Name: Analiza węzłów glikanowych: oddolne podejście do glikomiksu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Poznaj metodę bottom-up glycomics do analizy węzłów glikanowych w biofluidach przy użyciu GC-MS. Technika ta umożliwia identyfikację zmian glikanowych w chorobach, wspierając wczesne wykrywanie nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez College of Liberal Arts and Sciences Uniwersytetu Stanowego Arizony w formie funduszy na rozpoczęcie działalności laboratoryjnej dla CRB. Projekt został również wsparty grantem z Flinn Foundation (grant nr 1977) oraz z National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer R33CA191110. JA był wspierany przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health Postbaccalalureate Research Education Program (PREP) w ramach nagrody numer R25GM071798. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

<ol><li>Li, M., Song, L., Qin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+changes%3A+cancer+metastasis+and+anti-cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines.</a> J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).</li>
<li>Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStanley%2C+P+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans(2009).</li>
<li>Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+frequency+of+protein+glycosylation%2C+as+deduced+from+analysis+of+the+SWISS-PROT+database%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database.</a> Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).</li>
<li>Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrockhausen%2C+I+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).</li>
<li>Rini, J., Esko, J., Varki, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRini%2C+J+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).</li>
<li>Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+aberrant+tumor-reactive+immunoglobulins+in+the+circulation+of+patients+with+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).</li>
<li>An, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+glycans+in+serum+for+the+discovery+of+potential+biomarkers+for+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer.</a> J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).</li>
<li>Kanoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+serum+IgG+oligosaccharide+chains+with+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression.</a> Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).</li>
<li>Kyselova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+serum+glycome+due+to+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).</li>
<li>Okuyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucosylated+haptoglobin+is+a+novel+marker+for+pancreatic+cancer%3A+a+detailed+analysis+of+the+oligosaccharide+structure+and+a+possible+mechanism+for+fucosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation.</a> Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+microarrays+with+multi-lectin+detection%3A+unique+lectin+binding+patterns+as+a+tool+for+classifying+normal%2C+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+sera%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera.</a> J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).</li>
<li>Comunale, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+serum+associated+fucosylated+glycoproteins+in+the+development+of+primary+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma.</a> J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).</li>
<li>Goldman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Hepatocellular+Carcinoma+Using+Glycomic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis.</a> Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).</li>
<li>Aurer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+glycosylation+of+Igg+heavy+chain+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Coll+Antropol%22%5BJournal%5D)">Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma.</a> Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).</li>
<li>Abd Hamid, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+to+reveal+potential+glycan+markers+from+serum+glycoproteins+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression.</a> Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).</li>
<li>Kyselova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+diagnosis+and+prognosis+through+quantitative+measurements+of+serum+glycan+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles.</a> Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).</li>
<li>Hongsachart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteomic+analysis+of+WGA-bound+glycoprotein+biomarkers+in+sera+from+patients+with+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma.</a> Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).</li>
<li>Arnold, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+glycan+biomarkers+for+the+detection+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer.</a> J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).</li>
<li>Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+Fc+N-glycan+profiling+in+patients+with+gastric+cancer+by+LC-ESI-MS%3A+relation+to+tumor+progression+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival.</a> Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc-glycosylation+profiling+reveals+associations+with+age%2C+sex%2C+female+sex+hormones+and+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer.</a> J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).</li>
<li>Takeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucosylated+haptoglobin+is+a+novel+type+of+cancer+biomarker+linked+to+the+prognosis+after+an+operation+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer.</a> Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).</li>
<li>Parekh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+rheumatoid+arthritis+and+primary+osteoarthritis+with+changes+in+the+glycosylation+pattern+of+total+serum+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG.</a> Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).</li>
<li>Mehta, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+galactose-deficient+anti-Gal+immunoglobulin+G+in+the+sera+of+hepatitis+C+virus-infected+individuals+with+fibrosis+and+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis.</a> J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).</li>
<li>Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutional+and+clinical+implications+of+the+epigenetic+regulation+of+protein+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation.</a> Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).</li>
<li>Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+epigenomics+of+the+human+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Genomics and epigenomics of the human glycome.</a> Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).</li>
<li>Lowe, J. B., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+approach+to+Mammalian+glycan+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">A genetic approach to Mammalian glycan function.</a> Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).</li>
<li>Tuccillo, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+Glycosylation+as+Biomarker+for+Cancer%3A+Focus+on+CD43%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43.</a> Biomed Res Int. , (2014).</li>
<li>Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVarki%2C+A+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).</li>
<li>Brockhausen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin-type+O-glycans+in+human+colon+and+breast+cancer%3A+glycodynamics+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions.</a> EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).</li>
<li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+in+cellular+mechanisms+of+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.</a> Cell. 126 (5), 855-867 (2006).</li>
<li>Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertozzi%2C+CR+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).</li>
<li>Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+surrogate+analysis+of+glycotransferase+activity+in+whole+biospecimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens.</a> Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).</li>
<li>Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+Carbohydrate+Derivatives+by+Gas-Liquid+Partition+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography.</a> J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).</li>
<li>Ciucanu, I., Caprita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Per-O-methylation+of+neutral+carbohydrates+directly+from+aqueous+samples+for+gas+chromatography+and+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis.</a> Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).</li>
<li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0008621584852428">A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates.</a> Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+permethylation+of+glycans+for+mass+spectrometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis.</a> Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+solid-phase+permethylation+of+glycans+prior+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).</li>
<li>Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomic+profiling+of+invasive+and+non-invasive+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells.</a> Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).</li>
<li>Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic%2Fchemical+release+of+O-glycans+allowing+MS+analysis+at+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity.</a> Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).</li>
<li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMulloy%2C+B+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).</li>
<li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silanizing+glassware%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Silanizing glassware.</a> Curr Protoc Immunol. 21, A.3K.1-A.3K.2 (1997).</li>
<li>Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+aminosugar+linkages+in+glycolipids+by+methylation.+Aminosugar+linkages+of+ceramide+pentasaccharides+of+rabbit+erythrocytes+and+of+Forssman+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen.</a> Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ogólnie rzecz biorąc, udana produkcja częściowo metylowanych octanów aldytolu (PMAA) z heksoz jest obarczona mniejszymi trudnościami i jest bardziej niezawodna niż udana produkcja N-acetyloheksozaminy (HexNAc) PMAA. Dokładny mechanizm stojący za tym zjawiskiem, który rozgrywa się na każdym etapie tej procedury, jest nieznany, ale musi odnosić się do unikalnej chemii grupy N-acetylowej (a nie grupy hydroksylowej), która jest unikalna dla HexNAcs w stosunku do heksoz. Mechanizm stojący za tym zjawiskiem, ...

