Name: Badanie funkcji koroniny A we wczesnej reakcji głodowej Dictyostelium discoideum za pomocą testów agregacyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj testy agregacyjne do badania roli koroniny A w reakcji głodowej Dictyostelium discoideum. Ta metoda umożliwia automatyczny przesiew czynników rozwojowych i analizę sygnałowania komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dictyostelium Stock Center za szczepy i odczynniki. Badania te zostały sfinansowane z grantów Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki i kantonu Bazylea.

<ol>
	<li>Obserwuj wczesną reakcję głodową Dictyostelium discoideum za pomocą mikroskopii poklatkowej.
	<ol>
		<li>Hodować komórki DH1,10 lub komórki z niedoborem korA w kolbie Erlenmayera zawierającej pożywkę HL-5 (dla 1 l: 5 g peptonu proteozy, 5 g peptonu tiotonu E, 10 g glukozy, 5 g ekstraktu drożdżowego, 0,35 g Na2HPO4*7H2O, 0,35 g KH2PO4, 0,05 g siarczanu dihydrostreptomycyny, pH 6,6) w temperaturze 22 °C w inkubatorze z wytrząsaniem o prędkości obrotowej 160 obr./min. Utrzymuj komórki w gęstości od 0,01 x 106 komórek/ml do 2 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Zbadać agregację komórek, zbierając komórki DH1.10 we wzroście w fazie logarytmicznej21 lub komórki z niedoborem korA 10 wytworzone na tle DH1.10, hodowane w kulturze wstrząsającej z pożywką HL-5 w temperaturze 22 °C. W tym celu należy pobrać odpowiednią ilość komórek (zwykle od 10 do 50 ml), odwirować przez 3 minuty przy 400 x g i dwukrotnie umyć komórki w BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, pH 6,5).</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie płytki o gęstości (5, 10, 20 lub 40) x 104 komórek/cm2 w 24-dołkowej płytce. Pozwól im przylegać przez 1 godzinę w temperaturze 22 °C w BSS.</li>
		<li>Wizualizacja agregacji za pomocą mikroskopii poklatkowej, jak opisano wcześniej10, wykonywanie obrazów co 135 sekund przy użyciu zestawu do obrazowania na żywo wyposażonego w obiektyw 5X i kamerę urządzenia sprzężonego z ładunkiem zwielokrotniającym elektrony, zautomatyzowaną przez odpowiednie oprogramowanie (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pulsowanie cAMP komórek Dictyostelium discoideum podczas głodu.
	<ol>
		<li>Zbadaj wpływ zewnętrznie stosowanych impulsów cAMP na rozwój komórek DH1.1021 lub komórek z niedoborem DH1.10 corA 10, poprzez pobieranie komórek. W tym celu należy pobrać odpowiednią ilość komórek (zwykle od 10 do 50 ml), odwirować przez 3 minuty przy 400 x g i dwukrotnie przemyć w BSS.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i ponownie zawiesić komórki do gęstości 1 x 107 komórek/ml w BSS. Potrząsać kulturami bakterii (160 obr./min) w temperaturze 22 °C przez 2 godziny przed zastosowaniem impulsów. Dodaj impulsy cAMP za pomocą pompy perystaltycznej sterowanej zegarem. Zaprogramuj pompę tak, aby co 6,5 minuty dostarczała impuls o stężeniu 15 μl 50 nM cAMP (stężenie końcowe) przez okres 5 godzin.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie płytkie komórki o gęstości (5, 10, 20 lub 40) x 104 komórki/cm2 na płytce 24-dołkowej. Pozostawić na 1 godzinę w BSS.</li>
		<li>Wizualizacja agregacji po 16 godzinach w temperaturze 22 °C za pomocą mikroskopii w jasnym polu przy użyciu obiektywu 5X.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja rozwoju Dictyostelium discoideum poprzez ekspozycję na kondycjonowaną pożywkę.
	<ol>
		<li>Przygotować świeże kondycjonowane podłoże zgodnie z opisem22. Zebrać komórki DH1,10 w fazie logarytmicznej21 lub komórki z niedoborem korA DH1,10 10 z wytrząsania kultur z pożywką HL-5 w temperaturze 22 °C za pomocą pipety, odwirować przez 3 minuty przy 400 x g i przemyć komórki trzykrotnie w PBM (0,02 M fosforan potasu, 10 μM CaCl2 i 1 mM MgCl2, pH 6,1).</li>
		<li>Zliczyć komórki za pomocą hemocytometru, zawiesić je ponownie w PBM o gęstości 1 x 107 komórek/ml i wstrząsać przez 20 godzin przy 110 obr./min/22 °C.</li>
		<li>Zebrać kondycjonowaną pożywkę po odwirowaniu w stężeniu 400 × g przez 3 minuty i sklarować przez odwirowanie w temperaturze 8 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4°C.</li>
		<li>Przefiltrować kondycjonowane medium przez filtr 0,45 μm (patrz tabela materiałów) i rozcieńczyć trzykrotnie w PBM.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i płytki o gęstości (5, 10, 20 lub 40) x 104 komórek/cm2 na płytce 24-dołkowej. Pozostawić je do przylegania przez 1 godzinę w temperaturze 22 °C.</li>
		<li>Zamiana supernatantu komórek na wcześniej przygotowane kondycjonowane podłoże.</li>
		<li>Wizualizacja agregacji po 16 godzinach za pomocą mikroskopii jasnego pola przy użyciu obiektywu 5X.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Weijer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+cell+movement+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic cell movement in Dictyostelium.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).</li>
<li>Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+discoideum%3A+a+model+system+for+cell-cell+interactions+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development.</a> Science. 245, 1054-1058 (1989).</li>
<li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signal+transduction+pathways+regulating+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum.</a> Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).</li>
<li>Clarke, M., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSF+and+CMF%2C+autocrine+factors+that+regulate+gene+expression+during+growth+and+early+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium.</a> Experientia. 51, 1124-1134 (1995).</li>
<li>Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Aggregation+in+Dictyostelium+discoideum+by+an+External+Periodic+Pulse+of+Cyclic+Adenosine+Monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate.</a> Science. 175, 333-335 (1972).</li>
