikrolitrów inhibitora ALDH DEAB do probówek ALDH, ALDH i DEAB oraz ALDH, DEAB i CD44-APC. Resuspenduj komórki w probówce ALDH i CD44-APC w czterech mililitrach odczynnika C zawierającego cztery mililitry buforu jeden i 20 mikrolitrów odczynnika z zestawu, a następnie natychmiast przenieś 100 mikrolitrów tych komórek do probówek ALDH, ALDH i DEAB oraz ALDH, DEAB i CD44-APC. Wszystkie probówki umieść w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C na 30 minut, chroniąc je przed światłem i mieszając próbki po 15 minutach poprzez delikatne wortexowanie.Po zakończeniu inkubacji odwiruj wszystkie próbki i odlej nadsączniki. Następnie umieść wszystkie probówki na lodzie i zresuspenduj osad ALDH i CD44-APC w czterech mililitrach buforu A, a osady CD44-APC i ALDH DEAB oraz CD44-APC w 100 µl tego samego buforu. Zresuspenduj osad IGG1-APC w 100 µl buforu B, a próbki ALDH niebarwione oraz ALDH i DEAB w 100 µl buforu one.Po 10 minutach ponownie odwiruj wszystkie próbki, a następnie przeprowadź płukanie w 1 mililitrze buforu jeden dla wszystkich próbek z wyjątkiem próbki ALDH i CD44-APC, którą płucze się w czterech mililitrach buforu jeden. Po drugim wirowaniu ponownie zawieś wszystkie osady w jednym mililitrze świeżego buforu jeden, z wyjątkiem próbki ALDH i CD44-APC, którą zawiesza się w czterech mililitrach buforu jeden. Teraz umieść probówkę z ALDH i CD44-APC w cytometrze przepływowym i utwórz wykres kropkowy APC względem FITC, aby zwizualizować populację podwójnie barwioną.Następnie wczytaj próbkę ALDH, aby stworzyć bramkę dla komórek ALDH-high. Komórki pozytywne powinny zniknąć po wczytaniu próbki ALDH i DEAB. Na tym samym wykresie stwórz drugą bramkę, wykorzystując próbki CD44-APC i IGG1-APC, aby wyselekcjonować komórki CD44-high.Komórki pozytywne znikną po załadowaniu probówki IGG1-APC. Następnie należy załadować probówki ALDH i CD44-APC oraz ALDH DEAB i CD44-APC, aby stworzyć trzecią bramkę obejmującą komórki CD44-high/ALDH-high. Użyj probówki z podwójnym barwieniem ALDH-CD44, aby ustawić ostatnią bramkę na komórkach podwójnie pozytywnych.Następnie posortuj komórki CD44-high/ALDH-high do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml kompletnej pożywki dla nowotworowych komórek macierzystych, zbierając komórki CD44-low/ALDH-low do 1 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowej zgodnie z potrzebami. Po drugim sortowaniu wysiej komórki CD44-high/ALDH-high do odpowiedniej kolby do hodowli komórkowej z kompletną pożywką dla nowotworowych komórek macierzystych i inkubuj w inkubatorze do hodowli komórkowej przez 18 do 24 godzin. Po przytwierdzeniu się komórek do dna kolby wymień pożywkę i wprowadź kolbę z powrotem do inkubatora.Aby potwierdzić potencjał nowotworowy komórek CD44-high/ALDH-high, należy poddać monowarstwę komórek macierzystych nowotworu trypsynizacji w sposób zademonstrowany w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie przenieść 1×10⁶ komórek do probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Po odwirowaniu komórek, osad należy resuspendować w medium o niskiej zawartości surowicy, uzupełnionym o rekombinowany ludzki czynnik wzrostu naskórka, heparynę oraz B27, i inkubować komórki w szalce Petri do hodowli w warunkach niskiej adhezji w inkubatorze do hodowli komórkowych, aż do momentu zaobserwowania sfer nowotworowych za pomocą mikroskopii optycznej. Przy pierwszym przeprowadzeniu sortowania nowej linii komórkowej konieczne jest potwierdzenie potencjału nowotworowego tej linii, co przejawia się zdolnością do tworzenia sfer nowotworowych w medium bezsurowiczym in vitro.Ponadto, badanie QPCR powinno wykazać wysoką ekspresję beta-kateniny oraz innych markerów komórek macierzystych w komórkach CD44-high/ALDH-high. Komórki CD44-high/ALDH-high powinny być również zdolne do tworzenia guzów in situ po wstrzyknięciu w niewielkich ilościach w porównaniu z komórkami CD44-low/ALDH-low. Po opanowaniu metody, każda procedura sortowania komórek powinna zostać zakończona w ciągu pięciu godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o ochronie próbek znakowanych fluorochromem przed bezpośrednim naświetleniem. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak testy inwazji i migracji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące udziału komórek macierzystych nowotworu w procesie przerzutowania. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie onkologii do zgłębienia mechanizmów ucieczki nowotworu w raku HNSCC.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować komórki macierzyste nowotworu z linii komórkowych HNSCC, wykorzystując multiparametryczną analizę cytometryczną oraz sortowanie komórek. Należy pamiętać, że praca z komórkami nowotworowymi oraz środkami interkalującymi DNA może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas przeprowadzania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.

isolation-characterization-head-neck-squamous-cell-carcinoma

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano przedzielone urządzenie mikrofluidyczne do badania migracji komórek macierzystych nowotworu. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co w przyszłości może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych terapii.

Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

W tym filmie opisujemy izolację subpopulacji komórek macierzystych nowotworowych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją lub FACS. Wyizolowaną populację boczną komórek można wykorzystać do dalszej analizy.

Test dyskryminacji populacji po stronie raka: metoda izolowania rakowych komórek macierzystych za pomocą testu wypływu barwnika Hoechsta

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych (CSC) bezpośrednio z tkanek ludzkich jest niezbędna do ich biologicznej charakterystyki. Niniejszy manuskrypt opisuje metodologię izolacji CSC prostaty od tkanek ludzkich, a także zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania trudnych etapów.

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych z próbek ludzkiego raka prostaty

Testy sferyczne in vitro są powszechnie używane do identyfikacji komórek macierzystych raka. Tutaj porównujemy testy sferyczne pojedyncze i wielokomórkowe. Bardziej pracochłonne testy jednokomórkowe lub suplementacja metylocelulozą dają dokładniejsze wyniki, podczas gdy testy wielokomórkowe wykonywane w płynnym podłożu mogą mieć duży wpływ na gęstość komórek.

Ocena właściwości komórek macierzystych w ludzkich komórkach raka jajnika przy użyciu wielo- i jednokomórkowych testów sferycznych

Komórki macierzyste raka trzustki (CSC) mogą być namnażane in vitro za pomocą techniki hodowli sferycznej niezależnej od zakotwiczenia, która stanowi potężne narzędzie do badania biologii CSC i może służyć jako pierwszy krok do opracowania nowych terapii ukierunkowanych na CSC. W tym miejscu przedstawiono metodologię rozszerzania, analizowania i celowania w CSC trzustki.

Badanie charakterystyki komórek macierzystych raka trzustki w celu opracowania nowych strategii leczenia

Obecność nowotworowych komórek macierzystych (CSC) w mięsakach kostnych została ostatnio powiązana z ich patogenezą. W artykule przedstawiono izolację CSCs z pierwotnych kultur komórkowych uzyskanych z ludzkich biopsji konwencjonalnego kostniakomięsaka (OS) z wykorzystaniem zdolności CSC do wzrostu w warunkach niezakaźnych.

Ustanowienie hodowli nowotworowych komórek macierzystych z ludzkiego konwencjonalnego kostniakomięsaka

Opisujemy szczegółowy protokół izolacji komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z ludzkim mięsakiem poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, przy użyciu ludzkiego antygenu leukocytów-1 (HLA-1) jako markera ujemnego, oraz dla dalszej walidacji i charakterystyki tych komórek inicjujących HLA-1-ujemny nowotwór.

Izolacja i charakterystyka komórek inicjujących nowotwór z ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z mięsakiem

Tutaj prezentujemy powtarzalną metodę tworzenia ortotopowego mysiego modelu raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Guzy wykazują klinicznie istotne cechy histopatologiczne choroby, w tym martwicę, słabe różnicowanie, przerzuty węzłowe i naciek immunologiczny. U myszy z guzem rozwijają klinicznie istotne objawy, w tym dysfagię, przemieszczenie szczęki i utratę wagi.

Dośluzówkowa inokulacja komórek raka płaskonabłonkowego u myszy w celu profilowania immunologicznego guza i oceny odpowiedzi na leczenie

Korzystając z ludzkich pierwotnych komórek nabłonka prostaty, przedstawiamy nową, wolną od biomarkerów metodę funkcjonalnej charakterystyki komórek macierzystych za pomocą testu retencji znaczników opartego na sferoidach. Opisano protokół krok po kroku dla znakowania komórek BrdU, CFSE lub Far Red 2D; trójwymiarowe tworzenie sferoid; identyfikacja komórek macierzystych zachowujących znacznik za pomocą immunocytochemii; i izolacja przez FACS.

Izolacja komórek macierzystych z trójwymiarowych kultur sferoidalnych

Ten eksperymentalny protokół opisuje izolację BCSC z próbek komórek i tkanek raka piersi, a także testy in vitro i in vivo, które mogą być użyte do oceny fenotypu i funkcji BCSC.

Izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych

Poznaj izolację komórek macierzystych raka z linii komórkowych HNSCC przy użyciu cytometrii przepływowej i markerów CD44/ALDH. Ta metoda pozwala badać oporność na chemioterapię i biologię nowotworów głowy oraz szyi.

Izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o charakterystyce komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów