Name: Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj metody identyfikacji i walidacji enhancerów w komórkach macierzystych przy użyciu analizy ChIP-seq. Protokół umożliwia badanie regulacji transkrypcji podczas różnicowania komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Bence Danielowi, Mattowi Peloquinowi, Dr. Endre Barta, Dr. Balintowi L. Balintowi oraz członkom laboratorium Nagya za dyskusje i komentarze na temat manuskryptu. L.N jest wspierany przez granty z Węgierskiego Funduszu Badań Naukowych (OTKA K100196 i K111941) oraz współfinansowany przez Europejski Fundusz Społeczny i Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego oraz Węgierski Program Badań nad Mózgiem - Grant No. KTIA_13_NAP-A-I/9.

1. Wybór wzmacniacza na podstawie analizy sekwencyjnej chipów
<ol>
	<li>Pobierz plik fastq surowych danych RXR ChIP-seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) z http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/</li>
	<li>Pobierz i rozpakuj wymagany plik indeksu BWA do wyrównania (w naszym przypadku: Mus_musculus_UCSC_mm10). (ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz 
	UWAGA: Odwiedź stronę https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts, aby uzyskać więcej informacji na temat etapów analizy bioinformatycznej i pobrać skrypty używane poniżej.</li>
	<li>Dopasuj przykładowy plik fastq do genomu mm10 (użyj skryptu: perform_alignment.sh). Spowoduje to utworzenie folderu z plikiem .bam i statystykami wyrównania. Wyrównane dane RXR ChIP-seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam) i odpowiadający im plik indeksu (.bai) są dostępne tutaj: 
	http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ 
	UWAGA: BWA to pakiet oprogramowania, który dopasowuje stosunkowo krótkie sekwencje (np. wyniki sekwencji ChIP) do bazy danych sekwencji, takiej jak genom referencyjny myszy (np. mm10) 13.</li>
	<li>Uruchom skrypt (callpeaks.sh) w celu wywołania piku i analizy motywu de novo. Użyj pliku .bam jako danych wejściowych. Skrypt jest oparty na Homer findPeaks 14. 
	UWAGA: Pliki wyjściowe dostarczają nam informacji o całkowitej liczbie szczytów, wzbogaceniu motywów, procentowym udziale tła oraz docelowych sekwencjach z motywami itp. (Rysunek 1). Zazwyczaj kilka motywów jest wymienionych w kolejności ich znaczenia.</li>
	<li>Zmień mapowanie motywu rangi #1 (NR połowa 'AGGTCA') (użyj skryptu: remap_motif.sh) 
	UWAGA: W rezultacie skrypt generuje plik .bed, który pokaże, które piki ChIP pokrywają regiony genomu, które zawierają kanoniczne miejsce wiązania interesującego czynnika transkrypcyjnego.</li>
	<li>Pobierz i zwizualizuj wyniki wyrównanych odczytów RXR ChIP-seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (pobierz również plik .bai)) oraz wystąpień motywu AGGTCA (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) za pomocą przeglądarki Integrative Genomics Viewer (IGV)15 w celu zidentyfikowania przypuszczalnych miejsc wiązania RAR/RXR (Rysunek 2 i Rysunek 3). 
	UWAGA: Integracja różnych danych ChIP-seq pomoże w dokładniejszym przewidywaniu dobrych kandydatów na wzmacniacze16,17. Ostatnie badania wykazały, że aktywne wzmacniacze są zazwyczaj wzbogacone o P300 i korelują z H3K4me1 i H3K27ac i są zlokalizowane w otwartych regionach chromatyny, co oznacza, że nadwrażliwość na DNazę-I jest również zalecana 18-21.</li>
	<li>Użyj opcji "Zdefiniuj region zainteresowania" w IGV 15, aby uzyskać sekwencję 200 - 400 pz wybranego regionu genomowego i wykorzystać te sekwencje do kolejnych projektów starterów.</li>
</ol>
2. Test reporterowy
UWAGA: System lucyferyna/lucyferazy jest używany jako bardzo czuły test reporterowy do regulacji transkrypcji. W zależności od aktywności wzmacniacza wytwarzany jest enzym lucyferazy, który katalizuje utlenianie lucyferyny do oksylucyferyny, co prowadzi do bioluminescencji, którą można wykryć. W pierwszym kroku zidentyfikowane przypuszczalne sekwencje wzmacniacza powinny zostać sklonowane do wektora reporterowego (np. TK-Lucyferazy 22, pGL3 lub NanoLuc).
<ol>
	<li>Projekt podkładu
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery PCR do amplifikacji 200 - 400 pz przypuszczalnych regionów wzmacniających za pomocą Primer3 (dostępne tutaj: http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23</li>
		<li>Skopiuj i wklej sekwencję genomową z IGV, która zawiera przypuszczalne miejsce wiązania, do Primer3 (patrz krok 1.7). Ustaw zakres rozmiarów produktu na 250 - 300 pz w Primer3.</li>
		<li>Walidacja starterów PCR za pomocą narzędzia In silico PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) UCSC Genome Browser ()24 
		UWAGA: Ten protokół w późniejszym kroku wykorzystuje enzymy restrykcyjne HindIII i BamHI do klonowania. Sprawdź, czy amplifikowana sekwencja PCR zgodnie z przewidywaniami narzędzia UCSC In-silico PCR będzie zawierać miejsca restrykcyjne AAGCTT lub GGATCC (np. http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).</li>
		<li>Uzyskaj wymagane startery od komercyjnego dostawcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikacja PCR sekwencji wzmacniacza z genomowego DNA
	<ol>
		<li>Oczyść matrycowe genomowe DNA z komórek pierwotnych (np. pierwotnych fibroblastów embrionalnych). Użyj komercyjnego zestawu do izolacji gDNA i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Wysoka jakość gDNA jest niezbędna do udanej amplifikacji PCR. Odpowiednie klony BAC mogą być stosowane, jeśli PCR nie jest łatwy od gDNA.</li>
		<li>Przygotować 50 μl reakcji PCR zawierającej 100 ng gDNA, 5 μl 10x buforu, 3 μlMgSO4 (25 mM), 5 μl dNTP (po 2 mM), 1,5 μl startera Fwd (10 μM), 1,5 μl Rev startera (10 μM), 1 μl polimerazy DNA 
		UWAGA: Użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności z niskim poziomem błędów dla reakcji PCR.</li>
		<li>Ustaw cykl PCR (2 min 95 °C, (20 s 95 °C, 10 s 58 - 65 °C, 18 s 70 °C) x25 powtórz, 2 min 70 °C, na zawsze 4 °C). Ustawić temperaturę wyżarzania z uwzględnieniem przewidywanych wartości Tm podkładu.</li>
		<li>Oczyść produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Wprowadzić miejsca ograniczenia do klonowania, powtarzając PCR ze starterami, jak użyto powyżej, ale dodając zwisy na ich końcach 5' (np. Fwd: 5'-ATAT AAGCTTxxxxxxxxxxx-3' (HindIII), Rev: 5'-TATAGGATCCxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3' (BamHI)).</li>
		<li>Uruchom 5 μl produktu PCR na żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy nie ma niespecyficznych produktów PCR. 
		UWAGA: Jeśli zostanie wykrytych więcej prążków, uruchom cały produkt PCR i oczyść odpowiednią prążek za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ograniczenie 
	UWAGA: Aby sklonować ininsert przed promotorem TK22, oczyszczony produkt PCR i wektor (np. TK-Luc) należy roztrawić za pomocą HindIII i BamHI.
	<ol>
		<li>Przygotować 50 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 μg oczyszczonego produktu PCR, 1 μl HindIII (20 U/μl), 1 μl BamHI (20 U/μl) i 5 μl 10x buforu.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną o objętości 250 μl zawierającą 5 μg wektora (TK Luc lub alternatywny wektor reporterowy), 5 μl HindIII (20 U/μl), 5 μl BamHI (20 U/μl), 5 μl termoczułej fosfatazy alkalicznej (1 U/μl) i 25 μl 10x bufor. 
		UWAGA: Traktowanie wektora AP znacznie zmniejsza samoligację pojedynczo strawionego wektora, a tym samym tła.</li>