<li>Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cyclic+AMP+in+Dictyostelium+discoideum+and+Polysphondylium+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum.</a> Nature. 224, 1211-1212 (1969).</li>
<li>Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analyses+of+gene+regulation+during+early+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum.</a> Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).</li>
<li>Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+signals+induce+cell+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).</li>
<li>Mann, S. K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+regulation+of+early+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum%3A+mediation+via+the+cell+surface+cyclic+AMP+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor.</a> Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).</li>
<li>Vinet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+multicellular+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum+is+regulated+by+coronin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A.</a> Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).</li>
<li>Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holistic+phylogeny+of+the+coronin+gene+family+reveals+an+ancient+origin+of+the+tandem-coronin%2C+defines+a+new+subfamily%2C+and+predicts+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function.</a> BMC Evol Biol. 11, 268(2011).</li>
<li>Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+guard%3A+coronin+proteins+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity.</a> Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).</li>
<li>Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+Leukocyte+Plasma+Membrane+with+the+Actin+Cytoskeleton+through+Coiled+Coil-mediated+Trimeric+Coronin+1+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules.</a> Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).</li>
<li>Kammerer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+trimerization+motif+controls+the+topology+of+short+coiled+coils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).</li>
<li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronins%3A+the+return+of+the+crown%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coronins: the return of the crown.</a> Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).</li>
<li>Jayachandran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin+1+Regulates+Cognition+and+Behavior+through+Modulation+of+cAMP%2FProtein+Kinase+A+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling.</a> PLoS Biol. 12, e1001820(2014).</li>
<li>Suo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin-1+is+a+neurotrophin+endosomal+effector+that+is+required+for+developmental+competition+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival.</a> Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).</li>
<li>Mueller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+survival+through+coronin-1-mediated+generation+of+inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate+and+calcium+mobilization+after+T+cell+receptor+triggering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering.</a> Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).</li>
<li>de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin%2C+an+actin+binding+protein+of+Dictyostelium+discoideum+localized+to+cell+surface+projections%2C+has+sequence+similarities+to+G+protein+beta+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits.</a> EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).</li>
<li>Shina, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+unique+roles+of+coronin+proteins+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).</li>
<li>Cornillon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phg1p+is+a+nine-transmembrane+protein+superfamily+member+involved+in+dictyostelium+adhesion+and+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).</li>
<li>Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+80+x+10%283%29+Mr+protein+mediates+sensing+of+cell+density+and+the+onset+of+development+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium.</a> Development. (112), 269-278 (1991).</li>
<li>Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteinous+factor+mediating+intercellular+communication+during+the+transition+of+Dictyostelium+cells+from+growth+to+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+science%22%5BJournal%5D)">A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation.</a> Zoological science. 12, 61-69 (1995).</li>
<li>Mehdy, M. C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+factor+and+cyclic+AMP+jointly+regulate+cell-type-specific+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum.</a> Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).</li>
<li>Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+density-sensing+factor+controls+development+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A density-sensing factor controls development in Dictyostelium.</a> Genes Dev. 6, 390-400 (1992).</li>
<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Dev Biol. 391, 1-16 (2014).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Białka koroniny znajdują się w większości taksonów kladu eukariotycznego. Dictyostelium discoideum coronin A, homolog koroniny 1 ssaków, bierze udział we wczesnej odpowiedzi głodowej, ponieważ komórki z niedoborem koroniny A nie są w stanie tworzyć centrów agregacji we wczesnym cyklu rozwojowym10. Aby móc ilościowo i dokładnie ocenić opóźnienie w rozwoju między szczepami, niezbędnym narzędziem jest zestaw do obrazowania żywych komórek pod mikroskopem z automatycznym kontrolerem stopnia.
<p class="...