Glikolipidy, glikoproteiny, proteoglikany i glikozaminoglikany stanowią cztery główne klasy złożonych, heterogenicznych węglowodanów, znanych jako glikany. Jako wszechobecne i integralne składniki błony komórkowej, glikokaliksu oraz macierzy i płynów zewnątrzkomórkowych, glikany biorą udział w tak różnorodnych procesach biochemicznych, jak endocytoza, transport wewnątrzkomórkowy, ruchliwość komórek, transdukcja sygnału, rozpoznawanie molekularne, aktywacja receptorów, adhezja komórek, interakcja gospodarz-patogen, komunikacja międzykomórkowa, nadzór immunologiczny i inicjacja odpowiedzi immunologicznej. 1 Enzymy znane jako glikozylotransferazy, które budują polimery glikanów, obecne w prawie każdej dziedzinie życia, działają w tandemie z hydrolazami glikozydów (znanymi również jako glikozydazy, które rozkładają glikany) w celu budowy, przebudowy i ostatecznie wytworzenia sfinalizowanych polimerów glikanowych 2. Chociaż każda glikozylotransferaza może działać na różnych glikokoniugatach, glikozylotransferaza na ogół tworzy wiązanie glikozydowe specyficzne dla wiązania i anomeru, przenosząc ugrupowanie monosacharydowe określonego aktywowanego donora cukru nukleotydowego (np. GDP-fukozy) do określonej kategorii akceptorów nukleofilowych (np. lipidu, polipeptydu, kwasu nukleinowego lub rosnącego oligosacharydu). Szacuje się, że ponad 50% białek (zwłaszcza białek błonowych i wydzielniczych) jest modyfikowanych potranslacyjnie przez glikozylację. 3 Podstawowe obliczenia kombinatoryczne pozwalają docenić znaczną zmienność, wszechstronność i specyficzność przyznaną glikoproteinom przez glikozylację; Na przykład, jeśli substrat polipeptydowy ma tylko 10 miejsc glikozylacji, a każde miejsce może tworzyć wiązanie glikozydowe z 1 z zaledwie 3 różnych końców redukujących monosacharydy, to teoretycznie końcowa glikoproteina może przyjąć 310 = 59 049 różnych tożsamości. W glikoproteinach wiązania glikozydowe często tworzą się z azotem o łańcuchu bocznym reszt asparaginy w sekwencji Asn-X-Ser / Thr (X może być dowolnym aminokwasem z wyjątkiem proliny), aby uzyskać N-glikany2 i hydroksyle łańcucha bocznego reszt seryny i treoniny, aby uzyskać O-glikany 4. Skład glikudu komórkowego (tj. jego uzupełnienia produktów glikozylacji) jest unikalny i ograniczony, ponieważ, z nielicznymi wyjątkami, glikozylotransferazy wykazują ścisłą specyficzność donorową, akceptorową i wiązania. 5 Ważne i obfite glikoproteiny osocza krwi ulegają nieprawidłowej glikozylacji jako dalszej konsekwencji nieprawidłowej ekspresji i aktywności glikozylotransferazy z powodu wielu stanów patologicznych, zwłaszcza raka i chorób zapalnych. 6-24 Rozdział
Głównie ze względu na czynniki epigenetyczne, glicome jest znacznie bardziej różnorodny, dynamiczny i złożony niż proteom i transkryptom. Podczas gdy około 1% genomu ssaków koduje tworzenie, modyfikację i składanie glikanów,27 glikozylacja przebiega w sposób niezależny od matrycy - co stanowi wyraźny kontrast z biosyntezą polipeptydów i kwasów nukleinowych. Wzajemne oddziaływanie między względną ilością i aktywnością enzymów glikozylacji a takimi czynnikami środowiskowymi, jak dostępność składników odżywczych i prekursorów, ostatecznie określa charakter, szybkość i zakres glikozylacji. 5,28 Embriogeneza (np. determinacja i różnicowanie), aktywacja komórkowa i progresja w cyklu komórkowym wpływają na ekspresję genów (tj. transkrypcję i translację) oraz zmieniają tożsamość i ilość dostępnych glikozylotransferaz, których aktywność jest bezpośrednim wyznacznikiem profilu glikanowego komórki. Ponieważ (niektóre) właściwości proliferacyjne, adhezyjne i inwazyjne komórek rakowych przypominają zwykłe komórki embriogenne, specyficzne zmiany w szlakach biosyntezy glikanów (np. akumulacja prekursorów, rozregulowana ekspresja, nieprawidłowa modyfikacja, skrócenie struktury lub tworzenie powieści) służą jako uniwersalne biomarkery raka, które wskazują na różne etapy powstawania guza, progresji, migracji i inwazji. 29 Chociaż glikozylacja jest bardzo złożona, najwyraźniej tylko nieliczne zmiany w glikozylacji mogą umożliwić kancerogenezę i przerzuty; Wygląda na to, że niektóre "nieprawidłowe" produkty glikozylacji rzeczywiście przynoszą korzyści komórkom rakowym, umożliwiając im unikanie rozpoznania immunologicznego i przetrwanie wymagań migracji w niegościnnych środowiskach wewnątrznaczyniowych i przerzutowych. 28,30,31 Nic dziwnego, że eksperymenty wykazały, że zakłócanie lub zapobieganie wzorcom zmienionej ekspresji genów i nieprawidłowemu tworzeniu glikanów może zatrzymać nowotwór. 29 Niemniej jednak nieprawidłowe glikany wykryte w próbce płynu biologicznego (np. moczu, śliny i osocza krwi lub surowicy) mogą nie być bezpośrednimi wskaźnikami raka (lub innej choroby), ale raczej dalszymi wynikami subtelnych, ale znaczących zmian w układzie odpornościowym lub wymiernymi konsekwencjami szkodliwego stanu w nieprzewidywalnym narządzie. Rozdział 32