		<li>Mieszaniny reakcyjne inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie oczyścić strawione produkty PCR i wektor za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ligacji
	<ol>
		<li>Przygotuj reakcję do ligacji w probówkach PCR, w tym 2 μl 10x bufor ligazy DNA T4, wektor TK-Luc 10 ng, inserta 50 ng (strawiony produkt PCR), 1 μl ligazy DNA T4 (400 U/μl) i woda wolna od nukleaz do 20 μl. 
		UWAGA: Przygotować kontrolę ujemną, w której reakcja nie zawiera wstawki.</li>
		<li>Delikatnie wymieszać reakcję, pipetując w górę i w dół, krótko odwirować probówki do PCR za pomocą miniwirówki, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie schłodzić na lodzie i użyć 5 μl produktu do przemiany w 50 μl kompetentnych komórek (np. DH5α).</li>
		<li>Użyj standardowej procedury szoku cieplnego, aby przekształcić bakterie, zebrać kolonie i wyizolować plazmidowe DNA za pomocą komercyjnego zestawu. Zweryfikuj wszystkie konstrukcje, sekwencjonując przed kolejnymi krokami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja komórek ES
	<ol>
		<li>Używaj płytek 48-dołkowych. Dodać 200 μl 0,1% roztworu żelatyny/basenik 30 minut przed posiewem komórek.</li>
		<li>Płytki z embrionalnych komórek macierzystych (ES) na dzień przed transfekcją. Stosować bezpodajnikowe komórki ES i płytkę o gęstości 3 x 104 komórki na studzienkę w 250 μl pożywki ES / studzienkę.</li>
		<li>Przygotuj mieszaniny plazmidów (każda mieszanina jest obliczana dla 8 dołków, 4 niepoddanych działaniu i 4 traktowanych kwasem retinowym). Mix 1: 1,250 ng TK-Luc Pusty (kontrola ujemna), 950 ng wektor kodujący β-galaktozydazę (βGal), Mix 2: 1,250 ng wzmacniacz TK-Luc Hoxa1 (kontrola pozytywna), 950 ng βGal, Mix 3: 1,250 ng wzmacniacz TK-Luc PRMT8 (obszar zainteresowania), 950 ng βGal. 
		UWAGA: Komórki ES wyrażają pożądane czynniki transkrypcyjne (RAR / RXR). Pozostaw studzienki nietransfekowane, aby określić wartości zasad później podczas pomiarów lucyferazy i β-galaktozydazy.</li>
		<li>Dodaj pożywkę surowicy o obniżonej jakości transfekcji do każdej mieszaniny plazmidów do 106 μl całkowitej objętości (wystarcza na 8 dołków).</li>
		<li>Dodać 4,5 μl odczynnika do transfekcji o jakości ES, a następnie dokładnie wymieszać, pipetując 15 razy w górę i w dół. Inkubować mieszaninę transfekcyjną przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 13 μl mieszanki transfekcyjnej do komórek w każdym dołku, dokładnie wymieszać pipetując. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze (37 °C) O/N przed poddaniem działaniu liganda.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć pożywkę przez aspirację z komórek i dodać 250 μl świeżej pożywki/studzienki zawierającej 0,01 - 1 μM kwasu all-trans-retinowego (RA) jako stężenie końcowe lub DMSO jako nośnik. Inkubuj komórki przez 24 - 48 godz. 
		UWAGA: Kwas retinowy jest wrażliwy na światło.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie lizatów komórkowych
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 5x bufor do lizy (1,25 ml 0,5 M Tris pH = 7,8, 1 ml 1 M ditiotreitol (DTT) (w H2O), 10 ml 0,1 M EDTA pH = 8,0, 50 ml glicerolu, 5 ml Triton X-100, sterylna woda do 100 ml) do 1x za pomocą sterylnej wody, dodać 20 μl 1 M DTT/10 ml i zrównoważyć do RT przed użyciem. Przygotować 10 ml na płytkę 48-dołkową w dniu testu.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć pożywkę przez aspirację z komórek. Wypłucz komórki raz 1x PBS. Dodaj 200 μl 1x bufor do lizy/studzienki bezpośrednio do komórek.</li>
		<li>Wstrząsać przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Zamrozić lizaty komórkowe na płytce w temperaturze -80 °C (liza mechaniczna). Lizaty można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka dni.</li>
		<li>Rozmrozić lizaty. Po całkowitym rozmrożeniu przenieś lizaty komórek na 96-dołkową płytkę za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej. Przenieść 80 μl lizatu komórkowego na 96-dołkową przezroczystą płytkę do testu β-galaktozydazy i 40 μl lizatu komórkowego na białą płytkę w celu pomiaru lucyferazy. Unikaj tworzenia się pęcherzyków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test β-galaktozydazy 
	UWAGA: Beta galaktozydaza lub alternatywne drugie reportery powinny być stosowane jako kontrola wewnętrzna w celu uwzględnienia niespecyficznych zmian eksperymentalnych.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor substratu β-galaktozydazy: 80,0 g Na2HPO4•7H2O, 3,8 g NaH2PO4•H2O, 30,0 g KCl, 1,0 g MgSO4•7H2O, uzupełnić do 1 000 ml sterylną wodą. Dostosuj pH do 7,4. Filtr Sterylizuj (0,2 mikrona) i przechowuj w temperaturze 4 °C</li>
		<li>Zmieszać 1 ml buforu substratowego β-galaktozydazy z 4 mg ONPG (o-nitrofenylo-β-D-galaktozydazy). Dodać 3,5 μl 2-merkaptoetanolu (βME) na 1 ml buforu tuż przed użyciem. Dodać 100 μl buforu substratowego β-galaktozydazy do 80 μl lizatu komórkowego.</li>
		<li>Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C aż do uzyskania słabego żółtego zabarwienia. Odczyt absorbancji przy średnicy zewnętrznej 420 nm na czytniku płytek i eksport danych. 
		UWAGA: Czas różni się w zależności od wydajności transfekcji, zwykle nie dłużej niż 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test lucyferazy
	<ol>
		<li>Przygotować 50 ml odczynnika substratowego lucyferyny: 15,1 mg soli D-lucyferyny, 82,7 mg soli ATP, 185 mg MgSO4•7H2O, dodać do 50 ml probówki polipropylenowej, następnie dodać 1,5 ml 1 M buforu HEPES, 48,5 ml wody wolnej od ATP, wirować, upewnić się, że wszystkie związki całkowicie się rozpuszczą. Przechowywać 5-10 ml porcji w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Przed rozpoczęciem ogrzej 5 ml odczynnika substratowego lucyferyny do RT. Odpipetować 100 μl odczynnika substratowego do każdej studzienki białej płytki zawierającej 40 μl lizatu komórkowego i natychmiast zmierzyć sygnał za pomocą licznika luminescencyjnego.</li>
		<li>Wykonaj zadania z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów w potrójnych transfekcjach.</li>
		<li>Oblicz najpierw podstawową znormalizowaną aktywność lucyferazy i znormalizowane wartości zasady β-galaktozydazy dla każdej studzienki, odejmując średnie wartości zmierzone dla komórek nietransfekowanych od każdej mierzonej wartości. Następnie oblicz stosunek aktywności lucyferazy do β-galaktozydazy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka RNA wzmacniacza
UWAGA: Bardziej bezpośredni wskaźnik aktywności wzmacniacza wyłonił się z ostatnich badań całego genomu, które zidentyfikowały wiele krótkich, niekodujących RNA, o rozmiarach od 50 do 2000 nt, które są transkrybowane ze wzmacniaczy i są określane jako wzmacniające RNA (eRNA)16,25,26 (Rysunek 4). Indukcja eRNA silnie koreluje z indukcją sąsiednich genów kodujących egzony. W ten sposób zależną od sygnału aktywność wzmacniacza można określić ilościowo in vivo, porównując produkcję eRNA w różnych warunkach za pomocą RT-qPCR.
<ol>
	<li>Wytyczne dotyczące projektowania starterów do wykrywania eRNA za pomocą RT-qPCR
	<ol>
		<li>Wybierz regiony genomowe do pomiarów eRNA, które są oddalone o co najmniej 1,5 - 2 kb od miejsc rozpoczęcia transkrypcji z adnotacjami. 
		UWAGA: Co ważne, wysokie poziomy transkrypcji mRNA w wzmacniaczach wewnątrzgenowych uniemożliwiają dokładną kwantyfikację eRNA w orientacji zmysłowej, antysensowne eRNA w wzmacniaczach wewnątrzgenowych są wykrywalne i mają podobny poziom do eRNA w wzmacniaczach pozagenowych.</li>