Rodzina białek koroniny jest wysoce konserwatywna u eukariontów. Białka te charakteryzują się obecnością aminokońcowego regionu zawierającego powtórzenia tryptofanu-asparaginianu (WD), po którym następuje unikalny region połączony z domeną cewki zwiniętej na końcu karboksylowym13,14 (Figura 1). Koroniny są zaangażowane w różne funkcje komórkowe, w tym regulację cytoszkieletu i transdukcję sygnału12. U ssaków może dojść do jednoczesnej ekspresji do sześciu krótkich cząsteczek koroniny (koronina 1-6), a także "tandemowa" koronina 712,15. Koronina 1 jest najszerzej badanym członkiem rodziny i wykazano, że bierze udział w niszczeniu patogenów, przeżywalności limfocytów T i sygnalizacji neuronalnej. W jaki dokładnie sposób koronina 1 przeprowadza te działania, pozostaje niejasne. Podczas gdy wykazano, że koronina 1 reguluje sygnalizację zależną od Ca2 + i cAMP, a także modulację cytoszkieletu F-aktyny 16-18, potencjalna koekspresja do 7 członków rodziny u ssaków utrudniła badanie funkcji molekularnej koronin w tych systemach ze względu na potencjalne redundancje. W przeciwieństwie do organizmów ssaków, dolny eukariont Dictyostelium discoideum wykazuje ekspresję tylko dwóch członków rodziny koroniny (koroniny A, ortologi koroniny ssaków 1 i koroniny B, ortologi koroniny ssaków 7) z pozornie niezbędnymi funkcjami15,19,20. Fakt ten sprawia, że Dictyostelium discoideum jest silnym modelem do badania funkcji koronin.
Aby zbadać rolę koroniny A w Dictyostelium discoideum, wywołaliśmy cykl rozwojowy poprzez głodzenie na płytkach z kulturami tkankowymi zawierającymi zrównoważony bufor roztworu soli (BSS) przy użyciu komórek typu dzikiego lub komórek pozbawionych koroniny A10. Odkryliśmy, że komórki pozbawione koroniny A nie były w stanie tworzyć agregatów wielokomórkowych po zagłodzeniu. Dla dokładnej oceny ilościowej tego fenotypu niezbędne jest zautomatyzowane obrazowanie żywych komórek opisane w tym protokole. Defekt w inicjacji wczesnej odpowiedzi głodowej w komórkach pozbawionych koroniny A można uratować poprzez dostarczanie impulsów cAMP, co sugeruje, że koronina A działa przed kaskadą cAMP. Egzogeniczne zastosowanie impulsów cAMP do symulacji rozpoczęcia rozwoju było wykorzystywane przez kilka laboratoriów w ciągu ostatnich8,9 lat. Jednak wiadomo również, że ta procedura jest w dużym stopniu zależna od gęstości komórek i czasu. W związku z tym opisany tutaj protokół ma na celu zmniejszenie tych zmienności, aby zagwarantować wysoki stopień odtwarzalności. Podsumowując, techniki wykorzystane w tych badaniach dostarczają solidnych narzędzi do badania funkcji białek we wczesnych stadiach cyklu rozwojowego Dictyostelium discoideum i mają potencjał do identyfikacji efektorów w górę i w dół funkcji koroniny A.

