Analiza węzłów glikanowych: oddolne podejście do glikomiksu
22 maja 2016
Ten artykuł przedstawia ulepszoną formę nowatorskiej techniki glikomicznej od dołu do góry, przeznaczonej do analizy zbiorczego profilu składu glikanów w niefrakcjonowanych biopłynach poprzez chemiczny rozkład glikanów na ich składowe specyficzne dla wiązania monosacharydy do wykrycia przez GC-MS. Potencjalne zastosowania obejmują wczesne wykrywanie raka i innych zaburzeń glikanowo-afektywnych.
Ogólnym celem tej procedury jest rozbicie wszystkich glikanów w próbce biologicznej przy jednoczesnym zachowaniu składu monosacharydów i informacji o wiązaniach. Ułatwienie destylacji interesujących cech glikanów, takich jak chora cyalalizacja i dzielenie N-acetyloglukozaminy na pojedyncze sygnały analityczne. Metoda ta może pomóc w bezpośredniej odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie glikomitów, takie jak to, jakie unikalne cechy glikanów są zmienione w poszczególnych stanach chorobowych.
Główną zaletą tej techniki jest to, że cechy glikanów, które mają tendencję do zmiany w chorobie, takie jak rozgałęzienia beta 1-6 i korfulkosulacja, są destylowane do pojedynczych sygnałów analitycznych, a nie rozprzestrzeniane po wielu nienaruszonych glikanach. Ogólnie rzecz biorąc, osoby muszą wykonać tę metodę naprawdę zmagają się ze słabym poziomem N-acetylocysteiny z powodu niewłaściwego przetwarzania świeżo permetylowanych glikanów. Przygotuj próbki, najpierw przenosząc dziewięć mikrolitrów każdego analitu biologicznego do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 mililitra.
Do każdej próbki dodaj jeden mikrolitr wody dejonizowanej i 270 mikrolitrów DMSO o wysokiej czystości. I energicznie wymieszaj, wirując je. Po przygotowaniu próbki należy zmontować kolumny wirowe naładowane wodorotlenkiem sodu, jak opisano w protokole tekstowym.
Za pomocą strzykawki analitycznej dodaj 105 mikrolitrów jodometanu do każdego analitu i natychmiast zakryj probówki. Dokładnie zwirować próbki. Odłączyć poprzednio przygotowane kolumny wirowe i odwirowywać je przez 15 sekund przy 2 400 Gs. Po wyrzuceniu probówek ze zbiornikiem i napływającym, ponownie zatkaj kolumny i umieść je w nowym zestawie probówek, oznaczonych dla każdego analitu.
Użyj głowicy rurowej o pojemności 1000 mikrolitrów, aby przenieść każdy roztwór analitu na odpowiednią kolumnę wirową. Po dodaniu roztworu analitu zaciśnij około dwóch mililitrów od końca końcówki głowicy rury o pojemności 200 mikrolitrów i pozostaw końcówkę w kolumnie, aby użyć jej jako mieszadła. Użyj końcówek głowicy rury, aby delikatnie wymieszać kolumny raz na dwie do trzech minut.
Po 11 minutach odłączyć kolumny i odwirowywać je przez 15 sekund w temperaturze 2 400 Gs. Natychmiast wyjmij kolumny wirujące i umieść je w nowych rurkach zbiornika, oszczędzając roztwór przepływowy, ale wyrzucając korki. Do kolumn dodać 300 mikrolitrów acetonenitrylu i odwirować je przez 30 sekund przy 9 600 Gs. Teraz przenieś pierwsze permetylowane roztwory przepływowe do silanizowanych szklanych probówek zawierających 3,5 mililitra buforu fosforanu sodu. Upewnij się, że przeniesiony supernaned jest przezroczysty i że nie przenosi się żadnego materiału stałego.
Na dnie plastikowych rurek utworzy się mała biała granulka. Unikaj przenoszenia jakichkolwiek widocznych materiałów stałych. Niezastosowanie się do tego spowoduje słabe plony nut glikanów N-acetylocysteiny-glukozaminy.
Natychmiast po przeniesieniu wszystkich próbek należy przeprowadzić wirowanie każdej próbki w partii. Następnie połącz przepływowe roztwory acetonitrylu z resztą cieczy w odpowiednich probówkach. Również na tym etapie należy unikać przenoszenia jakichkolwiek stałych, białych pozostałości.