		<li>Zgodnie z ogólną zasadą, należy używać regionów 200 - 1,000 pz od środka interesującego miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego do projektowania startera na nici sensownej lub antysensownej (Figura 4 i Figura 6). 
		UWAGA: Jeśli dostępne są dane GRO-seq, DNase-seq, H3K4me1, H3K4me3 lub H3K27ac ChIP-seq z żądanych typów ogniw i warunków, można je wykorzystać do dokładniejszego projektowania starterów. eRNA są transkrybowane z przypuszczalnych regionów wzmacniających charakteryzujących się wysokimi poziomami H3K4me1 i me3. Ekspresja eRNA dodatnio koreluje ze wzbogaceniem znakowania histonów aktywowanego wzmacniacza H3K27ac.</li>
		<li>Zaprojektuj startery PCR do pomiaru eRNA na bazie barwnika fluorescencyjnego RT-qPCR za pomocą Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23Wygeneruj sekwencję antysensowną (odwrotne uzupełnienie nici sensownej) do projektowania startera zgodnie z: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Wstaw 200 - 300 pz sekwencji sensownej lub antysensownej do projektowania podkładu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar transkrypcji eRNA
	<ol>
		<li>Wyizolować całkowite RNA z leczonych komórek za pomocą dostępnego w handlu odczynnika ekstrakcyjnego na bazie kwaśnego fenolu/chloroformu zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
		<li>Użyj DNazyI do leczenia wyizolowanego RNA przed użyciem ich w reakcji odwrotnej transkrypcji. Dezaktywuj DNazę zgodnie z zaleceniami producenta przed odwrotną transkrypcją.</li>
		<li>Zmierz stężenie RNA po leczeniu DNazą I i użyj 1,000 ng na reakcję RT. Użyj wysokiej jakości odwrotnej transkryptazy. 
		UWAGA: Ponieważ duża liczba eRNA może nie być poliadenylowana, odwrotna transkrypcja wymaga użycia losowych starterów.</li>
		<li>Wykryj odwrotną transkrypcję eRNA za pomocą RT-qPCR przy użyciu standardowej procedury. Zmierz mRNA niezależnego od leczenia w celu normalizacji (np. 36B4, Ppia, Gapdh, Actb).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distal+enhancers%3A+new+insights+into+heart+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Distal enhancers: new insights into heart development and disease.</a> Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).</li>
<li>Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers%3A+five+essential+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancers: five essential questions.</a> Nat Rev Genet. 14, 288-295 (2013).</li>
<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+welcome+to+the+new+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: welcome to the new frontier.</a> Nature methods. 4, 613-614 (2007).</li>
<li>Muller, F., Tora, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+DNA+sequences+in+defining+promoters+for+transcription+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation.</a> Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).</li>
<li>Ounzain, S., Pedrazzini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+enhancer-associated+long+noncoding+RNAs+in+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration.</a> Trends Cardiovasc Med. , (2015).</li>
<li>Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+RNAs+and+regulated+transcriptional+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs.</a> Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).</li>
<li>Dickel, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function-based+identification+of+mammalian+enhancers+using+site-specific+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration.</a> Nature methods. 11, 566-571 (2014).</li>
<li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle%3A+the+role+of+MyoD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li>
<li>Vermunt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+coregulated+enhancer+networks+in+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports+9%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain.</a> Cell reports 9. , 767-779 (2014).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Mahony, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-dependent+dynamics+of+retinoic+acid+receptor+binding+during+early+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis.</a> Genome Biol. 12 (R2), (2011).</li>
<li>Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+retinoic+acid+receptor+signaling+coordinates+lineage+commitment+of+spontaneously+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells+in+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies.</a> FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38, 576-589 (2010).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29, 24-26 (2011).</li>
<li>Daniel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+active+enhancer+network+operated+by+liganded+RXR+supports+angiogenic+activity+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages.</a> Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+enhancer+transcription+and+activity+from+chromatin+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications.</a> Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).</li>
<li>Visel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457, 854-858 (2009).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+predictive+chromatin+signatures+of+transcriptional+promoters+and+enhancers+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 311-318 (2007).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470, 279-283 (2010).</li>
<li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44, 148-156 (2012).</li>
<li>Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+DNA-binding+and+transcriptional+activation+functions+in+the+human+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor.</a> Cell. 49, 39-46 (1987).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40, e115(2012).</li>
<li>Rhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+Genome+Browser+database%3A+update+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The UCSC Genome Browser database: update 2010.</a> Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transcription+at+neuronal+activity-regulated+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers.</a> Nature. 465, 182-187 (2010).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+transcription+by+distinct+classes+of+enhancers+functionally+defined+by+eRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA.</a> Nature. 474, 390-394 (2011).</li>
<li>Simandi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+and+PRMT8+regulate+retinoic+acid-dependent+neuronal+differentiation+with+implications+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology.</a> Stem Cells. 33, 726-741 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ostatnich latach postępy w technologii sekwencjonowania umożliwiły przewidywanie na dużą skalę wzmacniaczy w wielu typach komórek i tkanek 7-9. Opisany powyżej przepływ pracy pozwala na przeprowadzenie podstawowej charakterystyki potencjalnych wzmacniaczy wybranych na podstawie danych ChIP-seq. Szczegółowe kroki i notatki pomogą każdemu skonfigurować rutynową walidację wzmacniacza w laboratorium.
Najbardziej krytycznym krokiem w teście reporterowym lucyferazy jest wydajność transf...