Chociaż dostarczają uniwersalnych informacji o glikomie, wiele technik glikomicznych opartych na oddziaływaniach molekularnych (np. matryce lektyny/przeciwciała i znakowanie metaboliczne/kowalencyjne) zależy od wykrywania całych struktur glikanów i nie dostarcza szczegółowych informacji strukturalnych o poszczególnych glikanach. W przeciwieństwie do tego, spektrometria mas (MS) może pomóc w identyfikacji i ilościowym określeniu poszczególnych struktur glikanów oraz ujawnieniu takich informacji strukturalnych, jak miejsca przyłączenia do rdzeni polipeptydowych. Rozregulowana ekspresja lub aktywność tylko jednej glikozylotransferazy może zainicjować kaskadę szkodliwych zdarzeń molekularnych w wielu szlakach glikozylacji. Ponieważ każda glikozylotransferaza może działać na więcej niż jednym podłożu glikokoniugatu i na różnych rosnących polimerach glikanów, zderegulowane kaskady biosyntezy dają nieproporcjonalnie zwiększone ilości tylko jednego produktu glikanowego, ale kilka niejednorodnych klas nieprawidłowych glikanów w płynach wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowych. 33 Jednakże takie unikalne nieprawidłowe glikany są czasami uważane za niepraktyczne jako biomarkery raka lub innych patologii wpływających na glikany, ponieważ w porównaniu z dużą pulą dobrze regulowanych glikanów te nieprawidłowe glikany stanowią bardzo małą frakcję, która często może pozostać niewykrywalna nawet przy użyciu tak bardzo czułych technik, jak spektrometria mas. Na przykład w wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych płynach ustrojowych szerokie spektrum stężenia białek (które obejmuje osiem rzędów wielkości) może zapobiec wykryciu rzadkich glikoprotein, które są maskowane przez liczniejsze gatunki. 32 Ponadto określenie aktywności glikozylotransferazy pozostaje poważnym wyzwaniem praktycznym i teoretycznym, ponieważ wiele glikozylotransferaz jest nieobecnych w klinicznych płynach biologicznych lub staje się nieaktywnych ex vivo. Pomimo trudności w konsekwentnym wykrywaniu i ilościowym określaniu ultra-maleńkich ilości unikalnych całych glikanów, praktycy spektrometrii mas poczynili ogromne postępy w kierunku wykorzystania nienaruszonych glikanów jako markerów klinicznych. Niedawno opracowaliśmy komplementarne podejście do analizy nienaruszonych glikanów, które, wykorzystując GC-MS, ułatwia wykrywanie wszystkich składowych monosacharydów specyficznych dla punktów rozgałęzień i wiązań ("węzłów glikanowych"), które razem nadają unikalność każdemu glikanowi i w wielu przypadkach bezpośrednio służą jako substytuty molekularne, które określają ilościowo względną aktywność winnej glikozylotransferazy.
Od czasu pierwszego bezpośredniego zastosowania do analizy glikanów w 1958 roku, chromatografia gazowa (GC) udowodniła potężną technikę analizy permetylowanych mono- i disacharydów,34 określa ich anomeryczność i bezwzględną konfigurację, a następnie rozdziela je do późniejszej analizy spektrometrii masowej. 35 RozdziałW latach 1984-2007 Ciucanu i współpracownicy wprowadzili i udoskonalili technikę permetylacji glikanów w fazie stałej, w której wykorzystano wodorotlenek sodu i jodometan, a następnie ekstrakcję permetylowanych glikanów w ciecz/ciecz przy użyciu wody i chloroformu. 35,36 W latach 2005-2008 Kang i współpracownicy włączyli do etapu permetylacji oszczędzające czas podejście oparte na kolumnie wirowej. 37,38 W 2008 r. grupa badawcza Goetz opracowała ilościową metodę profilowania glikanów permetylacji w fazie stałej przy użyciu spektrometrii mas z desorpcją-jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI) w celu porównania i potencjalnego rozróżnienia inwazyjnych i nieinwazyjnych komórek raka piersi; Następnie, w 2009 roku, zespół Goetza połączył techniki uwalniania enzymatycznego i chemicznego, aby rozszczepić O-glikany z nienaruszonych glikoprotein w wysoce zasadowym schemacie permetylacji w fazie stałej. 40 Chociaż procedura Goetza ułatwiała jednoczesną permetylację i chemiczne uwalnianie O-glikanów, była ona stosowana tylko do wstępnie wyizolowanych glikoprotein. Zmodyfikowaliśmy tę technikę w 2013 roku i dostosowaliśmy ją do całych niefrakcjonowanych płynów biologicznych i homogenizowanych próbek tkanek poprzez włączenie etapów hydrolizy, redukcji i acetylacji kwasu trifluorooctowego (TFA). 33 Te dodatkowe etapy uwalniają również glikany z glikolipidów i glikany sprzężone z N z glikoprotein i przekształcają je w częściowo metylowane octany aldytolu (PMAA, ryc. 1), których charakterystyczne wzorce metylacji i acetylacji ułatwiają analizę za pomocą GC-MS i jednoznacznie charakteryzują węzły składowe glikanów w oryginalnym nienaruszonym polimerze glikanowym41 (Figura 2). 33 Ostatecznie procedura ta pozwala uzyskać złożony portret wszystkich glikanów w złożonym płynie biologicznym oparty na bezpośrednim, względnym oznaczaniu ilościowym unikalnych cech glikanów, takich jak "fukozylacja rdzenia", "6-sjalilacja", "dwuczęściowe GlcNAc" i "rozgałęzienie beta 1-6" - z których każdy pochodzi z pojedynczego piku chromatograficznego GC-MS. W artykule przedstawiono dalszą optymalizację etapów permetylacji, acetylacji, izolacji i oczyszczania wraz z ulepszeniami w trybie względnej kwantyfikacji.