Połączone roztwory należy zamknąć, wstrząsnąć i zwirować bezpośrednio przed przejściem do następnej próbki. Po permetylacji dodaj 1,2 mililitra chloroformu do każdej probówki wewnątrz dygestorium. Następnie zakryj probówki i energicznie wymieszaj zawartość.
Aby oddzielić warstwy, na krótko odwirować roztwory o stężeniu 3 000 Gs. Użyj głowicy rury pastwiskowej, aby usunąć i wyrzucić większość górnej warstwy wodnej, pozostawiając około trzech mililitrów warstwy. Dodać 3,5 mililitra 0,2-molowego buforu fosforanu sodu, a następnie zakryć, wymieszać i odwirować probówkę. Wykonaj ten etap ekstrakcji cieczą/cieczą w sumie trzy razy.
Pozostawiając około jednego mililitra warstwy wodnej w końcowej ekstrakcji. Teraz użyj czystej silanizowanej głowicy rury pastwiskowej, aby ostrożnie przenieść warstwę chloroformu do czystej i oznakowanej probówki ze szkła silanizowanego, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W podgrzanym kolektorze parowania, ustawionym na 75 stopni Celsjusza, wysuszyć próbki pod delikatnym strumieniem azotu gazowego.
Upewnij się, że przepływ gazu narusza powierzchnię cieczy, ale bez jej rozpryskiwania. Po wyschnięciu próbki są gotowe do hydrolizy. Dodać 325 mikrolitrów 2 molowego kwasu trifluorooctowego lub TFA do każdej próbki i dobrze wymieszać.
Natychmiast po dodaniu do wszystkich próbek należy szczelnie zakryć każdą probówkę z próbką, aby zapobiec parowaniu TFA i utracie próbki podczas kolejnego etapu ogrzewania. Inkubuj próbki w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby zhydrolizować glikany. Podczas inkubacji próbek ponownie przygotuj kolektor parowania w temperaturze 75 stopni Celsjusza.
Po inkubacji wysuszyć próbki pod stałym strumieniem azotu w kolektorze odparowującym. Często sprawdzaj próbki, aby upewnić się, że są suszone przy użyciu minimalnego możliwego czasu suszenia. Do każdej próbki dodaj 475 mikrolitrów po 10 gramów na litr borowodorku sodu.
A następnie dokładnie wymieszaj próbki, aby rozpuścić wszelkie pozostałości. Zakryj probówki i pozwól reakcji redukcji trwać przez godzinę. Następnie dodaj 63 mikrolitry metanolu do każdej próbki.
Wymieszaj, a następnie wysusz próbki w temperaturze 75 stopni Celsjusza pod azotem. Dodać 125 mikrolitrów metanolu do roztworu kwasu octowego do każdej próbki. Wymieszaj, a następnie ponownie wysusz próbki w temperaturze 75 stopni Celsjusza pod azotem.
Upewnij się, że próbki są całkowicie suche, umieszczając je w próżni na 20 minut. Po wysuszeniu do każdej próbki dodaj 18 mikrolitrów wody dejonizowanej. Następnie należy krótko odwirować próbki i dobrze je wymieszać, aby rozpuścić osad.
Następnie dodaj 250 mikrolitrów bezwodnika octowego do każdej probówki. Zakryj probówki, dokładnie zwiruj i poddaj sonikacji próbki w łaźni wodnej przez dwie minuty, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie wszelkich pozostałości. Następnie inkubować próbki w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 10 minut.
Teraz dodaj 230 mikrolitrów skoncentrowanego TFA do każdej próbki. Po zamknięciu i wymieszaniu próbek inkubować je przez 10 minut w temperaturze wewnętrznej 50 stopni Celsjusza. Dodaj 1,8 mililitra dichlorometanu do każdej próbki i dobrze wymieszaj.
Następnie dodaj dwa mililitry zjonizowanej wody do probówki i dwukrotnie wykonaj ekstrakcję ciecz/ciecz. Odzyskać warstwę dichlorometanu za pomocą silanizowanej głowicy rury pastwiskowej. Przenieść do fiolki z automatycznym samplerem, a następnie wysuszyć próbkę w atmosferze azotu w temperaturze 74 stopni Celsjusza.