Rozwój organizmu wielokomórkowego wymaga precyzyjnie regulowanej ekspresji tysięcy genów w rozwijających się tkankach. Regulacja ekspresji genów odbywa się w dużej mierze za pomocą wzmacniaczy. Wzmacniacze to krótkie, niekodujące elementy DNA, które mogą być wiązane z czynnikami transkrypcyjnymi (TF) i działać na odległość, aby aktywować transkrypcję docelowego genu1. Wzmacniacze są na ogół cis-działające i najczęściej znajdują się tuż przed miejscem rozpoczęcia transkrypcji (TSS), ale ostatnie badania opisały również przykłady, w których wzmacniacze znaleziono znacznie dalej, na 3' genu lub nawet w intronach i eksonach2. 
W genomach kręgowców znajdują się setki tysięcy potencjalnych wzmacniaczy1. Najnowsze metody oparte na immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dostarczają danych o wysokiej przepustowości całego genomu, które można wykorzystać do analizy wzmacniaczy3-9. Chociaż dane uzyskane w eksperymentach ChIP-seq znacznie zwiększają prawdopodobieństwo identyfikacji wzmacniaczy specyficznych dla komórek i tkanek, ważne jest, aby pamiętać, że wykryte miejsca wiązania niekoniecznie identyfikują bezpośrednie wiązanie DNA i / lub wzmacniacze funkcjonalne. W związku z tym niezbędna jest dalsza analiza funkcjonalna nowo zidentyfikowanych wzmacniaczy. W tej pracy przedstawiamy podstawowy, trzyetapowy proces identyfikacji i walidacji domniemanego aktywnego wzmacniacza. Obejmuje to: 1) wybór przypuszczalnych miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego za pomocą analizy bioinformatycznej danych ChIP-seq, 2) klonowanie i walidację tych sekwencji regulatorowych w konstruktach reporterowych oraz 3) pomiar wzmacniającego RNA (eRNA). 
Ekspozycja embrionalnych komórek macierzystych (ES) na kwas retinowy (RA) jest często wykorzystywana do promowania różnicowania neuronalnego komórek pluripotencjalnych 10. RZS wywiera swoje działanie poprzez wiązanie się z receptorami RA (RARα, β, γ) i receptorami retinoidów X (RXRα, β, γ). RAR i RXR w postaci heterodimeru wiążą się z motywami DNA zwanymi elementami odpowiedzi RA, które są zwykle ułożone jako bezpośrednie powtórzenia sekwencji AGGTCA (zwane jako miejsce połowiczne) i regulują transkrypcję. Eksperymenty z użyciem ligandów pozwoliły na identyfikację kilku genów regulowanych kwasem retinowym w komórkach ES 11,12. Jednak elementy wzmacniające wiele z tych genów nie zostały jeszcze opisane. Aby zademonstrować, w jaki sposób opisany tutaj przepływ pracy może być wykorzystany do identyfikacji i walidacji wzmacniaczy, pokazujemy krok po kroku wybór i charakterystykę dwóch wzmacniaczy zależnych od kwasu retinowego w embrionalnych komórkach macierzystych.