<table><tbody><tr><td>Kulki wodorotlenku sodu&nbsp;</td><td>367176</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>20-40 mesh, klasa odczynnika 97%</td></tr><tr><td>Kolumna wirująca 0,9 ml</td><td>69705</td><td>Pierce oddział ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Zawiera&nbsp; korki i frytki z polietylenu&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiolka z autosamplerem GC-MS (silanizowana)*</td><td>C4000-9</td><td></td><td>Fiolka o wysokim odzysku ThermoFisher Scientific Target DP, 1,5&nbsp; ml, 12&nbsp; mm x 32&nbsp; mm, zawiera nasadki do przekłuwania wyłożone teflonem</td></tr><tr><td>1,5 ml probówki polipropylenowe</td><td>05-402-25</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Pokrywka z zatrzaskiem</td></tr><tr><td>Probówki polipropylenowe 2 ml</td><td>05-408-138</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Pokrywka z zatrzaskiem</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>D8418</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>BioOdczynnik do biologii molekularnej, klasa odczynnika >99,0%</td></tr><tr><td>Jodometan&nbsp;</td><td>I8507</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Zawiera miedź jako stabilizator, ReagentPlus 99%</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>A955-4</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Optima LC/MS</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>75002436: Wirówka Sorvall Legend Micro 17</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Rotor 24 x 1,5/2,0 z pokrywą biohermetyczną ClickSeal. Numer katalogowy wirnika: 75003424</td></tr><tr><td>Probówka szklana 13 x 100 (silanizowana)*</td><td>53283-800</td><td>VWR</td><td>13 mm x 100 mm probówki ze szkła borokrzemianowego z nakrętką</td></tr><tr><td>Zaślepki do szklanych probówek</td><td>14-930-15D</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Kimble&handel; Czarne fenolowe nakrętki; 13&nbsp; mm-415 Gwint GPI; Gumowa wkładka pokryta PTFE.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>S7653</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>> 99,5% czystości</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>4440-08</td><td>Macron Chemikalia wysokowartościowe&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy&nbsp;</td><td>299537</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99% oczyszczone przez redestylację do sekwencjonowania białek&nbsp;</td></tr><tr><td>Borowodorek sodu</td><td>71321</td><td>Fluka Analytical&nbsp;</td><td>99%</td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku amonu&nbsp;</td><td>320145</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Zawartość NH3: 28,0-30,0%</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>AH230-4</td><td>Honeywell Burdick & Kwas</td> octowy <td>Jackson klasy HPLC</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>320099</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99,70%</td></tr><tr><td>Plastikowy eksykator próżniowy&nbsp;</td><td>Dowolny model o odpowiedniej wielkości</td> Bezwodnik octowy <td>FoodSaver</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>539996</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>99,50%</td></tr><tr><td>Dichlorometan&nbsp;</td><td>D143SK-4</td><td>ThermoFisher Naukowy&nbsp;</td><td>Stabilizowany gatunek HPLC</td></tr><tr><td>Aceton&nbsp;</td><td>9006-03</td><td>J.T.Baker</td><td>Baker Analizowane&nbsp;</td></tr><tr><td>Podgrzewany kolektor parowania (jednostka główna)</td><td>pi18823</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Thermo Scientific* Reacti-Therm* Moduł grzewczo-mieszający; Model trzyblokowy z funkcją podgrzewania i mieszania</td></tr><tr><td>Podgrzewany kolektor parowania (parownik górny)</td><td>pi18826</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Parownik ThermoScientific* Reacti-Vap, 27-portowy; Do stosowania z modułem grzewczym Reacti-Therm z potrójnym blokiem</td></tr><tr><td>Aluminiowe bloki uchwytu na próbki do kolektora parownika</td><td>pi18816</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>Blok, Aluminium, Reacti-Block S-1, Mieści 13&nbsp; Probówki o średnicy mm, 13 otworów (14&nbsp; mm śr. x 45&nbsp; mm głębokość)</td></tr><tr><td>Chromatograf gazowy</td><td>Model A7890</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>Wyposażony w automatyczny podajnik próbek CTC PAL</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy&nbsp;</td><td>GCT Premier (czas przelotu)</td><td>Wody&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka typu split-mode (dezaktywowana / silanizowana)</td><td>5183-4647</td><td>Agilent</td><td>Zawierająca małą zatyczkę z silanizowanej wełny szklanej</td></tr><tr><td>DB-5ms GC kolumna</td><td>122-5532</td><td>Agilent</td><td>30 m x 0,25 mm ID x 0,25 mikrona grubość folii</td></tr><tr><td>Chlorotrimetylosilan</td><td>95541</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szklany eksykator próżniowy (do silanizacji wyrobów szklanych)</td><td>EW-06536-30</td><td>Cole-Parmer</td><td>12" szerokości; rozmiar</td></tr><tr> płytki 230 mm<td colspan="4">*Silanizacja szkła jest przeprowadzana we własnym zakresie, przez noc przy użyciu oparów chlorotrimetylosililanu w dużym szklanym eksykatorze próżniowym.</td></tr></tbody></table>