<table><tbody><tr><td>Pożywka HL-5 (na 1 l: 5 g peptonu proteozy, 5 g peptonu tiotonu E, 10 g glukozy, 5 g ekstraktu drożdżowego, 0,35 g Na2HPO4*2H2O, 0,35 g KH2PO4, 0,05 g siarczanu dihydrostreptomycyny, pH 6,6)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepton Proteozy</td><td>BD Bioscience</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Pepton Thiotone E</td><td>BD Bioscience</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>BD Bioscience</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>AppliChem</td><td>A3666</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4*2H2O</td><td>Fluka</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td></td></tr><tr><td>siarczan dihydrostreptomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1954000</td><td></td></tr><tr><td>PBM (0,02 M fosforan potasu, 10 &mu; M CaCl2 i l mM MgCl2, pH 6,1)</td><td></td><td></td><td>samodzielnie wykonany</td></tr><tr><td>BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, pH 6,5)</td><td></td><td></td> <td>własnej produkcji</td></tr><tr><td>0,45-&mu; m Filtropure S</td><td>filtr Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1H</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Cellobserver Zeiss</td><td></td><td>niestandardowe</td></tr><tr><td>oprogramowanie AxioVision</td><td>Mikroprocesor Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPC&ndash; sterowana pompa dozująca</td><td>ISMATEC</td><td>ISM 931</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Axiovert 135M</td><td>Zeiss</td><td>491237-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka inkubacyjna</td><td>Inforst HT Minitron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badanie funkcji koroniny a we wczesnej reakcji głodowej dictyostelium discoideum za pomocą testów agregacyjnych

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Ameba Dictyostelium discoideum znajdują się w glebie, żywiąc się bakteriami. Kiedy źródła pożywienia stają się rzadkie, wydzielają czynniki, aby zainicjować program rozwoju wielokomórkowego, podczas którego pojedyncze komórki chemotaksują w kierunku centrów agregacji1-4. Proces ten jest zależny od uwalniania cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP)5. cAMP jest wytwarzany falami w wyniku skoordynowanego działania cyklazy adenylanowej i fosfodiesterazy oraz wiąże się z receptorami cAMP sprzężonymi z białkiem G6,7. Szeroko stosowany test do analizy mechanizmów zaangażowanych w cykl rozwojowy dolnego eukarionta Dictyostelium discoideum opiera się na obserwacji agregacji komórek w warunkach zanurzonych8,9. Protokół ten opisuje analizę roli koroniny A w cyklu rozwojowym poprzez głodzenie na płytkach do hodowli tkankowych zanurzonych w zrównoważonym roztworze soli (BSS)10. Koronina A należy do szeroko konserwatywnej rodziny białek koronin, które są zaangażowane w szeroki zakres działań11,12. Komórki dictyostelium pozbawione koroniny A nie są w stanie tworzyć agregatów wielokomórkowych, a wadę tę można uratować, dostarczając impulsy cAMP, co sugeruje, że koronina A działa przed kaskadą cAMP10. Techniki opisane w tych badaniach dostarczają solidnych narzędzi do badania funkcji białek w początkowych etapach cyklu rozwojowego Dictyostelium discoideum przed kaskadą cAMP. Dlatego wykorzystanie tego testu agregacji może umożliwić dalsze badania funkcji koroniny A i pogłębić naszą wiedzę na temat biologii koroniny.