<table><tbody><tr><td>Polimeraza DNA KOD</td><td>Merck Millipore</td><td>71085-3</td><td>do amplifikacji PCR wzmacniacza z gDNA</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Zestaw chusteczek&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>do izolacji genomowego DNA</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>do oczyszczania produktu PCR</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>do ekstrakcji żelu, jeśli jest więcej produktu PCR</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R3104L</td> enzym <td>restrykcyjny</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>Enzym restrykcyjny</td><td>R3136L</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>uwalnianie grup 5'- i 3'-fosforanowych z DNA</td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>do ligacji</td></tr><tr><td>QIAprep Zestaw Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>do izolacji plazmidu</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>ES media</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>ES media</td></tr><tr><td>MEM Aminokwas endogenny</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>ES media</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>ES media</td></tr><tr><td>Beta Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>ES Media</td></tr><tr><td>FuGENE HD&nbsp;</td><td>Odczynnik do transfekcji</td> <td>Promega</td><td>E2311</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; I Reduced Serum</td><td>Medium Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>do transfekcji</td></tr><tr>Ligand<td>kwasu all-trans retinowego</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>, do aktywacji 96-dołkowej przezroczystej płytki RAR / RXR</td></tr><tr><td></td><td>655101</td><td></td><td>do testu beta galaktozydazy</td></tr><tr><td>96-dołkowa biała płytka</td><td>Greinera</td><td>655075</td><td>do testu lucyferazy</td></tr><tr><td>D-lucyferyna, sól potasowa</td><td>Goldbio.com</td><td>115144-35-9</td><td>do testu lucyferazy</td></tr><tr><td>sól ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699-1G</td><td>do testu lucyferazy</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>do testu lucyferazy</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td>do testu lucyferazy</td></tr><tr><td>Na2HPO4 &#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>431478-50G</td><td>do testu beta galaktozydazy</td></tr><tr><td>NaH2PO4 &#8226; H2O</td><td>Sigma</td><td>S9638-25G</td><td>do testu beta galaktozydazy</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>do testu beta galaktozydazy</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td>do testu beta galaktozydazy</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrofenylo-&beta;-D-galaktozydaza)</td><td>Sigma</td><td>N1127-1G</td><td>do testu beta galaktozydazy</td></tr><tr><td>TRIzol&reg;</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>Izolacja RNA</td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności Life</td><td>Technologies</td><td>4368814</td><td>odwrotną transkrypcję eRNA</td></tr><tr><td>Dnazy bez rnazy</td><td>Leczenie Dnazy</td><td>Promega</td><td>M6101</td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green</td><td>BioRad</td><td>750000105</td><td>RT-qPCR mastermix</td></tr><tr><td>CFX384 Touch&trade; System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym Maszyna</td><td>BioRad</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek BioTek Synergy 4</td><td>Licznik luminescencyjny</td> <td>BioTek</td><td></td></tr></tbody></table>

przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Rozwój embrionalny to wieloetapowy proces obejmujący aktywację i represję wielu genów. Wiadomo, że elementy wzmacniające w genomie przyczyniają się do specyficznej dla tkanek i typów komórek regulacji ekspresji genów podczas różnicowania komórkowego. Dlatego ich identyfikacja i dalsze badania są ważne, aby zrozumieć, w jaki sposób determinowany jest los komórki. Integracja danych dotyczących ekspresji genów (np. mikromacierzy lub sekwencji RNA) oraz wyników badań całego genomu opartych na immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) umożliwia identyfikację tych regionów regulatorowych na dużą skalę. Jednak walidacja funkcjonalna wzmacniaczy specyficznych dla typu komórkowego wymaga dalszych procedur eksperymentalnych in vitro i in vivo. Tutaj opisujemy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i weryfikowane eksperymentalnie. Protokół ten zapewnia przepływ pracy krok po kroku, który obejmuje: 1) identyfikację regionów regulatorowych za pomocą analizy danych ChIP-seq, 2) klonowanie i eksperymentalną walidację przypuszczalnego potencjału regulacyjnego zidentyfikowanych sekwencji genomowych w teście reporterowym oraz 3) określenie aktywności wzmacniacza in vivo poprzez pomiar poziomu transkryptu wzmacniającego RNA. Prezentowany protokół jest na tyle szczegółowy, że każdy może skonfigurować ten przepływ pracy w laboratorium. Co ważne, protokół może być łatwo zaadaptowany i wykorzystany w dowolnym systemie modelu komórkowego.

