Badanie funkcji koroniny A we wczesnej reakcji głodowej Dictyostelium discoideum za pomocą testów agregacyjnych

Ogólnym celem tej eksperymentalnej procedury jest zbadanie zależnej od koroniny-A wczesnej odpowiedzi głodowej Dictyostelium discoideum. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju, takie jak identyfikacja szlaków sygnałowych i czynników zaangażowanych we wczesny rozwój Dictyostelium discoideum. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona stanowić narzędzie do zautomatyzowanych i wysokoprzepustowych badań przesiewowych czynników indukujących rozwój i białek zaangażowanych we wczesną sygnalizację rozwojową.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą zmagać się z wieloma zmiennymi nieodłącznie związanymi z testem, takimi jak gęstość komórek, czas przylegania i czas rozwoju. Aby rozpocząć tę procedurę, hoduj komórki DH1,10 lub komórki z niedoborem korA w kolbie Erlenmeyera zawierającej pożywkę HL-5, w temperaturze 22 stopni Celsjusza, w inkubatorze z wytrząsaniem przy 160 obr./min. Utrzymuj komórki w gęstości od jednego razy 10 do czterech i dwa razy 10 do sześciu komórek na mililitr.

Aby zbadać agregację komórek, zbierz od 10 do 50 mililitrów komórek DH1.10 rosnących w fazie logarytmicznej lub komórek z niedoborem corA wygenerowanych w tle DH1.10. Wiruj je przez trzy minuty w temperaturze 400 razy g. Potem były komórki dwa razy w BSS.

Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie umieść komórki na płytce 24-dołkowej. Pozwól im przylegać przez godzinę w temperaturze 22 stopni Celsjusza w BSS.

Następnie wizualizuj agregację komórek za pomocą mikroskopii poklatkowej i rób zdjęcia co 135 sekund. Aby zbadać wpływ zewnętrznie stosowanych cyklicznych impulsów AMP na rozwój komórek DH1.10 lub komórek z niedoborem DH1.10 corA, należy zebrać od 10 do 50 mililitrów komórek i odwirować je przez trzy minuty w temperaturze 400 razy g. Następnie umyj je dwukrotnie w BSS.

Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie ponownie zawieś komórki do gęstości od jednego razy 10 do siedmiu komórek na mililitr w BSS. Następnie potrząsaj kulturami w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez dwie godziny przy 160 obr./min przed zastosowaniem roślin strączkowych.

Następnie zastosuj cykliczne impulsy AMP za pomocą pompy perystaltycznej sterowanej zegarem. Zaprogramuj pompę tak, aby dostarczała pięciosekundowy impuls cyklicznego AMP co sześć i pół minuty przez okres pięciu godzin. Krytycznym krokiem jest upewnienie się, że końcówka cyklicznego wstrzykiwania AMP nie jest stale zanurzona w roztworze, ale tylko okresowo zanurzana w falach generowanych przez wytrząsarkę.

Po cyklicznym zastosowaniu AMP ponownie policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie umieść komórki w płytce 24-dołkowej i pozwól im przylegać przez godzinę w BSS. Po 16 godzinach zwizualizuj agregację komórek w temperaturze 22 stopni Celsjusza za pomocą mikroskopii jasnego pola przy użyciu pięciokrotnego subiektywnego kąta.

W tej procedurze należy przygotować świeżo kondycjonowaną pożywkę, zbierając komórki DH1,10 w fazie logarytmicznej lub komórki z niedoborem korA DH1,10 z kultur wstrząsających pożywką HL5 w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Odwirowywać komórki przez trzy minuty w temperaturze 400 razy g. Następnie umyj je trzy razy w PBM.

Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru, a następnie ponownie zawieś je w PBM o gęstości od jednego razy 10 do siedmiu komórek na mililitr i potrząsaj nimi przez 20 godzin w temperaturze 22 stopni Celsjusza przy 110 obr./min. Następnie odwirować komórki w temperaturze 400 razy g przez trzy minuty, a następnie zebrać kondycjonowaną pożywkę. Następnie sklarować pożywkę przez odwirowanie 8 000 razy g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przefiltruj kondycjonowane podłoże przez filtr 0,45 mikrometra i rozcieńcz je trzykrotnie w PBM. Policz komórki za pomocą hemocytometru, umieść je na płytce 24-dołkowej i pozwól im przylegać przez godzinę w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Następnie należy wymienić supernatant komórek na wcześniej przygotowane kondycjonowane podłoże.

Po 16 godzinach zwizualizuj agregację komórek za pomocą mikroskopii jasnego pola przy użyciu pięciokrotnie subiektywnego wskaźnika. W tym przypadku komórki z niedoborem koroniny-A wykazują defekt we wczesnym rozwoju i nie były w stanie tworzyć agregatów wielokomórkowych, co jest początkowym etapem cyklu rozwojowego Dictyostelium discoideum. Na tym rysunku wegetatywne komórki typu dzikiego i z niedoborem korA były myte i głodzone przez dwie godziny, a następnie pulsowane z lub bez 15 zwierzęcych lub cyklicznych AMP, co sześć i pół minuty przez pięć godzin w zawiesinie.

Zastosowanie egzogennych cyklicznych impulsów AMP w pełni przywróciło fenotyp typu dzikiego. Na tym rysunku, wykładniczo rosnące komórki typu dzikiego i z niedoborem corA, zostały umyte w PBM, wysiane na płytki wielodołkowe i inkubowane w kondycjonowanym podłożu uzyskanym z komórek głodowych typu dzikiego lub z niedoborem korA. Zdjęcia zostały wykonane 16 godzin po wysianiu komórek.

Dictyostelium discoideum z niedoborem corA, były w stanie wytworzyć wszystkie czynniki wymagane do indukcji rozwoju, ale nie były w stanie na nie zareagować. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu 20 godzin, wliczając czas inkubacji, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że dla różnych szczepów wymagane będzie dostosowanie wielu zmiennych testu, takich jak gęstość komórek, czas przylegania, czas rozwoju.

Po tej procedurze można przeprowadzić frakcjonowanie biochemiczne, a następnie analizę proteomiczną w celu zidentyfikowania czynników zaangażowanych we wczesną reakcję głodową Dictyostelium discoideum. Po obejrzeniu tego filmu należy dobrze zrozumieć, jak indukować wczesny rozwój w Dictyostelium discoideum w warunkach zanurzenia, używając zarówno kondycjonowanych pożywek, jak i cyklicznych impulsów AMP.