Przed GC-MS należy rozpuścić próbki w 120 mikrolitrach acetonu, zamykając je i dokładnie mieszając. W trybie dzielonym użyj automatycznego próbnika, aby wstrzyknąć jeden mikrolitr każdej próbki do wkładki GC w trybie podziału. W przypadku spektrometrów masowych czasu przelotu zaleca się podział proporcji czterdziestu i helu gazowego w trybie stałego przepływu przy 0,8 mililitra na minutę.
Przeanalizuj próbkę za pomocą dwustopniowego gradientu, który osiąga 325 stopni Celsjusza. Poddaj wymykające się składniki próbki jonizacji elektronowej. Dla analizatora masy czasu lotu analizuj fragmenty M powyżej Z 40 do 800 z szybkością sumowania impulsów 0,1 sekundy.
Aby zademonstrować czułość tego protokołu, starannie przetworzono próbkę biologiczną. Otrzymany chromatogram daje odpowiednią intensywność między pożądanymi pikami produktu, co ułatwia porównanie i analizę. Ta sama początkowa próbka biologiczna została następnie przetworzona przy użyciu tej samej procedury.
Ale biała pozostałość w roztworze permetylacji, która została przepuszczona przez kolumnę NAOH, została przeniesiona do późniejszej mieszaniny w celu ekstrakcji ciecz/ciecz. Chromatogram daje różny stosunek intensywności pików tych samych kluczowych produktów próbki. W bezpośrednim porównaniu różnica jest wyraźna.
Wyraźne obniżenie 4-pozycyjnego piku N-acetyloglukozaminy w drugim chromatogramie jest rozpoznawalną cechą nieudanej permetylacji i ekstrakcji. Aby docenić użyteczność tego podejścia w wykrywaniu różnic w składzie glikanów w stanach chorobowych, wyekstrahowane chromatogramy jonowe z normalnej próbki osocza krwi i próbki osocza krwi pacjenta z rakiem są normalizowane dla 2-sprzężonych manos i nakładane. Różnice ilościowe w unikalnych cechach glikanów, takich jak rozgałęzienie beta 1-6, a także chora sinica, są łatwo widoczne.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić oddolną analizę węzłów glikanowych glikomików. Ułatwienie destylacji interesujących cech glikanów, takich jak korfulkosulacja, cyalalacja chora i dzielenie glikanitu na dwie części na pojedyncze sygnały analityczne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia ulepszoną technikę glikomiki oddolnej (bottom-up) do analizy glikanów w płynach ustrojowych poprzez ich rozkład do monosacharydów o specyficznych wiązaniach w celu detekcji metodą GC-MS. Metoda ta ma na celu ułatwienie identyfikacji cech glikanów zmienionych w stanach chorobowych, co może pomóc we wczesnym wykrywaniu nowotworów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Glikomika
- Analiza biologiczna
- Badania nad rakiem
Wstęp
- Technika ta pozwala zachować skład monosacharydowy oraz informacje o wiązaniach.
- Odpowiada ona na wyzwania związane z analizą cech glikanów w przebiegu chorób.
- Poprzednie metody często skutkowały niską wydajnością otrzymywania istotnych glikanów.
- Zrozumienie zmian w glikanach może dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów chorobowych.
Cel badania
- Opracowanie metody pozwalającej na sprowadzenie cech glikanów do pojedynczych sygnałów analitycznych.
- Identyfikacja unikalnych zmian w glikanach związanych z konkretnymi chorobami.
- Poprawa wydajności i dokładności analizy glikanów.
Zastosowane metody
- Rozkład glikanów do składowych monosacharydów.
- Wykorzystanie GC-MS do wykrywania monosacharydów o specyficznych wiązaniach.
- Przygotowywanie próbek biologicznych w probówkach o pojemności 1,5 ml.
- Ułatwienie analizy cech glikanów, takich jak rozgałęzienia beta 1-6.
Główne wyniki
- Metoda ta skutecznie kondensuje cechy glikanów do postaci pojedynczych sygnałów.
- Pozwala ona na identyfikację zmian w cechach glikanów powiązanych z chorobami.
- Zaobserwowano zwiększone wydajności N-acetylocysteiny.
- Kluczowe cechy glikanów zostały skutecznie przeanalizowane.
Wnioski
- Udoskonaleń technika glikomiki wykazuje potencjał w analizie chorób.
- Może ona wspomagać wczesne wykrywanie nowotworów oraz zaburzeń związanych z glikanami.