analiza węzłów glikanowych: oddolne podejście do glikomiksu

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Syntetyzowane w procesie niesterowanym przez matryce przez enzymy zwane glikozylotransferazami, glikany są kluczowymi graczami w różnych znaczących zdarzeniach wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych. Wiele stanów patologicznych, w szczególności rak, wpływa na ekspresję genów, co z kolei może deregulować względną obfitość i poziom aktywności hydrolazy glikozydowej i enzymów glikozylotransferazy. Unikalne, nieprawidłowe całe glikany powstające w wyniku rozregulowanej glikozylotransferazy są często obecne w śladowych ilościach w złożonych biopłynach, co utrudnia ich wykrycie, a czasem jest stochastyczne. Jednak przy odpowiednim przygotowaniu próbki, jedna z najstarszych form spektrometrii mas (chromatografia gazowa ze spektrometrią mas, GC-MS) może rutynowo wykrywać zbiór monosacharydów specyficznych dla punktu rozgałęzienia i wiązania ("węzłów glikanowych") obecnych w złożonych płynach biologicznych. Podejście omawiane w niniejszym dokumencie, uzupełniające tradycyjne techniki glikomiczne typu top-down, polega na zbieraniu i kondensacji każdego węzła składowego glikanu w próbce w jeden niezależny sygnał analityczny, który dostarcza szczegółowych informacji strukturalnych i ilościowych na temat zmian w glikotransferazie jako całości i ujawnia potencjalnie rozregulowane glikozylotransferazy. Ulepszenia permetylacji i kolejnych etapów ekstrakcji ciecz/ciecz przedstawione w niniejszym dokumencie zwiększają odtwarzalność i ogólną wydajność, ułatwiając minimalne narażenie permetylowanych glikanów na alkaliczne warunki wodne. Modyfikacje etapu acetylacji dodatkowo zwiększają zakres reakcji i ogólną wydajność. Pomimo ich odtwarzalności, wykazano, że ogólna wydajność częściowo permetylowanych octanów aldytolu (PMAA) N-acetyloheksozaminy (HexNAc) jest z natury niższa niż ich oczekiwana wartość teoretyczna w stosunku do heksozy PMAA. Obliczanie stosunku obszaru pod wyekstrahowanym chromatogramem jonowym (XIC) dla każdego pojedynczego PMAA heksozy (lub HexNAc PMAA) do sumy takich obszarów XIC dla wszystkich heksoz (lub HexNAcs) zapewnia nową metodę normalizacji, która ułatwia względną kwantyfikację poszczególnych węzłów glikanu w próbce. Chociaż metoda ta jest obecnie ograniczona pod względem bezwzględnych granic wykrywalności, przyspiesza analizę klinicznych płynów biologicznych i jest bardzo obiecująca jako podejście uzupełniające do tradycyjnej glikomiki odgórnej.