Użyliśmy przeciwciała pan-specyficznego przeciwko RXR, aby zidentyfikować w skali całego genomu geny regulowane przez RA, które wykazują wzbogacenie receptora w ich bezpośrednim sąsiedztwie. Analiza bioinformatyczna danych RXR ChIP-seq uzyskanych z komórek ES traktowanych kwasem retinowym ujawniła wzbogacenie połowy miejsca wiążącego receptor jądrowy (AGGTCA) w obrębie miejsc zajmowanych przez RXR (Rysunek 1). Przy użyciu algorytmu bioinformatycznego przypisaliśmy wynik w...

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

Ogólnym celem tego filmu jest przedstawienie zintegrowanego zestawu metod służących do identyfikacji i eksperymentalnej walidacji genomowych elementów regulacyjnych, nazywanych enhancerami. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące transkrypcji i regulacji zdarzeń biologicznych, w tym wyboru i wykorzystania enhancerów podczas różnicowania komórek lub w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne. Główną zaletą prezentowanego schematu postępowania jest możliwość łatwego dostosowania i zastosowania protokołu w dowolnych modelowych systemach komórkowych.Przedstawię kroki postępowania. W pierwszej kolejności należy wybrać potencjalny enhancer na podstawie istniejącej analizy chip seq. Użyj przeglądarki genomu, aby przejrzeć wyniki wybranego eksperymentu chip seq i zidentyfikować miejsca wiązania w sąsiedztwie interesującego nas genu.Wybierz opcję Define a Region of Interest, aby uzyskać sekwencję od 200 do 400 par zasad wybranego regionu genomowego, a następnie wykorzystaj te sekwencje do późniejszego projektowania starterów. Przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej amplifikuj i sklonuj wybrany region genomowy do konstruktu plazmidu reporterowego. Aby przetestować aktywność enhancera, przetransformuj konstrukty reporterowe do embrionalnych komórek macierzystych myszy, dodając najpierw 200 µL 0,1% roztworu żelatyny na każdą studzienkę płytek 48-dołkowych.Inkubować płytki przez 30 minut przed wysiewaniem. Dzień przed transfekcją wysiać embrionalne komórki macierzyste (ES) w warunkach bezkomórkowych (feeder-free) w 250 µL pożywki ES w zagęszczeniu 3 × 10⁴ komórek na dołek. W dniu transfekcji przygotować mieszaniny plazmidów w ilości wystarczającej dla ośmiu dołków z każdej mieszaniny.Do każdej mieszaniny plazmidów dodać medium z redukowaną zawartością surowicy do transfekcji, aby zwiększyć objętość do 106 µL. Następnie dodać 4,5 µL odczynnika do transfekcji klasy ES i ostrożnie wymieszać, pipetując 15 razy w górę i w dół. Inkubować mieszaninę do transfekcji przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji dodaj do każdej studzienki 13 µL mieszaniny do transfekcji i dokładnie wymieszaj za pomocą pipety. Następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze na noc przed traktowaniem porostem. Wydajność transfekcji jest krytycznym etapem.W przypadku zastosowania innego typu komórek, ten etap wymaga optymalizacji. Aby zminimalizować efekty zależne od kontekstu, należy użyć typu komórek najbardziej odpowiedniego do badania aktywności enhansera. Następnego dnia należy ostrożnie usunąć pożywkę poprzez aspirację, a następnie dodać 250 µL świeżej pożywki na studzienkę, zawierającej 1 µM kwasu retinowego w formie all-trans lub DMSO jako nośnika.Inkubuj komórki przez 24-48 godzin. Po przygotowaniu buforu do lizy zgodnie z protokołem tekstowym, ostrożnie odessij pożywkę z komórek. Przemyj komórki raz za pomocą 1X PBS, a następnie dodaj 200 µL 1X buforu do lizy na każdą studniom.Wstrząsaj komórki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie, w celu całkowitej lizy komórek, zamroź lizaty komórkowe w płytce w temperaturze -80 °C. Po całkowitym rozmrożeniu lizatów, za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej przenieś 80 µL lizatu komórkowego do przezroczystej płytki 96-dołkowej w celu oznaczenia beta-galaktozydazy oraz 40 µL lizatu do białej płytki w celu pomiaru lucyferazy.Aby przeprowadzić test na beta-galaktozydazę, wymieszaj jeden mililitr buforu do podłoża beta-gal z czterema miligramami OMPG. Następnie dodaj do mieszaniny 3,5 µL beta-merkaptoetanolu i niezwłocznie dodaj 100 µL buforu do 80 µL lizatu komórkowego. Inkubuj reakcje w temperaturze 37 °C do momentu pojawienia się słabej żółtej barwy.Odczytaj absorbancję przy 420 nanometrach za pomocą czytnika płytek i wyeksportuj dane. Aby przeprowadzić test lucyferazowy, po przygotowaniu odczynnika substratowego zgodnie z protokołem tekstowym, przed rozpoczęciem ogrzej odczynnik substratowy lucyferazy do temperatury pokojowej. Następnie pipetuj 100 mikrolitrów do każdej studni białej płytki zawierającej 40 mikrolitrów lizatu komórkowego.Należy niezwłocznie użyć licznika luminescencyjnego, aby zmierzyć sygnał. Wyniki aktywności należy uzyskać z co najmniej trzech niezależnych transfekcji i eksperymentów. Obliczenia dla obu analiz należy przeprowadzić zgodnie z protokołem tekstowym.Aby zaprojektować startery do detekcji eRNA metodą RTCPR, należy wybrać region genomowy oddalony o co najmniej 1,5 do 2 kb od jakichkolwiek adnotowanych transkryptów genów. Należy określić wzglupowy kierunek genu oraz ustalić położenie transkryptów sensownych i antysensownych. W celu zaprojektowania starterów do kwantyfikacji RNA enhancera, należy wybrać regiony oddalone o 200–1 000 par zasad od centrum miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego.Jeśli gen znajduje się na nici minus, skopiuj 200-300 par zasad nici dodatniej i przekształć sekwencję, aby uzyskać sekwencję odwrotnej komplementarności. Następnie użyj tej sekwencji do dalszego projektowania starterów. Ustaw zakres wielkości produktu (Product Size Range) na 80-150 par zasad.Aby zmierzyć transkrypcję eRNA, po wyizolowaniu całkowitego RNA z komórek poddanych działaniu preparatu zgodnie z protokołem tekstowym, należy wykryć odwrocie transkrybowane eRNA metodą RT-qPCR zgodnie ze standardową procedurą. W celu normalizacji należy zmierzyć poziom mRNA niezależnego od zastosowanej kuracji. Jak pokazano tutaj, analiza bioinformatyczna danych RXR chip-seq uzyskanych z komórek ES traktowanych kwasem retinowym wykazała wzbogacenie półmiejsca receptora jądrowego w obrębie miejsc zajętych przez RXR.Przy użyciu algorytmu bioinformatycznego wyniki wyszukiwania motywów dla półwitryny zostały odwzorowane z powrotem na dane z sekwencjonowania ChIP dla RXR. Analiza ta pozwoliła zidentyfikować piki ChIP pokrywające się z kanonicznymi miejscami wiązania receptorów jądrowych. Wizualizacja tych miejsc w programie IGV wykazała wzbogacenie czynników transkrypcyjnych w pobliżu Hoxa1.Wcześniej scharakteryzowany cel RAR RXR. Zidentyfikowano również wzmacniacz dla nowej ścieżki celu RA, PRMT8. Zidentyfikowane regiony wzmacniające sklonowano do wektora reporterowego lucyferazy TK, a następnie ESy transfekowano tymi konstruktami.Aktywność lucyferazy mierzono w obecności i w nieobecności RA. Konstrukty zawierające element odpowiedzi na RA (RARE) wykazały zwiększoną intensywność sygnału lucyferazy po traktowaniu RA, podczas gdy konstrukt pozbawiony RARE nie uległ indukcji. Aby ustalić, czy ekspresja eRNA w sensie i antysensie wzmacniacza Hoxa1 związanego z RAR RXR koreluje z ekspresją mRNA genu, zmierzono również poziom eRNA Hoxa1. Wyniki potwierdziły, że aktywność wzmacniacza jest indukowana przez krótkotrwałe traktowanie RA.Po opanowaniu tej procedury, opisany eksperyment pułapki enhancerów oraz kwantyfikacja enhancerów można przeprowadzić w ciągu kilku dni, co pozwala na dostarczenie silnych dowodów funkcjonalnych na aktywność enhancerów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak identyfikować i charakteryzować enhancery karne. Gdy enhancer zostanie zidentyfikowany i zwalidowany, można zastosować inne metody, takie jak chromosomalne potwierdzenie przechwytywania (chromosomal confirmation capture, CCC), aby odpowiedzieć na dodatkowe istotne pytania, na przykład: który gen jest regulowany przez zwalidowany enhancer?