Komórki z niedoborem koroniny A wykazują defekt we wczesnym rozwoju (Rysunek 2). Wobec braku koroniny A komórki nie są w stanie tworzyć agregatów wielokomórkowych, co stanowi początkowy etap cyklu rozwojowego Dictyostelium discoideum. Zatem koronina A zdaje się odgrywać rolę podczas wczesnej odpowiedzi na głodzenie i/lub w sygnalizacji cAMP. Rzeczywiście, brak tworzenia agregatów wielokomórkowych przy braku koroniny A towarzyszy zredukowana sygnalizacja cAMP <sup...

Ameba społeczna Dictyostelium discoideum przechodzi rozwojowe przejście w organizm wielokomórkowy, gdy jest głodzona. Ewolucyjnie konserwatywne białko koronina A odgrywa kluczową rolę w inicjacji rozwoju. Wykorzystując testy agregacyjne jako naszą główną metodę, staramy się wyjaśnić rolę koroniny A we wczesnym rozwoju.

Badanie funkcji koroniny A we wczesnej reakcji głodowej Dictyostelium discoideum za pomocą testów agregacyjnych

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest zbadanie zależnej od Coronin-A wczesnej odpowiedzi na głodzenie u Dictyostelium discoideum. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak identyfikacja szlaków sygnałowych i czynników zaangażowanych we wczesnym rozwoju Dictyostelium discoideum. Główną zaletą tej techniki jest potencjał do dostarczenia narzędzia do zautomatyzowanego i wysokoprzepustowego przesiewania czynników indukujących rozwój oraz białek biorących udział w wczesnej sygnalizacji rozwojowej.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na liczne zmienne właściwe dla testu, takie jak gęstość komórek, czas adhezji oraz czas inkubacji. Aby rozpocząć procedurę, należy hodować komórki DH1.10 lub komórki z deficytem corA w kolbie Erlenmeyera zawierającej medium HL-5, w temperaturze 22°C, w inkubatorze wytrząsowym przy 160 rpm. Gęstość komórek należy utrzymywać w przedziale od 1×10⁴ do 2×10⁶ komórek/ml.Aby zbadać agregację komórek, należy zebrać od 10 do 50 ml komórek DH1.10 w fazie logarytmicznego wzrostu lub komórek z deficytem corA wytworzonych w tle DH1.10. Odwiruj je przez trzy minuty przy 400 ×g. Następnie przemyj komórki dwukrotnie w BSS.Następnie należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Po tym czasie wysiać komórki na płytkę 24-dołkową. Pozostawić je do przytwierdzenia na jedną godzinę w temperaturze 22 stopni Celsuis w roztworze BSS.Następnie wizualizuj agregację komórek za pomocą mikroskopii time-lapse, wykonując zdjęcia co 135 sekund. Aby zbadać wpływ zewnętrznie podawanych impulsów cyklicznego AMP na rozwój komórek DH1.10 lub komórek DH1.10 z deficytem corA, pobierz od 10 do 50 mililitrów komórek i wiruj je przez trzy minuty przy 400 ×g. Następnie przemyj je dwukrotnie w BSS.Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie resuspenduj komórki do gęstości 1×10⁷ komórek/mL w BSS. Potem inkubuj kultury w wytrząsaniu w temperaturze 22 °C przez dwie godziny przy 160 rpm przed zastosowaniem impulsów.Następnie podawaj impulsy cAMP za pomocą pompy perystaltycznej sterowanej czasomierzem. Zaprogramuj pompę tak, aby dostarczała pięciosekundowy impuls cAMP co sześć i pół minuty przez okres pięciu godzin. Kluczowym krokiem jest upewnienie się, że końcówka wtryskiwacza cAMP nie jest stale zanurzona w roztworze, lecz zanurza się okresowo w falach