Chromatogram całkowitego prądu jonowego (TIC) wykazujący pomyślną permetylację, hydrolizę, redukcję i acetylację próbek ludzkiej osocza krwi w porównaniu do przypadków, w których dwa kluczowe etapy permetylacji zostały wykonane nieprawidłowo, przedstawiono na Rysunku 3.
Bezwzględna wydajność HexNAc w stosunku do heksoz:
N-acetylheksos...

Ten artykuł przedstawia ulepszoną formę nowatorskiej techniki glikomicznej od dołu do góry, przeznaczonej do analizy zbiorczego profilu składu glikanów w niefrakcjonowanych biopłynach poprzez chemiczny rozkład glikanów na ich składowe specyficzne dla wiązania monosacharydy do wykrycia przez GC-MS. Potencjalne zastosowania obejmują wczesne wykrywanie raka i innych zaburzeń glikanowo-afektywnych.

Analiza węzłów glikanowych: oddolne podejście do glikomiksu

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rozkład wszystkich glikanów w próbce biologicznej przy jednoczesnym zachowaniu informacji o składzie monosacharydowym i wiązaniach. Umożliwia to sprowadzenie interesujących cech glikanów, takich jak sjalilacja czy przeciętna N-acetyloglukozamina, do pojedynczych sygnałów analitycznych. Metoda ta może pomóc w bezpośredniej odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie glikomiki, na przykład dotyczące tego, które unikalne cechy glikanów ulegają zmianie w konkretnych stanach chorobowych.Główną zaletą tej techniki jest to, że cechy glikanów, które mają tendencję do zmian w przebiegu choroby, takie jak rozgałęzienie beta 1-6 i korfulkozalacja, są sprowadzane do pojedynczych sygnałów analitycznych, zamiast być rozproszone w wielu nienaruszonych glikanach. Zazwyczaj osoby wykonujące tę metodę borykają się z niską wydajnością N-acetylocysteiny ze względu na nieprawidłowe przetwarzanie świeżo permetylowanych glikanów. Przygotuj próbki, przenosząc najpierw 9 µL każdego analitycznego materiału biologicznego do osobnych probówek o pojemności 1,5 ml.Do każdej próbki dodaj 1 µL wody dejonizowanej oraz 270 µL DMSO wysokiej czystości. Następnie wymieszaj zawiesinę energicznie za pomocą wkręcarki. Po przygotowaniu próbek zmontuj kolumny wirówkowe załadowane wodorotlenkiem sodu zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Za pomocą strzykawki analitycznej dodaj 105 µL jodku metylu do każdego anality i natychmiast zamknij probówki zakrętkami. Próbki dokładnie wymieszaj w wstrząsarce wortexowej. Wyjmij wcześniej przygotowane kolumny wirówkowe i wiruj je przez 15 sekund przy 2 400 ×g. Po usunięciu probówek zbiorczych i odpływu, ponownie zamknij kolumny i umieść je w nowym zestawie probówek, opisanych dla każdego anality.Użyj końcówki do pipety o pojemności 1000 µL, aby przenieść roztwór każdego anality do odpowiedniej kolumny wirówki. Po dodaniu roztworu anality odetnij niewielki fragment z końca końcówki do pipety o pojemności 200 µL i pozostaw ją w kolumnie, aby służyła jako mieszadło. Używaj końcówek do pipety, aby delikatnie mieszać zawartość kolumn co dwie do trzech minut.Po 11 minutach odłącz kolumny i wiruj je przez 15 sekund przy 2 400 Gs. Natychmiast wyjmij kolumny wirówki i umieść je w nowych probówkach zbiorczych, zachowując filtrat, ale wyrzucając korki. Do kolumn dodaj 300 µL acetonitrylu i wiruj przez 30 sekund przy 9 600 Gs. Następnie przenieś pierwsze permetylowane roztwory z filtratu do silanizowanych szklanych probówek zawierających 3,5 ml buforu fosforanowego sodu. Upewnij się, że przenoszony nadsącz jest klarowny i że nie przeniesiono żadnego materiału stałego.Na dnie plastikowych probówek utworzy się mały biały osad. Należy unikać przenoszenia widocznego materiału stałego. Niedopełnienie tego wymogu spowoduje niską wydajność otrzymania glikanu N-acetylocysteino-glukozaminowego.Natychmiast wymieszaj na wortexie każdą próbkę w partii, gdy wszystkie próbki zostaną już przeniesione. Następnie połącz roztwory filtratu acetonitrylowego z pozostałą cieczą w odpowiednich probówkach. Ponownie unikaj przenoszenia jakichkolwiek stałych, białych osadów podczas tego etapu.Zakręć probówki, wstrząśnij i wymieszaj połączone roztwory wirówką wShortly przed przejściem do kolejnej próbki. Po permetylacji dodaj 1,2 ml chloroformu do każdej probówki wewnątrz komory dymnej. Następnie zakręć probówki i energicznie wymieszaj ich zawartość.Aby rozdzielić warstwy, krótko odwiruj roztwory przy 3 000 Gs. Użyj pipety Pasteura, aby odessać i usunąć większość górnej warstwy wodnej, pozostawiając około trzech mililitrów tej warstwy. Dodaj 3,5 mililitra 0,2 molarnego buforu fosforanowego sodu, a następnie zamknij probówkę, wymieszaj i odwiruj. Powtórz ten etap ekstrakcji ciecz-ciecz łącznie trzy razy.Pozostawiając około one milliliter warstwy wodnej w końcowej ekstrakcji, należy teraz użyć czystej, silanizowanej pipety Pasteura, aby