prediction-validation-gene-regulatory-elements-activated-during

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Opisujemy test z reporterem fluorescencyjnym służący do szybkiej identyfikacji i charakterystyki genów regulujących utrzymanie oraz samoodnawianie embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Analiza reporterowa Oct4GiP w celu badania genów regulujących utrzymanie i samoodnawianie macierzystych komórek embrionalnych myszy

Film demonstruje metodę indukowania różnicowania komórek macierzystych w progenitory nerwowe za pomocą kwasu retinowego i metody hodowli wiszącej kropli.

Różnicowanie komórek ciała zarodka w progenitory nerwowe za pomocą kwasu retinowego

Ten film demonstruje technikę oceny aktywności kwasu retinowego w zarodkach myszy. Po wyizolowaniu komórek z zarodków myszy, komórki są hodowane wspólnie z komórkami reporterowymi kwasu retinowego (RA). Komórki embrionalne wytwarzają RZS, który indukuje ekspresję beta-galaktozydazy w komórkach reporterowych, wskazując na aktywność RA w komórkach embrionalnych.

Wykorzystanie komórek reporterowych w kokulturze do badania produkcji kwasu retinowego przez komórki embrionalne myszy

Reporterowe linie komórkowe oferują sposób na wizualizację, śledzenie i izolowanie interesujących komórek z heterogenicznych populacji. Jednak celowanie w geny za pomocą konwencjonalnej rekombinacji homologicznej w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych jest wyjątkowo nieefektywne. W tym miejscu opisujemy celowanie w locus czynnika transkrypcyjnego PITX3 specyficznego dla OUN za pomocą EGFP przy użyciu rekombinacji homologicznej wzmocnionej nukleazą palca cynkowego.

Ukierunkowanie genów na nukleazę palca cynkowego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Manipulowanie czasową ekspresją genów w różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) można osiągnąć za pomocą indukowalnych systemów genetycznych. Jednak wytwarzanie tych linii komórkowych jest kosztowne i czasochłonne. Protokół ten zapewnia szybką ekspresję transgenu w różnicujących się komórkach pochodzących z ES, a następnie analizę dalszego różnicowania układu krwiotwórczego.

Zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które są zaangażowane w ostateczną endodermę w celu poprawy dalszych zastosowań i dalszego różnicowania.

Szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Metody dokładnego pomiaru poziomu kwasu retinowego (RA) w małych ilościach tkanek nie istnieją. Protokół ten opisuje łatwy, ilościowy pomiar względnych poziomów RZS w zarodkach i neurosferach E8.5 przy użyciu linii komórek reporterowych RA.

Ilościowy pomiar względnych poziomów kwasu retinowego w zarodkach E8.5 i kulturach neurosfery przy użyciu testu reporterowego F9 RARE-LACZ

Opisujemy technikę wykorzystania mysich embrionalnych komórek macierzystych do generowania dwu- lub trójwymiarowych ciał embrionalnych. Następnie wyjaśniamy, jak indukować różnicowanie neuronalne komórek ciała zarodka za pomocą kwasu retinowego i jak analizować ich stan różnicowania za pomocą immunofluorescencji markerów komórek progenitorowych i immunoblottingu.

Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

Tutaj stworzyliśmy tanią i łatwą w obsłudze metodę, która kieruje szybkim i efektywnym różnicowaniem się od embrionalnych komórek macierzystych do neuronów. Metoda ta nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów i może być przydatnym narzędziem do badań neurologicznych.

Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

Test nasiąkniętych kulek polega na ukierunkowanym dostarczeniu odczynnika testowego w dowolnym momencie rozwoju w celu zbadania regulacji różnicowania i morfogenezy komórek. Przedstawiono szczegółowy protokół, mający zastosowanie do każdego doświadczalnego modelu zwierzęcego, dotyczący przygotowania trzech różnych rodzajów namoczonych koralików i wszczepienia ich w komórkę międzypalcową zarodka kurczaka.

Analiza różnicowania komórek, morfogenezy i wzorcowania podczas embriogenezy kurczaka przy użyciu testu z namoczonymi kulkami

Poznaj metody identyfikacji i walidacji enhancerów w komórkach macierzystych przy użyciu analizy ChIP-seq. Protokół umożliwia badanie regulacji transkrypcji podczas różnicowania komórkowego.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym (Wideo) | JoVE Journal

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Przeglądaj więcej filmów