Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym
June 21st, 2016
W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.
Ogólnym celem tego filmu jest dostarczenie zintegrowanego zestawu metod identyfikacji i eksperymentalnej walidacji geneomicznych elementów regulatorowych, tzw. wzmacniaczy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące transkrypcji i regulacji zdarzeń biologicznych, w tym selekcji i stosowania wzmacniaczy, różnicowania komórek lub w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne. Główną zaletą prezentowanego przepływu pracy jest to, że protokół można łatwo dostosować i wykorzystać w dowolnych systemach modeli komórkowych.
Zademonstruję etapy procedury. Aby rozpocząć, wybierz kandydata na wzmacniacz na podstawie istniejącej wcześniej analizy sekwencyjnej chipów. Użyj przeglądarki genomu, aby wyświetlić wyniki pożądanego eksperymentu z sekwencją chipów i zidentyfikować miejsca wiązania w pobliżu genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Wybierz opcję Zdefiniuj region zainteresowania, aby uzyskać sekwencję 200–400 par zasad wybranego regionu genomu i użyć sekwencji do późniejszego projektowania starterów. Za pomocą standardowych technik biologii molekularnej amplifikuj i klonuj wybrany region genomu do konstruktu plazmidu reporterowego. Aby przetestować działanie wzmacniacza, transfekuj konstrukty reporterowe na masę embrionalnych komórek macierzystych, najpierw dodając 200 mikrolitrów 0,1% roztworu żelatyny na dołek do 48 płytek dołkowych.
Inkubować płytki przez 30 minut przed posiewem. Dzień przed transfekcją, embrionalne komórki macierzyste lub ES bez karmienia płytkami w 250 mikrolitrach pożywki ES o gęstości trzy razy 10 do czwartej komórki na studzienkę. W dniu transfekcji przygotuj mieszanki plazmidowe, które wystarczą na osiem dołków z każdej mieszanki.
Dodaj pożywkę surowicy o obniżonej jakości transfekcji do każdej mieszanki plazmidów, aby zwiększyć objętość do 106 mikrolitrów. Następnie dodaj 4,5 mikrolitra odczynnika do transfekcji jakości ES i ostrożnie wymieszaj, pipetując 15 razy w górę iw dół. Inkubować mieszankę transfekcyjną przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Po inkubacji dodać do komórek 13 mikrolitrów mieszanki transfekcyjnej na studzienkę i dokładnie wymieszać przez pipetowanie. Następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze na noc przed leczeniem porostów. Wydajność transfekcji jest krytycznym krokiem.
Jeśli używany jest inny typ komórki, ten krok wymaga optymalizacji. Użyj najbardziej odpowiedniego typu komórki, aby przetestować aktywność wzmacniacza, aby zminimalizować efekty zależne od kontekstu. Następnego dnia ostrożnie usuń pożywkę przez aspirację i dodaj 250 mikrolitrów świeżej pożywki na studzienkę zawierającą jeden mikromolowy kwas trans retinowy lub DMSO jako nośnik.
Inkubuj komórki przez 24-48 godzin. Po przygotowaniu buforu do lizy zgodnie z protokołem tekstowym należy ostrożnie odessać pożywkę z komórek. Użyj 1X PBS, aby jednokrotnie podnieść komórki, a następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu do lizy 1X na studzienkę.
Potrząsaj komórkami w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie, aby uzyskać całkowitą lizę komórek, zamroź lizaty komórkowe w płytce w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Po całkowitym rozmrożeniu lizatów użyj elektronicznej pipety wielokanałowej, aby przenieść 80 mikrolitrów lizatu komórkowego na 96-dołkową przezroczystą płytkę dla beta galaktozydazy i 40 mikrolitrów lizatu na białą płytkę w celu pomiaru lucyferazy.
Aby przeprowadzić beta-galaktozydazę, zmieszaj jeden mililitr buforu substratu beta gal z czterema miligramami OMPG. Następnie dodaj 3,5 mikro litra beta merkaptoetanolu do mieszaniny i natychmiast dodaj 100 mikro litrów buforu do 80 mikro litrów lizatu komórkowego. Inkubuj reakcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż rozwinie się słaby żółty kolor.