generowanych przez wytrząsarkę.Po zastosowaniu cyklicznego AMP ponownie policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie wysiej komórki na płytkę 24-dołkową i pozostaw je do przylgnięcia na jedną godzinę w BSS. Po 16 godzinach zwizualizuj agregację komórek w temperaturze 22 °C, wykorzystując mikroskopię w polu jasnym z obiektywem 5x.W tej procedurze należy przygotować świeżą pożywkę kondycjonowaną, zbierając komórki DH1.10 w fazie logarytmicznej lub komórki DH1.10 z deficytem corA z kultur wstrząsanych w pożywce HL5 w temperaturze 22 °C. Komórki należy wirować przez trzy minuty przy 400 ×g. Następnie należy je trzykrotnie przemyć w PBM.Następnie należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru, a potem zawiesić je ponownie w PBM z gęstością 1×10⁷ komórek/ml i inkubować z wytrząsaniem przez 20 godzin w temperaturze 22 °C przy 110 rpm. Następnie komórki należy odwirować z prędkością 400 ×g przez trzy minuty, po czym zebrać medium warunkujące. Następnie medium należy oczyścić poprzez wirowanie przy 8 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.Następnie przefiltruj medium warunkujące przez filtr 0,45 µm i rozcieńcz je trzykrotnie w PBM. Policz komórki za pomocą hemocytometru, wysiej je na płytkę 24-dołkową i pozostaw do adhezji na jedną godzinę w temperaturze 22 °C. Następnie wymień supernatant komórek na wcześniej przygotowane medium warunkujące.Po 16 godzinach należy zwizualizować agregację komórek za pomocą mikroskopii w polu jasnym, używając obiektywu 5x. W tym przypadku komórki z niedoborem Coronin-A wykazują defekt w wczesnym rozwoju i nie były w stanie tworzyć agregatów wielokomórkowych, co stanowi początkowy etap cyklu rozwojowego Dictyostelium discoideum. Na tej rycinie komórki wegetatywne typu dzikiego oraz komórki z niedoborem corA zostały przemyte i poddane głodzeniu przez dwie godziny przed podaniem, lub niepodaniem, 15 animal or cyclic AMP w odstępach co sześć i pół minuty przez pięć godzin w zawiesinie.Zastosowanie egzogennych impulsów cyklicznego AMP w pełni przywróciło fenotyp typu dzikiego. Na tej rycinie komórki typu dzikiego oraz komórki z deficytem corA, rosnące wykładniczo, zostały przemyte w PBM, wysiane na płytki wielodołkowe i inkubowane w medium warunkującym uzyskanym z głodujących komórek typu dzikiego lub komórek z deficytem corA. Zdjęcia wykonano 16 godzin po wysianiu komórek.komórki Dictyostelium discoideum z deficytem corA były w stanie wytworzyć wszystkie czynniki niezbędne do indukcji rozwojowej, lecz nie potrafiły na nie odpowiedzieć. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu 20 godzin, wliczając czas inkubacji, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że w przypadku różnych szczepów konieczna będzie korekta wielu zmiennych analizy, takich jak gęstość komórek, czas adhezji oraz czas rozwoju.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić frakcjonowanie biochemiczne i następczą analizę proteomiczną w celu zidentyfikowania czynników zaangażowanych we wczesną odpowiedź na głodzenie u Dictyostelium discoideum. Po obejrzeniu tego filmu widz powinien dobrze rozumieć sposób indukowania wczesnego rozwoju u Dictyostelium discoideum w warunkach zanurzenia, z wykorzystaniem pożywki kondycjonowanej lub impulsów cAMP.