ostrożnie przenieść warstwę chloroformu do czystej i oznakowanej silanizowanej szklanej probówki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W podgrzanym układzie do odparowywania, ustawionym na 75 °C, należy wysuszyć próbki pod delikatnym strumieniem gazu azotowego.Należy upewnić się, że przepływ gazu zakłóca powierzchnię cieczy, ale nie powoduje jej rozpryskiwania. Po wyschnięciu próbki są gotowe do hydrolizy. Do każdej próbki należy dodać 325 µL 2 M kwasu triflorooctowego (TFA) i dokładnie wymieszać.Każdą probówkę z próbką należy szczelnie zamknąć natychmiast po dodaniu odczynnika do wszystkich próbek, aby zapobiec odparowaniu TFA i utracie próbki podczas następnego etapu podgrzewania. Próbki inkubuj w temperaturze 121 °C przez dwie godziny w celu hydrolizy glikanów. Podczas inkubacji próbek ponownie przygotuj manifold do odparowywania w temperaturze 75 °C.Po inkubacji wysuszyć próbki pod stałym strumieniem azotu w kolektorze do odparowywania. Często sprawdzać próbki, aby upewnić się, że zostały wysuszone w możliwie najkrótszym czasie. Do każdej próbki dodać 475 µL borowodorku sodu o stężeniu 10 g/L.Następnie dokładnie wymieszaj próbki, aby rozpuścić wszelkie pozostałości. Zamknij probówki i pozwól reakcji redukcji trwać przez jedną godzinę. Następnie dodaj 63 µL metanolu do każdej próbki.Wymieszać, a następnie wysuszyć próbki w temperaturze 75 °C w strumieniu azotu. Do każdej próbki dodać 125 µL roztworu metanolu w kwasie octowym. Wymieszać i ponownie wysuszyć próbki w temperaturze 75 °C w strumieniu azotu.Upewnij się, że próbki są całkowicie suche, umieszczając je w próżni na 20 minut. Po wysuszeniu dodaj do każdej próbki 18 µL wody dejonizowanej. Następnie krótko odwiruj próbki i dobrze wymieszaj, aby rozpuścić osad.Następnie do każdej probówki dodaj 250 µL bezwodnika octowego. Zamknij probówki, dokładnie wymieszaj w vorexie i poddaj próbki sonikacji w kąpieli wodnej przez dwie minuty, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie wszelkich pozostałości. Następnie inkubuj próbki w temperaturze 50 °C przez 10 minut.Teraz dodaj 230 µL skoncentrowanego TFA do każdej próbki. Po zamknięciu i wymieszaniu próbek inkubuj je przez 10 minut w temperaturze wewnętrznej 50 °C. Dodaj 1,8 ml dichlorometanu do każdej próbki i dobrze wymieszaj.Następnie do probówki należy dodać dwa mililitry wody dejonizowanej i dwukrotnie przeprowadzić ekstrakcję ciecz-ciecz. Warstwę dichlorometanu odessać za pomocą zasilanizowanej końcówki pipety. Przenieść do fiolki dla autosamplera, a następnie wysuszyć próbkę w strumieniu azotu w temperaturze 74 °C.Przed analizą GC-MS zrekonstytuuj każdą z próbek za pomocą 120 µL acetonu, a następnie zakręć naczynia i dokładnie wymieszaj zawartość. W trybie podziału (split) użyj autosamplera, aby wstrzyknąć 1 µL każdej próbki do wkładu GC w trybie split. Dla spektrometrów masy z analizatorem czasu przelotu zaleca się stosowanie stopnia podziału 40 oraz gazu helu w trybie stałego przepływu na poziomie 0,8 mL/min.Przeanalizuj próbkę, stosując dwustopniowy gradient osiągający 325 °C. Poddaj wymywane składniki próbki jonizacji elektronowej. W przypadku analizatora masy czasu przelotu przeanalizuj fragmenty m/z od 40 do 800 przy częstotliwości sumowania impulsów 0,1 s.Aby zademonstrować czułość niniejszego protokołu, dokładnie przetworzono próbkę biologiczną. Otrzymany chromatogram wykazuje odpowiednią intensywność między pikami pożądanego produktu, co ułatwia porównanie i analizę. Ta sama próbka biologiczna została następnie poddana tej samej procedurze.Jednak biały osad w roztworze do permetylacji, który został przepuszczony przez kolumnę z NaOH, przedostał się do kolejnej mieszaniny przeznaczonej do ekstrakcji ciecz-ciecz. Chromatogram wykazuje inny stosunek intensywności piku dla tych samych kluczowych produktów z próbki. Po bezpośrednim porównaniu różnica ta jest uderzająca.Wyraźne obniżenie piku N-acetyloglukozaminy połączonej w pozycji 4 na drugim chromatogramie jest charakterystyczną cechą nieudanej permetylacji i ekstrakcji. Aby ocenić użyteczność tego podejścia w wykrywaniu różnic w składzie glikanów w stanach chorobowych, wyekstrahowane chromatogramy jonowe z próbki normalnej osocza krwi oraz próbki osocza krwi pacjenta z nowotworem zostały znormalizowane pod kątem manoz połączonych w pozycji 2 i nałożone na siebie. Ilościowe różnice w unikalnych cechach glikanów, takich jak rozgałęzienie beta 1-6 oraz sjalilacja, są łatwo widoczne.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać analizę węzłów glikanowych w glikomice typu bottom-up. Ułatwia to wyodrębnienie interesujących cech glikanów, takich jak korfukozylacja, sjalilacja typu sick oraz glikan poniżniczy, w postaci pojedynczych sygnałów analitycznych.