Odczytaj chłonność na poziomie 420 nanometrów na czytniku płytek i wyeksportuj dane. Aby przeprowadzić test lucyferazy, po przygotowaniu odczynnika substratowego zgodnie z protokołem tekstowym, przed rozpoczęciem należy ogrzać odczynnik substratu lucyferazy do temperatury pokojowej. Następnie odpipetuj 100 mikrolitrów do każdej studzienki białej płytki zawierającej 40 mikrolitrów lizatu komórkowego.
Natychmiast użyj licznika luminescencyjnego do pomiaru sygnału. Wykonaj zadania z co najmniej trzech niezależnych transfekcji i eksperymentów. Wykonaj obliczenia dla obu testów zgodnie z protokołem tekstowym.
Aby zaprojektować startery do wykrywania eRNA za pomocą RTCPR, wybierz region genomu, który jest oddalony o co najmniej 1,5 do dwóch kilogramów zasad od wszelkich opisanych transkryptów genów. Zidentyfikuj względny kierunek genu i określ pozycję transkryptów zmysłowych i antysensownych. Aby zaprojektować startery do kwantyfikacji wzmacniającego RNA, wybierz regiony 200-1 000 par zasad od środka miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego.
Jeśli gen znajduje się na nici ujemnej, skopiuj 200-300 par zasad nici dodatniej i przekształć sekwencję, aby uzyskać odwrotną sekwencję dopełniacza. Następnie użyj tej sekwencji do późniejszego projektowania podkładu. Ustaw zakres rozmiarów produktu między 80-150 par podstaw.
Aby zmierzyć transkrypcję eRNA, po wyizolowaniu całkowitego RNA z leczonych komórek zgodnie z protokołem tekstowym, wykryj odwrotną transkrypcję eRNA za pomocą RTCPR przy użyciu standardowej procedury. Zmierz mRNA niezależnego od leczenia w celu normalizacji. Jak pokazano tutaj, analiza bioinformatyczna danych sekwencyjnych chipa RXR uzyskanych z komórek ES traktowanych kwasem retinowym ujawniła wzbogacenie połowy receptora jądrowego w miejscach zajętych przez RXR.
Korzystając z algorytmu bioinformatycznego, wyniki wyszukiwania motywów dla połowy lokalizacji zostały zmapowane z powrotem do danych sekwencyjnych układu RXR. Analiza ta zidentyfikowała piki chipów nakładające się na kanoniczne miejsca wiązania receptorów jądrowych. Wizualizacja miejsc w IGV wykazała wzbogacenie czynników transkrypcyjnych zbliżonych do Hoxa1.
Wcześniej scharakteryzowany cel RAR RXR. Zidentyfikowano również wzmacniacz represyjny dla nowego łańcucha docelowego RA, PRMT8. Zidentyfikowane regiony wzmacniające sklonowano do wektora reporterowego lucyferazy TK, a komórki ES transfekowano tymi konstruktami.
Aktywność lucyferazy mierzono pod kątem braku i obecności RZS. Konstrukty zawierające element odpowiedzi RA lub RARE, wykazywały zwiększoną intensywność sygnału lucyferazy po leczeniu RZS, podczas gdy konstrukt bez RARE nie był indukowany. Aby ustalić, czy ekspresja eRNA sensu i antysensu wzmacniacza związanego z RXR Hoxa1 RAR koreluje z ekspresją mRNA genu, zmierzono również poziom eRNA Hoxa1. Wyniki potwierdziły, że działanie wzmacniacza jest indukowane przez krótkotrwałe leczenie RZS.
Po opanowaniu, to obciążenie pracą można wykonać w ciągu kilku dni, przeprowadzając opisany eksperyment z pułapką wzmacniacza i kwantyfikację wzmacniacza, można dostarczyć silnych dowodów funkcjonalnych na działanie wzmacniacza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować i scharakteryzować karne wzmacniacze. Po zidentyfikowaniu i walidacji wzmacniacza można zastosować inne metody, takie jak przechwytywanie potwierdzenia chromosomów lub CCC, aby odpowiedzieć na dodatkowe ważne pytania, takie jak to, który gen jest regulowany przez zwalidowany wzmacniacz?