- Przyszłe zastosowania mogą zostać rozszerzone o inne stany chorobowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
To podejście glikomiczne typu bottom-up umożliwia wykrywanie związanych z chorobą zmian w glikanach poprzez sprowadzanie złożonych struktur glikanowych do specyficznych dla wiązań sygnałów monosacharydowych. Wspiera ono walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w onkologii i odkrywaniu biomarkerów, dostarczając ilościowych, powtarzalnych odczytów zmian w glikomie. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną wczesnych etapów odkryć, łącząc dysregulację węzłów glikanowych z aktywnością glikozylotransferaz w stanach patologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez ujawnianie rozregulowanych glikozylotransferaz dzięki detekcji aberracyjnych węzłów glikanowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez korelację zmian w węzłach glikanowych z aktywnością enzymatyczną w modelach chorób.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez identyfikację unikalnych cech glikanów zmienionych w nowotworach i innych patologiach.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez generowanie spójnych profili węzłów glikanowych z kompleksowych płynów ustrojowych.
- Wartość operacyjna: Rozwiązuje problemy standaryzacji i powtarzalności analiz poprzez usprawnione protokoły permetylowania oraz ekstrakcji ciecz-ciecz.
- Wartość naukowa: Umożliwia wiarygodną ocenę związków poprzez dostarczenie ilościowych pomiarów węzłów glikanowych za pomocą stosunków powierzchni XIC.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omawia znaczenie dla diagnostyki chorób, wykazując użyteczność metody w porównywaniu próbek plazmy od zdrowych osób i pacjentów onkologicznych pod kątem zmian glikanowych.
- Wartość operacyjna: Opisuje ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając śledzenie zmian w węzłach glikanowych w różnych zestawach próbek.
- Wartość naukowa: Koncentruje się na predykcyjnym ograniczaniu ryzyka poprzez ujawnianie powiązań mechanistycznych między dysregulacją glikozylotransferaz a zmianami w glikomie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od testowania hipotez po identyfikację związków wiodących – umożliwiając identyfikację i walidację celów terapeutycznych sterowaną przez glikany.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez izolację cech glikanów zmienionych w przebiegu choroby do pojedynczych sygnałów analitycznych.
- Screening: Opisuje gotowość i powtarzalność testu dzięki usprawnionemu przygotowaniu próbek, które minimalizuje ubytek glikanów i zwiększa wydajność.
- Analityka: Podkreśla wyniki ilościowe poprzez normalizację stosunku pól XIC w celu względnej kwantyfikacji węzłów glikanowych w różnych próbkach.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną, umożliwiając porównywanie zmian w glikanach w różnych stanach chorobowych między próbkami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako wielokrotnie wykorzystywalną funkcjonalność do screeningu glikomicznego w wielu modelach chorób i programach biomarkerów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w relacjach między glikanami a chorobami.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki zoptymalizowanym etapom permetylacji, ekstrakcji i acetylacji.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne w późnych etapach dzięki możliwości wczesnego wykrywania biomarkerów opartych na glikanach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju dzięki ilościowemu profilowaniu glikomu w modelach chorób.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie chemii glikanów, spektrometrii mas oraz przygotowania próbek do etapów derywatyzacji i ekstrakcji.
- Wymagane jest zastosowanie aparatury GC-MS z jonizacją elektronową i możliwością stosowania dwustopniowych gradientów temperatury do 325°C.
- Konieczna jest standaryzacja postępowania z próbkami pomiędzy zespołami, aby uniknąć przeniesienia pozostałości stałych, co mogłoby obniżyć wydajność N-acetylheksozaminy.
- Metoda wymaga rozważenia adaptacji dla różnych typów płynów ustrojowych ze względu na zmienność złożoności glikanów oraz obecność interferencji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują mniejszą wydajność PMAA N-acetylheksozaminy w porównaniu do PMAA heksozy, co wpływa na bezwzględne granice detekcji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Biological Sample Permethylation
3:58
Liquid/Liquid Extraction and Glycan Purification
5:24
Trifluoroacetic Acid (TFA) Hydrolysis of Glycans
6:19
Glycan Reduction
7:13
Glycan Acetylation
8:36
Gas Chromatography – Mass Spectrometry (GC-MS)
9:35
Results: Optimized Route for Permethylation
11:03
Conclusion