investigating-function-coronin-early-starvation-response

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

To badanie opisuje techniki biofizyczne, biochemiczne i molekularne do scharakteryzowania aktywności opiekuńczej Escherichia coli HdeB w warunkach kwaśnego pH. Metody te zostały z powodzeniem zastosowane do innych opiekuńczych chroniących przed kwasami, takich jak HdeA, i mogą być modyfikowane tak, aby działały w przypadku innych białek opiekuńczych i warunków stresu.

Wykrywanie zależnej od pH aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro i In Vivo

Społeczny ameba Dictyostelium discoideum został niedawno założony jako system do badania nieprawidłowego fałdowania białek i proteostazy. W tym miejscu opisujemy nową metodologię opartą na obrazowaniu do badania agregacji białek wywołanej temperaturą i odpowiedzi na stres komórkowy u D. discoideum.

Badanie systemu kontroli jakości białek D. discoideum przy użyciu obrazowania żywych komórek w kontrolowanej temperaturze

Tutaj opisujemy metody oceny odpowiedzi komórkowej na ostrą stymulację mechaniczną. W teście opartym na mikroskopii badamy lokalizację biosensorów znakowanych fluorescencyjnie po krótkiej stymulacji przepływem ścinającym. Badamy również biochemicznie aktywację różnych interesujących nas białek w odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną.

Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną

Celem przedstawionej tutaj metody jest zbadanie agregacji białek podczas normalnego starzenia się w modelowym organizmie C. elegans. Protokół stanowi potężne narzędzie do badania wysoce nierozpuszczalnych dużych agregatów, które tworzą się wraz z wiekiem i do określenia, w jaki sposób zmiany w proteostazie wpływają na agregację białek.

Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans

Makropinocytoza, niespecyficzny pobór płynów na dużą skalę, jest ważna w wielu dziedzinach biologii klinicznej, w tym w immunologii, infekcjach, nowotworach i chorobach neurodegeneracyjnych. W tym przypadku istniejące techniki zostały zaadaptowane, aby umożliwić wysokoprzepustowy pomiar makropinocytozy z rozdzielczością pojedynczej komórki w organizmie modelowym makropinocytozy Dictyostelium discoideum przy użyciu cytometrii przepływowej.

Wysokoprzepustowy pomiar makropinocytozy Dictyostelium discoideum za pomocą cytometrii przepływowej

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Ten protokół opisuje ekstrakcję i wizualizację zagregowanych i rozpuszczalnych białek z Escherichia coli po leczeniu proteotoksycznym środkiem przeciwbakteryjnym. Postępowanie zgodnie z tą procedurą pozwala na jakościowe porównanie tworzenia agregatów białkowych in vivo w różnych szczepach bakteryjnych i/lub między zabiegami.

Ekstrakcja i wizualizacja agregatów białkowych po leczeniu Escherichia coli stresorem proteotoksycznym

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentowana jest metoda analizy kinetyki agregacji białek u nicieni Caenorhabditis elegans. Zwierzęta z populacji zsynchronizowanej pod względem wieku są obrazowane w różnych punktach czasowych, a następnie następuje półautomatyczne zliczanie inkluzji w CellProfiler i dopasowywanie do modelu matematycznego w AmyloFit.

Monitorowanie kinetyki agregacji białek in vivo przy użyciu automatycznego zliczania inkluzji u Caenorhabditis elegans

Poznaj testy agregacyjne do badania roli koroniny A w reakcji głodowej Dictyostelium discoideum. Ta metoda umożliwia automatyczny przesiew czynników rozwojowych i analizę sygnałowania komórkowego.

Badanie funkcji koroniny A we wczesnej reakcji głodowej Dictyostelium discoideum za pomocą testów agregacyjnych

Przeglądaj więcej filmów