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To wideo przedstawia zintegrowany zestaw metod do identyfikacji i walidacji genomowych elementów regulatorowych znanych jako enhancery. Podkreśla adaptacyjność procesu dla różnych systemów modeli komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genomowe elementy regulatorowe
- Identyfikacja enhancerów
- Systemy modeli komórkowych
Tło
- Enhancery odgrywają kluczową rolę w regulacji genów.
- Rozumienie selekcji enhancerów jest niezbędne do badania transkrypcji.
- Różnicowanie komórek i reakcje na bodźce mogą być wpłynięte przez enhancery.
- Analiza ChIP-seq pomaga w identyfikacji kandydatów na enhancery.
Cel badania
- Zapewnienie procesu identyfikacji i walidacji enhancerów.
- Ułatwienie badań nad transkrypcją i regulacją genów.
- Wykazanie adaptacyjności protokołu w różnych modelach komórkowych.
Stosowane metody
- Selekcja kandydatów na enhancery na podstawie danych ChIP-seq.
- Wykorzystanie przeglądarek genomu do analizy miejsc wiązania.
- Eksperymentalna walidacja aktywności enhancerów.
- Adaptacja metod dla różnych systemów komórkowych.
Główne wyniki
- Identyfikacja aktywnych enhancerów w różnych kontekstach.
- Walidacja funkcjonalności enhancerów za pomocą podejść eksperymentalnych.
- Demonstracja wszechstronności procesu.
- Wgląd w użycie enhancerów podczas różnicowania komórek.
Wnioski
- Prezentowany proces jest skuteczny w badaniach nad enhancerami.
- Może być dostosowany dla różnych ustawień eksperymentalnych.
- Identyfikacja enhancerów jest kluczowa dla zrozumienia regulacji genów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate prediction and validation of gene regulatory elements, such as enhancers, are critical for de-risking early discovery and clarifying gene function during cell fate transitions. This workflow integrates ChIP-seq data analysis with functional reporter assays and eRNA quantification, enabling robust target validation and mechanistic insight in disease-relevant stem cell models. The protocol's adaptability supports portfolio-wide application across diverse cellular systems, enhancing translational continuity and predictive confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of functional enhancers regulating gene expression during differentiation.
- Supports mechanistic de-risking by linking regulatory elements to transcriptional outcomes.
- Facilitates functional target validation through quantitative reporter and eRNA assays.
- Improves predictive confidence for gene regulatory hypotheses in stem cell models.
Screening & Assay Development
- Establishes validated reporter assays for enhancer activity measurement in relevant cell types.
- Standardizes quantitative outputs for cross-condition and cross-experiment comparison.
- Enables reproducible screening of regulatory element function under defined stimuli.
- Supports scalable assay development for high-throughput enhancer validation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns enhancer validation with disease-relevant differentiation models for translational insight.
- Provides continuity from discovery-stage regulatory mapping to preclinical functional studies.
- Enables risk-adjusted advancement of gene targets based on validated regulatory control.
- Supports biomarker development through eRNA quantification linked to gene activation.
Pipeline & Workflow Integration
This integrated workflow bridges early discovery, target validation, and preclinical research by combining genomic, molecular, and functional assays in stem cell differentiation systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer function and pathway regulation during cell fate transitions.
- Screening: Provides standardized, quantitative reporter assays for enhancer activity across conditions.
- Analytics: Delivers quantitative luciferase and eRNA readouts for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects regulatory element validation to disease-relevant gene expression changes.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to any cellular model, supporting broad R&D deployment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible, and scalable enhancer validation workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through validated regulatory insights.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene targets based on functional regulatory evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, reporter assays, and quantitative PCR.
- Needs access to ChIP-seq data, genome browsers, and plate-based detection instruments.
- Demands cross-team standardization for assay setup and data analysis.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for transfection efficiency.
- Dependent on quality of genomic annotations and bioinformatics support for region selection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Enhancer Selection Based on ChIP-seq Analysis
1:27
Transfection of Embryonic Stem Cells
3:21
β-Galactosidase and Luciferase Assays
5:19
Characterization of Enhancer RNA and Measurement of eRNA Transcription
6:34
Results: Retinoic Acid Induced Enhancer Activation in Embryonic Stem Cells
8:13
Conclusion