glycan-node-analysis-a-bottom-up-approach-to-glycomics

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisano specyficzną i czułą metodę pozwalającą na poznanie profilu ekspresji antygenów glikosfingolipidowych w organach i komórkach układu odpornościowego. Metoda ta wykorzystuje spektrometrię mas z pułapką jonową, umożliwiając etapową fragmentację cząsteczek glikosfingolipidów w celu analizy strukturalnej w porównaniu ze standardami otrzymanymi drogą syntezy chemicznej.

Analiza spektrometryczna glikosfingolipidowych antygenów

Opisano technikę o nazwie Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP), służącą do charakterystyki glikanów ścian komórkowych roślin. Metoda ta łączy specyficzność przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko określonym epitopom glikanów z miniaturową analityczną platformą mikromacierzy, która umożliwia przesiewowe badanie występowania glikanów w szerokim zakresie kontekstów biologicznych.

Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

Aby kompleksowo zbadać różnorodność glikanów sprzężonych z O, nowa procedura redukcyjnej eliminacji β w żelu, połączona z permetylacją i metodą szybkiego podziału fazy, jest stosowana do analizy glikanów sprzężonych z O, bezpośrednio uwalnianych z glikoprotein rozdzielonych przez SDS-PAGE i podatnych na późniejszą analizę glikomiczną za pomocą spektrometrii mas.

Ulepszona redukcyjna eliminacja β w żelu dla kompleksowych O-sprzężonych i sulfoglikomów za pomocą spektrometrii mas

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Ta praca pokazuje potencjał technologii drukowanych tablic glikanowych (PGA) do analizy krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt.

Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

Otwarte wyszukiwanie umożliwia identyfikację glikopeptydów ozdobionych nieznanymi wcześniej kompozycjami glikanów. W tym artykule przedstawiono uproszczone podejście do podejmowania otwartych poszukiwań i późniejszych poszukiwań glikopeptydów skoncentrowanych na glikanie dla próbek bakteryjnych na przykładzie Acinetobacter baumannii.

Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O

Ten protokół ilustruje, jak badać, porównywać i interpretować ludzkie glicomes białkowe za pomocą zasobów online.

Zasoby bioinformatyczne do badania oddziaływań białek za pośrednictwem glikanów

Profilowanie polimerów w mikromatrycach (MAPP) to wysokoprzepustowa technika analizy składu glikanów w próbkach biologicznych.

Profilowanie polimerów w mikromacierzy (MAPP) do wysokoprzepustowej analizy glikanów

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Opisano podejście do badań przesiewowych materiałów w celu opracowania mikromacierzy domieszkowanych białkiem pochodzącym zol-żel przy użyciu nowej metody produkcji druku pinów. Metodologia ta została zademonstrowana poprzez opracowanie mikromacierzy acetylocholinoesterazy i multikinaz, które są wykorzystywane do opłacalnych badań przesiewowych małych cząsteczek.

Podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel

Poznaj metodę bottom-up glycomics do analizy węzłów glikanowych w biofluidach przy użyciu GC-MS. Technika ta umożliwia identyfikację zmian glikanowych w chorobach, wspierając wczesne wykrywanie nowotworów.

Analiza węzłów glikanowych: oddolne podejście do glikomiksu

Przeglądaj więcej filmów